JP5330230B2 - 改良型抗菌ペプチド - Google Patents

Description

本発明は、アミノ末端又はカルボキシ末端に結合された約２〜約３６のアミノ酸残基若しくはそのアナログの長さを有するアミノ酸残基の第一セット、及び３〜８の疎水性アミノ酸残基若しくはそのアナログを含む第二セットを含む抗菌ペプチドであって、当該ペプチドが抗菌活性を有する抗菌ペプチドに関する。

ヒトなどの哺乳動物の免疫系は、いくつもの感染に対しうまく対抗する。しかしながら、幾つかの場合、細菌、真菌、又はウイルスが必ずしも排除されるわけではなく、局所又は全身の急性感染を引き起こすことがある。これは、周産期集中治療室、熱傷集中治療室、又は集中治療室において、並びに免疫力のない個人において重大な懸念となる。例えば、シュードモナス アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa)は、重篤な細菌結膜炎の主な原因であり、そしてその感染は、現在の抗菌剤でうまく治療することが難しい。別の場合では、上皮表面での継続的な細菌残留は、慢性疾患を引き起こすこともあるし、又は悪化させることもある。ヒトでは、慢性皮膚潰瘍、アトピー性皮膚炎、及び他のタイプの湿疹、にきび、又は泌尿生殖感染により例示される。今では、例えば、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウスでの感染又はコロニー形成がアトピー性皮膚炎のトリガー因子又は悪化因子であるという考慮すべき証拠が存在する。全てのアトピー性皮膚炎の患者の約９０％が、Ｓ．アウレウス（S. aureus)に感染しているか又は侵されている一方、健常な個体の５％しか、そうした細菌を有していない。慢性の潰瘍は、様々な細菌、例えばＰ．アエルギノーサ（P. aeruginosa)、及びＳ．アウレウス（S. aureus)などに感染又は侵されており、これらの潰瘍の回復遅延をもたらす。

症候性感染は、様々な医薬により治療されうる。幾つかの疾患は、例えばワクチンなどにより対抗することができる。しかしながら、ワクチンは、常に最良の治療オプションであるわけではなく、そして特定の微生物については、どのワクチンも利用できない。予防が利用できない場合、疾患の治療が行われている。治療は、微生物を殺す抗生物質の使用により行われることが多い。しかしながら、近年、いくつもの微生物が、抗生物質に対して耐性になってきた。おそらく近い将来、耐性の問題は増加するであろう。さらに、いくらかの個体は、抗生物質に対してアレルギーを発達させており、それにより特定の抗生物質を効果的に使用する可能性を低下させる。

様々な生物の上皮表面は、細菌に対して連続的にさらされている。近年、抗菌ペプチドに基づく生来の免疫系が、感染しやすい生物学的境界における細菌の一次排除における重要な役割に関与した（Lehrer, R. I., and Ganz, T. (1999) Curr Opin Immunol 11: 23-27, Boman, H. G. (2000) Immunol. Rev. 173, 5-16)。抗菌ペプチドは、その膜を透過することにより細菌を殺すと考えられており、そうして微生物標的の特定分子を欠如することは、耐性の発達を最小限にすると考えられている。

本明細書には無関係の幾つかの抗菌ペプチド及びタンパク質が当該技術分野に知られている。

US 6,503,881は、抗菌ペプチドとして使用されるインドリシジンアナログであるカチオン性ペプチドを開示する。カチオン性のペプチドは、動物及び植物を含む異なる種に由来する。

US 5,912,230は、抗真菌及び抗細菌性のヒスタミンに基づくペプチドであって、天然のヒトヒスタミンのアミノ酸配列の規定の部分に基づくペプチドを開示し、そして真菌及び細菌感染の治療方法も開示する。

US 5,717,064は、メチル化リジンリッチ溶解性ペプチドを開示する。当該溶解性ペプチドは、トリプシン切断抵抗性であり、そして非天然ペプチドである。溶解性ペプチドは、in vivo投与に適している。

US 5,646,014は、抗菌性ペプチドを開示する。当該ペプチドは、カイコ血リンパ由来の抗菌画分から単離された。当該ぺプチドは、エスケリキア・コリ（Escherichia coli)、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus)、及びバチルス・セレウス（Bacillus cereus)などの幾つかの細菌株に対する優れた抗菌活性を示す。

WO2004016653は、アズロシジンの２０〜４４配列に基づくペプチドを開示する。当該ペプチドは、ジスルフィド架橋により結合されたループ構造を含む。

US 6,495,516及び関連特許は、殺菌性の５５ｋＤａタンパク質である殺菌／透過増加タンパク質（ＢＰＩ）に基づくペプチドを開示する。当該ペプチドは、抗菌効果を発揮し、そしてＬＰＳ中和能を有した。

WO 01/81578は、多くの疾患について使用されうるＧ結合タンパク質受容体関連ポリペプチドをコードする多くの配列を開示する。

現在では、セロピン、デフェンシン、マガイニン及びカテリシジンを含む７００を超える異なる抗菌ペプチド配列が知られている（www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/search.htm)。

今日では利用可能な比較的多数の抗菌ペプチドが存在しているが、抗生物質及び／又は他の抗菌剤に対して耐性又は抵抗性である微生物に対抗するために使用できる新規の改良型抗菌ペプチドについての高いニーズが存在する。より重要なことに、ヒトなどの哺乳動物に導入された場合にアレルギーを引き起こさない新規の抗菌ペプチドについてのニーズが存在する。

細菌並びに哺乳動物膜に対するＡＭＰの潜在的溶解性並びに他の性質のため、新規ペプチドを設計する試みのうちの１つは、細菌又は真菌細胞などの微生物に対する高い特異性、つまり高い治療指数（最小の溶血性濃度／最小の抗菌活性；ＭＨＣ／ＭＥＣ）、を有するＡＭＰを開発することに拠っている。

Ｐ．アエルギノーサ（P. aeruginosa)、Ｅ．ファエカリス（E. faecalis)、プロテウス ミラビリス（Proteus mirabilis)、ストレプトコッカス ピオゲネス（Streptococcus pyogenes)及びＳ．アウレウス（S. aureus)などの様々な細菌は全て、幾つかの抗菌ペプチド、例えばカテリシジンＬＬ−３７、を分解するプロテアーゼを分泌する。こうして、プロテアーゼ抵抗性抗菌ペプチドは、治療見地から利点がある。さらに、多くの抗菌ペプチドは、細菌、例えば、問題ある発病機序に重要な役割を頻繁に果たすＳ．アウレウス（P. aureus）及びＰ．アエルギノーサ(P. aeruginosa)が、微生物の暴露において十分効率的ではなく、そして高い効果を示すように最適化されることを必要とする。

本発明は、対応ペプチドに比べて高い抗菌活性を有する新規の改良型抗菌ペプチドに関する。抗菌活性を増加するために必要とされる所定数のアミノ酸が存在するということが驚くべきことに発見された（つまり３未満又は８超のアミノ酸残基である場合当該抗菌活性は低減される）。当該アプローチは、特に親水性、高度に正荷電のペプチドについて特に適している。なぜなら、こうしたペプチドは、高度に膜破壊性であるからである。当該ペプチドを１又はいくつかの疎水性アミノ酸で修飾することにより、細菌の脂質膜へのその結合能力は向上し、そして得られた高ペプチド結合性は、強化された微生物膜形成異常をもたらし、そして当該微生物の高い致死率をもたらす。しかしながら、これは理論でしかなく、そして作用機序は、異なってもよいし、又は異なる作用機序の組み合わせであってもよい。

第一態様では、本発明は、アミノ又はカルボキシ末端に結合された約２〜約３６のアミノ酸残基又はそのアナログの長さを有するアミノ酸残基の第一セット、３〜８の疎水性アミノ酸残基又はそのアナログを含む第二セットを含む抗菌ペプチドであって、当該ペプチドが、抗菌活性又は改善された抗菌活性を獲得する、前記ペプチドに関する。

別の態様では、本発明は、当該抗菌ペプチド及び許容される緩衝液、希釈剤、単体、アジュバント、又は賦形剤を含む抗菌／医薬組成物に関する。

更なる態様では、本発明は、当該抗菌ペプチドを含む製品であって、包帯剤、プラスター、縫合糸、石鹸、タンポン、オムツ、シャンプー、歯磨き粉、抗にきび化合物、日焼け止めクリーム、繊維、カテーテル及び針の被膜、コンタクトレンズ、接着剤、創傷包帯剤の内容物、洗浄溶液、コンタクトレンズ、又はインプラントからなる群から選ばれる製品にも関する。

別の態様では、本発明は、治療又は診断における上記抗菌ペプチド又は上記抗菌／医薬組成物、又は上記製品の使用に関する。

最後の態様では、本発明は、細菌、ウイルス、寄生生物、真菌及び酵母からなる群から選ばれる微生物により引き起こされる抗菌性疾患又は感染のための医薬の製造のための抗菌ペプチド、抗菌／医薬組成物、又は当該抗菌ペプチドを含む製品の使用に関する。

このような抗菌ペプチドを提供することにより、抗菌ペプチドに対するアレルギー反応についてのリスクは、内在性タンパク質及び／又はペプチドのポリペプチド配列に由来するか、又は同様のアミノ酸残基組成を有するという事実のため低減されうる。短いペプチドを用いることにより、長いペプチド及びタンパク質に比べると当該ペプチドの安定性は増加し、そして製造費用は低減し、それにより本発明は経済的に有利でありうる。

本発明のペプチドは、微生物の効果的な予防、低減、又は除去を促進する組成物を提供する。それにより、抗生物質に対して耐性又は抵抗性である微生物に対抗できる可能性が高まる。さらに、市販の抗菌剤に対してアレルギーを有する哺乳動物が治療されることもある。改良型の内在性タンパク質に由来する抗菌／医薬組成物を提供することにより、哺乳動物が、これらの特定のペプチドに対してアレルギーを発達させる可能性を低減するか又はさらに除去することができる。これにより、抗菌／医薬組成物は、感染を予防するために医薬又は添加物のいずれかとして哺乳動物と当該抗菌／医薬組成物を接触させる適用に有用なものとなる。

さらに、短いペプチドの使用は、バイオアベイラビリティを改善しうる。さらに、グラム陰性及びグラム陽性細菌、又は真菌についての特異的又は好ましい作用を有する構造的に異なるペプチドを使用することは、様々な微生物の特異的標的を可能にし、そうして、耐性及び生態上の問題の発達を最小化する。哺乳動物中にすでに存在するペプチドに匹敵する、補助ペプチド（supplementing peptide)を用いることにより、新規の抗生物質によるさらなる生態上の圧力のリスクはさらに減少する。最終的に、これらの製剤は、内在性抗菌ペプチド又はそのアナログの効果を向上させうる。

本発明の抗菌ペプチドは、ヒトなどの哺乳動物に侵襲するか又は感染する微生物を限定せずに含む全ての種類の適用において微生物を予防、低減、又は除去するための選択を助ける抗菌剤のリストを増加させる。

定義
本出願及び発明の文脈で、以下の定義が用いられる。

「ヌクレオチド配列」という語句は、２以上のヌクレオチドの配列を意味することを意図する。当該ヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成又は合成起源、又はその混合物であってもよい。当該語句は、ＤＮＡ又はＲＮＡの一本鎖及び二本鎖形態を含む。

「抗菌組成物」という語句は、本発明に記載された発明にかかるペプチドを含む任意の組成物、例えば哺乳動物を攻撃する微生物に対抗するために有用な抗菌又は医薬組成物、並びに抗生物質並びに他の薬剤などの１以上の追加の抗菌剤を含む組成物などを意味することを意図する。

「置換」という語句は、アミノ酸残基が、他のアミノ酸残基により置き換えられるということを意味することを意図する。

「そのアナログ」という語句は、ペプチドの一部又は全体が、非タンパク質性のアミノ酸残基（合成又は半合成）、例えばアミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、ノルバリンγアミノ酪酸（Ａｂｕ）又はオルニチンに基づいているということを意味することを意図する。他の非タンパク質性のアミノ酸残基の例は、http://www.hort.purdue.edu/rhodcv/hort640c/polvam/po00008.htmで見出すことができる。

「取り除かれる」という語句は、少なくとも１のアミノ酸残基が取り除かれること、つまり別のアミノ酸残基により置き換えられることなくポリペプチドから放出されることを意味することを意図する。

「ホモロジー」という語句は、ポリペプチドの全体のホモロジーを意味することを意図し、特定のアミノ酸残基が同じ群（つまり疎水性、親水性）に属するということを意味する「類似性（similarities）」という言葉、又はアミノ酸残基が同一であるということを意味する「同一性（identity)」という言葉と混同してはならない。

「結合された」という語句は、共有結合又は化学結合で結合されることを意味することを意図する。

「抗菌ペプチド」という語句は、微生物を予防し、阻害し、低減するか、又は破壊するペプチドを意味することを意図する。抗菌活性は、実施例１の方法などの任意の方法により測定できる。

「両親媒性」という語句は、親水性及び疎水性のアミノ酸残基が、αへリックス構造、βストランド、直線状、環状、又は他の二次構造の反対の表面に沿って、並びにペプチドの一次構造に沿って、分布するということを意図し、これは分子の１又は幾つかのドメインが主に荷電されかつ親水性であり、そしてその他が重荷疎水性であるということをもたらす。

「カチオン性」という語句は、約２〜約１２、例えば約４〜約１０のｐＨ範囲において正味の正荷電を有する分子を意味することを意図する。

「微生物」という語句は、任意の生存している微生物を意味することを意図している。微生物の例は、細菌、真菌、ウイルス、寄生生物、及び酵母である。

「抗菌剤」という語句は、微生物の命を妨げ、阻害し、又は破壊する任意の薬剤を意味することを意図する。抗菌剤の例は、Sanford Guide to Antimicrobial Therapy(第３２版、Antimicrobial Therapy, Inc, US)で見ることができる。

本文脈では、アミノ酸名及び原子名は、タンパク質データバンク（ＰＮＢ）（www.pdb.org)により定義される通りに使用され、これは、ＩＵＰＡＣ命名法に基づいている（IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (residue names, atom names etc.), Eur J Biochem., 138, 9-37 (1984) とEur J Biochem., 152, 1 (1985)におけるその訂正版）。「アミノ酸」という語句は、アラニン（Ａｌａ又はＡ)、システイン(Ｃｙｓ又はＣ)、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ)、ヒスチジン(Ｈｉｓ又はＨ)、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、アルギニン（Ａｌｇ又はＲ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、及びチロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、又はそれらの誘導体からなる群に由来するアミノ酸を指すことを意図する。

説明
抗菌ペプチド
第一の実施態様では、本発明は、少なくとも１の疎水性アミノ酸残基又はそのアナログを含む第二セットに結合された約２〜約３６のアミノ酸残基又はそのアナログの長さを有するアミノ酸残基の第一セットを含む抗菌ペプチドであって、ここで当該ペプチドが、抗菌活性又は高い抗菌活性を取得する、前記抗菌ペプチドに関する。アミノ酸残基の第二セット（ここでアミノ酸残基は疎水性である）を結合することによって、当該ペプチドの抗菌活性が改善／増加されるか又は取得される。第二セットが疎水性アミノ酸残基を含むアミノ酸残基の第一及び第二セットの組合せを使用することによって、不活性なアミノ酸残基の第一セットを微生物に対して活性なものとすることすら可能となる。アミノ酸残基の第一セットは、微生物に対する親和性のみを有しているか、又は抗菌活性を有していてもよい。

疎水性アミノ酸残基の第二セットは、３、４、５、６、７又は８個のアミノ酸残基又はそのアナログであってもよく、そして疎水性アミノ酸残基は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ及びＷからなる群から選択されうる。疎水性アミノ酸残基の第二セットは、１及び同一の疎水性アミノ酸残基、例えばＷ又はＦのセットを含んでもよいし、又はそれらが疎水性である限り、異なる疎水性アミノ酸残基、並びにＤアミノ酸残基又は合成アミノ酸残基の混合物であってもよい。アミノ酸残基の第二セットは、アミノ酸残基の第一セットのＣ又はＮ末端において、又はその両末端において、アミノ酸残基の第一セットに結合されてもよい。３〜８のアミノ酸残基の第二セットの例は、Ｆ_(3-8)、Ｗ_(3-8)、Ｉ_(3-8)、Ｙ_(3-8)、Ｖ_(3-8)であり、そして当該アミノ酸残基又はそのアナログの混合物である。Ｆ_(3-8)は、３〜８のＦが、疎水性アミノ酸残基の第二セット（つまり、３、４、５、６、７又は８個のアミノ酸残基は、１及び同一であるか、又はその混合物、並びにそれらのアナログである）中に存在するということを意味することを意図する。アミノ酸残基の混合物の例は、ＦＷＹ、ＷＷＹＹＩＩ、ＷＹＩＶ、ＹＹＶＶＦＦなどであり、つまり、最も重要な態様は、末端が疎水性であり、そして末端が他の部分に結合しており、それにより抗菌活性の増加を可能にするということである。抗菌活性を増加させるために、所定数のアミノ酸が必要とされるということ、つまり３未満又は８超のアミノ酸残基が存在する場合は抗菌活性が減少するということが驚くべきことに発見された。第一セットは、カチオン性アミノ酸などのアミノ酸残基を有する直線状の構造であってもよいし、又は直線状構造を生じさせる他のアミノ酸残基であってもよい。第一セットのアミノ酸残基は、全体として正味の正荷電を有してもよい。

アミノ酸残基の第一セットは、アミノ酸残基の第一セットが微生物への結合性若しくは抗菌活性を示す限り、又はアミノ酸残基の第二セットと組み合わされる場合に抗菌性である限り、任意のソースから得られてもよい。アミノ酸残基の第一セットは、合成であってもよいし、半合成であってもよいし、並びに天然であってもよい。アミノ酸残基の第一セットの由来元であるタンパク質の例は、キニノゲンタンパク質、増殖因子タンパク質、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、凝血因子タンパク質、例えばトロンビン、第ＩＸ因子、及び第Ｘ因子、相補因子Ｃ３ａ、フォン・ウィルブラント因子、ビトロネクチン、タンパク質Ｃ阻害剤、フィブロネクチン、ケモカイン、ラミニン、スーパーオキシドジスムターゼ、プリオンタンパク質、又はＰＲＥＬＰ（プロリンアルギニンリッチ末端ロイシンリッチリピートタンパク質）である。他の例は、配列番号１、又は表中にあげられた配列、並びに配列番号２〜１２に由来するアミノ酸残基の第一セットである。アミノ酸残基の第一セットのサイズは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個のアミノ酸残基又はそのアナログであってもよい。

さらに、ペプチドは、１以上のアミノ酸残基、例えば２〜２１のアミノ酸残基において置換されてもよい。例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のアミノ酸残基は、取り除かれてもよいし、及び／又は置換されてもよい。

抗菌ペプチドは、１以上のアミノ酸残基、例えば１〜１００のアミノ酸残基、５〜５０のアミノ酸残基、又は６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０のアミノ酸残基だけ延長されてもよい。このような追加のアミノ酸は、非抗菌タンパク質に由来する抗菌ペプチドの配列に接する配列を繰り返してもよい。加えられる数は、どの微生物に対抗するか、ペプチドの安定性、毒性、治療される動物、或いはどの製品に当該ペプチドが入れられるか、及び抗菌ペプチドがどのペプチド構造に基づいているのかに左右される。ペプチドに加えられるアミノ酸残基の数は、生成物の選択、例えば、発現ベクター及び発現宿主、並びに抗菌／医薬組成物の製造の選択に左右される。ペプチドの抗菌効果を妨害しない限り、抗菌ペプチドの両側で、又はＮ末端若しくはＣ末端で延長されうる。抗菌ペプチドは、融合タンパク質であってもよいし、ここで当該抗菌ペプチドは他のペプチドに融合されてもよい。

さらに、抗菌ペプチドは、他の既知の抗菌ペプチド又は他の物質、例えば他のペプチド、資質、タンパク質、オリゴ糖、多糖、他の有機化合物、又は向き物質に作用可能なように結合されてもよい。例えば、抗菌ペプチドは、抗菌ペプチドが微生物の命を阻害、妨害、又は破壊する前に、哺乳動物内で破壊されることから抗菌ペプチドを保護する物質に結合されてもよい。

従って、抗菌ペプチドは、アミド化又はエステル化によりＣ末端で、そしてアシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、アルキル化などによりＮ末端で修飾されてもよい。

抗菌ペプチドにより阻害、妨害、又は破壊される微生物の例は、細菌、グラム陽性及びグラム陰性細菌の両方、例えばエンテロコッカス・ファエカリス（Enterococcus faecalis)、エシェリキア・コリ（Eschericia coli)、シュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa)、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes)、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus)、フィネゴルジア マグナ（Finegoldia magna）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylorii）、ウイルス、寄生虫、真菌、酵母、例えばカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）及びカンジダ・パラプシロシ（Candida parapsilosi）、並びにマラセジア種（Malassezia）である。他の関心を寄せる微生物として、非限定的に、シトロバクター ｓｐ.(Citrobacter sp.)、クラブシエラ sp.(Klebsiella sp.)、エンテロバクター sp.(Enterobacter sp.)、モルゲネラ(Morganella）、プロビデンシア(Providencia）、リステリア sp.(Listeria sp.)、サルモネラ sp.(Salmonella sp.)、セラチア sp.(Serratia sp.)、シゲラsp. (Shigella sp.)、エルシニア sp.(Yersinia sp.)、パスツレラ sp.(Pasteurella sp.)、ビブリオ sp.(Vibrio sp.)、カンピロバクター sp.(Campylobacter sp.)、ヘモフィラス sp.(Haemophilus sp.)、ボルデテラ sp.(Bordetella sp.)、ブルセラ sp.(Brucella sp.）、ネイセリア sp.(Neiserria sp.)、レジオネラ sp.(Legionella sp.)、ミオプラスマ sp.(Mycoplasma sp.)、及びクラミジア sp.(Chalmydia sp.)が挙げられる。他の例は、ウイルス、例えば単純疱疹ヘルペス、バリゼラ・ズースター(Varizella Zooster）、インフルエンザウイルスである。寄生生物の例は、内部寄生虫及び外部寄生虫であり、例えばマラリア形態を含む。

抗菌ペプチドは、天然ソース、例えばヒト細胞、ｃＤＮＡ、ゲノムクローン、化学合成から得られることもあり、又は細胞ソースからの発現産物として組み換えＤＮＡ技術により得られることもある。

抗菌ペプチドは、自動化方法による合成を含む標準的な化学方法により合成されうる。一般的に、ペプチドアナログは、カップリング試薬としてＨＡＴＵ（Ｎ−［ジメチルアミノ−１Ｈ−１．２．３．−トリアゾロ［４，５−Ｂ］ピリジン−１−イルメチル］−Ｎ−メチルメタンアンモニウムヘキサフルオロホスフェートＮ−オキシド、又はＨＯＡｔ−１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールなどのほかのカップリング試薬を用いた標準的な固相Ｆｍｏｃ保護戦略に基づいて合成される。当該ペプチドは、適切なスカベンジャーを含むトリフルオロ酢酸を用いて固相レジンから切断され、これは側鎖の官能基も脱保護する。粗製ペプチドをさらに調製逆層クロマトグラフィーを用いて生成する。他の精製方法、例えば分画クロマトグラフィー、ゲルろ過、ゲル電気泳動、又はイオン交換クロマトグラフィーが使用されてもよい。当該技術分野に知られているほかの合成技術、例えばｔＢｏｃ保護戦略、又は異なるカップリング試薬の使用などは、同等のペプチドをもたらすために使用することができる。

あるいは、ペプチドは組み換え精製により合成されることもある（US 5,593,866を参照のこと）。細菌、例えば大腸菌、酵母、例えばサッカロミセス・セルビシエ(Saccharomyces cerevisiae)又はピチア、昆虫、例えばＳｆ９、及び哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ又はＣＯＳ−７を含む様々な宿主系がペプチドアナログの生産に適している。宿主の各々に使用するために利用できる多くの発現ベクターが存在し、そして本発明は、当該ベクター及び宿主が、抗菌ペプチドを生産できる限りにおいて、それらのうちのいずれにも限定されることはない。大腸菌においてクローニングし、そして発現させるためのベクター及び方法は、例えばSambrookら（Molecular Cloning.: A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1987)及びAusubelら（Current Protocol in Molecular Biology, Greene Publishing Co., 1995）に見出すことができる。

最終的に、本ペプチドは、血漿、血液、様々な組織などから精製されてもよい。当該ペプチドは、内在性であってもよいし、又は精製されたタンパク質の酵素又は化学切断後に生成されてもよい。例えば、タンパク質は、トリプシンにより切断されてもよいし、そして得られた抗細菌ペプチドはさらに大スケールで単離されてもよい。

抗菌ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、宿主に適した適切な発現ベクターに導入される。好ましい実施態様では、当該遺伝子は、ベクター中にクローニングされて、融合タンパク質を作り出す。当該ペプチド配列の単離を促進するために、化学切断（例えばＣＮＢｒ）または酵素切断（例えばＶ８プロテアーゼ、トリプシン）に感受性のアミノ酸を用いてペプチドと融合パートナーを架橋する。大腸菌での発現では、融合パートナーは、好ましくは、封入体形成へと発現を仕向ける通常の細胞内タンパク質である。このような場合、最終生成物を放出するために、切断の後に当該ペプチドを復元する必要性がない。本発明では、融合パートナーとペプチド遺伝子を含むＤＮＡカセットが、発現ベクターに組み込まれてもよい。好ましくは、発現ベクターは、宿主内に挿入されたＤＮＡ配列の有効な転写を促進する誘導性又は構成的プロモーターを含むプラスミドである。

カルシウム媒介性の技術、電気穿孔、又は当業者に知られているほかの方法による慣用の形質転換技術により、宿主に発現ベクターを導入できる。抗菌ペプチドをコードする配列は、哺乳動物細胞、既存のｃＤＮＡ又はゲノムクローンなどの天然ソース、または合成のものから生成されうる。使用されうる１の方法は、抗菌ＤＮＡテンプレートの５’及び３’末端に由来する増殖プライマーを用いてＰＣＲの助けを借り、そして典型的に当該ベクターのクローニング部位に関して選択された制限酵素部位を一般的に取り込むことにより、抗菌ペプチドを増幅することである。必要に応じて、翻訳開始及び終結コドンをプライマー配列に操作して入れることができる。抗菌ペプチドをコードするこの配列は、コドンの選択が最終的な治療を受ける哺乳動物を考慮している限り、特定の宿主において発現を促進するために、コドン最適化されてもよい。こうして、例えば、抗菌ペプチドが細菌中で発現されるならば、当該コドンは細菌用に最適化される。

発現ベクターは、誘導抗菌ペプチドの発現を促進するためにプロモーター配列を含んでもよい。必要に応じて、１以上のエンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナル配列、分泌シグナル配列、複製起点、選択可能なマーカーなどの調節配列も含められうる。当該調節配列は、互いに作用可能なように結合されており、転写及びそれに続く翻訳を可能にする。抗菌ペプチドが細菌中で発現される場合、調節配列は、細菌内で使用されるように設計されている配列であり、そしてそれらは当業者に周知である。適切なプロモーター、例えば構成的及び誘導性プロモーターが広く利用でき、そしてＴ５、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６ファージ由来のプロモーター、及びｔｒｐ、ｌｐｐ、及びｌａｃオペロン由来のプロモーターを含む。

抗菌ペプチドを含むベクターが、細菌内で発現されるならば、複製起点の例は、高コピー数を生じさせるものか又は低コピー数を生じさせるもののいずれか、例えばｆ１−ｏｒｉ及びｃｏｌＥ１ｏｒｉである。

好ましくは、当該プラスミドは、宿主において機能する少なくとも１の選択可能なマーカーを含み、これは形質転換された細胞を同定し、及び／又は選択的に増殖させることを可能にする。細菌宿主に対する適切な選択可能なマーカー遺伝子として、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、及び当該技術分野に知られている他のものが挙げられる。

細菌における発現用のプラスミドの例として、ｐＥＴ発現ベクターであるｐＥＴ３ａ、ｐＥＴ１１ａ、ｐＥＴ１２ａ−ｃ、及びｐＥＴ１５ｂ（Novagen, Madison, Wis.から利用できる）が挙げられる。低コピー数のベクター（例えば、ｐＰＤ１００）は、大腸菌宿主にとって有害なペプチドの十分な過剰生産をするために使用することができる（Derschら、FEMS Microbiol. Lett. 123: 19, 1994)。

適切な宿主の例は、細菌、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞である。しかしながら、大腸菌などの細菌が使用されることが多い。

発現された抗菌ペプチドは、アフィニティー、サイズ排除、又はイオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどの慣用の単離技術によって単離される。異なる精製技術は、「A Biologist's Guide to Principles and Techniques of Practical Biochemistry」(Wilson及びGolding編、Edward Arnold, London）又は「Current Protocols in Molecular Biology」(John Wiley & Sons, Inc.)に見出すことができる。

従って、当該ペプチドは、様々なグラム陰性細菌に由来するリポ多糖に結合でき、そして不活性化することができ、そうしてリポ多糖誘導性の炎症の阻害剤として作用する。当該ペプチドは、真核細胞の増殖を調節することもある。発明にかかる抗菌ペプチドは、包帯剤、プラスター、縫合糸、石鹸、タンポン、オムツ、シャンプー、歯磨き粉、抗にきび化合物、日焼け止めクリーム、繊維、接着剤、創傷包帯剤の内容物、洗浄溶液、コンタクトレンズ又はインプラントなど中に配置／取り込まれてもよい。

さらに、本発明は、上に記載される抗菌ペプチド及び医薬として許容される緩衝液、希釈剤、担体、アジュバント又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。さらなる化合物、例えば他の抗菌ペプチド、免疫調節剤、かゆみ止め薬が当該組成物に含まれてもよい。他の抗菌ペプチドの例は、WO 2005/061535及びWO 2005/001737に開示される。他の例として、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、ＥＧＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤が挙げられる。抗菌／医薬組成物は、十分に貯蔵安定性であり、そしてヒト及び動物に投与するのに適している当業者に知られた様式で調製される。医薬組成物は、例えばフリーズドライ、スプレードライ、又はスプレー冷却を介して凍結乾燥されてもよい。

「医薬として許容される」は、活性成分、つまり抗菌ペプチドの生物活性の効果を低減しない非毒性物質を意味する。このような医薬として許容される緩衝液、担体、又は賦形剤は、当該技術に周知である（「Remington's Pharmaceutical Science」第１８版、A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) 及びｄ「handbook of Pharmaceutical Excipients」第三版、A.Kibbe編、Pharmaceutical Press (2000)を参照のこと）。

「緩衝液」という語句は、ｐＨを安定させる目的を有する酸−塩基混合物を含む水溶液を意味することを意図する。緩衝液の例は、Ｔｒｉｚｍａ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓ、ＨＥＰＢＳ、ＭＥＳ、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ホウ酸塩、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、酒石酸塩、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＣＡＢＳ、カコジレート、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、エタノールアミン、グリシン、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、イミダゾール乳酸、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＳＳＰＥ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳＯ及びＴＥＳである。

「希釈剤」という語句は、医薬調製品中にペプチドを希釈する目的を有する水溶液又は非水性の溶液を意味することを意図する。希釈剤は、１以上の生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール又はオイル（例えば、紅花油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、又はゴマ油）であってもよい。

「アジュバント」という語句は、当該ペプチドの生体効果を増加させるために製剤に加えられる任意の化合物を意味する。アジュバントは、異なるアニオン、例えば非限定的に、フロリド、クロリド、ブロミド、ヨージド、チオシアネート、スルファイト、ヒドロキシド、ホスフェート、カルボネート、ラクテート、グリコレート、シトレート、ボレート、タートレート、及び種種のアシル組成物のアセテートを伴う１以上の亜鉛、銅、又は銀の塩でありうる。

賦形剤は、炭水化物、重合体、脂質及びミネラルのうちの１以上でありうる。炭水化物の例として、例えば凍結乾燥を促進するために組成物に加えられるラクトース、スクロース、マンニトール、及びシクロデキストリンが挙げられる。ポリマーの例は、粘度調節のため、生体接着を達成するため、又は化学及びタンパク質分解から脂質を保護するためのデンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギネート、カラギーナン、ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリ−アクリル酸、ポリスルホネート、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレン−オキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、異なる加水分解の程度のポリビニルアルコール／ポリビニルアセテート、及びポリビニルピロリドン、異なる分子量のもの全てである。脂質の例は、液体蓄積の減少又は有利な色素性質などの利点を得るために組成物に加えられる脂肪酸、リン脂質、モノ、ジ、及びトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質及び糖脂質、異なるアシル鎖長及び飽和度の全て、卵レシチン、大豆レシチン、水素付加卵及び大豆レシチンである。

発明にかかる製剤は、１以上の単糖又は二糖、例えばキシリトール、ソルビトール、マンニトール、ラクチトール、イソマルト、マルチトール又はキシロシド、及び／又はモノアシルグリセロール、例えばモノラウリンを含みうる。担体の特徴は、投与経路に左右される。１の投与経路は、局所投与である。例えば、局所投与では、好ましい担体は活性ペプチド、並びにポリマーゲル、液晶相及びマイクロエマルジョンを含む乳化クリームであるが、他の一般的な担体、例えばある石油／ミネラルに基づく、及び植物に基づく軟膏を使用することができる。

組成物は、１以上のペプチド、例えば１、２、３又は４の異なるペプチドを含んでもよい。異なるペプチドの組合せを使用することにより、抗菌効果は増加することがあり、及び／又は微生物が、抗菌剤に対して耐性及び／又は抵抗性となる可能性を低減しうる。

塩としてのペプチドは、例えば塩酸、硫酸、硝酸、臭化水素酸、リン酸、過塩素酸、チオシアン酸、ホウ酸などの無機酸、或いはギ酸、酢酸、ハロ酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、グルコン酸、乳酸、マロン酸、フマル酸、アントラニル酸、安息香酸、桂皮酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸などの有機酸を伴った酸添加物でありうる。一価ナトリウム、カリウム又は二価亜鉛、マグネシウム、銅、カルシウムなどの無機塩（これら全ては対応するアニオンを伴う）は、抗菌組成物の微生物活性を改善するために加えられてもよい。

本発明の抗菌／医薬組成物は、リポソームの形態であってもよく、ここで当該ペプチドは、他の医薬として許容される担体に加えて、見せる、不溶性単層及び液晶として凝集体中に存在する両親媒性物質、例えば脂質と混合されてもよい。リポソーム製剤のための適切な脂質は、非限定的に、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙げられる。このようなリポソーム製剤の調製は、例えば、US4,235,871に見出すことができる。

本発明の抗菌／医薬組成物は、生物分解性マイクロスフィアの形態であってもよい。脂肪性ポリエステル、例えばポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ＰＬＡとＰＧＡのコポリマー（ＰＬＧＡ）又はポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、及びポリ無水物は、マイクロスフィアの製造において生分解性のポリマーとして広く使用された。このようなマイクロスフィアの製造は、US5,851,451及びEP0213303に見出すことができる。

本発明の抗菌／医薬組成物は、ポリマーゲルの形態であってもよく、ここでデンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギネート、カラギーナン、ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホネート、ポリエチレングリコール/ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド/ポリプロピレンオキシドコポリマー、異なる加水分解度のポリビニルアルコール／ポリビニルアセテート、及びポリビニルピロリドンが、ペプチドを含む溶液の粘度を高めるために使用される。当該ポリマーは、ゼラチン又はコラーゲンを含んでもよい。

或いは、抗菌ペプチドは、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール又はオイル（例えば、紅花油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油又はごま油）、トラガカントゴム及び／又は様々な緩衝液中に溶解されてもよい。医薬組成物は、イオン、及び抗菌ペプチドの増強作用のための所定のｐＨを含んでもよい。

抗菌／医薬組成物は、滅菌などの慣用される医薬操作を行ってもよく、及び／又は本明細書のいたるところに開示される保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、フィラーなどの慣用されるアジュバントを含んでもよい。

本発明に記載の医薬組成物は、局所的又は全身に投与されてもよい。投与経路は、局所、眼、鼻腔、肺、頬側、非経口（静脈内、皮下、及び筋注）、口腔、非経口、膣及び直腸経路を含む。インプラントからの投与も可能である。適切な剤形は、例えば、顆粒、粉末、錠剤、被覆錠剤、（マイクロ）カプセル、坐薬、シロップ、乳濁液、マイクロ乳濁液である。水、オイル及び界面活性剤、液晶相からなる光学的等方性熱力学的に安定なシステムと定義される。長期間の秩序状態であるが、短期間の無秩序状態により特徴付けられるシステム（例えば層状、六角形及び立方体相、水又は油連続のいずれか）、又はその分散されたカウンターパート、ゲル、軟膏、分散剤、懸濁剤、クリーム、エアロゾル、液滴、又はアンプル中の注射溶液、及び活性化合物の保護放出を伴う製剤、その製剤の賦形剤、希釈剤、アジュバント又はキャリアは上に記載されるように習慣的に使用される。医薬組成物は、包帯剤、プラスター又は縫合糸などで提供されてもよい。

医薬組成物は、医薬として有効な量で患者に投与されよう。「医薬として有効な量」は、当該医薬が投与される条件に関連して所望の効果を産生するために十分である量を意味する。正確な容量は、化合物の活性、投与様式、障害の性質及び重篤度、患者の年齢及び体重によって左右され、異なる用量が必要とされてもよい。用量の投与は、個別の用量の形態で、又は幾つかの少ない用量単位の形態で一回投与により、及び一定の間隔で分割された要領の複数回投与により行うことができる。

本発明の医薬組成物は、単独で、又は他の治療薬、例えば抗生物質、抗炎症薬、又は消毒剤、例えば抗細菌薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、及び抗寄生生物薬と組み合わせて投与されうる。或いは、医薬組成物は、１以上の抗生物質又は消毒剤を含む。例として、ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、セファマイシン、カルバペネム、モノバクタム、アミノ配糖体、糖ペプチド、キノロン、テトラサイクリン、マクロライド、及びフルオロキノロンが挙げられる。消毒剤として、ヨウ素、銀、銅、クロルヘキシジン、ポリヘキサジン及び他のビグアナイド、キトサン、酢酸、及び過酸化水素が上げられる。これらの薬剤は、同じ医薬組成物の一部として取り込まれてもよいし、又は別々に投与されてもよい。医薬組成物は、ステロイド及びマクロラクタム誘導体などの抗炎症薬を含んでもよい。

本発明は、とりわけ、ヒト及び他の哺乳動物、例えばウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ラクダなどに関する。こうして、本方法は、ヒトの治療と獣医適用の両方に適用できる。このような治療に適した対象は、感染の確立された特徴、例えば熱、脈、微生物の培養などにより同定されてもよい。抗菌ペプチドで治療されうる感染としては、微生物により引き起こされるか又は微生物のため生じる感染が挙げられる。微生物の例として、細菌（例えば、グラム陽性、グラム陰性）、真菌（例えば酵母及びカビ）、寄生生物（例えば原虫、線虫、条虫、及び吸虫）、ウイルス及びプリオンが挙げられる。これらのクラスにおける特定の生物が周知である（例えば、Davisら、Microbiology, 第３版、Harper & Row、1980を参照のこと)。感染としては、非限定的に慢性の皮膚潰瘍、感染性の急性及び慢性創傷、及び火傷損傷、感染性皮膚湿疹、膿痂疹、アトピー性皮膚炎、ざ瘡、外耳炎、腟感染症、脂漏性皮膚炎、経口感染及び歯根膜炎、カンジダの間擦疹、結膜炎及び他の眼感染症例えば、Ｐ．アエルギノーサ(P. aeruginosa)角膜炎、及び肺炎が挙げられる。

したがって、医薬組成物は、火傷損傷、外科手術後及び皮膚外傷の後の予防処置に使用されてもよい。医薬組成物は、人体と接触する外部物質、例えばコンタクトレンズ、整形移植片、及びカテーテルなどの貯蔵及び処置を意図した溶液中に含まれてもよい。

さらに、医薬組成物は、アトピー性皮膚炎、膿痂疹、慢性皮膚潰瘍、感染性急性創傷及び熱傷創傷、ざ瘡、外耳炎、真菌症、肺炎、脂漏性皮膚炎、カンジダ間擦疹、カンジダ腟炎、中咽頭カンジダ症、眼感染症（細菌性結膜炎）、及び鼻ＭＲＳＡの感染症（例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌輸送）の治療のための使用であってもよい。

医薬組成物は、洗浄溶液、例えばレンズ殺菌及び貯蔵溶液に使用されてもよいし、又は尿道カテーテルの使用又は中枢静脈カテーテルの使用に関連した細菌感染を予防するために使用されてもよい。

さらに、当該組成物は、プラスター、接着剤、縫合糸の中で外科手術後の感染を予防するために使用されてもよいし、又は創傷包帯剤に含まれてもよい。

抗菌ペプチドは、ポリマー、繊維などの中で使用されて、抗菌表面又は化粧品を作成してもよいし、そして個人のケア製品（石鹸、シャンプー、歯磨き粉、抗にきび薬、日焼け止めクリーム、タンポン、オムツなど）に医薬組成物を添加してもよい。

最終的に、本発明は、微生物感染を有するか、又はアレルギーを患う哺乳動物を治療する方法であって、当該患者に治療有効量の上で定義される医薬組成物を投与することを含む。

以下の例は、非限定的に任意の様式、形状、又は形態の本発明を明確に又は暗に例示する。

抗菌ペプチド
ペプチド：ペプチドは、Sigma-Genosysからペプチド合成プラットフォームにより作成された（PEPscreen（商標）、Custom Peptide Libraries, SigmaGenosys)。収量は、１〜６ｍｇであり、そしてペプチド長は２０アミノ酸であった。ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ質量分析法を、これらのペプチドについて行った。２０Ｍｅｒの平均粗純度は〜６０％であった。ペプチドを凍結乾燥状態で、９６ウェルチューブラックに入れて提供された。生物学的試験の前に、ＰＥＰscreenペプチドをｄＨ２Ｏ中に希釈し（５ｍＭストック）、そして―２０℃で貯蔵した。このストック溶液を次の実験に用いた。

微生物
エシェリキア コリ（Eschericia coli)ＡＴＣＣ２５９２２、スタフィロコッカス アウレウス（Staphylococcus aureus）ＡＴＣＣ２９２１３、及び単離真菌カンジダ アルビカンス（Candida albicans)ＡＴＣＣ９００２８を、Department of Bacteriology, Lund University Hospital から取得した。

実施例１
放射状拡散アッセイ
放射状拡散アッセイ（ＲＤＡ）を、実質的に以前に記載されたとおりに行った（Lehrer, R. I., Rosenman, M., Harwig, S. S., Jackson, R. & Eisenhauer, P. (1991) Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides, J Immunol Mehtods. 137, 167-73)。結果を表１a-eに示す。簡潔に記載すると、細菌（E.コリ（E. coli)及びＳ．アウレウス（S. aureus)又は真菌（Ｃ．アルビカンス（C. albicans））を、１０ｍｌのトリプシン大豆培養液（Becton-Dickinson, Cockeysville, MD）中で対数増殖期の途中まで増殖させた。微生物を１回１０ｍＭ・Ｔｒｉｓ、ｐＨ３で洗浄した。４×１０⁶細菌ｃｆｕ又は１×１０⁵細菌ｃｆｕを５ｍｌのアガロースゲル層（０．０３％（ｗ／ｖ）ＴＳＢ、１％（ｗ／ｖ）低電気浸透型）アガロース（Sigma, St Louis MO）及び終濃度０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（Sigma））に加えた。基層を直径８５ｍｍのペトリ皿へと注いだ。アガロースを固化させた後に、４ｍｍ直径のウェルをくり貫き、そして６μｌの試験サンプルを各ウェルへと加えた。プレートを３７℃で３時間インキュベートして、当該ペプチドを拡散させた。次に下層のゲルを５ｍｌの溶融された上層（６％ＴＳＢ及び１％Ｌｏｗ−ＥＥＯアガロースを含むｄＨ₂Ｏ）でカバーした。ペプチドの抗菌活性を、細菌について３７℃及びカンジダ・アルビカンスについて２８℃で１８〜２４時間インキュベートした後における各ウェルの周囲の透明領域として可視化した。上記微生物に対して高い効果を示すことが発見され、スクリーニングされたペプチドのほかの例を以下に挙げる。結果の幾つかは、Ｃ．アルビカンスに対する効果を示す表１ｃ、Ｅ．コリに対する効果を示す表１ｄ、そしてＳ．アウレウスに対する効果を示す表１ｅにおいて見出すことができる。

補体
ＣＮＹ１
ＣＮＹ１ＷＷＷ ＣＮＹＩＴＥＬＲＲＱＨＡＲＡＳＨＬＧＬＡＷＷＷ
ＣＮＹ１８７
ＣＮＹ１８７ＷＷＷ ＣＫＹＩＬＬＬＲＲＱＨＡＲＡＷＲＲＧＬＲＷＷＷ

増殖因子
ＧＫＲ２２
ＧＫＲ２２ＷＷＷ ＧＫＲＫＫＫＧＫＧＬＧＫＫＲＤＰＣＬＲＫＹＫＷＷＷ
ＰＫＲ２１
ＰＫＲ２１ＷＷＷ ＰＫＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲＮＲＫＫＫＮＷＷＷ

凝血因子ＩＩ
ＶＦＲ１７
ＶＦＲ１７ＷＷＷ ＶＦＲＬＫＫＷＩＱＫＶＩＤＱＦＧＥＷＷＷ

タンパク質Ｃ阻害剤
ＳＥＫ２０
ＳＥＫ２０ＷＷＷ ＳＥＫＴＬＲＫＷＬＫＭＦＫＫＲＱＬＥＬＹＷＷＷ

ＰＲＥＬＰ
ＱＰＴ２２
ＱＰＴ２２ＷＷＷ ＱＰＴＲＲＰＲＰＧＴＧＰＧＲＲＰＲＰＲＰＲＰＷＷＷ

ＬＬ−３７
ＬＬ−３７
ＬＬ−３７ＷＷＷ ＬＬＧＤＦＦＲＫＳＫＥＫＩ
ＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥＳＷＷＷ

オミナガン
オミガナンＷＷＷ ＩＬＲＷＰＷＷＰＷＲＲＫＷＷＷ

実施例２
ＥＤＴＡ−血液を８００ｇで１０分間遠心し、その後血漿及び軟膜を取り除いた。赤血球を３回洗浄し、そして５％ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に懸濁した。次に、細胞を回転させて１時間３７℃で、ペプチド(３〜６０μＭ)の存在下でインキュベートした。２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、陽性対象として機能した。次にサンプルを８００ｇで１０分間遠心した。ヘモグロビン放出がないことをλ５４０ｎｍで計測し、そしてプロットにおいてＴｒｉｔｏｎＸ−１００誘導性の溶血の割合として表現した（表１ａ）。

Claims (10)

1. 以下の：
   ａ）以下の：
   （１）HKHGHGHGKHKNKGKKN、
   （２）GKHKNKGKKNGKHNGWK、
   （３）KNKGKKNGKH、
   （４）KNKGKKNGKHGSGSP、
   （５）GKRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK、
   （６）PKRKKKGGKNGKNRRNRKKKN、
   （７）NKKGKNKHKGHGHGHKH、及び
   （８）HKHGHGHGKHKNKGKK
   からなる群から選ばれるアミノ酸残基の第一セット、ここで当該第一セットのアミノ酸残基が、抗菌活性を有し、親水性であり、かつ高度に正荷電しており、
   ｂ）Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、及びＷからなる群から選ばれる同一の３〜５の疎水性アミノ酸からなるアミノ酸残基の第二セット、ここで当該第二セットのアミノ酸残基が、第一セットのアミノ酸残基のアミノ末端又はカルボキシ末端に結合されており、それにより第一セットのアミノ酸残基のみに比較して高い抗菌活性を有する
   を含む抗菌ペプチド。
2. 前記第二セットのアミノ酸残基が、Ｆ、Ｙ及びＷからなる群から選ばれる、請求項１に記載の抗菌ペプチド。
3. 前記ペプチドが、表１ａの４、７、１２、１３、１５、１８、２１〜３２、４５、４７〜４８、５３〜５５及び５７〜６１、並びに表１ｂのＴ６１からなる群から選ばれる、請求項１に記載の抗菌ペプチド。
4. 前記新規の抗菌ペプチドが、Ｃ末端でエステル化により改変されるか、及び／又はＮ末端でＰＥＧ化又はアルキル化により改変される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗菌ペプチド。
5. 任意のアミノ酸が、対応するＤアミノ酸により置き換えられている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗菌ペプチド。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗菌ペプチド、及び許容される緩衝剤、希釈剤、担体、アジュバント、又は賦形剤を含む、抗菌医薬組成物。
7. 前記抗菌医薬組成物が、顆粒、粉末、錠剤、被膜錠剤、カテーテル及び針の被膜、カプセル、坐剤、シロップ、エマルジョン、ゲル、軟膏、分散剤、懸濁剤、クリーム、エアロゾル、液滴、又は注射剤の形態である、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗菌ペプチド、又は請求項６又は７に記載の抗菌医薬組成物を含む製品であって、ここで当該製品が、包袋、プラスター、縫合糸、石鹸、タンポン、おむつ、シャンプー、歯磨き粉、抗ニキビ化合物、日焼け止めクリーム、線維、接着剤、創傷被覆材、洗浄溶液、コンタクトレンズ、又はインプラントである、前記製品。
9. 細菌、ウイルス、寄生生物、真菌、及び酵母からなる群から選ばれる微生物により引き起こされる疾患又は感染の治療用の医薬組成物であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗菌ペプチドを含む医薬組成物。
10. 前記疾患が、アトピー性皮膚炎、膿痂疹、慢性皮膚潰瘍、感染性急性及び慢性創傷及び火傷創傷、ざ瘡、外耳炎、真菌症、肺炎、脂漏性皮膚炎、カンジダ間擦疹、カンジダ腟 炎、中咽頭カンジダ症、眼感染症及び鼻感染症からなる群から選ばれる、請求項９に記載の医薬組成物。