CN109627312A - 一种新型抗菌肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种新型抗菌肽及其应用，该新型抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的所述新型抗菌肽对革兰阳性菌和革兰阴性菌都具有广泛的杀灭活性，在小鼠体内切除创口模型和体外猪皮肤模型中证明了潜在的抗感染作用。

Description

一种新型抗菌肽及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地，涉及一种新型抗菌肽以及该新型抗菌肽在制备治疗皮肤和/或软组织感染的药物中的应用。

背景技术

在过去的几十年里，门诊中出现了大量皮肤和软组织感染，表现为疖、痈、脓肿或蜂窝织炎。这种感染的主要致病菌是金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌是一种常见的革兰阳性菌，会导致多种疾病，从轻微的表面皮肤感染到危及生命的疾病。治疗这些皮肤和软组织感染的主要挑战是金黄色葡萄球菌耐药菌株迅速增加。随着金黄色葡萄球菌和其他微生物对抗生素耐药性的增加，迫切需要找到更有效的抗菌策略。

抗菌肽具有广泛的对抗多种细菌和真菌的生物活性，有望成为新的抗菌策略首选药物。而且，与常规抗生素相比，抗菌肽产生耐药性的程度要小得多，因为抗菌肽杀死细菌的机制通常涉及攻击多个疏水性或阴离子靶标。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的上述缺陷，提供一种新型抗菌肽。本发明的所述新型抗菌肽(命名为抗菌肽PDK160)对革兰阳性菌和革兰阴性菌都具有广泛的杀灭活性，在小鼠体内切除创口模型和体外猪皮肤模型中证明了潜在的抗感染作用。

本发明的第一方面提供一种新型抗菌肽，该新型抗菌肽的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示：AIPIKAIGKAGKLRAINIANFNFLKPKRK，其中，N端为硝基丙氨酸，C端为酰胺化末端。因此，所述新型抗菌肽可以表达为：NO₂-AIPIKAIGKAGKLRAINIANFNFLKPKRK-NH₂。所述硝基丙氨酸为甲基具有硝基取代基的丙氨酸，即，所述硝基修饰在丙氨酸的甲基上，取代甲基的一个氢原子。C端的酰胺化末端是指赖氨酸的羧基被酰胺化所形成的末端。上述修饰方式均为本领域常规的氨基酸修饰，修饰方法也可采用常规的各种方法。本发明对此并无特别限定。

本发明的所述新型抗菌肽基于爪蟾素经过氨基酸突变获得，是指该抗菌肽基于爪蟾素设计得到。但在真正应用时，该抗菌肽可以通过人工合成得到。

本发明中的所述新型抗菌肽为不含二级结构的小分子多肽，如不含α螺旋等高级复杂结构。

本发明的第二方面提供上述新型抗菌肽的应用。

具体地，本发明的第三方面提供上述新型抗菌肽在制备治疗皮肤和/或软组织感染的药物中的应用。

本发明的第四方面提供上述新型抗菌肽在制备治疗革兰阳性菌或革兰阴性菌感染的药物中的应用。

本发明的抗菌肽PDK160具有广谱杀菌活性。

具体地，所述革兰阳性菌包括金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、疮疱丙酸杆菌、白假丝酵母、近平滑假丝酵母和克柔假丝酵母中的至少一种。

具体地，所述革兰阴性菌包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和鲍氏不动杆菌中的至少一种。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1示出了PDK160对细菌细胞膜去极化强度的影响。

图2示出了PDK160体内切除抗菌实验结果。

图3示出了PDK160体外伤口抗菌实验结果。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例

1、材料和方法

1.1所需材料

抗菌肽PDK160(NO₂-AIPIKAIGKAGKLRAINIANFNFLKPKRK-NH₂)由本实验室合成并保存。用莫匹罗星和夫西地酸(购自上海安瀚特生物医药技术有限公司)作为对照。体外耐药试验中，以庆大霉素(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)作为对照抗生素。本发明所用微生物均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号见表1。试验选取的无特定病原体小鼠及大鼠均购自北京华阜康生物科技股份有限公司(实验动物生产许可证号：BJXK(京)2013-0016；实验动物使用许可证号：BJXK(京)2016-0012)。人血红细胞购自上海血液生物医药有限责任公司。细胞毒性检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份公司；膜电位检测试剂盒、钙离子荧光探针购自碧云天生物技术有限公司；化学试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Thermo Forma 310CO₂细胞培养箱购自美国Thermo Scientific公司。

1.2体外杀菌实验

本发明试验了抗菌肽PDK160对金黄色葡萄球菌、链球菌、丙酸杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、几种假丝酵母的抑菌效果，采用微量杀菌浓度(MMC)法进行测定。将最小抗菌肽浓度导致减少≥99％的微生物被定义为MMC99。先将细菌在3.7％BHI培养基中37℃培养24h，再孵育2小时，达到指数生长时收集细菌悬液5000r/min离心5min，稀释成浓度为10⁷CFU/ml的菌悬液。同样方法将抗菌肽PDK160稀释成最终浓度范围1.56-200μg/ml。96孔板中加入25μl细菌悬液，然后再加入5μl抗菌肽PDK160，37℃培养2h，所有样品均有重复，样品重复5孔。

1.3溶血性试验

采用新鲜人血红细胞测定PDK160的溶血活性。将红细胞与EDTA混合，5000r/min离心5分钟，用PBS清洗，5000r/min离心5分钟，重复三次，将最终红细胞的浓度调整为10％(v/v)。将实验所需要的抗菌肽用PBS稀释到浓度5-200μg/ml。将100μl红细胞悬浮液，50μl抗菌肽溶液和50μl PBS转移到圆孔96孔板，37℃培养1h，在5000r/min离心5分钟后将上清液转移到平底96孔板。测量上清液在540nm处的吸光度，观察血红蛋白的释放情况。用PBS(阴性对照)或0.1％Triton X-100(阳性对照)处理红细胞后的吸光度分别设为0和100％溶血。溶血的百分比计算通过使用下列公式：溶血率(％)＝100％×(Abs-Abs_0％)/(Abs_100％-Abs_0％)。

1.4耐药性实验

制备金黄色葡萄球菌悬液，将其浓度调整为10⁸CFU/ml。制备稀释的抗菌肽，浓度范围为0.75-96μg/ml。实验中，以庆大霉素做为阳性对照，持续时间为21天。

1.5细胞质膜去极化的测定

膜电位敏感的氰胺染料DiSC₃(5)可以检测完整细菌细胞质膜上电势梯度的破坏情况。DiSC₃(5)可以在细菌细胞中积累并自我抑制荧光。因此，荧光读数的增加反映了由于细胞膜渗透性的增加导致细菌细胞释放染料。具体测定方法为：制备金黄色葡萄球菌悬液，将其浓度调整为10⁷CFU/ml。1ml细菌悬浮液中加入0.4mmol DiSC₃(5)，制备浓度范围0.625-160μg/ml的PDK160，每1ml细菌悬浮液中加入100μl PDK160。在650nm波长和670nm波长下使用荧光分光光度计连续实时监测荧光强度，从添加PDK160开始，持续15分钟。

1.6小鼠体内创面感染模型抗菌效果评价

制备金黄色葡萄球菌悬液，将其浓度调整为10⁹CFU/ml。用75％的酒精擦洗小鼠(6周龄，无特定病原体，雌雄性各一半，BALB/c系，共60只，随机分为4组，每组15只，体重平均为22g)的背部，每隔5mm做一个10mm×10mm的伤口，在伤口接种20μl细菌悬液。两小时，每个伤口添加100μl PDK160(浓度50μg/ml)。2小时后，处死小鼠，将整个创面解剖并转移到离心管内，加入1ml Kligman缓冲液，涡旋振荡2min，2000rpm离心10分钟，取上清液进行稀释，将稀释液放入血平板37℃培养24h，观察抑菌情况。

1.7猪皮肤体外感染抗菌效果评价

实验中使用的猪是本地黑猪，皮肤取自猪的臀部，用塑料薄膜包装，冻结在-20℃存储。实验进行时，皮肤解冻，皮下脂肪用手术刀去除。切成厚度约0.5-1mm，面积10mm×10mm小块，放入1.5ml离心管，用250μl无菌水清洗两次。制备金黄色葡萄球菌悬液，将其浓度调整为10⁷CFU/ml。在每个伤口涂上100μl的细菌悬浮液，37℃培养2h后，每个伤口添加100μl PDK160(浓度50μg/ml)，两小时加入1ml Kligman缓冲液，涡旋振荡2min，2000rpm离心10分钟，取上清液进行稀释，将稀释液放入血平板37℃培养24h，观察抑菌情况。

1.8急性毒性试验的初步评估

制备两种浓度的PDK160(1.5mg/l和6.5mg/ml)，将6只小鼠分成3组，每组2只，于小鼠颈部区域以单次皮下注射方式给药，每100克体重注射0.2ml，研究观察小鼠0.5h，2h，4h，24h和48h后一般行为和临床症状。

2、结果

2.1PDK160的体外杀菌作用

体外杀菌实验表明：PDK160表现出广谱杀菌的活性，结果见表1。尤其在与夫西地酸和莫匹罗星比较中，PDK160在对除了金黄色葡萄球菌和化脓链球菌的其他实验微生物中均表现了更好的抑制效果，即使在对金黄色葡萄球菌和化脓链球菌的抑制效果中，PDK160也达到了传统抗生素的效果。

表1 PDK160的抑菌效果

2.2PDK160溶血性检测

测定人红细胞的溶血性是研究细菌对哺乳动物细胞的抗菌肽选择性的最常用方法。研究表明：PDK160没有显示任何重大溶血性活动，即使在浓度高达200μg/ml时也没有显示出溶血性。

2.3PDK160的耐药性

采用金黄色葡萄球菌对PDK160进行了耐药性试验，并与庆大霉素进行了比较，庆大霉素在第16天时出现耐药性，金黄色葡萄球菌浓度从0.047μg/ml增加到0.75μg/ml，然而，PDK160直到第21天仍未出现耐药性，金黄色葡萄球菌浓度稳定在3μg/ml未变。

2.4细胞质膜去极化测定结果

为表明PDK160对细菌的作用方式，使用膜电位敏感的氰胺染料DiSC₃(5)对PDK160诱导的金黄色葡萄球菌细胞质膜的变化进行了评价。实验表明：在金黄色葡萄球菌中加入PDK160会导致荧光迅速增加，膜去极化依赖于抗菌肽的浓度以及时间，大约2到5分钟内PDK160去极化作用最强，荧光强度增加的速率随着时间的推移趋于稳定，结果见表2和图1。图1中，由下至上的浓度依次为0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、160μg/ml、80μg/ml。

表2PDK160的细胞质膜去极化测定结果

2.5PDK160在局部感染动物模型中的抗菌作用

通过两种不同的局部感染动物模型即小鼠体内切除创口模型和体外猪皮肤模型的剂量反应研究表明，PDK160的抗菌作用效果明显，能对金黄色葡萄球菌具有较好的抑制作用。结果见表3、图2和表4、图3。

表3 PDK160体内切除抗菌实验结果

药物	细菌存活率(％)
		H<sub>2</sub>O	100
0.1mg/ml	58
		0.5mg/ml	59
2mg/ml	20

表4 PDK160体外伤口抗菌实验结果

2.6PDK160的初步急性毒性试验结果

本发明研究了PDK160对小鼠的潜在全身毒性。在观察期间，没有观察到任何一组的行为迹象表明没有系统性毒性。此外，在上述小鼠感染的体内切除创口模型中未观察到与治疗相关的局部不良反应。

3、结论

PDK160的强效抗感染作用在两种不同的局部创面动物模型中得到了证实，而在皮下注射实验中也没有观察到全身毒性的迹象。因此，本发明的PDK160作为新型抗感染药物在皮肤及软组织感染局部治疗中具有广泛的应用前景。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

序列表

<110> 江苏医药职业学院

<120> 一种新型抗菌肽及其应用

<130> BJI1802152JSYY

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Ile Pro Ile Lys Ala Ile Gly Lys Ala Gly Lys Leu Arg Ala Ile

1 5 10 15

Asn Ile Ala Asn Phe Asn Phe Leu Lys Pro Lys Arg Lys

20 25

Claims (9)

1.一种新型抗菌肽，其特征在于，该新型抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：AIPIKAIGKAGKLRAINIANFNFLKPKRK，其中，N端为硝基丙氨酸，C端为酰胺化末端。

2.根据权利要求1所述的新型抗菌肽，其特征在于，所述硝基丙氨酸为甲基具有硝基取代基的丙氨酸。

3.根据权利要求1所述的新型抗菌肽，其特征在于，所述新型抗菌肽基于爪蟾素经过氨基酸突变获得。

4.根据权利要求1所述的新型抗菌肽，其特征在于，所述新型抗菌肽为不含二级结构的小分子多肽。

5.权利要求1-4中任意一项所述的新型抗菌肽的应用。

6.权利要求1-4中任意一项所述的新型抗菌肽在制备治疗皮肤和/或软组织感染的药物中的应用。

7.权利要求1-4中任意一项所述的新型抗菌肽在制备治疗革兰阳性菌或革兰阴性菌感染的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，所述革兰阳性菌包括金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、疮疱丙酸杆菌、白假丝酵母、近平滑假丝酵母和克柔假丝酵母中的至少一种。

9.根据权利要求7所述的应用，所述革兰阴性菌包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和鲍氏不动杆菌中的至少一种。