CN104478996A - 一种新型阳离子抗菌肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型阳离子抗菌肽及其应用,属于生物化学中的多肽药物技术领域。本发明多肽是以中国林蛙皮肤分泌物中的天然抗菌肽为模板人工设计并化学合成的一种小分子多肽,包含13个氨基酸残基,C端酰胺化,其序列为IKKILSKIKKLLK-NH2,分子量为1552.13Da,等电点为10.70,带有6个正电荷。试验证明该小分子多肽在体外对多种细菌、人肿瘤细胞具有广谱的抑杀作用,不易产生耐药性,在抑菌抑癌浓度范围内不具备溶血活性和真核细胞毒性;此外,动物试验结果表明该肽还具有抗伤口感染作用;加之其分子量小,人工合成方便,是一个极具应用价值的小分子多肽,可用于制备新型抗菌抗感染和抗癌药物等。
Description
技术领域
本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域,具体涉及一种具有α-螺旋结构的阳离子抗菌肽以及该肽在制备抗菌抗感染以及抗癌药物中的应用。
背景技术
随着抗生素的广泛使用和滥用,使得大量耐药菌产生和扩散。而在癌症治疗中,传统的化学或天然抗癌药物也会出现对正常细胞选择性较差,且容易产生耐药等问题。因此,寻找安全有效且不易产生耐药的新型抗菌及抗癌药物成为当今全世界科学家关注的热点。
抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是生物体内广泛存在的一类多肽,用来抵抗外来微生物的侵入和体内一些突变细胞而产生的。作为先天免疫的第一道防线,抗菌肽有着广谱的抗菌活性。与传统的抗生素相比具有分子量小、热稳定性好、广谱抗菌、抗菌机理独特等优点。此外近年来国内外研究表明,抗菌肽不仅具有抗菌活性,还具有良好的抗肿瘤活性以及抗感染、免疫调节、信号转导等生物学功能。因此,抗菌肽的研究和发展为开发新型多肽类抗菌及抗癌药物提供了巨大的资源库,也为解决临床耐药的问题提供了极大的可能性。
自20世纪80年代初期,Boman等人首次分离出小分子抗菌肽之后,目前已经分离并鉴定出了来源丰富的800多种天然抗菌肽。天然抗菌肽大多数是小分子多肽,一般是由10到50个氨基酸残基组成。天然抗菌肽序列保守性较强,无论其来源相同与否。但是其一级结构有共同的相似性:一端是富含疏水性氨基酸、均酞胺化的C端;另一端为富含亲水性的碱性氨基酸残基的N端。目前发现的抗菌肽,按照结构可分为四类:①α-螺旋型,单链并具有α-螺旋,不具有二硫键。例如,蛙皮素(Magainins)和天蚕素(Cecropins);②β-折叠型,具有两个或两个以上的二硫键、形成β-折叠结构的抗菌肽,其中最具特征的是从日本马蹄蟹中分离出来的Tachyplesins;③扩展片层,不含半胱氨酸,但脯氨酸和精氨酸或色氨酸残基含量丰富,具有代表性的有从蜜蜂体内分离纯化到的Apidaecins;④环链型,N末端为线状结构,C末端存在一个二硫键,形成一个C末端的环链结构,具有代表性的有青蛙皮肤细胞产生的Brevinins、Ranalexino和Bactenecin。
抗菌肽作用机理复杂,但大多数理论都认为其机制涉及到抗菌肽的阳离子性和疏水性与带负电荷的微生物胞膜或肿瘤细胞膜之间的作用。其中的α-螺旋阳离子抗菌肽(α-cationicantimicrobial peptides,α-CAPs)则是最主要的一类能够选择性杀伤细菌或癌细胞,对正常细胞作用较弱或无毒,不易产生多药耐药,也不会通过特定信号转导产生耐受的新型抗菌及抗癌候选药物。此类抗菌肽存在于水溶液中成无规则卷曲状态,当存在于极性溶液如TFE或SDS等模拟细胞膜环境的溶液中时,呈α-螺旋结构。原因是α-CAPs的N末端区域富含碱性氨基酸,带正电荷,而G+和G-细菌细胞壁的磷壁酸和脂多糖使细菌表面带负电荷,肿瘤细胞膜也含有较多酸性磷脂和糖胺聚糖等负电荷成分,α-CAPs所带正电荷使其易与带负电的细菌或肿瘤细胞膜磷脂双分子层间通过静电吸附发生相互作用;C端的疏水性氨基酸残基使抗菌肽易于插入到细胞膜磷脂双分子层中结构,且容易形成两性α-螺旋结构。有研究表明,抗菌肽的抗菌抗癌活性与螺旋的程度和所带电荷有关,而且抗菌肽酞胺化的C末端会增强其活性作用。稳定的α-螺旋结构是抗菌肽与膜结合进而发挥抗菌抗癌活性的重要因素。
在诸多的抗菌肽中,两栖类抗菌肽的研究正逐渐受到关注。由于两栖类动物生活在温暖湿润、微生物复杂的环境中,其皮肤经过长期进化,也逐渐形成了抵抗外来微生物侵袭的防御机制。两栖类生物的皮肤分泌物中包含了大量种类繁多、功能复杂的生物活性肽。很多两栖类皮肤活性肽能在不损害正常细胞的前提下对细菌和癌细胞产生抑杀作用。此外,细菌和肿瘤细胞不易对其产生耐药性。
当然,天然来源的抗菌肽部分会因为分子量较大存在免疫原性,抗菌抗癌活性不高,对宿主细胞有细胞毒作用,或会引起溶血等方面限制了其作为抗菌抗癌药物的推广应用,因此,科学家们在寻找新型抗菌肽的同时也开始致力于对原有的天然抗菌肽进行结构改造或重新设计,比方说更换某些氨基酸残基或根据需要直接设计抗菌肽氨基酸的一级结构,以期获得活性更高、更有针对性同时对宿主细胞无毒害作用的抗菌肽。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的具有抗菌抗癌活性的小分子α-螺旋阳离子多肽,为制备在制备抗菌抗感染以及抗癌药物方面提供可能。
本发明的阳离子子抗菌肽为人工设计化学合成的活性多肽,包含13个氨基酸残基,C端酰胺化,分子量为1552.13Da,等电点为10.70,其全序列为:
Ile Lys Lys Ile Leu Ser Lys Ile Lys Lys Leu Leu Lys NH2。
本发明中的抗菌肽为人工合成,分子量小、制备方法简单方便。
本发明中的抗菌肽具有广谱抗菌活性,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较为显著的抑制作用。其在小鼠皮肤伤口感染实验中能够促进皮肤伤口愈合,效果明显优于商品化的莫匹罗星软膏(百多邦)。而且本发明中的抗菌肽在体外对多种人肿瘤细胞具有不同程度的抑制作用,其中对乳腺癌MCF-7尤为敏感。
本发明所述抗菌肽在抗菌抗癌活性浓度范围内未见明显溶血活性和真核细胞毒性。
附图说明
图1小鼠皮肤伤口治疗6天后愈合情况;
图2抗菌肽对人不同肿瘤细胞的抑制作用;
图3抗菌肽对人红细胞的溶血活性;
图4抗菌肽对人永生化表皮细胞HaCat的细胞毒性分析。
具体实施方式
以下实施例子进一步解释本发明的内容,但并不用以限制本发明;
本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和过程,但本发明的保护范围不仅限于下述的实施例;
下述实例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到;
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
实施例1
抗菌肽的制备
1、抗菌肽的化学合成方法:根据发明内容中所述的氨基酸序列,用自动多肽合成仪按照标准的Fmoc固相肽合成程序进行合成。合成肽经反向HPLC(Vydac218TP1022柱)纯化;
2、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF);
3、纯化的抗菌肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度,测试中所用纯度均大于95%。用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构;
本发明抗菌肽一共包含13个氨基酸残基,分子量为1552.13Da,等电点为10.70。氨基酸全序列如下:
Ile-Lys-Lys-Ile-Leu-Ser-Lys-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-NH2。
实施例2
抗菌肽对革兰氏阳性菌的抗菌实验
下述实施例中的病原菌均来自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)及中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC),其中包括:金黄色葡萄球菌(AS 1.72)、表皮葡萄球菌(CICC 23664)、蜡状芽孢杆菌(AS 1.126)、粪肠球菌(CGMCC 1.595)、屎肠球菌(CGMCC 1.2334)、变异链球菌(CGMCC 1.2500)、唾液链球菌(CGMCC 1.2498)、嗜酸乳杆菌(CGMCC 1.3251)、乳链球菌(AS 1.1690)。
最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC):为检测不到细菌生长的最低样品浓度。采用二倍稀释法。具体方法如下:
细菌接种于LB固体培养基上,37℃培养箱中倒置培养。待菌落长出后,用接种环挑取单克隆菌落转接到LB液体培养基中,37℃培养箱震荡培养至对数生长期。在紫外分光光度计上检测菌落OD600,根据1OD600=1×109CFU/mL将菌落用液体LB培养基稀释至2×105CFU/mL。在无菌96孔板各孔中预先加入50μL LB液体培养基,然后第一孔中加入50μL稀释到200μM的抗菌肽样品,混匀后取出50μL加入到第二孔,依次倍比稀释,肽的最低浓度是1.56μM,至此二倍浓度梯度样品即制备好。
向各孔中加入已稀释好的菌液50μL,混匀后与37℃缓慢震荡培养18小时,测定600nm处的光吸收值。结果计算:取检测不到细菌生长的孔和与之相邻的有细菌生长孔样品浓度之和的平均值作为样品最小抑菌浓度。
结果如表1所示,抗菌肽对各革兰氏阳性菌种均体现出不同程度的较好的抑菌效果。
表1 抗菌肽对革兰氏阳性菌的最低抑菌浓度
实施例3
抗菌肽对革兰氏阴性菌的抑制作用
下述实施例中的病原菌均来自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)及中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC),其中包括:大肠杆菌(AS 1.349)、铜绿假单胞菌(CGMCC 1.860)、鲍曼不动杆菌(CICC 22934)、具核梭杆菌(CGMCC 1.2528)、肺炎克雷伯氏肺炎亚种(CGMCC 1.716)、阴沟肠杆菌(CGMCC 1.58)、奇异变形杆菌(CICC 22930)。
细菌的培养方法以及MIC测定方法均与实施例一中所描述的方法一致。
结果如表2所示,抗菌肽对革兰氏阴性菌种均体现出不同程度的抑菌效果,其中对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和具核梭杆菌抑菌效果较好。
表2抗菌肽对革兰氏阴性菌的最低抑菌浓度
实施例4
抗菌肽对小鼠伤口感染的愈合作用
1、细菌培养:选取金黄色葡萄球菌,表皮葡萄球菌,铜绿假单胞菌,待对数生长时计数,稀释至5×107CFU/mL;按1:1:1比例配置混合细菌溶液。
2、伤口感染模型建立:将小鼠背部圈定预制造伤口的位置,范围约直径3cm,圈定部位用脱毛膏脱毛;脱毛后,对脱毛范围进行消毒;用消毒过的手术剪剪去直径约0.8cm的全层皮肤;灭菌棉签拭去小鼠伤口表面血迹,在小鼠内部伤口处均匀涂抹20μL混合细菌,待细菌风干时,用无菌纱布包扎伤口;放回笼内,给予充足的食物饲养48h,完成伤口感染模型的建立。
3、给药及观察伤口愈合情况:将小鼠随机分组给药处理,共分四组:①生理盐水治疗组;②阳性对照组(莫匹罗星软膏治疗组);③抗菌肽1×MIC;④抗菌肽2×MIC组;分组的小鼠按组别给以不同的药物,每12h给药一次,共治疗6天,即给药12次:给药方法:除去小鼠背部纱布,在伤口处涂100μL实验前准备好的适合浓度的抗菌肽,待抗菌肽风干后,重新用无菌纱布给小鼠进行包扎。
观察记录结果:在小鼠皮肤伤口治疗6天后对小鼠照相,记录伤口愈合情况。
小鼠皮肤伤口感染愈合程度可以由图3照片观察发现。治疗6天后,阳性对照组和生理盐水组结痂均未褪去,但阳性对照组愈合情况较生理盐水组略好一些,结痂即将褪去。而抗菌肽组伤口几乎完全愈合,2×MIC组伤口愈合程度好于1×MIC组。见图1。
实施例5
抗菌肽对多种人肿瘤细胞的抑制活性
下述实施例中涉及的细胞均来自于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库,选取人乳腺癌MCF-7、Bcap-37、MDA-MB-231细胞,宫颈癌Hela细胞、胃癌BGC-823细胞、黑色素瘤A375细胞、肺癌NCI-H446、LK-2细胞、卵巢癌HO-8910细胞、肝癌SMMC-7721、BEL-7402细胞等11种肿瘤细胞,培养待对数生长期,经胰蛋白酶消化后加入培养液制成细胞悬液,按5×104个/mL接种于96孔板中。过夜培养且细胞贴壁后加入抗菌肽。抗菌肽的浓度选择为100μM,作用时间定为1h和24h。待作用时间后每孔内加入MTT,继续在37℃条件下培养4小时,弃上清,加入DMSO后震荡3分钟,待沉淀完全溶解,于492nm下用酶标仪测定OD值。
结果如图2和表3所示,抗菌肽对所选取的人乳腺癌、宫颈癌、胃癌、黑色素瘤、肺癌、卵巢癌及肝癌等7类人肿瘤细胞的增殖都有不同程度的抑制作用,其中对人乳腺癌MCF-7细胞的抑制最为明显,说明该抗菌肽具有较好的抑癌活性。
表3抗菌肽对不同肿瘤细胞的抑制率
实施例6
抗菌肽对人红细胞的溶血活性
将人血与0.9%的生理盐水混匀,1200g离心3min。之后弃上清,取下层红细胞,用0.9%生理盐水配成2%的混悬液。再加入不同浓度的抗菌肽溶液,使终浓度为25、50、100、200、400μM,轻混后置37℃的恒温箱中温育1h。1h之后静止30min,取上清于EP管中1200g离心3min。取上清于540nm测吸光值,计算溶血率。
结果如图3所示,当抗菌肽在浓度低于50μM时,对人红细胞基本没有影响,溶血率基本维持在1.8%;当肽浓度增加到100μM时,溶血率也基本维持在2.5%;当肽浓度达到400μM时,对红细胞溶血率也是维持在5%左右。结果说明该抗菌肽对人红细胞无毒性且对人红细胞不具有明显的溶血作用。
实施例7
抗菌肽对人永生化表皮细胞HaCat的细胞毒实验
下述实施例中的正常细胞人永生化表皮细胞HaCat来自于中国南京凯基生物科技发展有限公司,培养细胞生长到对数生长期,将细胞按5×104个/mL的浓度接入96孔细胞培养板,于37℃、5%CO2条件下过夜继续培养。加入抗菌肽使其终浓度为20、40、60、80、100μM,用时间选择1h。待作用时间后加入MTT,继续培养4小时,弃上清,加DMSO后震荡3分钟,待沉淀完全溶解,于492nm下用酶标仪测定OD值。
结果如图4所示,抗菌肽对HaCat细胞的存活无影响,在抗菌肽浓度为20-100μM的范围内,细胞的存活率都维持在80%以上,说明刚抗菌肽对人真核细胞无细胞毒作用,其对细菌微生物和肿瘤细胞的抑制作用具备良好的选择性。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 辽宁师范大学
<120> 一种新型阳离子抗菌肽及其应用
<160> 1
<210> 1
<211> 13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221> AMIDATION
<222>(13)
<400>
Ile Lys Lys Ile Leu Ser Lys Ile Lys Lys Leu Leu Lys
1 5 10
Claims (6)
1.一种新型阳离子抗菌肽,其特征在于:阳离子抗菌肽全序列见序列表SEQ ID No.1。
2.如权利要求1所述的阳离子抗菌肽,其特征在于:阳离子抗菌肽由13个氨基酸残基组成,C端酰胺化,分子量为1552.13Da,等电点为10.70。
3.权利要求1所述的阳离子抗菌肽在制备抑制革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌药物中的应用。
4.权利要求1所述的阳离子抗菌肽在制备抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌药物中的应用。
5.权利要求1所述的阳离子抗菌肽在制备促进皮肤伤口愈合药物中的应用。
6.权利要求1所述的阳离子抗菌肽在制备抑制人乳腺癌、宫颈癌、胃癌、黑色素瘤、肺癌、卵巢癌或肝癌药物中的应用。
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2014
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