NO326899B1 - Antibakterielt protein samt anvendelser derav, terapeutisk formulering, polynukleotid og isolert organisme. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår lantibiotika samt anvendelser derav, terapeutisk formulering, polynukleotid samt isolert organisme.

Bakterieinfeksjon hos mennesker er et problem både av personlig betydning og økonomisk viktighet på helseområdet.

Streptokokkusinfeksjoner er spesielt forekommende, noe som forårsaker sykdommer som varierer fra tannkaries og mindre halsinfeksjoner til alvorlige sykdommer som skarlagensfeber, revmatisk feber og akutt glomerulonefritt.

For å redusere forekomsten av streptokokkusinfeksjoner er det ønskelig å styre eller forhindre veksten av den skadeforårsakende bakterien. En tilnærmingsmåte for det er å tilveiebringe bakteriociner og lignende substanser (som inkluderer antibiotika) som er virksomme mot streptokokki og organismer som er i stand til å fremstille slike substanser som er egnet til anvendelse for å kontrollere eller forhindre veksten av skadelige streptokokkusbakterier.

Et antall bakteriociner er kjent. Eksempler på bakteriociner avledet fra gram positive bakterier gis i Tagg et al., (1976), Bacteriol Rev. Vol. 40, sidene 722 - 756. Ytterligere eksempler på slike bakteriociner er lacticin 481 fra Lactobacillus lactis (Piard et al,

(1992) , Applied and Environmental Microbiology, Vol. 58, sidene 279 - 284), variacin fra Micrococcus varians (US 5,981,261) og bacteriociner fra Streptococcus thermophilus beskrevet i EP 0643136.

I Kalmokoff et al. 1999 (Applied and Environmental Microbiology, vol. 65, side 2128-2135) er lantibiotikaet butyrivibriocin OR79B beskrevet. Ingen aktivitet mot Streptococcus pyogenes er beskrevet.

Streptococcus salivarius har også lenge vært kjent for å ha en stor hyppighet av lantibiotikaproduksjon (Dempster RP et al. (1982) Arch Oral Biol 27:151). Ett lantibiotika som har blitt karakterisert fra S. Salivarius er salivaricin A (Ross et al

(1993) Appl Envir Microbiol 59:2014). Likevel, mens man viser den inhibitoriske virkningen mot et antall streptokokk specier, var aktiviteten heller bakteriostatisk enn bakteriocid. Salivaricin A og mikroorganismer som fremstiller det, tilveiebringer derfor ikke et fullstendig svar på å kontrollere streptokokkinfeksjoner. Søkerne har nå identifisert et ytterligere antibakterielt protein fra S. salivarius. Dette proteinet, som søkerne har funnet å ha bakteriocid virkning heller enn å være enkelt bakteriostatisk, er det primære fokus på den foreliggende oppfinnelsen.

Et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører et antibakterielt protein, kjennetegnet ved at det har aminosyresekvensen SEQ ID NO: 3 eller en aminosyresekvens som skiller seg fra SEQ DD NO: 3 ved innskudd, delesjon eller substitusjon av fra en til tre aminosyrer.

Proteinet ifølge oppfinnelsen har blitt beskrevet av søkerne som "salivaricin B" hvor det fullstendige nukleotidet og aminosyresekvensene gis i figur 2, sammen med sekvensene av en del av lederpeptidet. Vanligvis oppnås salivaricin B ved ekspresjon av en DNA-sekvens som koder for det i en vertcelle eller ved å kultivere produsentstammer S. salivarius K12 eller K30.

Et andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en terapeutisk formulering, kjennetegnet ved at den omfatter et protein ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen eller en organisme som uttrykker et protein ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen. Fortrinnsvis foreligger nevnte ingredienser i kombinasjon med et fortynningsmiddel, bærer og/eller eksipient.

I en spesielt foretrukket utførelsesform foreligger de terapeutiske formuleringer i form av næringsmidler eller drikker, mest foretrukket i form av melkeprodukt-baserte næringsmidler eller drikker.

Alternative former er legemidler og sukkervarer.

Et tredje aspekt ved oppfinnelsen vedrører et polynukleotid, kjennetegnet ved at det koder for et protein ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen.

Et fjerde aspekt ved oppfinnelsen vedrører en isolert organisme, kjennetegnet ved at den inkluderer et polynukleotid ifølge det tredje aspekt ved oppfinnelsen som uttrykker et protein ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen. Fortrinnsvis er nevnte organisme valgt fra S. salivarius stammer K12 og K30.

Fortrinnsvis er nevnte organisme i stand til å uttrykke salivaricin B alene eller i kombinasjon med et sekundært antibakterielt middel.

Mer foretrukket er nevnte sekundære antibakterielle middel et BLIS; mest foretrukket salivaricin A2. De fullstendige nukleotid og aminosyresekvensene for Salivaricin A2 gis i figur 3 sammen med sekvensene av lederpeptidet.

På en enkel måte velges nevnte organisme fra S. salivarius stammene Kl2 og K30.

Et femte aspekt ved oppfinnelsen vedrører anvendelse av et protein ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen, for fremstilling av en terapeutisk formulering for i det minste å inhibere vekst av skadelige streptokokkbakterier i de øvre luftveiene, hvor den terapeutiske formulering er formulert for oral administrering.

I en utførelsesform ifølge det femte aspekt ved oppfinnelsen skyldes nevnte inhiberende effekt kolonisering av i det minste en del av de øvre luftveier hos et individ med en levedyktig organisme som utrykker nevnte protein.

Fortrinnsvis administreres nevnte organisme som del av et næringsmiddel eller drikkevare.

Mer foretrukket er nevnte organisme en S. salivarius stamme valgt fra stammene Kl 2 ogK30.

En ytterligere utførelsesform vedrører anvendelsen ifølge det femte aspekt ved oppfinnelsen, hvori nevnte individ har blitt forbehandlet for i det minste å redusere den bakterielle populasjon tilstede i de øvre luftveier. Nevnte forbehandling omfatter fortrinnsvis trinnet med å administrere et antibiotikum oralt til nevnte individ. Nevnte antibiotikum er fortrinnsvis oral erytromycin.

Selv om oppfinnelsen i store trekk er som beskrevet over, vil det forstås av fagpersoner innenfor området at oppfinnelsen ikke er begrenset til dette, men også innbefatter utførelsesformer, hvilke beskrives i de følgende eksempler, sammen med aspekter som er fullstendig definert i det vedlagte kravsettet.

Henvisning gjøres til de vedlagte tegningene i hvilke:

Figur 1 viser strakturtrekkene av salivaricin B; Figur 2 viser nukleotid og aminosyresekvensen for salivaricin B som omfatter en del av ledepeptidet; og Figur 3 viser nukleotid og aminosyresekvensen for salivaricin A2 som inkluderer ledepeptidet.

BLIS (bakteriocin-lignende inhibitorsubstanser) er ekstracellulært frigitte bakteriepeptider eller proteiner som er i lave konsentrasjoner i stand til å drepe visse andre nært relaterte bakterier ved en mekanisme mot hvilken fremstillingscellene utviser en grad av spesifikk immunitet.

Uttrykket lantibiotika er et uttrykk avledet fra lantionin-inneholdende antibiotika (Schnell et al Nature 333:276,1988). Lantibiotika er en kategori av BLIS. Lantibiotika syntetiseres i ribosom som prelantibiotika som har en N-terminal ekstensjon (ledepeptid) som er spaltet fra det ved et bearbeidelsesenzym under dannelsen av den modne formen (biologisk aktive formen) av molekylet. Et karakteristisk trekk er at de er polycytiske polypeptider som inneholder lantionin og/eller P-metyllantionin, som danner tioeterbroer innenfor peptidkjeden. En klassifisering av de nåværende viste lantibiotika i to typer, A og B, har blitt foreslått av Jung i Angewandte Chemie, 30: 1051-1192,1991.

Tidligere undersøkelser av søkeren viste et antall BLIS-produserende stammer av Streptococcus salivarius med aktivitet mot visse andre streptokokker. BLIS fremstilt av en stamme, (stamme 20P3) ble isolert, delvis renset og en preliminær karakterisering ble satt i gang. Denne preliminære karakteirseringen indikerte at det fremstilte BLIS var et relativt varmestabilt protein med molekylmasse i størrelsesorden på fra 3500 til 8000 Da. BLIS ble gitt navnet SAL 20P3.

Etterfølgende undersøkelser frembrakte aminosyresekvensen til SAL 20P3 sammen med dets molekylmasse. Det spesifikt identifiserte antibiotika ble omdøpt til Salivaricin A (Ross et al., Appl. Envir. Microbiol 59: 2014).

BLIS ifølge den foreliggende oppfinnelsen skiller seg fra salivaricin A. Denne forskjellen vedrører både dets molekylmasse (2733 Da sammenlignet med 2316 Da for salivaricin A) og dets aminosyresekvens som vist i figur 2. Salivariciner A og B skiller seg også fra hverandre med hensyn til deres inhibitoraktivitet. Spesifikt, hvorved salivaricin A har blitt funnet å være virksom som et bakteriostat mot de fleste stammer av Streptococcus pyogenes, har salivaricin B blitt bestemt til å være bakteriocid. Viktigere er det at ingen stammer av S. pyogenes, som er resistent mot salivaricin B, ennå har blitt oppdaget.

Salivaricin B uttrykkes av S. salivarius stammer K12 og K30. S. salivarius stammer Kl2 og K30 ble deponert ved Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Germany, 8. oktober 1999. Stamme Kl2 har fått tilleggsnummer DSM 13084, hvorved stammen K30 har fått tilgangsnummeret DSM 13085.

Derfor, i et første aspekt, er oppfinnelsen rettet mot det antibakterielle proteinet, salivaricin B kjennetegnet ved at det har aminosyresekvensen SEQ ID NO: 3 eller en aminosyresekvens som skiller seg fra SEQ ID NO: 3 ved innskudd, delesjon eller substitusjon av fra en til tre aminosyrer.

Man vil videre forstå at modifikasjoner kan gjøres med hensyn til den naturlige aminosyresekvensen av både proteinet og de aktive fragmentene derav mens man fremdeles minst i det alt vesentlige bibeholder deres biologiske aktivitet. Slike modifikasjoner av den naturlige aminosyresekvensen som er resultatet av innsettelsen, substitusjon eller delesjon av en, to eller tre aminosyrer er spesifikt innenfor rekkevidden av denne oppfinnelsen, forutsatt at variantproteinene har eller omfatter en sekvens som er større enn 80% homolog med aminosyresekvensen av naturlig salivaricin B.

Man vil selvfølgelig forstå at et mangfold substitusjoner av aminosyrer er mulig mens fremdeles oppnår det. Konservative substitusjoner beskrives i patentlitteraturen, som for eksempel i US patent nr. 5,264,558 eller 5,487,983. Derfor forventer man, for eksempel, at utveksling blant ikke-polare alifatisk nøytrale aminosyrer, glycin, alanin, prolin, valin og isoleucin muligens kan gjøres. Likeledes kan substitusjoner av de polare alifatiske nøytrale aminosyrer, serin, treonin, metionin, aspargin og glutamin gjøres. Substitusjoner blant de laveste sure aminosyrer, aspartinsyre og glutaminsyre, kan muligens gjøres likeledes som substitusjonene blant de ladede basiske aminosyrer, lycin og arginin. Substitusjoner blant de aromatiske aminosyrer, som omfatter fenylalanin, histidin, tryptofan og tyrosin vil også sannsynligvis være mulig. Disse substitusjonstyper og utvekslingstyper er velkjent for personer med kunnskap innenfor fagområdet. Andre substitusjoner kan også være mulig. Selvfølgelig ville man også forvente at jo større prosentandel av homologien dvs. sekvenslikhet er, av en variantprotein med et naturlig forekommende protein som overskrider 80% terskelen, jo større er aktivitetsretensjonen.

Proteinet og fragmentene kan fremstilles ved et mangfold av mulige veier. Ved isolering fra en naturlig kilde, for eksempel, (som S. salivarius stammer Kl 2 og/eller K30), ved syntese ved anvendelse av hvilke som helst egnede kjente teknikker (som beskrevet for nisin syntese av Wakamiya et al., (1991) i "Nisin and Novel Lantibiotics" ed. G. Jung og H.G. Shal, 189 - 203, Escom, Leiden eller ved fastfasesyntese som beskrevet av Merrifield (1964) J. Am. Chem. Assoc. 85,2149 - 2154, eller ved syntese i homogen oppløsning som beskrevet av Houbenwycl (1987), Methods of Organic Chemistry, Vol. I og II) eller ved å anvende rekombinante DNA-teknikker som beskrevet av Sambrook et al (1989), Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Press, New York, USA.

Variantene av både det naturlige proteinet og dets aktive fragmenter kan på samme måte fremstilles ved hvilken som helst av disse teknikker som er kjent. Varianter kan for eksempel fremstilles ved stedsspesifikk motogenese av DNA som koder for den naturlige aminosyresekvensen som beskrevet av Adelman et al., DNA 2, 183 (1983).

Hvor rekombinant metodologi anvendes for fremstille BLIS, er det nødvendig som et første trinn å oppnå DNA som koder for det ønskede produktet. Slik DNA innbefatter også et aspekt av denne oppfinnelsen.

Nukleotidsekvensen av et polynukleotid som koder for salivaricin B vises i figur 2.

DNA'et som er nevnt heri kan kode for det naturlige proteinet eller et aktivt fragment derav.

DNA'et kan isoleres fra, for eksempel, S. salivarius stammer Kl2 og K30 ved å anvende prøver og/eller amplifiseirngsprimere basert på den bestemte nukleotidsekvensen av salivaricin B. DNA'et som identifiseres på denne måten kan fremstilles som intron-fritt cDNA ved å anvende konvensjonelle metoder. DNA'et kan også fremstilles i form av syntetiske oligonukleotider hvor størrelsen av de aktive fragmenter tillater det, for eksempel ved anvendelse av fosfotriestermetoden fra Matteucci et al. J. Am. Chem. Soc. 103: 3185-3191,1981. Ytterligere kann DNA'et fremstilles ved å anvende en egnet kommersielt tilgjengelig DNA synteseanordning som DNA synteseanordning fra Applied BioSystems.

Varianter av proteinet og dets fragmenter som skiller seg fra de naturlige aminosyresekvenser ved innskudd, substitusjon eller delesjon av en eller flere aminosyrer er også beskrevet heri. Hvor man ønsker en slik variant, forandres nukleotidsekvensen av det naturlige DNA passende. Denne forandringen kan gjennomføres ved elektiv syntese av DNA'et eller ved modifikasjon av det naturlige DNA ved, for eksempel, steds-spesifikk eller kassettmutagenese.

Fortrinnsvis, hvor deler av cDNA eller genom-DNA behøver sekvensmodiifkasjoner, anvendes setespesifikk primer rettet mutagenese. Denne metoden er nå standard i teknikken.

Når det er oppnådd, behandles det modifiserte DNA for å være egnet for innsesjon inn i en egnet klonings- og/eller ekspresjonsvektor. Således er DNA'et spaltet, tilpasset og relegert etter behov.

Spaltning utføres ved behandling med restriksjonsenzymer i en egnet buffer. Hvilket som helst av det store antall av kommersielt tilgjengelige restriksjonsenzymer kan anvendes på måten spesifisert av produsenten. Etter spaltning gjenvinnes nukleinsyren ved, for eksempel, presipitering med etanol.

Tilpasning (tailoring) av det spaltede DNA utføres ved anvendelse av konvensjonelle teknikker. For eksempel, hvis butte ender behøves, kan DNA'et behandles med DNA polymerase 1 (Klenow), fenol og kloroform ekstrahert, og presipitert med etanol.

Religering kan utføres ved å tilveiebringe omtrentlige ekvimolare mengder av de ønskede bestanddeler, på en egnet måte tilpasset for korrekt tilpasning og behandling med en egnet ligase (for eksempel T4 DNA ligase).

DNA molekylet som oppnås på denne måten innføres inn i en kloneringsvektor ved en lokalisering som tillater at proteinproduktet hvilket det koder for, uttrykkes.

Egnede kloningsvektorer kan konstrueres ifølge velk jente metoder eller kan velges fra et stort antall kloningsvektorer som er tilgjengelige i teknikken. Mens denne kloningsvektoren, som er valgt, kan variere ifølge vertscellen som skal anvendes for å uttrykke det BLIS-kodende DNA, vil brukbare kloningsvektorer generelt ha de følgende egenskaper:

(i) evnen til selv-replikasjon; (ii) tilstedeværelse av et enkelt mol for hvilken som helst spesifikk restriksjonsendonuklease; og (iii) ønskelig, bæregener for en lett selekterbar markør som antibiotikaresistens.

To hovedtyper av kloningsvektorer som har de tidligere nevnte egenskaper av plasmider og bakterielle vimser (bakteriofager eller fager). Eksempler på egnede kloningsvektorer omfatter pUC18, Mpl8, Mpl9, pRB322, pMB9, ColEl og pCRl fra E. coli; plasmider med en stor vertsrekkevidde som omfatter RP4, fage DNA'er som lambda og M13 og shuttle vektorer som pSA3 og pAT28.

For ekspresjon av det BLIS-kodende DNA i verten, må kloningsvektoren også inkorporere en ekspresjonskontrollsekvens. En typisk ekspresjonskontrollsekvens kan beskrives ved hjelp av fem elementer. I rekkefølgen der de foreligger i genet, er elementene som følger: (a) promotorområdet; (b) det 5'-utranslaterte området (signal eller ledesekvens); (c) den proteinkodende sekvensen;

(d) det 3'utranslaterte området; og

(e) transkripsjonstermineringsområdet.

Funksjon av hvert av disse elementene er anerkjent.

Hvilke som helst av et stort område av slike kontrollsekvenser kan anvendes hvilke for eksempel omfatter de fra lipoproteingenet, (5-galaktosidasegenet, tryptofangenet, 0-laktamasegenet og fagen lambda.

Som element (c) innføres DNA-sekvensen som koder for lantibiotika inn i kloningsvektor-kontrollsekvensen på den måten som er vist ovenfor.

En egnet vert inn i hvilken kloningsvektoren skal inserteres, velges deretter. Potensielt nyttige verter omfatter bakterier, gjær, sopp, insekter, dyr og planteceller. Prokaryotiske verter er generelt foretrukket for den foreliggende oppfinnelsen. Ikke-sykdomsforårsakende bakterielle verter er spesielt egnet.

Bakterielle verter er generelt valgt blant de grampositive bakterier. Streptococcus vertene er foretrukket for anvendelse i den foreliggende oppfinnelsen.

Som man vil forstå, i det utvalgte vertsystemet, anvendes plasmidvektorer som inneholder replikasjonsdeler og kontrollsekvenser avledet fra en art som er kompatibel med verten.

Kloningsvektoren, som dannes som ovenfor, anvendes for å transformere den valgte verten, som igjen anvender metoder som er velkjente i teknikken, for eksempel kalsiumkloridbehandlingen som beskrevet av Cohen, S.N. Proe. Nat. Acad. Sei. 69, 2110,1972.

Etter transformering av den utvalgte verten med kloningsvektoren, kan proteinet eller fragmentet, som kodes, fremstilles, potensielt som et fusjonsprotein, ved kultivering av vertcellene. Det eksogene proteinproduktet eller fragmentet isoleres deretter ved anvendelse av rutinefremgangsmåter som inkluderer ammoniumsulfatpresipitasjon, kolonnekromatografi (for eksempel ionebytte, gelfiltrerings-, affinitetskromatografi, osv.) elektroforese og til slutt krystallisering (se generelt "Enzyme Purification and Related Techniques". Methods in Enzymology, 22,233 - 577 (1971)). Rensing utføres etter behov ved anvendelse av konvensjonelle teknikker.

Der rekombinant metodologi anvendes, kan DNA'et som beskrives heri også kode for et fusjonsprotein som innbefatter det antibakterielle proteinet eller fragmentet og et vektorprotein for å bistå med isolering og rensing. Generelt kan dette vektorproteinet spaltes kjemisk eller enzymatisk fra det antibakterielle proteinet eller fragmentet ifølge de kjente teknikker.

En spesifikk kimer form av proteinet kan også ha anvendelse. En DNA-sekvens som koder for hvert komplett protein, eller en del av proteinet, kan for eksempel bindes med en sekvens som koder for et annet BLIS som salivaricin A2 slik at ekspresjon av DNA sekvensen fremstiller et kimert protein med et utvidet sektrum av antibakteriell aktivitet.

Når proteinet er renset, er det tilgjengelig for anvendelse. Slike anvendelser omfatter generelt antibakterielle midler (for eksempel som konserveirngsmiddel i næringsmidler) så vel som terapeutiske. I denne sammenheng vil man forstå at "terapeutisk" omfatter profylaktisk behandling.

Derfor, i et ytterligere aspekt, er den foreliggende oppfinnelsen rettet mot terapeutiske formuleringer som er kjennetegnet ved at den omfatter et protein ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen. Nevnte formulering er egnet for anvendelse for behandling eller forhindring av mikrobielle infeksjoner, spesielt streptokokkinfeksjoner.

Formuleringene er spesielt egnet for anvendelse mot S. pyogenes og S. sobrinus. Disse terapeutiske formuleringer innbefatter salivaricin B eller et fragment eller variant derav i kombinasjon med et fortynningsmiddel, bærer eller eksipient for det, som er kjent innen teknikken. Eksempler på terapeutiske formuleringer der salivaricin B kan anvendes, er oralt administrerbare medikamenter som kapsler, stikkpiller, siruper, munnskyllemidler, gurglevann, tannkrem og munnspray, men er ikke begrenset til disse. Ytterligere eksempler omfatter topikal administrerbare formuleringer som fuktighetskremer og kosmetiske midler for å bekjempe bakteriell vekst på huden.

I et ytterligere aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen en terapeutisk formulering som omfatter en organisme som uttrykker et protein ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen. Nevnte organisme er i stand til å kolonisere de øvre luftveiene eller en del derav og å uttrykke lantibiotikaet ifølge oppfinnelsen, i kombinasjon med en bærer, fortynningsmiddel og/eller presipient.

I en utførelsesform er organismen en transformert vertsorganisme fremstilt ifølge oppfinnelsen. Det er imidlertid foretrukket at organismen er en som fremstiller salivaricin B som et naturlig produkt. Eksempler på slike organismer er S. salivarius stamme Kl 2 ogK30.

S. salivius stamme K12 og K30 har blitt bestemt for å uttrykke ikke kun salivaricin B, men også salivaricin A2. Salivaricin A2 er relatert, men ikke identisk med salivaricin A. De fullstendige sekvenser (polynukleotid og aminosyre) for salivaricin A2 vises i figur 3.

I denne utførelsesformen er det foretrukket at de terapeutiske formuleringer ifølge oppfinnelsen er i form av et næringsmiddel, søtvareprodukt eller drikkevare. Det er spesielt foretrukket at næringsmiddelet eller drikkevaren er et melkeprodukt-basert næringsmiddel eller drikkevare, som omfatter for eksempel yoghurt, ost, melk, melkekjeks og aromatiserte melketyper. I tilfellet med en søtvare, kan den terapeutiske formuleringen være en tyggegummi som en tyggegummi beskrevet i WO 00/05972. En spesielt foretrukket formulering er der frysetørkede stammer av salivaricin B-produserende S. salivarius er inkludert i melkepulverformuleringer på en måte som ligner den som tidligere var vist for fremstilling av Bifidus melkepulver (Nagawa et al.

(1988); JDairySci71: 1777- 1782).

Forskjellige aspekter ved oppfinnelsen vil nå bli illustrert på en ikke-begrensende mate med referanse til den følgende eksperimentelle delen.

Eksperimentell

Ekstrahering av salivaricin

Salivaricin B ble renset fra vekst(lawn)kulturer av teststammene S. salivarius Kl 2 og K30 dyrket i 18 timer ved 37°C i 5% karbondioksid i luftatmosfæren på Ml7 medium supplert med 0,5% Davis agar, 0,5% sakkarose, 0,5% humant plasma og 0,1% kalsiumkarbonat. Vekstkulturene ble inokkulert ved pensling på overflaten av agarmediumet fra en 18 timers 37°C Todd Hewitt-kraftkultur av producer-stammen. Ekstraksjon av salivaricin B-aktiviteten oppnås ved frysing av agarplatene ved -70°C og deretter tining ved romtemperatur for å få agargelen til å kollapse, fulgt av sentrifugering for å oppklare den ekstraherte væsken. Titren av inhibitorisk aktivitet i disse fryse/tineekstrakter er generelt 2-4 AU/ml.

Titrering av salivaricinaktivitet

Salivaricinaktivitet titreres ved å anvende en agaroverflate assay. Dråper (20 ul) av to-gangers saltfortynninger av prøven undersøkes mot Mikrooccus luteus T-18 på Columbia agar basis. Den resiproke verdien av den høyeste fortynningen for å fremstille en bestemt sone av inhibering av veksten av indikatorveksten er titeren i arbitrære enheter pr. ml (Au/ml) av salivaricin aktivitet.

Rensing av salivaricin B

Et to liters volum av fryse-tine-ekstrakt ble anvendt i en XAD-2 kolonne (diameter 5,0 cm, sengvolum 150 ml; Serva) og vasket med 7 sengevolumer av 50% (v/v) metanol. Salivaricinaktivitet ble eluert med 5 sengvolumer av 90% (v/v) metanol (innstilt til pH 2 med 11,6 M CH1) og konsentrert ved fordamping ved 50°C under redusert trykk. Alikoter (1-ml) av dette materialet ble anvendt ved en Brownlee C8-omvendt fasekolonne (Aquapore RP300; porestørrelse, 7 um; 30 gange 4,6 mm; Applied Biosystems, Inc.), ekvilibrert med 0,1% trifluoreddiksyre (TFA). Fraksjonering av dette materialet oppnås ved anvendelse av et Pharmasia raskt-protein-likvid-kromatografi (FPLC) system ved en strømningshastighet på 1 ml pr. minutt ved å anvende en 10 minutts gradient (0 til 28% acetonitril som inneholder 0,085% TF A) fulgt av 80 minutters isokratisk (28% acetonitril) eluering. I løpet av denne isokratiske elueringen oppnås faseseparering av salivaricin A (eluering som begynner ved ca. 40 minutter) og salivaricin B (starter ved ca. 60 minutter). Hver 1-ml fraksjon ble undersøkt for inhibitorisk aktivitet mot M. luteus Tl8. De aktive fraksjoner i hver region som tilsvarer salivaricin A og salivaricin B ble separat oppsamlet som delvis rensede preparater av bacteriocinene. Hver oppsamling ble lyofilisert og deretter oppløst i 0,1% TFA. Aliquoter av hvert av disse preparater ble deretter overført på en Cis-omvendt-fase høytrykks likvid kromatografi (HPLC) kolonne (Alltech Nucleosil Cis; 10 um; 250,0 x 4,6 med mer) ekvilibrert med 0,1% TFA og ytterligere fraksjonert ved anvendelse av et Waters/Millipore HPLC system ved anvendelse av egnede acetonitril-gradienter..

Salivaricin A2 ble eluert som en homogen topp med 34 - 35% acetonitril og salivaricin B med 38 - 40% acetonitril. Absorbens ble overvåket ved 214 med mer og fraksjoner som tilsvarer de forskjellige toppene ble oppsamlet manuelt. Inhibitoraktivitet ble detektert ved en spot-diffusjonstest ved anvendelse av M. luteus T-18 som indikator. De aktive fraksjoner fra hvert løp ble oppsamlet, lyofilisert og gjenoppløst i 1 ml av Milli Q™-renset vann som inneholder 0,1% TFA. Fraksjonene som inneholder inhibitorisk aktivitet (renset salivaricin) ble oppsamlet og lagret ved -20°C.

Ione-spray massespektrometri indikerte at den molekylære massen av salivaricin B var 2733 Da. Edman analyse av renset salivaricin B avslørte den N-terminale sekvensen Gly-Gly-Gly-Val-Ile-Gln.

Kloning av Salivaricin B

Aminosyresekvensen avledet ved rensing og sekvensering av peptidet muliggjorde fremstilling av degenerert oligonukleotid DNA-prøver basert på den universelle kodon-anvendelsen. Den spesifikke prøven som ble anvendt (CF481) var basert på aminosyresekvensen: S W Q F L F T. Den tilsvarende nukleotidsekvensen var

TCNTGGCAATTTTTRTTTACT.

Kromosomalt DNA ble isolert fra Streptococcus salivarius stammen, Min 5 ved fremgangsmåten til Spanier and Cleary (1983). (Virology 130: 514-522). Et fordøyningstrinn ved anvendelse av både EcoRl og #wÆII-restriksjonsenzymer ble gjennomført og deretter ble det kuttede DNA separert i en 1% agarosegel kjørt ved 40 V/cm i 18 timer (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1989). DNA'et ble transferert til nylonmembran ved Southern blotting fulgt av instruksjonene fra anvendelse av Hybond-N+ (Amersham Pharmacia). Prøve CF481 ble merket med gamma P ATP ved anvendelse av T4-polynukleotidkinase. Hybridisering med prøve CF481 ble utført i et hybridiseringsrør ved 38°C i 18 timer. Membranet ble vasket to ganger i 5 minutter i 5 x SSC, 0,5% SDS, og deretter to ganger i 20 minutter i 2 x SSC, 0,2% SDS. Membranet ble deretter utsatt for en røntgenfilm ved -70°C i 18 timer.

Gelområdet som tilsvarer hybridiseringsstedet av CF481 på Southern blotten ble kuttet fra gelen og det ekstraherte DNA'et ved anvendelse av en Qiagen QIAquick gel ekstraheringskit. For ligering, ble 1 ul av vektoren pUC19 spaltet med restriksjonsenzymene EcoRl og Hindlll, blandet med 15 ul av de spaltede Min5 DNA fragmenter, 2 ul ligeringsbuffer og 1 ul T4 DNA-ligase (Roche). Inkubering skjedde i 18 timer ved 15°C.

E. coli stammen DH 10p ble anvendt for transformering ved elektroporese med det ligerte pUC19. De transformerte cellene ble dyrket i 1 time i 1 ml Luria kraftoppløsning og deretter overført på plater på Luria kraftoppløsningsagar med tilsats av ampicillin (100 (il/ml) og X-gal 20 mg/ml. Etter en inkubering over natt ved 37°C ble hvite kolonier selektert, subkulturert og screenet med CF481 prøven. Screeningen ble utført ved lysering av E. Coli koloniene i en 5% SDS 10% glyceroloppløsning ved 65°C i 30 minutter. Koloniene ble deretter kjørt i en agarosegel, behandlet med southem blotting, og membran hybridisert med CF481 prøven på samme måte som beskrevet over. Positive kolonier ble deretter dyrket i Luria kraftoppløsning med 100 ul/ml ampicillin i 18 timer ved 37°C ved omrøring. pUC19 plasmidet ble deretter ekstrahert ved anvendelse av QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) og sekvensert ved anvendelse av pUC 19 fremover og revers primere.

Resultatene vises i figur 2.

Antibakterielt aktivitet av salivaricin B

Dell

Stammer av S. salivarius som 20P3 og 5 som produserer salivaricin A (men ikke salivaricin B) inhiberer alle 9 standard indikatorbakterier i motsetning til indikator 3. Dette inhiberingsmønsteret i kodeform er kjent som produksjon (P) type 677. I motsetning inhiberer stammer Kl2 og K30 som fremstiller både salivaricin A2 og salivaricin B veksten av alle 9 standard indikatorer, aktivitet referert til som P-type 777. P-type-undersøkelsen omfatter først dyrking av undersøkelsesstammen på blodagar som en diametrisk utstrykskultur. Etter fjerning av denne veksten, steriliseres agaroverflaten med kloroformdamp, luftes og de 9 standard indikatorbakterier (som inkluderer 4 stammer av Streptococcus pyogenes) kryss-utstrykes langs linjen av det originale undersøkelses-staminokkulum. Etter inkubering tar man interferens med veksten av indikatorene i nærhet av det opprinnelige producerutstryket som indikator for bakteriocin aktivitet. I tilfellet av stammer 20P3 og 5 (producere av salivaricin A) kan inhibitorvirkningen vises å være bakteriostatisk, dvs. levedyktig indikatorcelle kan bli gjenvunnet i store tall fra inhiberingssonen ved prøving med en stempelanordning og overføring av cellene til et nytt (ikke-bakteriocin-inneholdende agarmedium). I motsetning er virkningen av P-type 777 stammene (vist også for å fremstille salivaricin B) er bactericid mot standard indikatorene, dvs. ikke levedyktige celler kan bli gjenvunnet fra inhiberingssonen i differerte antagonismeundersøkelse. Videre har undersøkelser som anvender rensede preparater av salivaricin A og salivaricin B (data ikke vist) bekreftet at virkningen mot S. pyogenet av salivaricin A er bakteriostatisk hvorved den til salivaricin B er bakteriocid.

Del 2

Inhibitoraktiviteten av salivaricinene ble bestemt ved måling av reduksjon av tiden med antallet av kolonidannende enheter (CFU) av en suspensjon av den sensitive indikatoren streptokokk ( Streptococcus pyogenes stamme FF22) etter blanding av cellene med et salivaricinpreparat. To ganger vaskede celler fra en eksponensiell Todd-Hewitt-kraftoppløsningskultur av indikatoren streptokokk ble resuspendert i 0,067 M fosfatbuffer (pH 6,5) til det opprinnelige kulturvolumet. Deler av delvis renset salivaricin (titre 16 Au/ml) eller fosfatbuffer (kontrollprøve) ble deretter blandet med et likt volum av den vaskede cellesuspensjonen og inkubering ble fortsatt ved 37°C. Overlevende ble bestemt ved intervaller ved å overføre egnede 10-gangers fortynninger

(i kald Todd Hewitt-kraftoppløsning) av undersøkelses- og kontrollblandingene på Columbia agarbasis og inkubering ved 37°C i 24 timer. Levedyktige tellinger ble uttrykt som totalantallet CFU pr. ml.

Det ble funnet at preparater av delvis renset salivaricin B av titer 16 var dødelig for over 99% av CFU'et av eksponensiell Todd-Hewitt-kraftoppløsningskulturer av S. pyogenes stamme FF22 i 4 timer ved 37°C. I motsetning drepte de delvis rensede preparater av salivaricin A2 med titer 16 når de ble undersøkt ved anvendelse under de samme betingelser mindre enn 10% av stamme FF22-celler. Ytterligere undersøkelser av inhibitorspektre av delvis renset salivaricin A2 og salivaricin B-preparater ble gjennomført ved anvendelse av agar-overflateundersøkelsen som beskrevet over. Dråper (20 ul) av et preparat med titer 16 Ua/ml ble overført på vekstkulturer av undersøkelsesstammene som har blitt fersk-inokkulert ved utstrykning av overflaten av en Columbia agar-basisplate med en 1/100 fortynning i saltoppløsning av en 18 timers Todd Hewitt kraftoppløsningskultur av denne stammen. Fremstilling av en begrenset sone av inhibert undersøkelsesstamvekst etter inkubering av disse platene ved 37°C i 18 timer ble tatt for å indikere sensitiviteten av denne stammen for salivaricin.

Resultatene vises i Tabell 1.

INDUSTRIELL ANVENDELSE

Resultatene vist ovenfor, viser den inhibitoriske og bakteriocide virkningen av salivaricin B og organismer som produserer dette BLIS. Salivaricin B og/eller organismer som produserer det, er derfor anvendelig ved behandling av individer mot skadelige virkninger av streptococcus-infeksjoner i de øvre luftveier, som omfatter munnen. Nevnte behandling omfatter tilstander som streptokokkal sår hals (forårsaket hovedsakelig av S. pyrogenes) og tannkaries (forårsaket delvis av S. sorbrinus).

De for tiden foretrukne oralt administrerbare formuleringer er blandinger av fryse-tørkede S. salivarius stammer med skummet melkepulver eller lignende som har blitt aromatisert for å forbedre smaksakseptansen.

Indikasjoner for tiden er at slike formuleringer er virksomme når de rekonstitueres ved tilsats av vann og når det drikkes tre eller fire ganger i løpet av en dag slik at man konsumerer en totalmengde på 50 mis av det aromatiserte produktet (som inneholder ca.

2 x IO<7> celler/ml frysetørket S. salivarius organisme(r).

Hvor de frysetørkede S. salivarius stammene er valgt fra K12 og K30 foreligger den tilleggsfordel at salivaricin B uttrykkes sammen med salivaricin A2. Ko-ekspresjon av disse to BLIS gjør formuleringen spesielt bacteriocid i forhold til S. pyogenes og S. sobrinus, så vel som i forhold til et antall andre bakterier.

Claims (35)

1. Antibakterielt protein, karakterisert ved at det har aminosyresekvensen SEQ ED NO: 3 eller en aminosyresekvens som skiller seg fra SEQ ED NO: 3 ved innskudd, delesjon eller substitusjon av fra en til tre aminosyrer.

2. Protein ifølge krav 1, karakterisert ved at det er bakteriocidalt.

3. Protein ifølge krav 1, karakterisert ved at det er bakteriocidalt med hensyn til Strepotococcus pyogenes.

4. Terapeutisk formulering, karakterisert ved at den omfatter et protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3 eller en organisme som uttrykker et protein ifølge hvilket som helst av kravene 1-3.

5. Terapeutisk formulering ifølge krav 4, karakterisert v e d at den ytterligere omfatter et fortynningsmiddel, bærer og/eller eksipient.

6. Terapeutisk formulering ifølge krav 5, karakterisert v e d at den omfatter et protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1 - 3 i kombinasjon med et fortynningsmiddel, bærer og/eller eksipient.

7. Terapeutisk formulering ifølge krav 5, karakterisert ved at den omfatter en organisme som uttrykker et protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1 - 3 i kombinasjon med et fortynningsmiddel, bærer og/eller eksipient.

8. Terapeutisk formulering ifølge et hvilket som helst av kravene 5-7, karakterisert ved at den er et oralt administrerbart legemiddel.

9. Terapeutisk formulering ifølge krav 8, karakterisert v e d at det er en sirup, et munnskyllemiddel, gurglevann, tannkrem eller munnspray.

10. Terapeutisk formulering ifølge krav 8, karakterisert v e d at det er i en enhetsdoseirngsform.

11. Terapeutisk formulering ifølge krav 9, karakterisert v e d at det er en pastill eller kapsel som inneholder en enhetsdose av en organisme som uttrykker et protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3.

12. Terapeutisk formulering ifølge et hvilket som helst av kravene 5-8, karakterisert ved at nevnte protein eller organisme er inkludert i et næringsmiddel eller en drikkevare.

13. Terapeutisk formulering ifølge krav 12, karakterisert ved at nevnte næringsmiddel eller drikkevare er et meieri basert næringsmiddel eller drikkevare.

14. Terapeutisk formulering ifølge krav 13, karakterisert v e d at nevnte protein eller organisme er inkludert i melkepulver, melkekjeks, melk, yoghurt eller ost.

15. Terapeutisk formulering ifølge krav 13, karakterisert v e d at nevnte protein eller organisme er inkludert i en smakstilsatt melk.

16. Terapeutisk formulering ifølge et hvilket som helst av kravene 4-7, karakterisert ved at nevnte protein eller organisme er inkludert i en søtvare.

17. Terapeutisk formulering ifølge krav 16, karakterisert v e d at nevnte søtvare er en tyggegummi.

18. Terapeutisk formulering ifølge et hvilket som helst av kravene 4-17, karakterisert ved at den ytterligere omfatter ett eller flere sekundære antibakterielle midler.

19. Terapeutisk formulering ifølge krav 18, karakterisert ved at nevnte sekundære antibakterielle middel/midler er valgt fra bacteriocin-lignende inhibitorsubstans(er) (BUS).

20. Terapeutisk formulering ifølge krav 18, karakterisert v e d at den ytterligere inneholder en eller flere av salivaricin A, en organisme som uttrykker salivaricin A, salivaricin A2 eller en organisme som utrykker salivaricin A2.

21. Polynukleotid, karakterisert ved at det koder for et protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3.

22. Polynukleotid ifølge krav 21, karakterisert ved at det omfatter den kodende sekvensen av SEQ ED NO: 2.

23. Isolert organisme, karakterisert ved at det inkluderer et polynukleotid ifølge krav 21 eller 22 som uttrykker et protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3.

24. Organisme ifølge krav 23, karakterisert ved at nevnte polynukleotid er heterologt.

25. Organisme ifølge krav 23, karakterisert ved at den er en S. salivarius organisme.

26. S. salivarius stamme K12, karakterisert ved at den er deponert ved Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Tyskland, tilgangsnummer DSM 13084.

27. S. salivarius stamme K30, karakterisert ved at den er deponert vedDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Tyskland, tilgangsnummer DSM 13085.

28. Terapeutisk formulering ifølge krav 7, karakterisert ved at organismen er S. salivarius stamme Kl2 eller S. salivarius stamme K30 som identifisert i krav 26 eller krav 27.

29. Anvendelse av et protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1 - 3 for fremstilling av en terapeutisk formulering for i det minste å inhibere vekst av skadelige streptokokkbakterier i de øvre luftveiene, hvor den terapeutiske formulering er formulert for oral administrering.

30. Anvendelse ifølge krav 29, hvor nevnte terapeutiske formulering er en terapeutisk formulering som definert i hvilke som helst av kravene 5-20 og 28.

31. Anvendelse ifølge krav 29, hvori nevnte inhiberende effekt skyldes kolonisering av i det minste en del av de øvre luftveier hos et individ med en levedyktig organisme som utrykker nevnte protein.

32. Anvendelse ifølge krav 31, hvori nevnte organisme utgjør en del av et medikament, et næringsmiddel, en drikkevare eller en søtvare.

33. Anvendelse ifølge krav 31 eller krav 32, hvori nevnte organisme er en S. salivarius stamme valgt fra stammene K12 og K30.

34. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 29-33, hvori nevnte individ har blitt forbehandlet for i det minste å redusere den bakterielle populasjon tilstede i de øvre luftveier.

35. Anvendelse ifølge krav 34, hvori nevnte forbehandling omfatter trinnet med å administrere et antibiotikum oralt til nevnte individ.