CZ301822B6 - Peptid, zpusob jeho prípravy a jeho použití - Google Patents

Abstract

Rešení se týká peptidu, izolovaného z jedových vácku samotárských vcel Melecta albifrons, který má vzorec H-Gly-Phe-Leu-Ser-Ile-Leu-Lys-Lys-Val-Leu-Pro-Lys-Val-Met-Ala-His-Met-Lys-NH.sub.2.n. (I), zpusobu jeho prípravy a jeho použití pro výrobu léciva pro lécení mikrobiálních, virových a plísnových onemocnení a pro lécení rakovin.

Description

Peptid, způsob jeho přípravy a jeho použiti

Oblast techniky

Vynález se týká peptidu, vyskytujícího se v přírodním materiálu, o vzorci I

H-Gly-Phe-Leu-Ser-ne-Leu-Lys-Lys-Val-Leu-Pro-Lys-Val--Met-Ala“His~Met-Lys-NH2 (I)» způsobu jeho výroby ajeho použití jako antimikrobiální, antivirové, protiplísňové a protirakovinné látky.

i5 Dosavadní stav techniky

Pro přežití v přírodě se všechny živé organismy musí bránit proti svým přirozeným nepřátelům, jako jsou například mikroorganismy. První obrana proti mikrobiální infekci, kterou si příroda během evoluce vyvinula, spočívá v sekreci látek peptidové povahy dnes v odborné terminologii označované jako antimikrobiální peptidy [1 ]. Například v říši hmyzu představují antimikrobiální peptidy hlavní prostředek obrany proti mikrobům [2]. S přihlédnutím k prostředí, ve kterém se hmyz pohybuje, se musí jednat o peptidy velmi účinné. Tyto peptidy jsou schopny velice rychle zabíjet bakterie a některé další mikroorganismy, a to mechanismem zcela odlišným než jaký využívá imunitní systém vyšších organismů. I když tento mechanismus ještě není zcela objasněn, v podstatě spočívá v narušení buněčné membrány tvorbou transmembránových pórů nebo iontových kanálů. To způsobí únik metabolitů a zborcení celé mikrobiální struktury [3]. Obecně je též známo, že antimikrobiální peptidy u bakterií nevyvolávající resistenci, jako tradiční antibiotika. Zvláštní skupina peptidů s antimikrobiálním účinkem se nachází vjedu hmyzu řádu Hymenoptera [4]. V přírodě je antimikrobiální účinek peptidů isolovaných z jedu vos, včel, čmeláků a mravenců většinou sekundární, a jejich hlavní úloha spočívá spíše v toxicitě či vyvolání bolesti a zánětu, jako třeba u peptidů patřících do skupiny mastoparanů [5].

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká peptidu, vyskytujícího se v přírodním materiálu, o vzorci I

H-Gly-Phe-Leu-Ser-Ile-Leu-Lys-Lys-Val-Leu-Pro-Lys-Val-Met-Ala-HÍs-Met-Lys-NH₂ (I), způsobu jeho výroby a jeho použití jako antimikrobiální, antivirální, protiplísňové a protirakovinné látky.

Podrobný popis vynálezu

Peptid vzorce (I) jsme nazvali melectin a byl isolován zjedových váčků samotářských včel Melecta albifrons. Peptid I má výrazný antimikrobiální účinek a nízkou hemolytickou aktivitu.

Jedná se o jedinečný nově získaný peptid s výraznými antimikrobiálními účinky a minimální hemolytickou aktivitou. Tento peptid má jedinečnou primární strukturu, která tvoří účinnou sekundární strukturu v přítomnosti buněčné membrány a chemických látek membráně podobných.

-1CL JU13ZZ BO

Sekundární struktura melectínu, kteráje neuspořádaná ve vodném prostředí, snadno přechází na strukturu α-helixu v přítomnosti látek tuto strukturu podporujících, jako jsou trifluoroethanol či SDS [6], či v kontaktu s biologickou membránou. V tzv. Edmundsonově kruhové projekci (Obr. 1) je patrný amphipathický charakter [6, 7] melectínu s jednotlivými aminokyselinami ses5 kupenými do dobře definovaného hydroťbbního (v šedém poli) i hydrofilního sektoru. Rozdělení těchto dvou odlišných sektorů na opačné strany α-helixu, nebo-li tzv. amphipathicita [7], hraje výraznou úlohu při interakci antimikrobiálního peptidu s bakteriální membránou a je tedy jedním z nejdůležitějších faktorů vedoucích k narušení bakteriální membrány a v konečném výsledku ke smrti bakterie [8]. V tomto procesu se zároveň uplatňuje kationicita peptidu [6], která je io v případě melectínu zajištěna přítomností čtyř lysinových zbytků soustředěných vhydrofilním sektoru peptidu. Toto prostorové uspořádání umožňuje elektrostatickou atrakci kladně nabitého sektoru peptidu k záporně nabitým fosfátovým skupinám bakteriální membrány. Hydrofobní sektor peptidu je poté vnořen do lipofilní části membrány a po dosažení určité koncentrace peptidu na bakteriální stěně dojde k jejímu narušení. Teoreticky může melectin v tzv. anisotropním prostředí vytvořit strukturu optimálního α-helixu o pěti závitech. Tato helikálni struktura je stabilizována spojením jednotlivých závitů pomocí vodíkových můstků mezi kyslíky a-karbonylů jednoho závitu a vodíky -NH- skupin závitu následujícího. V případě melectínu však může přítomnost prolinového zbytku (Pro) v poloze 11 tuto helikálni strukturu lehce narušit, a to z toho důvodu, že Pro nemůže díky absenci vodíku na svém dusíkovém atomu vodíkový můstek vytvo20 rit. Zároveň k tomuto narušení přispívá i cyklická struktura prolinu svým sterickým vlivem. Tento efekt, odborně značený jako Pro-kink [9, 10], vede k mírnému ohnutí celé a-helikální struktury a ukazuje se, že právě toto mírné narušení helikálni struktury peptidu je zodpovědné za velmi nízký nežádoucí hemolytický účinek melectínu. Pokud je Pro v molekule synthetického peptidu nahrazen jinou aminokyselinou, hemolytický účinek se průkazně zvýší. Podobný efekt byl popsán i v případě jiných antimikrobiálních peptidů [9, 10]. Jakékoliv další chemické změny provedení v molekule melectínu vedou ke změně jeho sekundární struktury, čímž dojde ke snížení či zvýšení jeho biologických aktivit.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace z přírodního materiálu

Včely Melecta albifrons byly pochytány a po několikadenním skladování při -20 °C byly vypreparovány jedové váčky ze čtyř jedinců. Ty byly extrahovány směsí 50% vodného acetonitrilu s obsahem 0,1% kyseliny trifluoroctové (TFA) (25 μΐ). Extrakt byl frakcionován pomoci vysoko40 účinné kapalinové chromatografie (HPLC) na koloně Vydac C—18 (250 x 4,6 mm) při průtoku 1 ml/min za použití gradientu od 5% acetonitril/voda/0,1% TFA do 70% aceton itril/voda/0,10 TFA. Hlavní peptidové frakce, které byly detekovány UV absorpcí, byly sebrány a koncentrovány v rotačním vakuovém koncentrátoru. Jejich primární struktura byla stanovena pomocí hmotové spektrometrie a metodou automatického Edmanova odbourávání. Melectin představuje hlavní peptidovou složku extraktu.

Příklad 2

Syntéza sloučeniny vzorce I

Na základě stanovené sekvence byl tento peptid syntetizován metodou syntézy peptidů na pevné fázi (SPPS). Syntéza byla provedena manuálně v 5 ml polypropylenových injekčních stříkačkách s teflonovým filtrem na dně stříkačky s využitím protokolu Fmoc-chemie. Jako pevný nosič byla použita Rink Amide MBHA pryskyřice o substituci 0,7 mmol/g. Chráněné Fmoc-aminokyseliny byly kondensovány ve 4-násobném přebytku v dimethylformamidu a ke kondensaci byl použit diisopropylkarbodiimid v přítomnosti 1-hydroxybenzotriazolu. Surový melectin (I) byl získán odštěpením z pryskyřice a deprotekci působením směsi TFA/l,2-ethanedithiol/H₂O/thio5 anísol/TIS (90 :2,5 : 2,5 : 3 :2) po dobu 3,5 hod a následnou precipitací fórc-butylmethyletherem. Tímto postupem bylo získáno 100- 150 mg surového peptidu. Část tohoto materiálu (15 mg) byla čištěna preparativní HPLC na koloně Vydac C—18 (250x 10 mm) při průtoku 3.0 ml/min a s využitím stejného gradientu, jak je popsáno výše. Takto bylo získáno 7 až 9 mg HPLC čistého peptidu, jehož identita byla ověřena hmotovou spektrometrií, jak udává

-3C/_ OUIOX4 BO

Tabulka 1. Sekvence melectinu (I) i

a i

s cu

-4Příklad 3

Stanovení antimikrohiální aktivity

Antimikrobiální aktivita byla stanovena jako tzv. minimální inhibiční koncentrace (MIC) pozorováním růstu bakterií v přítomnosti různých koncentrací peptidů (Tabulka 2). Bakterie v exponenciální fázi růstu byly přidány k roztoku testovaného antimikrobiálního peptidu o různé koncentraci (0,5 až 100 μΜ) v LB médiu v inkubačních destičkách a inkubovány při 37 °C po 20 h za stálého třepání v přístroji Bioscreen C. Absorbance byla měřena při 540 nm každých io 15 min. V experimentech bylo použito 1 x 10⁴ - 5 x 10⁴ CFU bakterií. Jako standard byl použit tetracyklin v koncentraci 1 až 50 μΜ.

Tabulka 2. Antimikrobiální a hemolytické aktivity melectinu (I)

peptid		antimikrobiální aktivita MIC [μΜ]	hemolytická aktivita ICjotgM]
	B.s.	S.a. E.c.	P.a.
(I)	1,1	7,5 2,7	25 >100

B.s. BaciHus subtilis; S.a., Staphylococcus aureus; E.c., Escherichia coli; P.a., Pseudomonas aeruginosa

Příklad 4

Stanovení hemolytické aktivity

Peptid v koncentraci 1 až 100 (200) μΜ byl inkubován s potkaními červenými krvinkami (5%) v 0,2 ml fysiologického roztoku po dobu 1 h při 37 °C. Poté byly vzorky centriftigovány při 250 g po dobu 5 min. Absorbance supematantu byla stanovena při 540 nm. Jako kontrola pro 100% hemolýzu byl místo peptidu použit 0,2% roztok TRITONU XI00. Výsledky testování jsou uvedeny v Tabulce 2.

Příklad 5

Cytostatický účinek na rakovinné buňky

Rakovinné buňky byly inkubovány s peptidem v 2 až 20 mikromolámí koncentraci v patřičných růstových médiích po dobu 24, 48 nebo 72 hodin a poté se počet živých buněk stanovoval rutinními testy např. MTT. Stanovovala se koncentrace peptidu IC50, při které přežívá 50 % buněk vzhledem ke kontrolám (místo peptidu pouze fysiologický roztok). V předběžných testech byl použity buňky: myší lymfatické leukémie L1210, lidské akutní lymfoblastické leukémie CCRFCEM T, lidské promyelotické leukémie HL-60, lidského karcinomu děložního čípku HeLaS3 a

-5CZ JU1822 Bb buněčná linie PC 12 odvozená z nádoru pheochromocytomu potkaní adrenální meduly. Peptid melectin (I) vykazoval ÍC50 10 až 18,3 mikromolámí (Tabulka 3).

Tabulka 3. Cytostatický účinek melectinu (I) na rakovinné buňky

Peptid	IC50 [μΜ]
L1210	CCRF-CEM T	HL-60 HeLaS3	PC12
(D	>10	>10	>10 18,30	10

Literatura ίο I. Hancock R. E. W., Sáhl H.-G. Antimicrobial and host-defense peptide as new anti-infective therapeutíc strategies. Nátur. Bitech. 24,1551-1557 (2006).

2. Otvos L. Jr. Antimicrobial peptides isolated from insects. J. Peptide Sci. 6,497-511 (2000).

3. Oren Z, Shai Y. Mode of action of línear amphipathíc α-helical antimicrobial peptides. Biopolymers 47,451-463 (1998).

4. Kuhn-Nentwig L. Antimicrobial and cytolytíc peptides of venomous arthropods. Cell. Mol.

Life Sci. 60, 2651-2668 (2003).

5. Mendes M. A., de SouzaB. M., Palma M. S. Structural and biological characterization of three novel mastoparan peptides from the venom of the neotropical sociál wasp Protopolybia exigua (Saussure), Toxicon 45; 101-106 (2005).

6. Tossi A., Sandri L., Giangaspero A. Amphipathíc, α-helical antimicrobial peptides.

Bipolymers (Peptide Science) 55,4-30 (2000).

7. Pathak N., Salas-Auvert R., Ruche G., Janna M-H,, McCarthy D., Harrison R. G. Comparison of the effect of hydrophobicity, amphiphilicity, and α-helicity on the activities of antimicrobial peptides. Proteíns: Struct. Funct. Genet. 22,182-86 (1995).

8. Yeaman M. R., Yount N. Y. Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance.

Pharm. Rev. 55, 27-55 (2003).

9. SuhJ.Y., Lee Y.-T., Park C.-B., Lee K.-H., Kim S.-C-, Choi B,-S. Structural and functional implications of a proline residue in the antimicrobial peptide gaegurin. Eur. J. Biochem. 266, 665-674 (1999).

10. Shin S. Y., Lee S -H., Yang S.-T,, Park E. I, Lee D. G., Lee Μ. K., Eom S. H., Song

W. K., Kim Y., Hahm K-S., Kim J. Y. Antibacteríal, antitumor and hemolytic activites of α-helical antibiotik peptide, P18 and its analogs. J. Pept. Res. 58, 504-514 (2001).

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Peptid vzorce I

   H-Gly-Phe-Leu-Ser-Ile-Leu-Lys-Lys-Val-Leu-Pro-Lys-Val-Met-Ala-His-Met-Lys-Nfy (IX
2. 2. Způsob přípravy peptidu vzorce I podle nároku 1, vyznačující se tím, že se po vypreparování jedových váčků včel Melecta albifrons tyto váčky extrahují směsí 50% vodného acetonitrilu s obsahem 0,1% kyseliny trifluoroctové (TFA) (25 μΐ), extrakt se frakcionuje vysokoúČinnou kapalinovou chromatografií za použití gradientu od 5 % acetonitrilu/voda/0,1 % TFA

   15 do 70 % acetonitrilu/voda/0,1 % TFA a hlavní peptidová frakce se zpracuje, čímž se získá peptid vzorce I.
3. 3. Způsob přípravy peptidu vzorce I podle nároku 1, vyznačující se tím, že se syntetizuje metodou syntézy peptidů na pevné fázi, SPPS.
4. 4. Použití peptidu vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčení mikrobiálních, virových a plísňových onemocnění a pro léčení rakovin.