CN112409457A

CN112409457A - 一类抗细菌多肽及其应用

Info

Publication number: CN112409457A
Application number: CN202011361437.XA
Authority: CN
Inventors: 招秀伯; 王静芳; 李月平; 唐婧; 尤蓉蓉; 吕松伟
Original assignee: Changzhou University
Current assignee: Changzhou University
Priority date: 2020-11-27
Filing date: 2020-11-27
Publication date: 2021-02-26
Anticipated expiration: 2040-11-27
Also published as: CN112409457B

Abstract

本发明提供了一类抗细菌多肽及其应用，是属于肽类的一种抗生素。抗细菌多肽由赖氨酸与异亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸等疏水氨基酸组成，设计得到At3:KLLKKVVKLFKKLLK，At5:KIIKKIIKIIKKIIK；At8：KLLKKLKKKLKKLLK；At10:IKKIIKIIKKIIKKI氨基酸序列，在水溶液中呈现出无规卷曲的结构，在磷脂膜环境中能够形成比较规则的螺旋结构。本发明的抗菌肽对革兰氏阴性菌有较好的抗菌性能，并且展示出较低的溶血活性。本发明的抗菌肽使得菌体胞内物质流失，导致菌体死亡，作为新型抗菌剂具有广泛的应用前景。

Description

一类抗细菌多肽及其应用

技术领域

本发明公开一类抗细菌的多肽，属于肽类抗生素的应用领域。

技术背景

抗生素的滥用已经使得耐药细菌的出现和传播，日益严重的耐药性问题已经严重威胁全球健康。如今，我们急需寻找不同于传统抗生素作用机理的新型抗菌剂。近年来，出现的新型抗菌剂抗菌肽引起了大家的关注，它是宿主先天性免疫防御系统中产生的一类小分子肽类生物活性物质，其热稳定性好、易溶于水、对哺乳动物正常细胞基本无毒害。它除了能够对细菌与真菌起到抑制或杀伤的作用，还能抑制细菌生物膜形成并且能够中和细菌内毒素。因为其不同的抗菌机理，能快速杀菌且不易引起耐药问题，一种具有巨大发展潜力的新型抗菌剂。

发明内容

本发明主要目的在于提供针对革兰氏阴性菌的抗菌肽，该类多肽对于革兰氏阴性菌有着抗菌活性。

本发明的目的通过如下技术实现：

本发明一类抗菌肽分子的设计步骤：(1)以一种蚂蚁α-螺旋抗菌肽 Ponericin-W1后半部分KLLPSVVGLFKKKKQ序列为模板。(2)对其氨基酸进行替换，亲水部分全部换成赖氨酸(K)，并调节其数量。(3)亲油部分换成缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)等疏水氨基酸中一种或多种。(4)在亲水区插入疏水氨基酸。(5)C-端采用酰胺化修饰，N-端采用乙酰化修饰。

经筛选，本发明的抗菌肽的氨基酸序列如下：At3： Ac-KLLKKVVKLFKKLLK-NH₂；At5：Ac-KIIKKIIKIIKKIIK-NH₂；At8： Ac-KLLKKLKKKLKKLLK-NH₂；At10:Ac-IKKIIKIIKKIIKKI-NH₂。

本发明提供的抗菌肽序列也在本发明的保护范围。

本发明的抗细菌肽可以用于制备抑制或杀灭革兰氏阴性菌的药物，可治疗或预防革兰氏阴性菌细菌的感染。

进一步，本发明的抗菌肽可以用于制备抑制或杀灭大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的药物，可治疗或预防这些细菌的感染。

进一步，所述药物剂型是液体、片剂、胶囊、乳剂、凝胶或本领域技术人员已知的其它药物剂型。

相较于现有技术，本发明的优点是：

本发明提供了一种能对细菌起到抑制或杀伤的作用的抗菌肽，该抗菌肽具有显著的抑制或杀灭革兰氏阴性菌生长的作用，所述的杀灭革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌等，能够替代传统抗生素，具有广谱抗菌活性，能快速杀菌且不易引起耐药，具有巨大发展潜力的抗细菌剂。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为本发明抗菌肽At3、At5、At8和At10形成α-螺旋后的氨基酸分布图；

图2为本发明抗菌肽At3、At5、At8和At10的质谱图；

图3为本发明抗菌肽At3、At5、At8和At10的二级结构测定图；

图4为本发明抗菌肽At3、At5、At8和At10的溶血活性实验结果图；

图5为本发明抗菌肽At3与大肠杆菌作用后的扫描电镜图。

具体实施方式

本发明所用实验药品均可通过商业渠道购买得到；

下面对本发明所用部分实验仪器的型号及规格进行说明；

分析天平；细菌培养摇床；细菌培养箱；冷冻离心机；多功能酶标仪；

本发明设计得到的抗菌肽由上海生工制备合成，采用Fmoc固相合成法。其通过在Rink酰胺MBHA树脂上合成，纯度在95％以上。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明；

实施方式1：

抗菌肽的设计

一类抗菌肽分子的设计策略：(1)以一种蚂蚁α-螺旋抗菌肽Ponericin-W1后半部分KLLPSVVGLFKKKKQ序列为模板。(2)对其氨基酸进行替换，亲水部分全部换成赖氨酸(K)，并调节其数量。(3)亲油部分换成缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)等疏水氨基酸。(4)在亲水区插入疏水氨基酸。(5) C-端采用酰胺化修饰，N-端采用乙酰化修饰。

表1氨基酸序列：

图1以Ponericin-W1为模板，将其进行修改为At3，At5，At8和At10。其中 At3的电荷数为+7，疏水性为0.387；At5的电荷数为+7，疏水性为0.498；At8 的电荷数为+9，疏水性为0.086；At10的电荷数为+7，疏水性为0.498。

图2是为At3，At5，At8和At10的质谱图。

实施方式2：

对本发明制备得到的抗菌肽进行二级结构测定：

以At3为例，采用圆二色光谱法，检测抗菌肽在水、十二烷基硫酸钠(SDS)、 1,2-棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)和二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)中的二级结构。

具体测定方式如下：

将抗菌肽分别稀释到水、25mM SDS、DPPG、DPPC溶液中，使得抗菌肽终浓度在0.1mM。

测量选取光程为2mm的石英样品池，扫描范围190nm-250nm。间隔1nm，响应时间为1s，在室温下进行所有实验，实验操作重复三遍，测量结果如图3 所示。

从图3中可以看出，α-螺旋在192nm处有一个正峰，在208nm和222nm处存在两个负峰；出现无规卷曲构象时，在197nm附近会有一个负峰，在217nm 处会有一个小而宽的正峰。At3的圆二色谱结果显示，At3在H₂O和DPPC中呈现无规卷曲，在SDS和DPPG中呈现α-螺旋。

实验方式3：

抗菌肽抗菌活性的测定：

通过微量肉汤稀释法确定抗菌肽的最低抑菌浓度，其检测方法包括如下：

将菌株的单菌落用接种棒挑至LB液体培养基中，放置在37℃，160rpm的恒温振荡培养箱中过夜培养，然后将其制备10⁴CFU/mL的菌液。在96孔板中加入100μL菌液，将抗菌肽通过2倍倍比稀释法对抗菌肽进行稀释，在每孔中加入 100μL的抗菌肽，使其终浓度分别为50、25、12.5、6.2、3.1、1.6和0.8μmol，阴性对照组将100μL的抗菌肽溶液替换成等量的LB液体培养基，空白对照组为无菌的LB液体培养基。每个处理三个平行样。将96孔板放置在37℃，160 rpm的恒温振荡培养箱中培养18-24h，直到阴性对照孔中有肉眼可见的浑浊液出现。能够完全抑制细菌生长的抗菌肽浓度即为抗菌肽对该菌的MIC值。

表2抗菌肽抗菌活性测定

结果如表2所示，抗菌肽At3对大肠杆菌(ATCC25922)的MIC值为3.1μmol，对铜绿假单胞菌(ATCC27853)的MIC值为6.2μmol，对金黄色葡萄球菌 (ATCC25923)和粪肠球菌(ATCC29212)的MIC值是12.5μmol。这说明At3 对革兰氏阴性菌有更好的好的抗菌性能。

实施方式4：

抗菌肽的溶血活性测定：

在抗菌肽研究中用抗菌肽对红细胞的溶血性来评价抗菌肽对正常哺乳动物细胞的杀伤作用。在采集过后的新鲜血液中加入抗凝剂。将血液转移至离心管中，在 4℃下，3000rpm，离心3min后弃去上层血清，留下下层沉淀红细胞。用等量的PBS溶液对红细胞进行离心清洗三次，除去残留的红细胞。将离心清洗后的红细胞用PBS溶液进行稀释至8(v/v)。取100μL红细胞溶液至离心管中，再加入一系列2倍稀释梯度的抗菌肽溶液。用100μL的PBS代替抗菌肽溶液作为实验的阴性对照，用100μL 0.1％Triton X 100溶液代替抗菌肽溶液作为实验的阳性对照。将离心管放置在37℃，160rpm的恒温摇床中进行孵育1h。在反应结束后，在4℃下，3000rpm，离心3min，使得红细胞形成沉淀。吸取离心管中上层清液至96孔板中，在吸取过程中注意不要吸取到红细胞沉淀。将溶液用酶标仪检测540nm处的吸光度，溶血百分比按下列公式计算。

从图4可知At3在浓度为50μM时溶血活性在5％左右，当溶血率大于5％时则视为溶血。但是At3在E.coli与S.aureus抗菌试验中分别在3.1μM和12.5 μM时就已经具有很好的抗菌效果，此时并未出现溶血现象。表明At3可在较低浓度下进行抗菌试验。

实施方式5：

抗菌肽作用大肠杆菌后的扫描电镜效果：

将E.coli ATCC 25922接种至LB液体培养基中，37℃，160rpm下进行过夜培养。培养后的E.coli用0.9％NaCl进行离心洗涤，除去LB培养基。用0.9％NaCl 进行菌液浓度的调整。取1mL抗菌肽与等体积的E.coli在37℃，160rpm的恒温摇床中进行2h的孵育。孵育完成后用PBS进行离心洗涤，除去肽液。用 5mm的载玻片上，等至菌液干燥后加入2.5％戊二醛进行固定1h。固定完成后，用PBS对其进行清洗，再用30％、50％、70％、85％和95％的乙醇进行梯度脱水，每个梯度进行5min的脱水时间。最终用无水乙醇进行脱水30min。图5为大肠杆菌未处理的SEM图和抗菌肽处理大肠杆菌后的SEM图。抗菌肽 At3在处理后，大肠杆菌出现菌体坍塌的现象，膜表面出现溶解的现象。这一现象可以证明At3能破坏膜表面，使得菌体胞内物质流失，导致菌体死亡。

序列表

<110> 常州大学

<120> 一类抗细菌多肽及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Lys Leu Leu Lys Lys Val Val Lys Leu Phe Lys Lys Leu Leu Lys

1 5 10 15

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Lys Ile Ile Lys Lys Ile Ile Lys Ile Ile Lys Lys Ile Ile Lys

1 5 10 15

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

Lys Leu Leu Lys Lys Leu Lys Lys Lys Leu Lys Lys Leu Leu Lys

1 5 10 15

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

Ile Lys Lys Ile Ile Lys Ile Ile Lys Lys Ile Ile Lys Lys Ile

1 5 10 15

Claims

1.一类抗细菌多肽，其特征在于：抗细菌多肽具有如下氨基酸序列：At3:KLLKKVVKLFKKLLK；At5:KIIKKIIKIIKKIIK；At8:KLLKKLKKKLKKLLK；At10:IKKIIKIIKKIIKKI。

2.根据权利要求1所述的一类抗细菌多肽，其特征在于：所述抗细菌多肽的C-端采用酰胺化修饰，N-端采用乙酰化修饰。

3.根据权利要求1所述的一类抗细菌多肽的应用，其特征在于：所述抗细菌多肽用于制备抑制或杀灭革兰氏阴性菌的药物。

4.根据权利要求3所述的一类抗细菌多肽的应用，其特征在于：所述抗细菌多肽用于制备抑制或杀灭大肠杆菌、抗铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的药物。