DE19532001A1 - Neues Peptid, Antibakterielles Agens, neues Peptidgen, neue Rekombinante DNA und Verfahren zur Herstellung des neuen Peptids - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Peptid, das in der Seiden­ spinner-Hämolymphe vorkommt, in der eine antibakterielle Aktivität induziert worden war, ferner ein das Peptid als aktive Komponente enthaltendes antibakterielle Agens, ein neues das Peptid codierende Peptidgen, eine neue das Gen umfassende rekombinante DNA und ein Verfahren zur Herstel­ lung des neuen Peptids.

Wenn Bakterien in die Körperhöhle (Coelum) eines Insekts eindringen, wird in der Hämolymphe des Insekts als eine der biologischen Abwehrreaktionen ein antibakterielles Protein oder Peptid induziert. Als antibakterielle aus der Hämolym­ phe eines Seidenspinners erhältliche Proteine oder Peptide sind Lysozym, Cecropine u.ä. bekannt. Lysozym weist jedoch nur gegen eine äußerst begrenzte Gruppe von gram-positiven Bakterien wie Micrococcus eine antibakterielle Aktivität auf. Ceropine zeigen andererseits zwar eine antibakterielle Aktivität gegen verschiedene gram-negative und gram-positive Bakterien, es gibt aber das Problem, daß sie keine wirksame antibakterielle Aktivität gegen nahrungsmittelvergiftende pathogene Bakterien wie Staphylococcus aureus und Bacillus cereus zeigen.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein neues Peptid und ein dieses Peptid umfassendes antibakteri­ elles Agens bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe der vor­ liegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines gen­ technologischen Verfahrens zur wirksamen Herstellung des Peptids.

Den Erfindern ist es gelungen, aus der Hämolymphe eines Sei­ denspinners, in der eine antibakterielle Aktivität induziert worden war, ein neues antibakterielles Peptid zu isolieren, das eine ausgezeichnete antibakterielle Aktivität gegen Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus u.ä. zeigt. Ferner haben die Erfinder ein Verfahren zur wirksamen Herstellung des neuen Peptids unter Anwendung gen­ technologischer Methoden etabliert. Auf diese Weise wurde die vorliegende Erfindung fertiggestellt.

Die vorliegende Erfindung stellt bereit:

• (1) Ein neues Peptid, das (a) durch die in SEQ ID NO: beschriebene Sequenz oder (b) durch eine zu (a) ho­ mologe Aminosäuresequenz repräsentiert wird, die aber Zusätze, Deletionen oder Austausche einer oder mehrerer Aminosäurereste in der SEQ ID NO:1 enthält und eine antibakterielle Aktivität zeigt.
• (2) Ein antibakterielles Agens, das das Peptid von (1) als einen aktiven Bestandteil enthält.
• (3) Ein neues Peptidgen, das entweder (a) die in SEQ ID NO:1 beschriebene Aminosäuresequenz oder (b) eine zu (a) homologe Aminosäuresequenz codiert, die aber Zusätze, Deletionen oder Austausche einer oder mehrerer Aminosäurereste der SEQ ID NO:1 Sequenz enthält und eine antibakterielle Aktivität zeigt.
• (4) Eine neue rekombinante DNA, die durch Inserieren des Peptidgens von (3) in eine Vektor-DNA erhalten wird.
• (5) Verfahren zur Herstellung eines neuen Peptids, das das Züchten eines zur Gattung Escherichia gehören­ den, die rekombinante DNA von (4) enthaltenden Bak­ teriums in einem Medium und die Gewinnung des Pep­ tids aus der Kultur umfaßt.

Das neue erfindungsgemäße Protein (nachstehend mit "Moricin" bezeichnet) läßt sich z. B. aus der Hämolymphe eines Seiden­ spinners, in der eine antibakterielle Aktivität induziert worden war, nach herkömmlichen Verfahren der Proteinisolie­ rung herstellen. Alternativ kann Moricin durch herkömmliche Peptidsynthese-Verfahren oder mit Hilfe von gentechnologi­ schen Verfahren hergestellt werden.

In Hinsicht auf die gentechnologischen Verfahren kann man zur Herstellung eines neuen Proteins z. B. ein Verfahren ver­ wenden, bei dem man eine Wirtszelle verwendet, die mit einer rekombinanten DNA, in die ein neues Peptidgen inseriert wor­ den war, transformiert oder transduziert ist. Dabei kann Mo­ ricin exprimiert werden in z. B. Prokaryonten wie E. coli, Bacillus subtilis, Actinoinycetes, etc., oder in Eukaryonten wie Tier-, Pflanzen-, Insekten- oder Hefezellen. Ein anderes Beispiel zur Produktion von Moricin ist die Möglichkeit, re­ kombinante DNA in einem zellfreien Proteinsynthesesystem (Kaninchen-Retikulocyten, Weizenkeimsystem u. ä.) zu translatieren.

Nachfolgend wird das Verfahren zur Moricinisolierung aus der Hämolymphe des Seidenspinners, in der eine antibakterielle Aktivität induziert worden war, und das Verfahren zur Her­ stellung von Moricin mit gentechnologischen Methoden im De­ tail beschrieben.

[1] Verfahren zum Isolieren von Moricin aus der Seidenspinner-Hämolymphe, in der eine antibakterielle Aktivität induziert worden war

Als Ausgangsmaterial zur Gewinnung von Moricin kann man jede Seidenspinner-Hämolymphe, in der eine antibakterielle Akti­ vität induziert worden war, verwenden. Zur Induktion einer antibakteriellen Aktivität kann man z. B. ein Verfahren an­ wenden, bei dem eine Suspension von E.coli in physiologi­ scher Kochsalzlösung in die Körperhöhle einer Seidenspinner­ larve injiziert wird.

Achtzehn bis vierundzwanzig Stunden nach Induktion einer an­ tibakteriellen Aktivität werden zur Gewinnung der Hämolymphe die Beine der Seidenspinnerlarven abgeschnitten. Nach dem Erhitzen wird diese Hämolymphe zentrifugiert und ein Über­ stand erhalten.

Der so erhaltene Überstand wird dann einem Aussalzungs­ schritt unterworfen. Als Beispiele für die zum Aussalzen verwendeten Salze lassen sich Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Magnesiumsulfat u.ä. aufzählen. Mit diesen Salzen wird der Überstand auf eine Konzentration von 15 bis 75% der Sätti­ gung gebracht, und das resultierende Präzipitat wird gewon­ nen.

Danach wird das Präzipitat in destilliertem Wasser, einem Ammoniumacetat enthaltenden Puffer etc. gelöst und einer Gelfiltration unterworfen. Durch dieses Vorgehen erreicht man das Fraktionieren und Entsalzen von Proteinen. Das Gel­ filtrationsmedium kann irgendein in der herkömmlichen Gel­ filtration verwendetes Medium sein. Man kann z. B. Sephadex G-50, G-75 und G-100 (Pharmacia Fine Chemical) oder Toyo­ pearl HW-55 (Tosoh Corp.) verwenden.

Dann werden die durch die Gelfiltration erhaltenen Fraktio­ nen mit Proteinen niederen Molekulargewichts einer Säulen­ chromatographie an einem Kationenaustauscher unterworfen. Als Kationenaustauscher kann man z. B. CM-Sepharose FF (Pharmacia Fine Chemical) und CM-Toyopearl 650 (Tosoh Corp.) verwenden. Unter denen an den Kationenaustauscher in der Säule adsorbierten Fraktionen wird die Fraktion, die die höchste antibakterielle Aktivität zeigt, einer Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie, bei der eine Revers­ phasen-Säule verwendet wird (nachstehend mit "Reversphasen- HPLC" bezeichnet), unterworfen. Als Beispiele für die hier verwendete Reversphasen-Säule kann man Capcell Pak C8 SG300 und C18 SG300 (Shiseido Co., Ltd.) aufzählen. Die an die Re­ versphasen-Säule adsorbierten Fraktionen lassen sich mit Gradienten von Trifluoressigsäure enthaltendem Acetonitril eluieren.

Unter den erhaltenen adsorbierten Fraktionen wird die Frak­ tion, die die höchste antibakterielle Aktivität zeigt, er­ neut einer Reversphasen-HPLC unterworfen, wodurch Moricin isoliert wird.

Die Messung der antibakteriellen Aktivität der durch die vorstehend erwähnten Isolierungs- und Reinigungsverfahren erhaltenen Fraktion kann man dadurch vornehmen, daß man als Indikator die Bildung einer Wachstumshemmzone auf einer Agarplatte benutzt und z. B. Staphylococcus aureus subsp. au­ reus ATCC6538P als Testbakterium verwendet.

[2] Verfahren zur Herstellung von Moricin unter Anwendung gentechnologischer Methoden

Nachstehend wird ein Verfahren zur Herstellung von Moricin beschrieben, das die Transformation oder Transduktion einer Wirtszelle mit einer rekombinanten DNA, in die eine das Mo­ ricingen enthaltende DNA inseriert worden ist, und die Pro­ duktion von Moricin durch Verwendung der so erhaltenen rekombinanten Mikroorganismen umfaßt.

Eine das Moricingen enthaltende DNA kann man durch clonieren eines natürlichen vom Genom des Seidenspinners oder von des­ sen cDNA abgeleiteten Moricingens erhalten. Diese das Mo­ ricingen enthaltende DNA kann man durch PCR unter Verwendung eines Satzes von DNA-Primern amplifizieren, die man auf der Grundlage der Aminosäuresequenz von Moricin synthetisieren kann. Es ist ebenfalls möglich, eine das Moricingen enthal­ tende DNA durch chemische Synthese zu konstruieren.

Es wird darauf hingewiesen, daß die durch ein Moricingen co­ dierte Aminosäuresequenz Zusätze, Deletionenen oder Austau­ sche einer oder mehrerer Aminosäurereste enthalten kann, wenn das Peptid mit dieser Aminosäuresequenz eine antibak­ terielle Aktivität beibehält. Alle Moricingene, bei denen die Aminosäuresequenz innerhalb eines solchen Umfangs abge­ ändert ist, daß die antibakterielle Aktivität nicht besei­ tigt wurde, fallen unter die vorliegende Erfindung.

Bevorzugt ist die das Moricingen enthaltende DNA auf jeder Seite mit einer Erkennungsstelle für ein geeignetes Restrik­ tionsenzym wie EcoR1 oder SalI versehen. Wenn die DNA solche Erkennungsstellen besitzt, läßt sich die Insertion dieser DNA in eine Vektor-DNA effizient durchführen.

Wenn eine das Moricingen enthaltende DNA chemisch syntheti­ siert wird, synthetisiert man sie als eine Vielzahl von Oli­ gonucleotiden. Nach dem Aneinanderlagern (annealing) werden die Oligonucleotide mit Ligase ligiert. In diesem Fall be­ vorzugt man, Codons durch solche Codons zu ersetzen, die keinen Einfluß auf die Aminosäuresequenz von Moricin haben, und die gleichzeitig in der benutzten Wirtszelle häufig ver­ wendet werden. Durch das vorstehende Verfahren wird es mög­ lich, eine - verglichen mit der Verwendung eines natürlichen Moricingens - größere Menge des Moricinproteins herzu­ stellen.

Eine das Moricingen enthaltende DNA läßt sich durch die nachstehend beschriebene Methode auf einfache Weise amplifi­ zieren. Kurz gesagt wird die DNA in eine geeignete Vektor- DNA, z. B. eine Plasmid-DNA oder eine Bakteriophagen-DNA, in­ seriert, um so eine rekombinante DNA zu erhalten. Dann wird zur Gewinnung eines rekombinanten Mikrooganismus eine Wirts­ zelle wie Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.) mit der rekombinanten DNA tranformiert oder transduziert. Der so erhaltene Mikroorganismus wird gezüchtet. Nachdem die rekombinante DNA nach herkömmlichen Verfahren präpariert wurde, wird die DNA-Insertion unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme herausgeschnitten. Die so erhaltene DNA- Insertion wird dann gereinigt. Wenn man eine rekombinante DNA aus einem rekombinanten Mikroorganismus gewinnt, nimmt man bevorzugt eine Bestätigung der Basensequenz der DNA-In­ sertion vor, z. B. nach dem Verfahren des Didesoxy-Kettenab­ bruchs [Methods Enzymol., 101 (1983), 20-78) oder nach einem ähnlichen Verfahren.

Hinsichtlich der Wirtszelle für die Produktion von Moricin kann man eine eukaryontische oder eine prokaryontische Zelle verwenden. Beispiele eukaryontischer Zellen schließen Zellen von Tieren, Pflanzen, Insekten, Hefen, Beispiele von Proka­ ryontenzellen E.coli, Bacillus subtilis und Actinomycetes ein.

Wenn man als Wirtszelle eine Pflanzen- oder Insektenzelle verwendet, heißt das nicht, daß sie gezüchtet werden muß; man kann einen Pflanzen- oder Insektenkörper, z. B. eine Ta­ bakpflanze oder eine Seidenspinnnerlarve als Wirtszelle ver­ wenden.

Wenn ein antibakterielles Peptid wie Moricin in Prokaryon­ tenzelle wie E.coli produziert wird, bevorzugt man es, daß das interessierende Peptid als Fusionsprotein mit β-Galacto­ sidase, β-Lactamase, dem Maltosebindungsprotein, Protein A oder ähnlichem exprimiert wird. Da ein auf diese Weise als Fusionsprotein exprimiertes Moricinpeptid keine antibakteri­ elle Aktivität zeigt, hemmt es die Vermehrung der prokaryon­ tischen Wirtszelle nicht. Als konkrete Beispiele prokaryon­ tischer Zellen, die sich erfindungsgemäß als Wirtszellen verwenden lassen, können Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101 (ATCC33694) u.ä. aufgeführt werden.

Ein antibakterielles als Fusionsprotein exprimiertes Peptid kann leicht durch Affinitätschromatographie gereinigt wer­ den, wenn das Fusionsprotein löslich ist, oder durch Zentri­ fugation, wenn das Fusionsprotein unlöslich ist.

Als Vektor-DNA zur Expression eines Moricinpeptids kann jede beliebige Vektor-DNA verwendet werden, wenn sie in der Lage ist, sich in einer Wirtszelle zu replizieren. Beispielsweise kann man eine Plasmid- oder eine Bakteriophagen-DNA verwen­ den. Wenn es sich bei dem Wirt um E.coli handelt, können Plasmide wie pMal-C2 (New England Labs.), pGEX-5X-1 (Pharmacia) oder pxa1 (Boehringer Mannheim) verwendet wer­ den.

Zur Herstellung einer rekombinanten DNA wird eine ein Mori­ cingen enthaltende DNA zwischen geeignete Restriktionsenzym- Stellen einer Vektor-DNA inseriert. Wenn man das Plasmid pXa1 als Vektor-DNA verwendet, spaltet man das Plasmid mit Restriktionsenzymen wie EcoRI und SalI und erhält so Frag­ mente der Vektor-DNA. Anschließend wird eine das Moricingen enthaltende DNA mit den Fragmenten der Vektor-DNA gemischt. Eine DNA-Ligase wie T4-DNA-Ligase wird mit dem resultieren­ den Gemisch umgesetzt, um so eine rekombinante DNA zu erhal­ ten.

Ein rekombinanter Mikroorganismus läßt sich durch Transfor­ mation oder Transduktion einer Wirtszelle mit der vorstehend genannten rekombinanten DNA gewinnen. Die Transformation ei­ ner Wirtszelle kann man nach dem Verfahren von D.M. Morrison [Methods Enzymol 68 (1979), 326-331], dem Calciumchlorid- Verfahren [Gene 6 (1979), 23] u.ä. vornehmen und die Trans­ duktion einer Wirtszelle nach dem Verfahren von B. Hohn [Methods Enzymol. 68 (1979), 299-309) u.ä.

Anschließend wird der so erhaltene Mikroorganismus in einem Medium gezüchtet, und Moricin wird aus der Kultur gewonnen.

Wenn Moricin nicht als Fusionsprotein sondern unter Verwen­ dung einer eukaryontischen Wirtszelle als Moricinpeptid per se exprimiert wird, kann man das Moricinpeptid unter Anwen­ dung herkömmlicher Verfahren zur Proteinisolierung gewin­ nen. Kurz gesagt schließt man die Zellen mit einer Lysebe­ handlung durch Detergenz, Ultraschall, Zermahlen u.ä. auf, um so das Moricinpeptid aus den Zellen freizusetzen. Danach kann man nach ähnlichen Verfahren, wie sie zum Isolieren des Moricins aus der Seidenspinnerhämolymphe angewandt wurden (d. h. Gelfiltration, Ionenaustausch-Chromatographie und Re­ versphasen-HPLC), ein hoch gereinigtes Moricin-Standardpro­ dukt erhalten.

Wenn Moricin als ein Fusionsprotein unter Verwendung einer eukaryontischen oder prokaraontischen Zelle als Wirtszelle exprimiert wird, erhält man das Fusionsprotein nach dem Auf­ brechen der Zellen durch eine Kombination von Behandlungen wie Zentrifugation und Affinitätschromatographie. Anschlie­ ßend wird das Moricinpeptid durch eine chemische Behandlung mit Bromcyan oder ähnlichem oder durch enzymatische Behand­ lung mit dem Faktor Xa (Boehringer Mannheim) oder ähnlichem aus dem Fusionsprotein herausgespalten. Das so erhaltene Mo­ ricinpeptid wird dann gereinigt.

Ein auf gentechnologischem Wege gewonnenes Moricinpeptid zeigt eine völlig identische antibakterielle Aktivität wie das Moricinpeptid, das aus der Seidenspinner-Hämolymphe iso­ liert wurde, in der eine antibakterielle Aktivität induziert worden war.

Moricin kann gegenüber einer großen Anzahl von Bakterien eine antibakterielle Aktivität entfalten. Zu diesen Bakte­ rien gehören Bacillus subtilis, durch das gekochter Reis, Brot etc. verderben, Staphylococcus aureus, das ein pathoge­ nes Nahrungsmittelvergiftung verursachendes Bakterium ist, Escherichia coli, andere gram-positive Bakterien, die zu den Gattungen Bacillus, Staphylococcus, Clostridium, Strepto­ coccus usw. gehören, und gram-negative Bakterien, die zu den Gattungen Escherichia, Pseudomonas, usw. gehören.

Moricin kann per se als antibakterielles Agens verwendet werden, oder nachdem es unter Verwendung von festen oder flüssigen Trägern oder von Emulsions-Dispersionsmitteln zu Tabletten, Staub, benetzbarem Pulver, Emulsionen, Kapseln usw. formuliert worden ist.

Als Trägermaterialien lassen sich z. B. Wasser, Gelatine, Stärke, Magnesiumstearat, Lactose, Gummiarabicum, Gemüseöl u.ä. verwenden.

Das vorstehend genannte antibakterielle Agens umfaßt Konser­ vierungsstoffe für Nahrungsmittel, antibakterielle Agentien für medizinische Zwecke, Konservierungsmittel für Baustoffe und/oder Farben, antibakterielle Mittel für den Gartenbau, Konservierungsstoffe für Futtermittel und Fischfutter usw. Das antibakterielle Agens läßt sich somit auf ganz verschie­ denen Gebieten einsetzen.

Wenn man Moricin einem Nahrungsmittel als Konservierungs­ stoff zusetzt, kann man Moricin z. B. mit dem Nahrungsmittel vermischen oder das Nahrungsmittel damit beschichten. Die in diesem Falle zugesetzte Menge Moricin beträgt 2 mg oder mehr pro kg Nahrungsmittel, bevorzugt 5-50 mg/kg.

Beispiele für Nahrungsmittel, bei denen sich Moricin verwen­ den läßt, umfassen verarbeitete Meeresprodukte wie gekochte Fischpaste, verarbeitete Fleischprodukte wie Schinken oder Wurst, Getränke wie alkoholfreie Getränke und Fruchtsäfte und Süßwaren wie Kuchen, Puddings und Gebäck mit einer Boh­ nenmarmelade-Füllung.

Das Moricin als aktiven Bestandteil enthaltende antibakteri­ elle Agens kann auf geeignete Weise mit anderen Bakterizi­ den, Arzneimitteln, Antiseptika, Lebensmittelzusätzen usw. vermischt und in Kombination verwendet werden.

Moricin zeigt eine wirksame antibakterielle Aktivität gegen­ über verschiedenen gram-negativen und gram-positiven Bakte­ rien, einschließlich Staphylococcus aureus und Bacillus ce­ reus, bei denen es sich um pathogene Nahrungsmittelver­ giftung verursachende Bakterien handelt. Somit läßt sich Mo­ ricin als Konservierungsstoff für Nahrungsmittel und als an­ tibakterielles Agens in der Medizin verwenden.

Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele genauer beschrieben. Im ersten Beispiel wird Moricin aus der Seidenspinner-Hämolymphe, in der eine antibakterielle Aktivität induziert worden war, isoliert. In einem anderen Beispiel wird Moricin unter Anwendung gentechnologischer Verfahren hergestellt und in Testbeispielen die antibakterielle Aktivität untersucht. Es wird darauf hingewiesen, daß diese Beispiele keine Ein­ schränkung der vorliegenden Erfindung bewirken.

Beispiel 1 (1) Isolieren von Moricin aus der Seidenspinner-Hämolymphe, in der eine antibakterielle Aktivität induziert worden war

• (i) Zur Induktion einer antibakteriellen Aktivität wurde in die Körperhöhle von 700 Seidenspinnerlarven im fünften Larvenstadium (instar) (Sorte: Bombyx mori var. Tokai x Asahi; bezogen vom Nationalen Institut für Seidenraupenzucht und Entomologische Forschung, Ministerium für Landwirtschaft, Forsten und Fische­ rei) eine Suspension von Escherichia coli ATCC33694 in physiologischer Kochsalzlösung (4 × 108 Zel­ len/ml) in einer Menge von 0,005 ml/Larve injiziert. Zwanzig Stunden nach der Injektion wurden die Beine der Seidenspinnerlarven abgeschnitten, und deren Hä­ molymphe wurde gewonnen. Unmittelbar nach ihrer Ge­ winnung wurde die Hämolymphe 5 Minuten in einem Was­ serbad mit 100°C erhitzt und dann zentrifugiert.
• (ii) Zu 200 ml des resultierenden Überstandes wurde Ammo­ niumsulfat bis zu einer 15%igen Sättigung gegeben, und das resultierende Präzipitat wurde durch Zentri­ fugation abgetrennt. Zum resultierenden Überstand wurde Ammoniumsulfat bis zu einer 75%igen Sättigung gegeben. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation abgetrennt und dann weiterverwendet. Das erhaltene Präzipitat wurde in 40 ml destilliertem Wasser ge­ löst.
• (iii) Zur Durchführung der Gelfiltration wurde die resul­ tierende Lösung auf eine mit 50 mM Ammoniumacetat (pH 5,0) äquilibrierte Sephadex G-50-Säule (5 × 100 cm) gegeben. Die Fraktionen mit Proteinen niederer Molekulargewichte wurden wiedergewonnen.
• (iv) Die Fraktionen mit den niederen Molekulargewichten wurden auf eine mit 50 mM Ammoniumacetat (pH 5,0) äquilibrierte CM-Sepharose-FF-Säule (2,5 × 4,4 cm) gegeben. Die adsobierten Fraktionen wurden durch aufeinanderfolgende Zugabe auf die Säule von je 50 ml eines Gemisches von 50 mM Ammoniumacetat (pH 5,0) und 0,8 M Ammoniumacetat (pH 7,0) in den Volumenver­ hältnissen 9,5 : 0,5, 9 : 1, 8 : 2, 7 : 3, 6 : 4, 5 : 5, 4 : 6 und 3:7 eluiert. Das Eluat wurde in Abhängigkeit von der Salzkonzentration 50 ml-weise gesammelt. Die mit dem Mischungsverhältnis 4 : 6 eluierte Fraktion zeigte die höchste antibakterielle Aktivität.
• (v) 10 ml der mit dem 4 : 6-Mischungsverhältnis eluierten Fraktion wurden einer Reversphasen-HPLC (Säule: Cap­ cell Pak C8 SG300 10 × 250 mm) unterworfen. Die ad­ sorbierten Fraktionen wurden mit einem Dichtegradi­ enten einer Acetonitrillösung, die Trifluoressig­ säure enthielt, eluiert. Die verbleibenden Eluate wurden in ähnlicher Weise der Reversphasen-HPLC un­ terworfen, und die die höchste antibakterielle Akti­ vität zeigenden Fraktionen wurden gesammelt.
• (vi) Die gesammelten Fraktionen wurden zur weiteren Rei­ nigung einer erneuten Reversphasen-HPLC (Säule: Cap­ cell PaK C8 SG300 4,6 × 250 mm) unterworfen. Die ad­ sorbierten Fraktionen wurden mit einem Dichtegradi­ enten von Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt, eluiert. Das Eluat wurde gesammelt, und die Fraktionen mit der höchsten antibakteriellen Aktivität wurden vereinigt. Ein Teil der vereinigten Fraktionen wurde einer Tricin-SDS-Polyacrylamid-Gel­ elektrophorese (nachstehend mit "Tricin-SDS-PAGE" bezeichnet) unterworfen, und das Gel wurde nach dem Lauf mit Coomassie Brilliant Blau R-250 (BRL) ange­ färbt. Als Ergebnis wurde eine einzelne angefärbte Bande erhalten.
• (vii) Durch das vorstehend beschriebene Verfahren wurden aus 200 ml Zentrifugationsüberstand der Seiden­ spinner-Hämolymphe 150 µg Moricin erhalten.

Zur Zeit der Moricinisolierung wurde die Messung seiner an­ tibakteriellen Aktivität dadurch vorgenommen, daß die Bil­ dung einer Wachstums-Hemmzone auf einer Agarplatte als Indi­ kator [Nature 292 (1981), 246] und Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC6538P als Testbakterium verwendet wurden.

Die Menge des Proteins wurde nach der verbesserten Lowry Me­ thode [Methods Enzymol. 91 (1983), 95] bestimmt, und die Tricin-SDS-PAGE wurde nach dem in Anal. Biochem. 166 (1987), 368 beschriebenen Verfahren durchgeführt.

(2) Strukturanalyse (a) Aminosäurezusammensetzung

Das gewonnene Moricin wurde in 0,1% Phenol enthaltender 6N HCl über eine Dauer von 24 Stunden hydrolysiert (unter ver­ mindertem Druck bei 110°C) und dann mit einem Hitachi Amino­ säure-Analysator, Model 835, analysiert. Die Ergebnisse sind nachstehend gezeigt.

Aminosäure
Anzahl der Mole/Mol Moricin
Lys
8,8
Ala	5,9
Ile	4,8
Asp + Asn	4,0
Gly	3,1
Val	3,2
Arg	1,7
Leu	2,1
Phe	2,3
Pro	1,9
Thr	1,9
His	1,4
Ser	1,0

(b) Molekulargewicht

Als Ergebnis der Molekulargewichtsanalyse mit einem Perkin Elmer Massenspektrometer, Modell API-III (Perkin Elmer Sciex) wurde festgestellt, daß das gewonnene Moricin ein Mo­ lekulargewicht von 4543,1 ± 0,6 Da hat.

(c) N-terminale Aminosäuresequenz

Die N-terminale Aminosäuresequenz des Moricins wurde unter Verwendung eines Proteinsequenators, Modell 473A (Applied Biosystems) nach dem Verfahren des Edmanabbaus analysiert.

Als Ergebnis wurde die in SEQ ID NO:2 beschriebene Aminosäu­ resequenz erhalten.

(d) Aminosäuresequenzen der Peptidfragmente aus der Endoproteinasespaltung

Das Moricin wurde mit der Endoproteinase Asp-N (Takara Shuzo) gespalten, und die resultierenden Peptidfragmente wurden durch Reversphasen-HPLC isoliert. Die Aminosäurese­ quenz eines jeden Fragments wurde nach dem Verfahren des Ed­ manabbaus analysiert. Als Ergebnis wurden die in SEQ ID NO:3 und -NO:4 wiedergegebenen Sequenzen erhalten.

(e) Aus den Ergebnissen der Aminosäureanalyse, der Moleku­ largewichtsbestimmung und der Aminosäuresequenz-Analyse wurde geschlossen, daß das erhaltene Moricin ein Peptid ist, das die in SEQ ID NO:1 beschriebene Sequenz hat.

Testbeispiel 1 Test der antibakteriellen Aktivität (1)

Zur Bestimmung der antibakteriellen Aktivität des in Bei­ spiel 1 erhaltenen Moricins gegenüber verschiedenen Bakte­ rien wurde die minimale inhibitorische Konzentration (minimum inhibitory conzentration, M.I.C.) von Moricin ge­ messen (basierend auf dem in Eur. J. Biochem 187 (1990), 381-386 beschriebenen Verfahren). Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I gezeigt.

(Testbakterien)

Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo)
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 6538P
Bacillus cereus IFO3457

(Testmedium)

Wenn E.coli und Staphylococcus aureus subsp. aureus als Testbakterien verwendet wurden, wurde Hirn-Herz-Infusionsme­ dium, BHI-Medium (brain heart infusion medium, BHI medium, Difco) benutzt. Bei Verwendung von Bacillus cereus als Test­ bakterium wurde NB-Medium (nutrient broth medium, Difco) verwendet.

(Test der antibakteriellen Aktivität)

Zu einem Testmedium, in dem Testbakterien mit einer Konzen­ tration von 4 × 10⁴ Zellen/ml suspendiert waren, wurde ein gleiches Volumen desselben Mediums, das Moricin in unter­ schiedlichen Konzentrationen enthielt, gegeben und 20 Stun­ den bei 30°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde ein glei­ ches Volumen einer 6%igen Formalinlösung dazugegeben, wo­ durch sich eine zweifache Verdünnung ergab. Dann wurde das Ausmaß der Zellvermehrung durch Messung der Absorption bei 650 nm untersucht. Als Kontrolle wurde Cecropin B1 [Comp. Biochem. Physiol. 95B (1990), 551] verwendet, bei dem es sich um ein bekanntes vom Seidenspinner abgeleitetes anti­ bakterielles Peptid handelt.

Tabelle I

Testbeispiel 2 Test der antibakteriellen Aktivität (2)

Die antibakterielle Aktivität des in Beispiel 1 erhaltenen Moricins gegenüber verschiedenen Bakterien wurde nach einem Verfahren untersucht, das auf dem in Nature 292 (1981), 246 beschriebenen Verfahren basiert. Die Ergebnisse sind in Ta­ belle II gezeigt.

(Test Bakterien)

Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo)
Pseudomonas fluorescens IAM1179
Bacillus subtilis IAM1107
Bacillus megaterium IAM1030
Bacillus cereus IFO3457
Staphylococcus aureus ATCC6538P
Staphylococcus aureus IFO3083
Staphylococcus epidermidis IFO12993
Staphylococcus xylosus IAM1312
Pseudomonas aeruginosa IAM1514
Streptococcus pyogenes ATCC21547

(Testmedium)

Verwendet wurde NB-Plattenmedium, enthaltend 0,8% Agarose (wahlweise wurde Natriumchlorid in solch einer Menge zugege­ ben, daß sich eine Konzentration von 150 mM ergab).

Bei der Verwendung von Streptococcus pyogenes als Testbakte­ rium wurde 0,8% Agarose enthaltendes BHI-Plattenmedium ver­ wendet.

(Verfahren zum Testen der antibakteriellen Aktivität)

Es wurden 50 µl Moricinlösung präpariert. 2 µl dieser Lösung wurden jeweils in eine Vertiefung eines Plattenmediums gege­ ben, das mit einem Testbakterium inokuliert worden war. Die Platte wurde über Nacht bei 30°C inkubiert, und dann wurden die Durchmesser der gebildeten wachstumshemmenden Zonen ge­ messen. Als Kontrolle wurde Cecropin B1 verwendet. Der Durchmesser der Vertiefung betrug - nebenbei bemerkt - 2 mm. Wenn der Durchmesser der Hemmzone in Tabelle II mit 2,0 mm angegeben ist, zeigt dies an, daß sich keine Hemmzone gebil­ det hatte.

Tabelle II

Wie aus den Tabellen I und II hervorgeht, weist Moricin eine hohe antibakterielle Aktivität gegen eine Reihe von gram- negativen und gram-positiven Bakterien auf, einschließlich von Staphylococcus aureus und Bacillus cereus, bei denen es sich um pathogene, Nahrungsmittelvergiftung verursachende Bakterien handelt.

Beispiel 2 Herstellung von Moricin durch gentechnologische Verfahren

Die Herstellung von Moricin durch gentechnologische Verfah­ ren wurde gemäß den nachfolgenden Prozeduren durchgeführt. Kurz gesagt wurde eine das Moricingen enthaltende DNA durch chemische Synthese konstruiert. Dann wurde das Plasmid pUC­ MOR1 durch Inserieren der vorstehend erwähnten DNA in ein Plasmid präpariert. E.coli wurde zur Amplifikation des Plas­ mids mit pUCMOR1 transformiert. Danach wurde für die Expres­ sion von Moricin durch Subclonieren der DNA-Insertion von pUCMOR1 das Plasmid pXAMOR1 präpariert. Dann wurde E.coli mit diesem Plasmid transformiert. Unter Verwendung der re­ sultierenden rekombinanten Mikroorganismen wurde ein Mori­ cin-Fusionsprotein produziert. Das Fusionsprotein wurde dann mit Bromcyan behandelt und zur Gewinnung eines grob gerei­ nigten Moricins vorgereinigt. Alle vorstehenden Verfahren werden nachstehend genauer beschrieben.

1. Konstruktion einer ein Moricingen enthaltenden DNA durch chemische Synthese (1) Bestimmung der Basensequenz

Die Sequenz der zu konstruierenden DNA (d. h. einer ein Mori­ cingen enthaltenden DNA) wurde durch Verwendung derjenigen Codons bestimmt, die in E.coli häufig verwendet werden [Ikemura, T., J. Mol. Biol. 151 (1987), 389-409]. Die Struk­ tur dieser DNA ist die folgende: Abwärts (dowstream) der EcoRI-Erkennungstelle befinden sich in der angegebenen Rei­ henfolge ein mit Methionin korrespondierendes Codon (ATG) für die Abspaltung mit Bromcyan, ein Moricingen, zwei Termi­ nationscodons (TAA und TAG) und die SalI-Erkennungsstelle. Die bestimmte Basensequenz des Moricingens ist in SEQ ID NO:5 gezeigt.

(2) Chemische Synthese der Oligonucleotide

Die das Moricingen enthaltende DNA wurde in 8 Oligonucleo­ tide (Mosy1-8) unterteilt, und jedes dieser Oligonucleo­ tide wurde chemisch synthetisiert. Die Synthese der Oligo­ nucleotide wurde mit einem DNA-Synthesizer (ABI Model 392, Applied Biosystems) unter Anwendung des Phosphoamidit-Ver­ fahrens vorgenommen.

Die Basensequenzen von Mosy1-8 sind nachfolgend aufge­ führt:

Mosy1  AATTCATGGCTAAAATCCCGATTAAGGCAATTAAA
Mosy2  ACTGTGGGCAAAGCTGTTGGTAAAGGTCTGCGTG
Mosy3  CTATCAACATCGCTTCTACCGCTAACGACGTATTCAA
Mosy4  CTTCCTGAAACCGAAGAAACGTAAACACTAATAG
Mosy5  CACAGTTTTAATTGCCTTAATCGGGATTTTAGCCATG
Mosy6  GTTGATAGCACGCAGACCTTTACCAACAGCTTTGCC
Mosy7  CAGGAAGTTGAATACGTCGTTAGCGGTAGAAGCGAT
Mosy8  TCGACTATTAGTGTTTACGTTTCTTCGGTTT.

(3) Reinigung der synthetischen Oligonucleotide

Die synthetischen Oligonucleotide wurden unter Verwendung des Qiagen Plasmid-Kits (Funakoshi) gereinigt.

Zuerst wurde ein Teil des in (2) synthetisierten Oligo­ nucleotids in MOPS-Lösung [50 mM MOPS (pH 7,0), 0,1 M NaCL] so gelöst, daß eine Lösung mit 20 µg/ml Oligonucleotid ent­ stand. Zur Adsorption des Oligonucleotids wurde 1 ml der vorstehend erwähnten Oligonucleotidlösung in eine Reini­ gungsspitze (Qiagen-tip 20) gegeben, die mit 2 ml eines Äquilibrierungspuffers [50 mM MOPS (pH 7,0), 0,1 M NaCl, 0,15% Triton X-100] äquilibriert worden war. Dann wurde die Spitze mit 4 ml MOPS-Lösung gewaschen. Anschließend wurden Elution, Präzipitation und Waschen des Oligonucleotids nach den Anweisungen des Kit-Herstellers durchgeführt. Jedes der so erhaltenen Oligonucleotide (6-13 µg) wurde in 15 µl TE- Puffer [10 mM Tris-HCL (pH 8,0), 1 mM EDTA] aufgenommen.

(4) Phosphorylierung der Oligonucleotide

Die 5′-Enden der sechs Oligonucleotide Mosy2-Mosy7 wurden mit ATP und T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert. Die Reak­ tion wurde mit jedem Oligoncleotid in einem separaten Reak­ tionsgefäß ausgeführt. Die Reaktionsbedingungen sind nach­ folgend wiedergegeben. 3 µg eines (in TE-Puffer gelösten) Oligonucleotids, 2 µl 10X Kinasepuffer [500 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM MgCl₂, 50 mM DTT, 1 mM Spermidin-HCl, 1 mM EDTA; Nippon Gene Co., Ltd.], 2 µl 10 mM ATP und 20 Einhei­ ten T4-Polynucleotidkinase (Nippon Gene) wurden vermischt, und mit destilliertem Wasser wurde auf 20 µl ergänzt. Die Lösung wurde 2 Stunden bei 37°C umgesetzt. Dann wurde zur Beendigung der Reaktion die Lösung 3 Minuten auf 90°C er­ hitzt.

(5) Konstruktion der das Moricingen enthaltenden DNA i. Aneinanderlagern (annealing) der Oligonucleotide

Alle Reaktionslösungen der Phosphorylierungen Mosy2-Mosy7 wurden in einem Reaktionsgefäß zu insgesamt 120 µl verei­ nigt. Hierzu wurden 3 µg Mosy1 und 3 µg Mosy8 hinzugegeben. Zur resultierenden Lösung wurden 20 µl 10X Ligationspuffer [500 mM Tris-HCl (pH 7,9), 100 mM MgCl₂, 200 mM DTT, 10 mM ATP; Nippon Gene) gegeben. Dann wurde die Lösung mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 197 µl ergänzt. Diese Lösung wurde 5 Minuten auf 90°C erhitzt, dann sofort mit Eis abgekühlt und in einem Heizblock (Dry Thermo Unit Model Al-10; Taitec Co., LTD.) 10 Minuten bei 75°C erhitzt. Danach wurde der Heizblock abgeschaltet und die Lösung 5 Stunden stehen gelassen.

ii. Ligation der Oligonucleotide

Zu 197 µl der vorstehenden Reaktionslösung wurden 1800 Ein­ heiten T4-DNA-Ligase (Nippon Gene) gegeben, und es wurde 14 Stunden bei 16°C umgesetzt.

iii. Reinigung der DNA

Ein Teil (30 µl) der vorstehenden Reaktionslösung wurde mit 3 µl BPB-Lösung (0,1% BPB, 30% Glycerin) versetzt und ei­ ner Elektrophorese durch ein 3%iges Agarosegel unterworfen. Aus dem Gel wurde eine einer DNA-Länge von ungefähr 140 bp entsprechende Bande ausgeschnitten. Die DNA im Gel wurde durch eine "Einfrier-Auftau"-Behandlung und eine anschlie­ ßende Ethanolpräzipitation gewonnen. Die so erhaltene DNA (800 ng) wurde in 9 µl 1X Kinasepuffer gelöst.

iv. Phophorylierung der das Moricingen enthaltenden DNA

Acht µl der vorstehend erhaltenen DNA-Lösung wurden mit 1 µl 10 mM ATP und 10 Einheiten T4-Polynucleotidkinase versetzt und 2 Stunden bei 37°C umgesetzt. Dann wurde die Lösung 3 Minuten auf 90°C erhitzt, um die Reaktion zu beenden.

2. Herstellung einer rekombinanten DNA (Plasmid pUCMOR1)

Das Plasmid pUCMOR1 enthält als Insertion die das Moricingen enthaltende DNA. Dieses Plasmid wurde wie folgt hergestellt. Ein Gemisch von 4 µg des Plasmids pUC119 (Takara Shuzo), 4 µl 10X H-Puffer [500 mM Tris-Hcl (pH 7,5), 100 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1000 mM NaCl; Takara Shuzo] und je 20 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI (Gibco BRL) und SalI (Takara Shuzo) wurde mit destilliertem Wasser auf ein Lösungsvolumen von 40 µl ergänzt. Zur Spaltung der DNA wurde diese Lösung 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Dann wurde die Lösung zur Beendigung der Reaktion 15 Minuten auf 65°C erhitzt. 2 µl der resultierenden Reaktionslösung (entsprechend 200 ng Plasmid), 10 µl der in 1. (5) vorstehend präparierten Mori­ cingen-DNA, 2 µl 10X Ligasepuffer, 2 µl BSA (2 µg/ml) und 1200 Einheiten T4-DNA-Ligase wurden miteinander vermischt, und mit destilliertem Wasser wurde das Lösungsvolumen auf 20 µl ergänzt. Diese Lösung wurde bei 16°C 6 Stunden einer Ligationsreaktion unterworfen.

20 µl der vorstehenden Ligations-Reaktionslösung wurden mit 100 µl einer Suspension kompetenter Zellen (Escherichia coli JM109; Nippon Gene) vermischt, und das Gemisch wurden zur Transformation der Zellen nacheinander 30 Minuten auf Eis, 2 Minuten bei 37°C und 5 Minuten wieder auf Eis gehalten. Da­ nach wurden 400 µl High Competent Broth (Nippon Gene) zur Lösung gegeben, und dieses Gemisch wurde unter Schütteln eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die resultierende Kultur wurde gleichmäßig auf 4 2xYT-Agarmedium-Platten (1,6% Tryp­ ton, 1% Hefeextrakt, 0,5% NaCl), das 50 µg/ml Ampicillin, 0,1 mM IPTG und 40 µg/ml X-Gal enthielt, verteilt und 20 Stunden bei 37°C inkubiert, wodurch ungefähr 300 ampicillin­ resistente Stämme erhalten wurden. Aus diesen ampicillinre­ sistenten Stämmen wurden 20 hellblaue Kolonien bildende Stämme ausgewählt und 10 Stunden in 3 ml flüssigem LB-Me­ dium, das 50 µg/ml Ampicillin enthielt, inkubiert. Die Kul­ turlösung wurde zur Zellernte zentrifugiert. Dann wurde un­ ter Verwendung von Qiagen Plasmid-Minikits (Funakoshi) die Plasmid-DNA gereinigt und in 20 µl TE-Puffer gelöst.

Ein Gemisch von 2 µl der resultierenden Plasmidlösung und 1 µl 10X H-Puffer, 3 Einheiten EcoRI und 3 Einheiten SalI wurde mit destilliertem Wasser zu einer Lösung mit einem Vo­ lumen von 10 µl ergänzt. Diese Lösung wurde 90 Minuten bei 37°C umgesetzt.

Diese Reaktionslösung wurde mit 1 µl BPB-Lösung versetzt und einer Elektrophorese durch ein 4%iges Agarosegel unterwor­ fen, um so die Länge der durch die Restriktionsenzyme her­ ausgeschnittenen DNA-Insertion zu bestätigen. Beobachtet wurden Fragmente unterschiedlicher Längen mit ungefähr 120 bis 140 bp.

Von 14 Plasmiden, die eine DNA-Insertion von 140 bp trugen, wurde die Basensequenz der jeweiligen DNA-Isertionen be­ stimmt. Für diese Bestimmung wurde ein Taq Dye Primer Cycle Sequencing-Kit (ABI), ein GeneAmp PCR System 96000 (Perkin Elmer Cetus) und ein ABI Model 373A DNA-Sequenator verwen­ det. Es gab 4 Plasmide, in die die das Moricingen enthaltene DNA inseriert worden war. Eines dieser Plasmide wurde mit pUCMOR1 bezeichnet.

3. Präparation einer rekombinanten DNA für die Moricin­ expression (Plasmid pXAMOR1)

Das Plasmid pXAMOR1 wurde durch Subclonieren der das Mori­ cingen enthaltenden DNA, die in das Plasmid pUCMOR1 iseriert ist, in das Plasmid pXa1 zwischen die EcoRI- und die SalI- Stelle erhalten. Das Plasmid pXAMOR1 besitzt als Kontroll­ element den lac-Promotor/Operator und exprimiert ein Fusi­ onsprotein, das die β-Galactosidase, ein Collagenfragment und Moricin umfaßt. Einzelheiten der Präparation des Plasmids pXAMOR1 werden nachstehend beschrieben.

Ein Gemisch von 5 µg des Plasmids pXa1 (Boehringer, Mann­ heim) mit 10 µl 10X H-Puffer, 20 Einheiten EcoRI und 20 Ein­ heiten SalI wurde mit destilliertem Wasser zu einer Lösung mit einem Volumen von 100 µl ergänzt. Zum Spalten der DNA wurde diese Lösung 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Dann wurde die Lösung zur Beendigung der Reaktion 15 Minuten auf 65°C erhitzt. Als Ergebnis wurden Fragmente des Plasmids pXa1 er­ halten.

Außerdem wurde das Plasmid pUCMOR1 mit EcoRI und SalI ge­ spalten, um so die DNA-Insertion herauszuschneiden, die dann durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt wurde. Die Reakti­ onsbedingungen sind nachfolgend aufgeführt.

Ein Gemisch von 10 µg des Plasmids pUCMOR1, 5 µl 10X H-Puf­ fer und jeweils 20 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI und SalI wurde mit destilliertem Wasser zu einer Lösung mit einem Volumen von 50 µl ergänzt. Diese Lösung wurde zum Spalten der DNA 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Die resultie­ rende Reaktionslösung wurde mit 3 µl einer BPB-Lösung ver­ setzt und einer Elektrophorese durch ein 3%iges Agarosegel unterworfen, um dann eine einer DNA-Länge von ungefähr 140 bp entsprechende Bande herauszuschneiden. Dann wurde die DNA im Gel durch eine "Einfrier-Auftau"-Behandlung und eine Ethanolfällung gewonnen. Die erhaltene DNA (60 ng) wurde in 18 µl destilliertem Wasser gelöst.

Dann wurden 20 ng der gereinigten DNA-Insertion, 1 µl (50 ng) der pXa1-Plasmidfragmente, 1 µl 10X Ligationspuffer, 1 µl BSA (2 µg/ml) und 600 Einheiten T4-DNA-Ligase miteinander vermischt, und das Volumen der Lösung wurde mit destillier­ tem Wasser auf 10 µl gebracht. Diese Lösung wurde 5 Stunden bei 16°C einer Ligationsreaktion unterworfen.

Die vorstehende Ligationsreaktionslösung wurde mit 100 µl einer Suspension kompetenter Zellen (Escherichia coli JM109, Nippon Gene) vermischt, und das Gemisch wurde zur Transfor­ mation der Zellen nacheinander 30 Minuten auf Eis, 2 Minuten bei 37°C und 5 Minuten wieder auf Eis gehalten. Diese Reak­ tionslösung wurde auf 2 Platten 2xYT-Agarmedium, das 50 µg/ml Ampicillin enthielt, verteilt und 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Hierdurch wurden ungefähr 1000 ampicillinre­ sistente Stämme erhalten.

Aus diesen ampicillinresistenten Stämmen wurden 10 Stämme ausgewählt und 10 Stunden bei 37°C in 3 ml flüssigem LB-Me­ dium inkubiert, das 50 µg/ml Ampicillin enthielt. Zum Ab­ ernten der Zellen wurde die Kulturlösung zentrifugiert. Dann wurde das Plasmid unter Verwendung des Qiagen Plasmid-Mini­ kits gereinigt und in 20 µl TE-Puffer gelöst.

Ein Gemisch von 2 µl der vorstehenden Plasmidlösung, 1 µl 10X H-Puffer, 3 Einheiten EcoRI und 3 Einheiten SalI wurde mit destilliertem Wasser zu einer Lösung mit einem Volumen von 10 µl ergänzt. Diese Lösung wurde 90 Minuten bei 37°C umgesetzt. Die Lösung wurde mit 1 µl BPB-Lösung versetzt und einer Elektophorese durch ein 4%iges Agarosegel unterworfen, um so die Länge der durch die Restriktionsenzyme herausge­ spaltenen DNA-Insertion zu bestätigen. Das Ergebnis bestä­ tigte, daß jedes Plasmid eine DNA-Insertion mit einer unge­ fähren Länge von 140 bp trug. Eines dieser Plasmide wurde mit pXAMOR1 bezeichnet. Das rekombinante pXAMOR1 enthaltende E.coli wurde mit (E.coli)JM109(pXAMOR1) bezeichnet und beim National Institute of Bioscience and Humantechnology, Agency of Industrial Sciencs and Technology unter der Hinterle­ gungsnummer FERM BP-5099 hinterlegt.

4. Produktion eines rekombinanten Moricin-Fusionsproteins durch den rekombinanten Mikroorganismus (1) Beweis für die Produktion eines Fusionsproteins

2 ml flüssiges LB-Medium wurden mit einer Kolonie des rekom­ binanten das Plasmid pXAMOR1 tragenden E.coli, d. h. mit (E.coli)JM109(pXAMOR1) inokuliert und 2 Stunden bei 37°C in­ kubiert. Dann wurden 10 µl 100 mM IPTG zugegeben, um die Ex­ pression eines Fusionsproteins zu induzieren, und das E.coli wurde weitere 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Zur Ernte der Zellen wurden 0,5 ml der Kulturlösung zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 100 µl eines Probenpuffers [62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 10% Glycerin, 2% SDS, 5% 2-Mercapto­ ethanol, 0,0025% BPB] resuspendiert und 5 Minuten auf 100°C erhitzt. 3 µl dieser Suspension wurden einer SDS-PAGE unter­ worfen. Außerdem wurde als Kontrolle eine ohne die Zugabe von IPTG inkubierte Kulturlösung des rekombinanten E.coli einer SDS-PAGE unterworfen.

Das erwartete Molekulargewicht des Fusionsproteins, das β- Galactosidase, ein Collagenfragment und Moricin umfaßt, be­ trägt 127,5 kDa. Bei ungefähr 127,5 kDa war nur dann eine Bande zu beobachten, wenn das rekombinante E.coli mit dem Zusatz von IPTG gezüchtet worden war; dies bestätigte die Espression des Fusionsproteins.

(2) Grobe Reinigung des Fusionsproteins

Das rekombinante E.coli wurde 14 Stunden in 20 ml flüssigem 2xYT-Medium, das Ampicillin enthielt, bei 37°C inkubiert. Dann wurden jeweils 10 ml der obigen Vorkultur zu 3 Kolben gegeben, die jeweils 300 ml flüssiges 2xYT-Medium mit 50 µg/ml Ampicillin enthielten. Diese Kulturen wurden 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Dann wurden zu jedem Kolben 1,5 ml 100 mM IPTG gegeben und das E.coli wurde weitere 2 Stunden inku­ biert. Zur Ernte der Zellen wurde die Kulturlösung zentrifu­ giert. Es wurden 3,7 g Zellen erhalten.

Die Zellen wurden in 35 ml einer Suspendierungslösung [20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 200 mM NaCl, 1mM EDTA (pH 8,0), 10 mM 2- Mercaptoethanol] suspendiert. Zum Aufbrechen der Zellen wurde diese Suspension einer "Gefrier-Auftau"- und einer Ul­ traschallbehandlung (verwendet wurde ein Sonifier Cell Dis­ ruptor W200P; Branson) unterzogen. Dann wurde die resultie­ rende Suspension aufgebrochener Zellen zentrifugiert, und das Präzipitat wurde in 35 ml einer Suspendierungslösung [0,5% Triton X-100, 10 mM EDTA (pH 8,0)] suspendiert. Diese Suspension wurde erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und es wurden 9 mg des Proteins erhalten. Dieses Material wurde als grob gereinigtes Fusionsprotein der nach­ stehend beschriebenen Behandlung mit Bromcyan unterworfen.

(3) Behandlung mit Bromcyan

Zu 1 mg des grob gereinigten durch die vorstehende Prozedur erhaltenen Fusionsproteins wurden 200 µl 70%ige Ameisensäure und 10 µl einer Bromcyanlösung mit 100 mg/ml (in Acetonitril gelöst) gegeben, und das Gemisch wurde 24 Stunden bei Raum­ temperatur umgesetzt. Dann wurde die Reaktionslösung unter vermindertem Druck getrocknet. Das resultierende Material wurde dem nachstehend beschriebenen Test auf antibakterielle Aktivität hin als grob gereinigtes Moricin unterworfen.

Testbeispiel 3 Test der antibakteriellen Aktivität (3)

Basierend auf dem in Nature 292 (1981), 246 beschriebenen Verfahren wurde die antibakterielle Aktivität des grob gereinigten Moricins gegenüber verschiedenen Bakterien gete­ stet.

Die Ergebnisse sind in Tabelle III gezeigt.

(Testbakterien)

Staphylococcus aureus ATCC6538P
Streptococcus pyogenes ATCC21547
Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo)
Pseudomonas fluorescens IAM1179

(Testmedium)

Verwendet wurde NB-Plattenmedium, enthaltend 0,8% Agarose. (Wenn Staphylococcus aureus als Testbakterium verwendet wurde, wurde Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 150 mM zugegeben.) Bei der Verwendung von Streptococcus pyogenes als Testbakterium wurden 0,8% Agarose enthaltende BHI-Platten verwendet.

(Verfahren zum Testen der antibakteriellen Aktivität)

Zu grob gereinigtem Moricin wurde soviel destilliertes Was­ ser gegeben, daß man eine Proteinsuspension mit einer Kon­ zentration von ungefähr 10 µg/µl erhielt. Zwei Mikroliter dieser Suspension wurden in je eine Vertiefung auf dem Plat­ tenmedium gegeben, das mit dem Testbakterium inokuliert wor­ den war. Dann wurde die Platte über Nacht bei 30°C inku­ biert, und der Durchmesser der wachstumshemmenden Zone ge­ messen.

Als Kontrollen wurden die nachstehenden Materialien präpa­ riert:

• a) Ein Fusionsprotein (umfassend β-Galactosidase und ein Collagenfragment), das durch das rekombinante pXA1 enthal­ tende E.coli produziert worden und nicht mit Bromcyan behan­ delt worden war.
• b) Das Fusionsprotein, das durch das rekombinante pXA1 ent­ haltende E.coli produziert und mit Bromcyan behandelt worden war.
• c) Das β-Galactosidase, ein Collagenfragment und Moricin enthaltende) Fusionsprotein, das von dem rekombinanten pXA­ MOR1 enthaltenden E.coli produziert, aber nicht mit Bromcyan behandelt worden war.

Wenn die Bromcyanbehandlung nicht durchgeführt wurde, wurden statt 10 µl Bromcyanlösung 10 µl Acetonitril zugegeben. Im übrigen wurde dieselbe Behandlung vorgenommen.

Tabelle III

Aus den in Tabelle III gezeigten Ergebnissen geht hervor, daß - ähnlich zum natürlichen aus der Seidenspinner-Hämo­ lymphe isolierten Moricin - ein von rekombinantem E.coli un­ ter Anwendung gentechnologischer Verfahren produziertes Mo­ ricin eine antibakterielle Aktivität gegen gram-positive und gram-negative Bakterien zeigt.

Ferner zeigt Moricin in Form eines Fusionsproteins keine an­ tibakterielle Aktivität; Moricin zeigt nur dann eine anti­ bakterielle Aktivität, wenn man es durch die Behandlung mit Bromcyan vom Fusionprotein abtrennt.

Auflistung der Sequenzen

Claims (17)

1. Pepdid, dadurch gekennzeichnet, daß es (a) die in SEQ ID NO:1 beschriebene Aminosäuresequenz oder (b) eine zu (a) homologe Aminosäuresequenz besitzt, die Zusätze, Deletionen oder Austausche einer oder mehrerer Aminosäu­ rereste in SEQ ID NO:1 enthält und eine antibakterielle Aktivität aufweist.

2. Protein, das die Sequenz des Peptids nach Anspruch 1 um­ faßt, wobei das Peptid aber kovalent mit einem oder mehreren zusätzlichen Peptiden oder Proteinen verknüpft ist, d. h. als Fusionsprotein vorliegt.

3. Antibakterielles Agens, dadurch gekennzeichnet, daß es als aktiven Bestandteil das Peptid nach Anspruch 1 ent­ hält.

4. Antibakterielles Agens nach Anspruch 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es ein Nahrungsmittel-Konservierungsstoff, ein antibakterielles Agens zur medizinischen Verwendung, ein Konservierungsmittel für Baustoffe und/oder Farben, ein antibakterielles Mittel für die Verwendung im Gar­ tenbau oder ein Konservierungsstoff für Vieh- oder Fischfutter ist.

5. Gen eines Peptids, dadurch gekennzeichnet, daß es (a) die in SEQ ID NO:1 oder (b) eine Aminosäuresequenz co­ diert, die zu (a) homolog ist, die aber Zusätze, Dele­ tionen oder Austausche eines oder mehrerer Aminosäure­ reste in SEQ ID NO:1 enthält und eine antibakterielle Aktivität aufweist.

6. Rekombinante DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie das Protein nach Anspruch 2 codiert.

7. Rekombinante DNA, die man durch Inserieren des Pep­ didgens nach Anspruch 5 oder der rekombinanten DNA nach Anspruch 6 in eine Vektor-DNA erhalten kann.

8. Rekombinante DNA nach Anspruch 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Vektor-DNA eine Plasmid- oder Virus- DNA ist.

9. Rekombinante DNA nach Anspruch 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Vektor-DNA pMAL-C2, pGEX-5X-1 oder pXA1 ist.

10. Wirtszelle, enthaltend die rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 6 bis 9.

11. Wirtszelle, enthaltend die rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei die Wirtszelle eine Euka­ ryontenzelle ist.

12. Wirtszelle nach Anspruch 11, wobei die eukaryontische Zelle eine tierische oder pflanzliche Zelle, eine In­ sektenzelle oder eine Hefezelle ist.

13. Wirtszelle nach Anspruch 10, wobei die Wirtszelle eine Prokaryontenzelle ist.

14. Wirtszelle nach Anspruch 13, wobei die Prokaryontenzelle Escherichia coli ist.

15. Wirtszelle nach Anspruch 14, wobei die Wirtszelle Esche­ richia coli JM109 ist.

16. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 10, 13, 14 oder 15, wobei die Wirtszelle das bei der FERM hinterlegte (E. coli) JM109 (pXAMOR1) mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5099 ist.

17. Verfahren zur Herstellung eines neuen Peptids, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle nach einem der An­ sprüche 10 bis 16 in oder auf einem Medium gezüchtet wird und man das Peptid aus der Kultur gewinnt.