DE60034879T2

DE60034879T2 - Lantibiotikum

Info

Publication number: DE60034879T2
Application number: DE60034879T
Authority: DE
Inventors: John Robert Tagg; Karen Patricia Corvallis DIERKSEN; Mathew Upton
Original assignee: BLIS Technologies Ltd
Current assignee: BLIS Technologies Ltd
Priority date: 1999-10-12
Filing date: 2000-10-12
Publication date: 2008-02-07
Also published as: EP1169340A1; HK1039622A1; CA2363713A1; HK1039622B; AU772224B2; ATE362481T1; CA2363713C; JP2003516123A; DE60034879D1; NO20013905L; NO20013905D0; WO2001027143A1; AU7973700A; US20040232205A1; PL364771A1; PL206441B1; US6773912B1; NO326899B1; BR0014740A; DK1169340T3

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Lantibiotika, Organismen, die derartige Lantibiotika herstellen, und auf die Verwendung sowohl von den Organismen als auch von den Lantibiotika, die von jenen hergestellt werden.
HINTERGRUND
Eine bakterielle Infektion bei Menschen ist ein Problem von beträchtlicher persönlicher Besorgnis sowie ökonomischer Bedeutung in dem Gesundheitsbereich.
Streptokokkeninfektionen treten besonders häufig auf und verursachen Krankheiten, die sich von dentalem Karies und leichteren Halsinfektionen bis hin zu ernsthaften Erkrankungen, wie zum Beispiel Scharlach, rheumatisches Fieber und akute Glomerulonephritis, erstrecken.
Um das Auftreten von Streptokokkeninfektionen zu verringern, ist es wünschenswert, das Wachstum der gesundheitsschädlich wirkenden Bakterien zu kontrollieren oder zu verhindern. Eine Vorgehensweise in dieser Richtung ist es, Bakteriozin und ähnliche Substanzen (einschließlich Lantibiotika), die aktiv gegen Streptokokken wirken, und Organismen, welche in der Lage sind, derartige Substanzen herzustellen, die für die Verwendung bei der Steuerung oder Verhinderung des Wachstums von schädlichen Streptokokkenbakterien geeignet sind, bereitzustellen.
Eine Anzahl von Bakteriozinen ist bekannt. Beispiele von Bakteriozinen, die von Grampositiven Bakterien abstammen, sind in Tagg et al., (1976), Bacteriol. Rev. Bd. 40, Seiten 722-756 gegeben. Weitere Beispiele von solchen Bakteriozinen sind Lacticin 481 von Lactobacillus lactis (Piard et al., (1992), Applied and Environmental Microbiology, Bd. 58, Seiten 279-284), Variacin von Microccocus varians ( US 5,981,261 ) und die Bakteriozine von Streptoccocus thermophilus, beschrieben in EP 0643136 .
In Kalmokoff et al., (1999), Applied and Environmental Microbiology, Bd. 65, Nr. 5, Seiten 2128-2135 wird das Lantibiotikum Butryrivibriocin OR79A beschrieben.
Über Streptoccocus salivarius ist auch schon lange bekannt, dass es eine große Häufigkeit bei der Herstellung von Lantibiotika aufweist (Dempster RP et al (1982) Arch Oral Biol 27:151). Ein Lantibiotikum, welches von S. salivarius charakterisiert wurde, ist Salivaricin A (Ross et al (1993) Appl Envir Microbiol 59: 2014). Während jedoch die inhibitorische Aktivität gegen eine Anzahl von Streptokokken-Spezies gezeigt wurde, war die Aktivität eher bakteriostatisch als bakterizid. Salivaricin A und Mikroorganismen, die es herstellen, stellen daher keine komplette Antwort zur Verfügung, um die Streptokokkeninfektionen zu steuern.
Die Antragsteller haben nun ein weiteres antibakterielles Protein von S. salivarius identifiziert. Dieses Protein, von dem die Antragsteller herausgefunden haben, dass es eher eine bakterizide Wirksamkeit hat als eine einfache bakteriostatische, ist der hauptsächliche Schwerpunkt der vorliegenden Erfindung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein antibakterielles Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:3 vorgesehen.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein antibakterielles Protein, welches eine Aminosäuresequenz hat, die sich von der Sequenz von SEQ ID NO:3 durch die Einfügung, die Deletion oder Substitution von ein bis drei Aminosäuren unterscheidet, vorgesehen.
In einem weiteren Aspekt ist eine antibakterielle Zusammensetzung, welche ein Protein der vorliegenden Erfindung oder einen Organismus, der ein Protein der vorliegenden Erfindung exprimiert, beinhaltet, vorgesehen.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine therapeutische Formulierung vorgesehen, welche folgendes umfasst:

(i) ein Protein der vorliegenden Erfindung; oder
(ii) einen Organismus, welcher ein Protein der vorliegenden Erfindung exprimiert, in Kombination mit einem Verdünnungsmittel, Träger und/oder Hilfsstoff.

In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid, welches für ein Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, vorgesehen.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein isolierter Organismus vorgesehen, welcher ein Polynukleotid umfasst, das für ein Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, welches ein antibakterielles Protein entsprechend der vorliegenden Erfindung exprimiert.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Polynukleotid vorgesehen, welches die kodierende Sequenz von SEQ ID NO:2 umfasst.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist weiterhin der S. salivarius-Stamm K12 vorgesehen, hinterlegt bei Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, Hinterlegungsnummer DSM 13084.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist der S. salivarius-Stamm K30 vorgesehen, hinterlegt bei Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, Hinterlegungsnummer DSM 13085.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine therapeutische Formulierung vorgesehen, welche S. alivarius-Stamm K12 oder S. alivarius-Stamm K30 beinhaltet, entsprechend der vorliegenden Erfindung.
Weiterhin ist in einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Proteins, entsprechend der vorliegenden Erfindung, bei der Herstellung einer therapeutischen Formulierung vorgesehen, um wenigstens das Wachstum schädlicher Streptokokkenbakterien in den oberen Luftwegen zu hemmen, wobei die therapeutische Formulierung für die orale Verabreichung formuliert ist.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine therapeutische Formulierung vorgesehen, welche ein antibakterielles Protein, entsprechend der vorliegenden Erfindung, und ein antibakterielles Protein Salivaricin A2 enthält.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine therapeutische Formulierung vorgesehen, welche wenigstens einen S. salivarius-Organismus, der ein antibakterielles Protein entsprechend der vorliegenden Erfindung exprimiert, und wenigstens einen weiteren S. salivarius-Organismus, der ein antibakterielles Protein Salivaricin A2 exprimiert, enthält.
Dementsprechend kann in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung allgemein gesagt werden, dass sie aus einem antibakteriellen Protein besteht, welches von den S. salivarius-Stämmen K12 und K30 isoliert werden kann, das eine Molekularmasse von ungefähr 2733 Da hat, wie durch Ionenspray-Massenspektrometrie bestimmt wurde, und aus der N-terminalen Aminosäuresequenz Gly-Gly-Gly-Val-Ile-Gln oder einem antibakteriellen Fragment oder einer Variante davon besteht, die eine mehr als 80% Aminosäuresequenzhomologie mit dem Protein aufweist.
Das Protein der Erfindung wurde von den Antragstellern „Salivaricin B" genannt, mit den vollständigen Nukleotid- und Aminosäuresequenzen, die in 2 gegeben sind, zusammen mit den Sequenzen von einem Abschnitts des Leitpeptids.
In geeigneter Weise wird Salivaricin B durch Expression einer DNA-Sequenz, die dafür kodiert, in einer Wirtszelle oder durch Kultivieren der Hersteller-Stämme S. salivarius K12 oder K30 erhalten.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine antibakterielle Zusammensetzung bereit, welche ein Protein, wie oben definiert, oder einen Organismus, der ein Protein, wie oben definiert, exprimieren kann, beinhaltet.
In noch einem weiteren Aspekt ist eine therapeutische Formulierung vorgesehen, welche Salivaricin B, wie oben definiert, oder ein antibakterielles Fragment oder eine Variante davon in Kombination mit einem Verdünnungsmittel, Träger und/oder Hilfsstoff umfasst.
In noch einem weiteren Aspekt ist eine therapeutische Formulierung vorgesehen, welche einen Organismus, der in der Lage ist, Salivaricin B, wie oben definiert, zu exprimieren, oder ein antibakterielles Fragment oder eine Variante davon, in Kombination mit einem Verdünnungsmittel, Träger und/oder Hilfsstoff, umfasst.
Vorzugsweise ist der Organismus in der Lage, Salivaricin B alleine oder in Kombination mit einem sekundären antibakteriellen Mittel zu exprimieren.
Mehr bevorzugt ist das sekundäre antibakterielle Mittel ein BLIS; am meisten bevorzugt Salivaricin A2 Die vollständigen Nukleotid- und Aminosäuresequenzen für Salivaricin A2 sind in 3 gegeben, zusammen mit den Sequenzen des Leitpeptids.
In geeigneter Weise ist der Organismus ausgewählt aus den S. salivarius-Stämmen K12 und K30.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegen die therapeutischen Formulierungen in der Form von Nahrungsmitteln oder Getränken vor, am meisten bevorzugt in der Form von Milchprodukt-basierten Nahrungsmitteln oder Getränken.
Alternative Formen sind Medikamente und Süßwaren.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen Organismus bereit, der Salivaricin B exprimiert.
Vorzugsweise ist der Organismus aus den S. salivarius-Stämmen K12 und K30 ausgewählt.
Es sind hier Verfahren zur Behandlung eines Individuums vorgesehen, um wenigstens das Wachstum schädlicher Streptokokkenbakterien in den oberen Luftwegen zu hemmen, das den Schritt der oralen Verabreichung einer effektiven Menge von Salivaricin B an das Individuum umfasst.
Vorzugsweise wird Salivaricin B als Teil einer therapeutischen Zusammensetzung verabreicht.
In geeigneter Weise wird in dem Verfahren die inhibitorische Wirkung durch Besiedeln wenigstens eines Teiles der oberen Luftwege eines Individuums mit einem lebensfähigen, nicht-pathogenen Organismus, der Salivaricin B exprimiert, verursacht.
Vorzugsweise wird der Organismus als Teil eines Nahrungsmittels oder eines Getränkes verabreicht.
Mehr bevorzugt ist der Organismus ein S. salivarius-Stamm, ausgewählt aus den Stämmen K12 und K30.
In noch einer weiteren Ausführungsform beinhaltet das Verfahren einen vorausgehenden Schritt der Vorbehandlung des Individuums, um wenigstens die Bakterienpopulation in den oberen Luftwegen zu reduzieren.
Vorzugsweise umfasst die Vorbehandlung den Schritt der oralen Verabreichung eines Antibiotikums, vorzugsweise Erythromycin, an das Individuum.
In noch einer weiteren Ausführungsform ist ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten gegen Infektionen der oberen Luftwege, die durch Streptokokkenorganismen verursacht werden, vorgesehen, welche die Schritte umfasst:

(i) orale Verabreichung einer Menge eines Antibiotikums an den Patienten, das effektiv ist, um die Anzahl der anwesenden Streptokokken zu reduzieren; und
(ii) Verabreichen von BLIS, das den (die) S. salivarius-Organismus (Organismen) herstellt, an die resultierende bakteriell entsiedelte Umgebung, um die Umgebung wieder neu zu besiedeln.

Obgleich die Erfindung so breit, wie oben beschrieben, ist, wird es von dem Fachmann im Stand der Technik anerkannt werden, dass die Erfindung nicht darauf beschränkt ist, sondern auch Ausführungsformen beinhaltet, von denen die folgende Beschreibung Beispiele gibt, zusammen mit den Aspekten, die in dem angefügten Anspruchsatz vollständig definiert sind.
BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Bezug kann auf die begleitenden Abbildungen gemacht werden, bei denen gilt:
1 zeigt die strukturellen Merkmale von Salivaricin B;
2 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz für Salivaricin B, einschließlich eines Teils des Leitpeptids; und
3 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz für Salivaricin A2, einschließlich des Leitpeptids.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
BLIS (Bakteriozin-artige inhibitorische Substanzen) sind extrazellulär freigesetzte bakterielle Peptide oder Proteine, die in niedrigen Konzentrationen dazu fähig sind, gewisse andere, nahe verwandte Bakterien durch einen Mechanismus zu töten, gegen den die Herstellerzelle einen Grad an spezifischer Immunität aufweist.
Der Begriff Lantibiotikum ist ein Begriff, der von Lanthionin-enthaltenen Antibiotika hergeleitet ist (Schnell et al Nature 333: 276, 1988). Lantibiotika sind eine Kategorie der BLIS. Die Lantibiotika werden ribosomal als Prä-Lantibiotika synthetisiert mit einer N-terminalen Verlängerung (Leitpeptid), die durch ein Prozessierungssenzym während der Bildung der reifen (biologisch aktiven) Form des Moleküls abgespalten wird. Ein charakteristisches Merkmal ist, dass sie polyzyklische Polypeptide sind, die Lanthionin und/oder β-Methyllanthionin, die Thioetherbrücken innerhalb der Peptidkette bilden, enthalten. Eine Klassifizierung der gegenwärtig gemeldeten Lantibiotika in zwei Typen, A und B, wurde von Jung in Angewandte Chemie 30:1051-1192,1991 vorgeschlagen.
Frühere Untersuchungen des Antragstellers machten eine Anzahl von BLIS-produzierenden Stämmen von Streptoccocus salivarius mit einer Aktivität gegen bestimmte andere Streptokokken ausfindig. Die BLIS, von einem einzigen Stamm hergestellt (Stamm 20P3), wurden isoliert, teilweise aufgereinigt und eine vorläufige Charakterisierung durchgeführt. Diese vorläufige Charakterisierung zeigte, dass das hergestellte BLIS ein relativ Hitze-stabiles Protein mit einer molekularen Masse in dem Bereich von 3500 bis 8000 Da war. Dem BLIS wurde der Name SAL 20P3 gegeben.
Nachfolgende Untersuchungen ermittelten die Aminosäuresequenz von SAL 20P3, zusammen mit seiner molekularen Masse. Das spezielle identifizierte Lantibiotikum wurde in Salivaricin A (Ross et al, Appl. Envir. Microbiol 59: 2014) umbenannt.
Das BLIS der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von Salivaricin A. Dieser Unterschied ist sowohl im Hinblick auf seine molekularen Masse (2733 Da verglichen mit 2316 Da für Salivaricin A) als auch im Hinblick auf seine Aminosäuresequenz, wie in 2 gezeigt. Die Salivaricine A und B sind auch unterschiedlich im Hinblick auf ihre inhibitorische Aktivität. Während Salivaricin A sich zeigte, effektiv als ein Bakteriostatikum gegen die meisten Stämme von Streptoccocus pyogenes zu wirken, wurde insbesondere Salivaricin B als bakterizid ermittelt. Noch wichtiger sind bisher keine Stämme von S. pyogenes entdeckt worden, die resistent gegen Salivaricin B sind.
Salivaricin B wird durch die S. salivarius-Stämme K12 und K30 exprimiert. Die S. salivarius-Stämme K12 und K30 wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Deutschland am 8. Oktober 1999 hinterlegt. Dem Stamm K12 wurde die Hinterlegungsnummer DSM 13084 zugeordnet, während dem Stamm K30 die Hinterlegungsnummer DSM 13085 zugeordnet wurden.
Daher ist die Erfindung in einem ersten Aspekt auf das antibakterielle Protein, Salivaricin B, gerichtet. Es werden auch Fragmente oder Varianten von Salivaricin B zur Verfügung gestellt, wenn sie funktionelle Gleichwertigkeit aufweisen.
Es wird weiterhin anerkannt sein, dass Veränderungen an der nativen Aminosäuresequenz sowohl des Proteins als auch deren aktiven Fragmente vorgenommen werden können, während dennoch wenigstens im Wesentlichen ihre biologische Aktivität erhalten bleibt. Derartige Veränderungen an der nativen Aminosäuresequenz, die in der Einfügung, Substitution oder Deletion von ein, zwei oder drei Aminosäuren resultiert, sind besonders innerhalb des Umfanges dieser Erfindung, vorausgesetzt, dass die Proteinvarianten eine Sequenz haben oder umfassen, die mehr als 80% Homologie mit der Aminosäuresequenz des nativen Salivaricin B aufweist.
Es wird natürlich verständlich sein, dass eine Vielzahl von Positionen der Aminosäuren möglich ist, während dieses dennoch erreicht wird. Konservative Substitutionen sind in der Patentliteratur beschriebenen, wie zum Beispiel in den Vereinigten Staaten Patent Nr. 5,264,558 oder 5,487,983 . Es wird daher angenommen, dass zum Beispiel ein Austausch zwischen den nicht-polaren, aliphatischen, neutralen Aminosäuren Glycin, Alanin, Prolin, Valin und Isoleucin möglicherweise durchgeführt werden könnte. Ebenfalls könnten Substitutionen zwischen den polaren, aliphatischen, neutralen Aminosäuren Serin, Threonin, Methionin, Asparagin und Glutamin möglich gemacht werden. Subventionen zwischen den geladenen, sauren Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure könnte möglicherweise durchgeführt werden, wie Substitutionen zwischen den geladenen, basischen Aminosäuren Lysin und Arginin möglich sein könnten. Substitutionen zwischen den aromatischen Aminosäuren, einschließlich Phenylalanin, Histidin, Tryptophan und Tyrosin würde wahrscheinlich auch möglich sein. Diese Art von Substitutionen und Austausche sind dem Fachmann gut bekannt. Andere Substitutionen können gut möglich sein. Natürlich würde auch zu erwarten sein, dass je mehr der Prozentsatz an Homologie, d. h. an Ähnlichkeit mit der Sequenz einer Proteinvariante mit einem natürlich auftretenden Protein, den Grenzwert von 80% überschreitet, desto größer die Aufrechterhaltung der Aktivität ist.
Das Protein und die Fragmente, die hier beschrieben werden, können durch eine Vielzahl von Wegen hergestellt werden. Zum Beispiel durch Isolierung aus einer natürlichen Quelle (wie zum Beispiel den S. salivarius-Stämmen K12 und/oder K30), durch Synthese oder Verwendung irgendwelcher, geeigneter, bekannter Techniken (wie es zum Beispiel für die Synthese von Nisin durch Wakamiya et al., (1991) in „Nisin and Novel Lantibiotics", Hrsg. G. Jung und H. G. Shal, 189-203, Escom, Leiden beschrieben wurde oder durch Festphasensynthese, wie es von Merrifield (1964) J. Am. Chem. Assoc. 85, 2149-2154 beschrieben wurde, oder durch Synthese in homogenen Lösungen, wie es von Houbenwyel (1987), Methods of Organic Chemistry, Bd. I und II beschrieben wurde) oder durch Verwendung rekombinanter DNA-Techniken, wie es von Sambrook et al (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Press, New York, USA, beschrieben wurde.
Die Varianten von sowohl den nativen Proteinen als auch von seinen aktiven Fragmenten können in ähnlicher Weise durch beliebige von jenen, im Stand der Technik bekannten, Techniken hergestellt werden. Varianten können zum Beispiel durch Stellen-spezifische Mutagenese der DNA, die für die natürliche Aminosäuresequenz kodiert, hergestellt werden, wie durch Adelman et al., DNA 2, 183 (1983) beschrieben wurde.
Wenn die rekombinante Methodik verwendet wird, um das BLIS herzustellen, ist es notwendig, in einem ersten Schritte die DNA, die für das erwünschte Produkt kodiert, zu erlangen. Die derartige DNA umfasst auch einen Aspekt der Erfindung.
Die Nukleotidsequenz eines Polynukleotids, das für Salivaricin B kodiert, ist in 2 gezeigt.
Die DNA, die hier erwähnt wird, kann für das native Protein oder ein aktives Fragment davon kodieren.
Die DNA kann zum Beispiel von den S. salivarius-Stämmen K12 und K30 unter Verwendung von Sonden und/oder Amplifizierungsprimern, basiert auf der ermittelten Nukleotidsequenz von Salivaricin B, isoliert werden. Die so identifizierte DNA kann auch in Form von synthetischen Oligonukleotiden hergestellt werden, wenn es die Größe der aktiven Fragmente erlaubt, zum Beispiel unter Verwendung der Phosphotriester-Methode von Matteucci et al. J. Am. Chem. Soc. 103: 3185-3191, 1981. Weiterhin kann die DNA noch unter Verwendung eines geeigneten, kommerziell erhältlichen DNA-Sythesizers, wie zum Beispiel dem Applied Bio Systems-DNA-Synthesizer, hergestellt werden.
Varianten des Proteins und seiner Fragmente, die sich von den nativen Aminosäuresequenzen durch die Einfügung, Substitution oder Deletion von einer oder mehrerer Aminosäuren unterscheiden, sind auch vorgesehen. Wenn solch eine Variante erwünscht ist, wird die Nukleotidsequenz der nativen DNA entsprechend geändert. Diese Änderung kann durch eine wahlweise Synthese der DNA oder durch Modifikation der nativen DNA durch zum Beispiel Stellen-spezifische oder Kassetten-Mutagenese durchgeführt werden.
Wenn Abschnitte der cDNA oder der genomischen DNA Sequenzmodifikationen erfordern, wird die Seiten-spezifische, Primer-ausgerichtete Mutagenese angewendet. Dieses Verfahren ist nun der Standard im Stand der Technik.
Sobald sie gewonnen ist, wird die modifizierte DNA behandelt, damit sie für die Einführung in den entsprechenden Klonierungs- und/oder Expressionsvektor passend ist. Zu diesem Ziel wird die DNA gespalten, Maß geschneidert und, wie erforderlich, religiert.
Die Spaltung wird durch Behandlung mit Restriktionsenzymen in einem geeigneten Puffer durchgeführt. Jede aus der großen Anzahl von kommerziell erhältlichen Restriktionsenzymen kann in der Art und Weise, die von dem Hersteller gefordert wird, verwendet werden. Nach der Spaltung wird die Nukleinsäure zum Beispiel durch Präzipitation mit Ethanol zurück gewonnen.
Das Maßschneidern der gespalten DNA wird unter Verwendung von konventionellen Techniken durchgeführt. Wenn zum Beispiel glatte Enden erforderlich sind, kann die DNA mit der DNA-Polymerase (Klenow) behandelt werden, mit Phenol und Chloroform extrahiert werden und durch Ethanol präzipitiert werden.
Die Religation kann durch Bereitstellen von ungefähr äquimolaren Mengen der erwünschten Komponenten, entsprechend maßgeschneidert für das korrekte Übereinstimmen, und durch eine Behandlung mit einer geeigneten Ligase (z. B. T₄ DNA-Ligase) durchgeführt werden.
Das so erhaltene DNA-Molekül wird in einen Klonierungsvektor an einer Stelle eingeführt, die es erlaubt, dass das Proteinprodukt, für das es kodiert, exprimiert wird.
Geeignete Klonierungsvektoren können entsprechend den gut bekannten Techniken konstruiert werden oder können aus der großen Anzahl von Klonierungsvektoren, die im Stand der Technik erhältlich sind, ausgewählt werden. Während dieser ausgewählte Klonierungsvektor entsprechend der Wirtszelle, die vorgesehen ist, für die Expression der BLIS-kodierenden DNA verwendet zu werden, variieren kann, werden sinnvolle Klonierungsvektoren im allgemeinen die folgenden Eigenschaften haben:

(i) die Fähigkeit, sich selbst zu replizieren;
(ii) den Besitz von einem einzelnen Zielbereich für eine beliebige Restriktionsendonuklease; und
(iii) nach Wunsch Gene für einen einfach auswahlbaren Marker, wie zum Beispiel die Antibiotikaresistenz, zu tragen.

Zwei Haupttypen von Klonierungsvektoren, die die vorher erwähnten Eigenschaften besitzen, sind Plasmide oder bakterielle Viren (Bakteriophagen oder Phagen). Beispiele von geeigneten Klonierungsvektoren beinhalten pUC18, Mp18, Mp19, pBR322, pMB9, ColE1 und pCR1 von E. coli; Plasmide mit breitem Wirtsbereich beinhalten RP4, Phagen DNAs, wie zum Beispiel Lambda und M13 und Shuttle-Vektoren, wie zum Beispiel pSA3 und pAT28.
Für die Expression der BLIS-kodierenden DNA in dem Wirt muss der Klonierungsvektor auch eine Expressionssteuerungssequenz berücksichtigen. Eine typische Expressionssteuerungssequenz kann in Form von fünf Elementen beschrieben werden. In der Reihenfolge, in der sie in dem Gen auftreten, sind die Elemente wie folgt:

(a) die Promoterregion;
(b) der 5'-untranslatierte Bereich (Signal- oder Leitsequenz);
(c) die Protein-kodierende Sequenz;
(d) der 3'-untranslatierte Bereich; und
(e) der Transkriptions-Schlussbereich.

Die Funktion jedes dieser Elemente ist gut verstanden.
Jede beliebigen Sequenzen aus einem großen Bereich von derartigen Steuerungssequenzen können verwendet werden, einschließlich zum Beispiel jene von dem Lipoprotein-Gen, dem β-Galaktosidase-Gen, dem Trypthophan-Gen, dem β-Lactamase-Gen und dem Phagen Lambda.
Als Element (c) wird wie die DNA-Sequenz, die für das Lantibiotikum kodiert, in die Steuerungssequenz des Klonierungsvektors in der oben angegebenen Art eingefügt.
Ein geeigneter Wirt, in den der Klonierungsvektor eingeführt werden soll, wird dann ausgewählt. Möglicherweise nützliche Wirte umfassen Bakterien-, Hefen-, Pilz-, Insekten-, Tier- und Pflanzenzellen. Prokaryontische Wirte sind im Allgemeinen für die vorliegende Erfindung bevorzugt. Bakterielle Wirte, die keine Krankheit verursachen, sind besonders geeignet.
Bakterielle Wirte werden im Allgemeinen von den Gram-positiven Bakterien ausgewählt. Streptoccocus-Wirte sind für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt.
Wie eingesehen wird, werden in dem ausgewählten Wirtssystem Plasmidvektoren, die Replikationsstellen und Steuerungssequenzen, abgeleitet von einer Spezies, die mit dem Wirt kompatibel ist, enthalten, verwendet.
Der Klonierungsvektor, der wie oben beschrieben gebildet ist, wird verwendet, um den ausgewählten Wirt zu transformieren, indem Techniken verwendet werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind, zum Beispiel die Calciumchlorid-Behandlung, wie sie durch Cohen, S. N. Proc. Nat. Acad. Sci. 69, 2110, 1972, beschrieben wird.
Nach der Transformation des ausgewählten Wirts mit dem Klonierungsvektor kann das Protein oder das kodierte Fragment, möglicherweise als ein Fusionsprotein, durch Kultivierung der Wirtszellen hergestellt werden. Das exogene Proteinprodukt oder Fragment wird dann unter Verwendung von Routineverfahren, einschließlich der Ammoniumsulfatpräzipitation, der Säulenchromatographie (z. B. Innenaustausch, Gelfiltration, Affinitätschromatographie, usw.), der Elektrophorese und zuletzt der Kristallisation (siehe im allgemeinen „Enzyme Purification and Related Techniques". Methods in Enzymology, 22, 233-577 (1971)) isoliert. Die Aufreinigung wird, wie es erforderlich ist, unter Verwendung von konventionellen Techniken durchgeführt.
Wenn die rekombinante Methodik verwendet wird, kann die DNA, die hier erwähnt ist, auch für ein Fusionsprotein kodieren, das das antibakterielle Protein oder Fragment und ein Vektorprotein umfasst, um die Isolierung und Aufreinigung zu unterstützen. Im Allgemeinen kann dieses Vektorprotein chemisch oder enzymatisch von dem antibakteriellen Protein oder Fragment entsprechend den bekannten Techniken gespalten werden.
Eine spezielle chimärische Form des Proteins könnte auch eine Anwendung haben. Eine DNA-Sequenz, die für jedes gesamte Protein oder ein Abschnitt des Proteins kodiert, könnte zum Beispiel mit einer Sequenz, die für ein anderes BLIS, wie zum Beispiel Salivaricin A2, kodiert, verbunden werden, so dass die Expression der DANN-Sequenz ein chimärisches Protein mit einem erweiterten Spektrum von antibakterieller Aktivität herstellt.
Sobald das Protein aufgereinigt ist, ist es dann für die Verwendung verfügbar. Derartige Verwendungen beinhalten im Allgemeinen antibakterielle Mittel (z. B. als Konservierungsstoffe in Nahrungsmitteln) sowie therapeutische Mittel. In diesem Zusammenhang ist es einsichtig, dass der Begriff „therapeutisch" eine prophylaktische Behandlung beinhaltet.
Aus diesem Grunde ist die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt auf therapeutische Formulierungen gerichtet, die für die Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung von mikrobiellen Infektionen, insbesondere Streptokokkeninfektionen, geeignet sind. Die Formulierungen sind besonders geeignet für die Verwendung gegen S. pyogenes und S. sobrinus. Die therapeutischen Formulierungen umfassen Salivaricin B oder ein Fragment oder eine Variante davon in Kombination mit einem Verdünnungsmittel, Träger oder Hilfsstoff dafür, wie es zum Beispiel im Stand der Technik bekannt ist. Beispiele für therapeutische Formulierungen, in denen Salivaricin B verwendet werden kann, beinhalten alle oral verabreichbaren Medikamente, wie zum Beispiel Kapseln, Lutschpastillen, Sirupe, Mundspülungen, Gurgellösungen, Zahnpastas und Mundsprays, sind aber nicht darauf begrenzt. Weitere Beispiele beinhalten topisch verabreichbare Formulierungen, wie zum Beispiel Feuchtigkeitscremes und Kosmetika, um das bakterielle Wachstum auf der Haut zu bekämpfen.
In einem weiteren Aspekt ist eine therapeutische Formulierung vorgesehen, die einen lebensfähigen Organismus umfasst, der keine Krankheit verursacht und der fähig ist, die oberen Luftwege oder einen Teil davon zu besiedeln und das Lantibiotikum der Erfindung zu exprimieren, in Kombination mit einem Verdünnungsmittel, Träger und/oder Hilfsstoff.
In einer Ausführungsform ist der Organismus ein transformierter Wirtsorganismus, der in Übereinstimmung mit der Erfindung hergestellt worden ist. Es ist jedoch bevorzugt, dass der Organismus einer ist, der Salivaricin B als ein natives Produkt herstellt. Beispiele für derartige Organismen sind die S. salivarius-Stämme K12 und K30.
Bei den S. salivarius-Stämmen K12 und K30 ist festgestellt worden, dass sie nicht nur Salivaricin B, sondern auch Salivaricin A2 exprimieren. Salivaricin A2 ist verwandt, aber nicht identisch mit Salivaricin A. Die vollständigen Frequenzen (Polynukleotide und Aminosäuren) für Salivaricin A2 sind in der 3 gezeigt.
In dieser Ausführungsform ist es bevorzugt, dass die therapeutischen Formulierungen der Erfindung in der Form von einem Nahrungsmittel, einer Süßware oder einem Getränk vorliegen. Es ist besonders bevorzugt, dass das Nahrungsmittel oder Getränke ein auf einem Milchprodukt basierendes Nahrungsmittel oder Getränk ist, einschließlich zum Beispiel Joghurt, Käse, Milch, Milchbrötchen und aromatisierte Milch. In dem Fall einer Süßware kann die therapeutische Formulierung ein Kaugummi sein, wie zum Beispiel ein Kaugummi, wie es in WO 00/05972 beschrieben ist.
Eine besonders bevorzugte Formulierung liegt vor, wenn gefriergetrocknete Stämme von Salivaricin B-herstellendem S. salivarius in den Milchpulverformulierungen aufgenommen sind, in einer Art und Weise ähnlich zu der, die vorher für die Zubereitung von Bifidus-Milchpulver (Nagawa et al (1988); J Dairy Sci 71: 1777-1782) berichtet wurde.
Verschiedene Aspekte der Erfindung werden nun in einer nicht-einschränkenden Weise in Bezugnahme auf den nachfolgenden experimentellen Abschnitt verdeutlicht werden.
Experimenteller Teil
Extraktion von Salivaricin
Salivaricin B wurde von ausgesäten Kulturen der Teststämme S. salivarius K12 und K30 aufgereinigt, die für 18 Stunden bei 30°C in einer 5% Kohlendioxid-in-Luft Atmosphäre in M17-Medium wuchsen, das mit 0,5% Davis-Agar, 0,5% Saccharose, 0,5% humanem Plasma und 0,1% Calciumcarbonat supplementiert war. Die ausgesäten Kulturen wurden durch Betupfen der Oberfläche des Agar-Mediums mit einer 18-stündigen Todd Hewitt-Nährkultur des Herstellerstammes inokuliert (angeimpft). Die Extraktion der Salivaricin B-Aktivität wird durch Einfrieren der Agarplatten bei –70°C und dann durch Auftauen bei Raumtemperatur, um das Agargel zu kollabieren, erreicht, gefolgt von einer Zentrifugation, um die extrahierte Flüssigkeit zu klären. Der Titer der inhibitorischen Aktivität in diesen Gefrieren/Auftauen-Extrakten ist im Allgemeinen 2-4 AU/ml.
Titration der Salivaricinaktivität
Die Salivaricinaktivität wird unter Verwendung eines Agar-Oberflächentestverfahrens titiriert. Tropfen (20ml) einer zweifachen Verdünnung einer Kochsalzlösung der Probe werden gegen Microccocus luteus T-18 auf einer Columbia-Agarbasis getestet. Der reziproke Wert der höchsten Verdünnung ist der Titer in freigewählten Einheiten pro ml (Au/ml) der Salivaricinaktivität, um einen definierten Inhibitionsbereich des Wachstums des ausgesäten Indikatorrasens herzustellen.
Aufreinigung von Salivaricin B
Ein Volumen von zwei Litern des Gefrieren/Auftauen-Extraktes wurde auf eine XAD-2-Säule (Durchmesser 5,0 cm, Bettvolumen. 150 ml; Serva) aufgetragen und mit 7 Bettvolumina an 50 % (v/v) Methanol gewaschen. Die Salivaricinaktivität wurde mit 5 Bettvolumina an 90% (v/v) Methanol (mit 11,6 M CH1 auf einen pH 2 adjustiert) eluiert und durch Verdampfung bei 50°C unter reduziertem Druck konzentriert. Aliquote Teile (1ml) dieses Material wurden auf eine Brownlee C8-reverse Phase-Säule (Aquapore RP 300; Porengröße 7μm; 30 × 4,6 mm; Applied Biosystems, Inc.) aufgetragen, mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) equilibriert. Die Fraktionierung dieses Materials wird unter Verwendung des Systems von Pharmacia der Schnellen-Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) bei einer Flussrate von einem ml pro Minute erreicht, unter Verwendung eines 10-Minuten-Gradienten (0 bis 28% Acetonitril, das 0,085% TFA enthält), gefolgt von einer 80 minütigen, isokratischen (28% Acetonitril) Elution. Während dieser isokratischen Elution wird eine Phasentrennung von Salivaricin A (die Elution startet ungefähr nach 40 Minuten) und Salivaricin B (wird ungefähr nach 60 Minuten gestartet) erreicht. Jede 1-ml-Fraktion wurde auf inhibitorische Aktivität gegen M. luteus T18 getestet. Die aktiven Fraktionen in jedem Bereich, die zu Salivaricin A und Salivaricin B korrespondieren, wurden separat als teilweise aufgereinigte Präparationen des Bakteriozins vereinigt. Jeder Pool (Vereinigung) wurde lyophilisiert und dann in 0,1% TFA aufgelöst. Aliquote Teile von jedem dieser Präparationen wurden dann auf eine C₁₈-reverse Phase Hochleistungsflüssigkeitschromatographie(HPLC)-Säule (Alltech Nucleosil C₁₈; 10 μm; 250,0 × 4,6 mm) aufgetragen, mit 0,1% TFA equilibriert und unter Verwendung eines HPLC-Sytems von Waters/Millipore durch Anwendung geeigneter Gradienten von Acetonitril weiterhin fraktioniert.
Salivaricin A2 wurde als ein homogener Peak mit 34-35% Acetonitril und Salivaricin B mit 38-40% Acetonitril eluiert. Eine Absorption wurde bei 214 mm beobachtet und Fraktionen, die den verschiedenen Peaks entsprachen, wurden manuell gesammelt. Eine inhibitorische Aktivität wurde mit Hilfe eines Spot-Diffusionstests, unter Verwendung von M luteus T-18 als Indikator, nachgewiesen. Die aktiven Fraktionen von jedem Lauf wurden vereinigt, lyophilisiert und in 1 ml Wasser, das Milli Q^TM gereinigt war und 0,1% TFA enthält, wieder aufgelöst. Die Fraktionen, die eine inhibitorische Aktivität (gereinigtes Salivaricin) enthielten, wurden gereinigt und bei –20°C gelagert.
Die Innenspray-Massenspektroskopie zeigte, dass die molekulare Masse von Salivaricin B 2733 Da betrug. Eine Edman-Analyse des aufgereinigten Salivaricin B offenbarte die N-terminale Sequenz Gly-Gly-Gly-Val-Ile-Gln.
Klonierung von Salivaricin B
Die Aminosäuresequenz, die nach Aufreinigung und Sequenzierung des Peptides erhalten wurde, ermöglichte den Aufbau von degenerierten Oligonukleotid-DNA-Sonden, basiert auf dem universellen Kodon-Gebrauch. Die spezifische Sonde, die verwendet wurde (CF481), basierte auf der Aminosäuresequenz S W Q F L F T. Die korrespondierende Nukleotidsequenz war TCNTGGCAATTTTTRTTTACT.
Chromosomale DNA wurde von dem Streptoccocus salivarius-Stamm Min5 nach dem Verfahren von Spanier und Cleavy (1983), Virology 130: 514-522, isoliert. Eine Verdauung unter Verwendung beider Restriktionsenzyme EcoR I und Hind III wurde durchgeführt, und die gespaltene DNA wurde in einem 1%-Agarosegel, das bei 40 V/cm für 18 Stunden lief (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 1989), aufgetrennt. Die DNA wurde auf eine Nylonmembran durch Southern-blotting transferiert, wobei den Instruktionen zur Verwendung von Hybond-N+ (Amersham Pharmacia) gefolgt wurde. Die Sonde CF481 wurde mit Gamma-P³²-ATP, unter Verwendung der T4-Polynukleotidkinase, markiert. Die Hybridisierung mit der Sonde CF481 wurde in einer Hybridisierungsröhre bei 38°C für 18 Stunden durchgeführt. Die Membran wurde zweimal für 5 Minuten in 5 × SSC, 0,5% SDS und dann zweimal für 20 Minuten in 2 × SSC, 0,2% SDS gewaschen. Die Membran wurde dann auf einem Röntgenfilm bei –70°C für 18 Stunden belichtet.
Die Fläche auf dem Gel, die mit der Hybridisierungsstelle der CF481 auf dem Southernblot korrespondierte, wurde aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA unter Verwendung eines QIAquick-Gelextraktionskits von Qiagen extrahiert. Für die Ligation wurde 1 μl des Vektors pUC 19, der mit den Restriktionsenzymen EcoR I und Hind III gespalten war, mit 15 μl der aufgereinigten Min5-DNA-Fragmente, 2 μl Ligationspuffer und 1 μl T4-DNA-Ligase (Roche) gemischt. Es wurde eine Inkubation für 18 Stunden bei 15°C durchgeführt.
Der E. coli-Stamm DH10β wurde für die Transformation mit dem ligierten pUC 19 mit Hilfe der Elektroporation verwendet. Die transformierten Zellen wurden für 1 Stunde in 1 ml Luria-Nährmedium wachsen gelassen und dann auf Luria-Nährmedium-Agar mit hinzugefügtem Ampicillin (100 ml/ml) und X-gal 20 mg/ml plattiert. Nach einer Übernacht-Inkubation bei 37°C wurden weiße Kolonien ausgewählt, subkultiviert und mit der Sonde CF481 überprüft. Das Überprüfen wurde durch Lysieren der E. coli-Kolonien in einer 5% SDS 10% Glycerinlösung bei 75°C für 30 Minuten durchgeführt. Die Kolonien wurden dann auf einem Agarosegel laufen gelassen, Southern-blot behandelt und die Membran mit der Sonde CF481 in der gleichen Art und Weise, wie oben beschrieben, hybridisiert. Positive Kolonien wurden dann unter Schütteln in Luria-Nährlösung mit 100 μl/ml Ampicillin für 18 Stunden bei 30°C wachsen gelassen. Das pUC-Plasmid wurde dann unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep-Kits (Qiagen) extrahiert und unter Verwendung von pUC 19 Vorwärts- und Rückwärtsprimern sequenziert.
Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
Antibakterielle Aktivität von Salivaricin B
Teil 1
Die Stämme von S. salivarius, wie zum Beispiel 20P3 und 5, die Salivaricin A (aber nicht Salivaricin B) herstellen, inhibieren alle 9 Standardindikatorbakterien außer Indikator 3. Dieses Muster der Inhibierung ist in kodierter Form als Produktionstyp (P) 677 bekannt. Im Gegensatz dazu inhibieren die Stämme K12 und K30, die sowohl Salivaricin A2 als auch Salivaricin B herstellen, das Wachstum von allen 9 Standardindikatoren, die Aktivität bezieht sich auf den P-typ 777. Der P-Typisierungstest umfasst zuerst das Wachsen des Teststammes auf Blutagar als eine diametrische Ausstrichkultur. Nach Entfernung dieses Wachstum, wird die Agaroberfläche mit Chloroformdampf sterilisiert, belüftet und die 9 Standardindikatorbakterien (einschließlich 4 Stämmen des Streptoccocus pyogenes) werden kreuzweise über die Linie des ursprünglichen Teststamm-Inokulums ausgestrichen. Im Anschluss an eine Inkubation wird die Beeinflussung des Wachstums der Indikatoren in der Nachbarschaft des ursprünglichen Ausstrichs des Herstellers als ein Zeichen der Bakteriozin-Aktivität gesehen. In dem Fall der Stämme 20P3 und 5 (Hersteller von Salivaricin A) erweist sich die inhibitorische Aktivität als bakteriostatisch, d. h. lebensfähige Indikatorzellen können in einer großen Anzahl aus der Inhibierungszone durch Probenentnahme mit einem Tupfer und Übertragung der Zellen in ein frisches (nicht Bakteriozin enthaltendes) Agarmedium wiedererlangt werden. Im Gegensatz dazu ist der Effekt der P-typ 777-Stämme (von den gezeigt wurde, dass sie auch Salivaricin B herstellen) bakterizid gegenüber dem Standardindikatoren, d. h. es können keine lebensfähigen Zellen aus der Inhibierungszone in verzögerte Antagonismustestverfahren wiedererlangt werden. Weiterhin haben Testverfahren, die aufgereinigte Präparationen von Salivaricin A und Salivaricin b (Daten nicht gezeigt) verwendeten, bestätigt, dass die Einwirkung von Salivaricin A gegenüber S. pyogenes bakteriostatisch ist, während die von Salivaricin B bakterizid ist.
Teil 2
Die inhibitorische Aktivität der Salivaricine wurde durch Messung der Abnahme mit der Zeit der Anzahl der Kolonie-bildenden-Einheiten (CFU) einer Suspension des empfindlichen Indikators Streptococcus (Streptococcus pygenes-Stamm FF22) nach dem Mischen der Zellen mit einer Salivaricinpräparation bestimmt. Zweimal gewaschene Zellen einer exponentiellen Todd Hewitt-Nährkultur des Indikators Streptococcus wurden in 0,067 M Phosphatpuffer (pH 6,5) des ursprünglichen Kulturvolumens resuspendiert. Portionen von teilweise aufgereinigtem Salivaricin (Titer 16 Au/ml) oder von Phosphatpuffer (Kontrolle) wurden dann mit einen gleichen Volumen der gewaschen Zelluspension gemischt und eine Inkubation wurde bei dem 37°C fortgeführt. In Intervallen wurden die überlebenden Stämme bestimmt, indem geeignete 10-fache Verdünnungen (in kalter Todd Hewitt-Nährlösung) der Test- und Kontrollmischungen auf eine Columbia-Agarbasis plattiert wurden und bei 24°C für 24 h inkubiert wurden. Die Anzahl der lebensfähigen Stämme wurde als die Gesamtanzahl der CFU pro ml exprimiert.
Es zeigte sich, dass die Präparationen des teilweise aufgereinigten Salivaricin B von dem Titer 16 für über 99% der CFU der exponentiellen Todd Hewitt-Nährkulturen des S. pyogenes-Stamms FF22 nach 4 h bei 37°C lethal war. Im Gegensatz dazu tötete die teilweise aufgereinigten Präparation von Salivaricin A2 des Titers 16, wenn sie unter Verwendung der gleichen Bedingungen getestet wurde, weniger als 10% des Stamms der FF22-Zellen. Weitere Testverfahren der inhibitorischen Spektren der teilweise aufgereinigten Salivaricin A2 und Salivaricin B Präparationen wurde unter Verwendung des Agaroberflächentestverfahrens, wie oben beschrieben, durchgeführt. Tropfen (20 μl) einer Präparation des Titers 16 Ua/ml wurden auf Rasenkulturen der Teststämme, die frisch inokuliert worden waren durch Betupfen der Oberfläche einer Columbia Agarbasisplatte mit einer 1/100-Verdünnung einer 18 h-Todd Hewitt Nährkultur jenes Stammes in einer Kochsalzlösung, gespotted. Die Herstellung einer definierten Zone von inhibiertem Wachstum des Teststammes nach Inkubation dieser Platten bei 97°C für 18 h, wurde als Anzeige für die Sensitivität dieses Stammes gegenüber Salivaricin angesehen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1: Inhibitorische Aktivität

Spezies	Getestete Anzahl	Sensitiv zu Sal A2	Sensitiv zu Sal B
Streptococcus pyogenes	15	15	15
Streptococcus equisimilis	5	5	5
Streptococcus agalactiae	5	0	2
Streptococcus pneumoniae	4	1	2
Streptococcus sanguis	6	0	6
Streptococcus mutans	6	0	0
Streptococcus sobrinus	4	0	3
Corynebacterium diphteriae	4	0	4
Lactobacillus casei	2	1	2
Stomatococcus mucilagenosus	4	0	3
Staphyloccocus aureus	4	0	0
Branhamella catarrhalis	1	0	1
Escherichia coli	2	0	0

Industrielle Anwendung
Die obigen Resultate zeigen den inhibitorischen und bakteriziden Effekt von Salivaricin B und Organismen, die dieses BLIS herstellen. Salivaricin B und/oder Organismen, die es herstellen, sind daher einsetzbar im Verfahren zur Behandlung von Individuen gegen die schädlichen Wirkungen von Streptokokkeninfektionen in den oberen Luftwegen, einschließlich des Mundes. Diese Verfahren umfassen Verfahren zur Behandlung von Beschwerden, wie zum Beispiel Halsentzündungen durch Streptokokken (hauptsächlich durch S. pyogenes verursacht) und Zahnkaries (teilweise durch S. sobrinus verursacht).
Die gegenwärtig bevorzugten oral verabreichbaren Formulierungen sind Mischungen der gefriergetrockneten S. salivarius-Stämme mit Magermilchpulver oder ähnlichem, das aromatisiert wurde, um die Schmackhaftigkeit zu verbessern.
Es gibt Indikationen bis dato, dass derartige Formulierungen effektiv sind, wenn sie durch Hinzufügung von Wasser wiederhergestellt werden und in kleinen Schlückchen bei drei bis vier Gelegenheiten während des Tagesablaufs getrunken werden, derart, dass eine Gesamtheit von 50 mls des aromatisierte Produktes konsumiert wird (das ungefähr 2 × 107 Zellen/ml des/der gefriergetrockneten S. salivarius-Organsimus/Organismen enthält).
Wenn die gefriergetrockneten S. salivarius-Stämme von K12 und K30 ausgewählt wurden, gibt es den zusätzlichen Vorteil, dass Salivaricin B zusammen mit Salivaricin A2 exprimiert wird. Die Co-expression dieser zwei BLIS macht die Formulierung besonders bakterizid in Bezug auf S. pyogenes und S. sobrinus, sowie in Bezug auf eine Anzahl von anderen Bakterien.
SEQUENZLISTE

Claims

Antibakterielles Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:3.
Antibakterielles Protein, welches eine Aminosäuresequenz hat, die sich von der Sequenz von SEQ ID NO:3 durch die Einfügung, Deletion oder Substitution von ein bis drei Aminosäuren unterscheidet.
Protein nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, welches bakterizid ist.
Protein nach Anspruch 3, welches bezüglich Streptococcus pyogenes bakterizid ist.
Antibakterielle Zusammensetzung, welche ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einen Organismus, der ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 exprimiert, beinhaltet.
Therapeutische Formulierung, welche folgendes umfaßt: (i) ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder (ii) einen Organismus, welcher ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 exprimiert, in Kombination mit einem Verdünnungsmittel, Träger und/oder Hilfsstoff.
Therapeutische Formulierung nach Anspruch 6, welche ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in Kombination mit einem Verdünnungsmittel, Träger und/oder Hilfsstoff umfaßt.
Therapeutische Formulierung nach Anspruch 6, welche einen Organismus, der ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 exprimiert, in Kombination mit einem Verdünnungsmittel, Träger und/oder Hilfsstoff umfaßt.
Therapeutische Formulierung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, welche ein oral verabreichbares Medikament ist.
Medikament nach Anspruch 9, welches ein Sirup, eine Mundspülung, eine Gurgellösung, eine Zahnpasta oder ein Mundspray ist.
Medikament nach Anspruch 9, welches in Form einer Dosierungseinheit vorliegt.
Medikament nach Anspruch 10, welches eine Lutschpastille oder eine Kapsel ist, die eine Dosierungseinheit eines Organismus, der ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 exprimiert, enthält.
Therapeutische Formulierung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei das Protein oder der Organismus in einem Nahrungsmittel oder einem Getränk enthalten ist.
Formulierung nach Anspruch 13, wobei das Nahrungsmittel oder das Getränk ein auf einem Milchprodukt basierendes Nahrungsmittel oder Getränk ist.
Formulierung nach Anspruch 14, wobei das Protein oder der Organismus in Milchpulver, Milchbrötchen, Milch, Joghurt oder Käse enthalten ist.
Formulierung nach Anspruch 14, wobei das Protein oder der Organismus in einer aromatisierten Milch enthalten ist.
Therapeutische Formulierung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei das Protein oder der Organismus in einer Süßware enthalten ist.
Formulierung nach Anspruch 17, wobei die Süßware ein Kaugummi ist.
Therapeutische Formulierung nach einem der Ansprüche 7 bis 18, welche weiterhin ein oder mehrere sekundäre antibakterielle Mittel umfaßt.
Therapeutische Formulierung nach Anspruch 19, wobei das sekundäre antibakterielle Mittel (die sekundären antibakteriellen Mittel) unter (einer) Bacteriocin-artigen inhibitorischen Substanz(en) (BLIS) ausgewählt ist bzw. sind.
Therapeutische Formulierung nach Anspruch 18, welche weiterhin Salivaricin A und/oder einen Organismus, der Salivaricin A exprimieren kann, und/oder Salivaricin A2 und/oder einen Organismus, der Salivaricin A2 exprimieren kann, enthält.
Polynukleotid, welches ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert.
Polynukleotid, welches die codierende Sequenz von SEQ ID NO:2 umfaßt.
Isolierter Organismus, welcher ein Polynukleotid nach Anspruch 22 oder Anspruch 23 umfaßt und ein antibakterielles Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 exprimiert.
Organismus nach Anspruch 24, wobei das Polynukleotid heterolog ist.
Organismus nach Anspruch 24, welcher ein S. salivarius-Organismus ist.
S. salivarius-Stamm K12, hinterlegt bei Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, Hinterlegungsnummer DSM 13084.
S. salivarius-Stamm K30, hinterlegt bei Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, Hinterlegungsnummer DSM 13085.
Therapeutische Formulierung, welche S. salivarius-Stamm K12 oder S. salivarius-Stamm K30 beinhaltet, wie sie in Anspruch 27 oder Anspruch 28 identifiziert sind.
Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4 bei der Herstellung einer therapeutischen Formulierung, um wenigstens das Wachstum schädlicher Streptokokken-Bakterien in den oberen Luftwegen zu hemmen, wobei die therapeutische Formulierung für die orale Verabreichung formuliert ist.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei die therapeutische Formulierung eine therapeutische Formulierung nach einem der Ansprüche 6 bis 21 und 29 ist.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei die inhibitorische Wirkung durch Besiedeln wenigstens eines Teils der oberen Luftwege eines Individuums mit einem lebensfähigen Organismus, der das Protein exprimiert, herbeigeführt wird.
Verwendung nach Anspruch 32, wobei der Organismus Teil eines Medikaments, eines Nahrungsmittels, eines Getränks oder einer Süßware ist.
Verwendung nach Anspruch 32 oder Anspruch 33, wobei der Organismus ein S. salivarius-Stamm, ausgewählt unter den Stämmen K12 und K30, ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 30 bis 34, wobei das Individuum vorbehandelt wurde, um wenigstens die Bakterienpopulation in den oberen Luftwegen zu reduzieren.
Verwendung nach Anspruch 35, wobei die Vorbehandlung die Stufe umfaßt, bei der man dem Individuum oral ein Antibiotikum verabreicht.
Therapeutische Formulierung, welche ein antibakterielles Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und ein antibakterielles Protein Salivaricin A2 enthält.
Therapeutische Formulierung, welche wenigstens einen S. salivarius-Organismus, der ein antibakterielles Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 exprimiert, und wenigstens einen weiteren S. salivarius-Organismus, der ein antibakterielles Protein Salivaricin A2 exprimiert, enthält.