CN111892646A - 高效低毒的抗菌肽衍生物及其在制备抗细菌感染药物中的应用 - Google Patents

高效低毒的抗菌肽衍生物及其在制备抗细菌感染药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了高效低毒的抗菌肽衍生物及其在制备抗细菌感染药物中的应用。本发明将GF‑17抗菌肽和SAAP‑148抗菌肽中除赖氨酸Lys和精氨酸Arg外的任意一个氨基酸残基替换为赖氨酸Lys，获得了两组细胞毒性低、治疗指数高、生物相容性好的新型抗菌肽衍生物。通过实验证明：与天然抗菌肽相比，本发明的新型抗菌肽衍生物对细菌有更高的选择性毒性，即它们具有与天然抗菌肽相同或更强的杀菌作用，且对人类的细胞毒性明显降低，对红细胞造成的影响极低。本发明的新型抗菌肽衍生物对革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌具有广谱的杀伤效应，可以用于治疗对抗生素耐药的革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染引起的疾病，具有良好的应用前景。

Description

高效低毒的抗菌肽衍生物及其在制备抗细菌感染药物中的 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及高效低毒的抗菌肽衍生物及其在制备抗细菌感染药物中的应用。
背景技术
耐药菌尤其是多药耐药菌的出现越来越威胁着人类的健康。其中多药耐药菌“ESKAPE”(粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌)威胁最大。抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是一种作用机制明显不同于传统抗生素、能够快速杀灭细菌、真菌、病毒和寄生虫的多肽类物质，有望成为治疗感染性疾病的新型药物。不同于传统的抗生素，一般认为抗菌肽的作用靶点是细菌的细胞膜。抗菌肽与细菌的细胞膜相互作用，裂解细胞膜而导致细菌死亡。而细菌细胞膜的基本成分非常稳定，不易对抗菌肽产生耐药性。但抗菌肽不仅能够作用于微生物细胞膜，还能够裂解真核细胞的细胞膜，产生细胞毒性，这阻碍了其临床应用。
影响抗菌肽选择性毒性的因素很多，环境因素如离子强度、pH、血清等，抗菌肽自身因素包括抗菌肽的净电荷、螺旋性、疏水性和两亲性等，同时这些参数之间还相互影响。如何降低抗菌肽对真核细胞的毒性、提高抗菌肽对细菌的选择性毒性是目前抗菌肽研究的热点与难点。
发明内容
本发明的目的是提供细胞毒性低、治疗指数高、生物相容性好的新型抗菌肽。
第一方面，本发明保护一种多肽。
本发明保护的多肽是将抗菌肽中除赖氨酸和精氨酸外的任意一个氨基酸残基替换为赖氨酸后得到的多肽；所述抗菌肽为GF-17抗菌肽或SAAP-148抗菌肽。
上述多肽中，当所述抗菌肽为GF-17抗菌肽时，所述多肽为如下A1)-A12)中的任一种：
A1)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第1位氨基酸残基替换为赖氨酸；
A2)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第2位氨基酸残基替换为赖氨酸；
A3)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第5位氨基酸残基替换为赖氨酸；
A4)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第6位氨基酸残基替换为赖氨酸；
A5)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第9位氨基酸残基替换为赖氨酸；
A6)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第12位氨基酸残基替换为赖氨酸；
A7)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第13位氨基酸残基替换为赖氨酸；
A8)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第16位氨基酸残基替换为赖氨酸；
A9)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第17位氨基酸残基替换为赖氨酸；
A10)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第7位氨基酸残基替换为赖氨酸；
A11)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第11位氨基酸残基替换为赖氨酸；
A12)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第15位氨基酸残基替换为赖氨酸。
进一步的，所述多肽为如下a1)-a12)中的任一种：
a1)序列表中序列1所示的多肽；
a2)序列表中序列2所示的多肽；
a3)序列表中序列3所示的多肽；
a4)序列表中序列4所示的多肽；
a5)序列表中序列5所示的多肽；
a6)序列表中序列6所示的多肽；
a7)序列表中序列7所示的多肽；
a8)序列表中序列8所示的多肽；
a9)序列表中序列9所示的多肽；
a10)序列表中序列10所示的多肽；
a11)序列表中序列11所示的多肽；
a12)序列表中序列12所示的多肽。
上述多肽中，所述抗菌肽为SAAP-148抗菌肽时，所述多肽为如下B1)-B12)中的任一种：
B1)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第1位氨基酸残基替换为赖氨酸；
B2)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第4位氨基酸残基替换为赖氨酸；
B3)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第5位氨基酸残基替换为赖氨酸；
B4)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第8位氨基酸残基替换为赖氨酸；
B5)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第9位氨基酸残基替换为赖氨酸；
B6)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第11位氨基酸残基替换为赖氨酸；
B7)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第12位氨基酸残基替换为赖氨酸；
B8)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第15位氨基酸残基替换为赖氨酸；
B9)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第16位氨基酸残基替换为赖氨酸；
B10)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第18位氨基酸残基替换为赖氨酸；
B11)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第19位氨基酸残基替换为赖氨酸；
B12)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第22位氨基酸残基替换为赖氨酸。
进一步的，所述多肽为如下b1)-b12)中的任一种：
b1)序列表中序列13所示的多肽；
b2)序列表中序列14所示的多肽；
b3)序列表中序列15所示的多肽；
b4)序列表中序列16所示的多肽；
b5)序列表中序列17所示的多肽；
b6)序列表中序列18所示的多肽；
b7)序列表中序列19所示的多肽；
b8)序列表中序列20所示的多肽；
b9)序列表中序列21所示的多肽；
b10)序列表中序列22所示的多肽；
b11)序列表中序列23所示的多肽；
b12)序列表中序列24所示的多肽。
上述任一所述多肽具有如下X1)或X2)所述的功能：
X1)预防和/或治疗细菌感染引起的疾病；
X2)抑菌或杀菌或抗菌。
上述任一所述多肽可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
第二方面，本发明保护与上述多肽相关的生物材料。
本发明保护的与上述多肽相关的生物材料为下述C1)至C8)中的任一种：
C1)编码上述多肽的核酸分子；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体；
C4)含有C2)所述表达盒的重组载体；
C5)含有C1)所述核酸分子的重组微生物；
C6)含有C2)所述表达盒的重组微生物；
C7)含有C3)所述重组载体的重组微生物；
C8)含有C4)所述重组载体的重组微生物。
上述生物材料中，所述核酸分子可为如下1)或2)或3)或4)所示的核酸分子：
1)编码所述多肽的DNA分子；
2)编码所述多肽的cDNA分子
3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述多肽的cDNA分子或基因组DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述多肽的cDNA分子或基因组DNA分子。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述多肽的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的所述多肽的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述多肽且具有抑菌或杀菌或抗菌作用，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码所述多肽的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，B2)所述的含有编码所述多肽的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达所述多肽的DNA，该DNA不但可包括启动所述多肽基因转录的启动子，还可包括终止所述多肽基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述多肽基因表达盒的重组载体。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。
第三方面，本发明保护上述多肽或生物材料的新用途。
本发明保护在上述多肽或生物材料在如下S1)-S4)中任一种中的应用：
S1)制备预防和/或治疗细菌感染引起的疾病的产品；
S2)预防和/或治疗细菌感染引起的疾病；
S3)制备抑菌或杀菌或抗菌的产品；
S4)抑菌或杀菌或抗菌。
第四方面，本发明保护如下T1)或T2)所述的方法：
T1)一种降低抗菌肽对真核细胞毒性的方法，包括如下步骤：将抗菌肽中除赖氨酸和精氨酸外的任意一个氨基酸残基替换为赖氨酸，得到抗菌肽衍生物；所述抗菌肽衍生物对真核细胞的毒性低于所述抗菌肽；
T2)一种提高抗菌肽杀菌功效的方法，包括如下步骤：将抗菌肽中除赖氨酸和精氨酸外的任意一个氨基酸残基替换为赖氨酸，得到抗菌肽衍生物；所述抗菌肽衍生物对细菌的杀菌功效高于所述抗菌肽；
所述抗菌肽为GF-17抗菌肽或SAAP-148抗菌肽。
上述方法中，当所述抗菌肽为GF-17抗菌肽时，所述抗菌肽衍生物为上述A1)-A12)任一所述的多肽或上述a1)-a12)任一所述的多肽。
当所述抗菌肽为SAAP-148抗菌肽时，所述抗菌肽衍生物为上述B1)-B12)任一所述的多肽或上述b1)-b12)任一所述的多肽。
上述方法中，所述T1)中，所述抗菌肽衍生物对真核细胞的毒性低于所述抗菌肽体现在所述抗菌肽衍生物对红细胞的溶血能力低于所述抗菌肽。
所述T2)中，所述抗菌肽衍生物对细菌的杀菌功效高于所述抗菌肽体现在所述抗菌肽衍生物的治疗指数高于所述抗菌肽。
所述治疗指数(TI)是抗菌肽或抗菌肽衍生物的最小溶血浓度(MHC)与抗菌肽或抗菌肽衍生物对几种细菌最小抑菌浓度(MIC)的几何平均数之比。在本发明中，所述细菌的种类为五种，具体为大肠杆菌Escherichia coli或金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus或绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa或表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis或肺炎克雷伯杆菌Klebsiella pneumoniae。
所述最小抑菌浓度(MIC)界定为抗菌肽在此浓度时能够完全抑制细菌生长，而较其稍小的抗菌肽浓度不能够抑制细菌生长。所述最小溶血浓度(MHC)界定为刚刚引起10％的红细胞溶血的抗菌肽浓度。
第五方面，本发明保护一种产品。
本发明保护的产品的活性成分为上述多肽或生物材料；
所述产品的功能为如下X1)或X2)：
X1)预防和/或治疗细菌感染引起的疾病；
X2)抑菌或杀菌或抗菌。
上述任一所述应用或方法或产品中，所述细菌可为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。在本发明的具体实施例中，所述细菌具体可为大肠杆菌Escherichia coli或金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus或绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa或表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis或肺炎克雷伯杆菌Klebsiella pneumoniae。
所述产品可为抑菌剂或杀菌剂或抗菌剂。
本发明将GF-17抗菌肽和SAAP-148抗菌肽中除赖氨酸Lys和精氨酸Arg外的任意一个氨基酸残基替换为赖氨酸Lys，获得了两组细胞毒性低、治疗指数高、生物相容性好的新型抗菌肽衍生物。通过用微量稀释法检测新型抗菌肽衍生物的杀菌活性，结果显示与天然抗菌肽GF-17或SAAP-148相比，新型抗菌肽衍生物对细菌的抑制作用增强，本发明还检测了新型抗菌肽衍生物对人红细胞的溶血活性，结果显示与天然抗菌肽GF-17或SAAP-148相比，新型抗菌肽衍生物溶血活性极低。通过实验证明：与天然抗菌肽相比，本发明的新型抗菌肽衍生物对细菌有更高的选择性毒性，即它们具有与天然抗菌肽相同或更强的杀菌作用，且对人类的细胞毒性明显降低，对红细胞造成的影响极低。本发明的新型抗菌肽衍生物对革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌具有广谱的杀伤效应，可以用于治疗对抗生素耐药的革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染引起的疾病，具有良好的应用前景。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的最小抑菌浓度(MIC)界定为抗菌肽在此浓度时能够完全抑制细菌生长，而较其稍小的抗菌肽浓度不能够抑制细菌生长。
下述实施例中的最小溶血浓度(MHC)界定为刚刚引起10％的红细胞溶血的抗菌肽浓度。
下述实施例中的治疗指数(TI)是抗菌肽的最小溶血浓度(MHC)与抗菌肽对几种细菌MIC的几何平均数(GM)之比。抗菌肽的治疗指数能够综合反映抗菌肽对真核细胞和对细菌的选择性毒性，是综合评价抗菌肽的常用指标。
实施例1、抗菌肽的改构方法及抗菌肽衍生物的制备
一、抗菌肽的改构方法
本发明的抗菌肽改构方法是将抗菌肽中除赖氨酸Lys和精氨酸Arg外的任意一个氨基酸残基替换为赖氨酸Lys。将单个氨基酸残基发生替换后的抗菌肽记作抗菌肽衍生物。
二、抗菌肽衍生物的制备
1、GF-17抗菌肽衍生物的制备
以GF-17抗菌肽为例，按照步骤一中的改构方法对GF-17抗菌肽进行改构，得到一组GF-17抗菌肽衍生物，命名为aGF1-aGF12。GF-17抗菌肽及GF-17抗菌肽衍生物aGF1-aGF12的氨基酸序列如表1所示。委托吉尔生化(上海)有限公司合成表1中的多肽。
表1、GF-17抗菌肽及其衍生物的氨基酸序列
Figure BDA0002631031140000061
Figure BDA0002631031140000071
2、SAAP-148抗菌肽衍生物的制备
以SAAP-148抗菌肽为例，按照步骤一中的改构方法对SAAP-148抗菌肽进行改构，得到一组SAAP-148抗菌肽衍生物，命名为SAAP1-SAAP12。SAAP-148抗菌肽及SAAP-148抗菌肽衍生物SAAP1-SAAP12的氨基酸序列如表2所示。委托吉尔生化(上海)有限公司合成表2中的多肽。
表2、SAAP-148抗菌肽及其衍生物的氨基酸序列
Figure BDA0002631031140000072
Figure BDA0002631031140000081
实施例2、抗菌肽衍生物的应用
一、GF-17抗菌肽衍生物的应用
1、GF-17抗菌肽衍生物的溶血能力测定
供试抗菌肽衍生物：实施例1制备的GF-17抗菌肽衍生物aGF1-aGF12，以GF-17抗菌肽作为对照。
按照如下方法分别测定GF-17抗菌肽及GF-17抗菌肽衍生物的溶血能力(对红细胞溶破作用能力)。具体步骤如下：
1)将人新鲜全血用PBS缓冲液(135mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH2PO4，and 8mMK2HPO4，pH 7.2)洗三次，每次450×g离心5min，然后将压实的红细胞用PBS缓冲液配成1.25％压积的红细胞悬液，取160μl红细胞悬液至96孔板中备用。
2)将抗菌肽或抗菌肽衍生物用PBS缓冲液倍比稀释，取40μl加入含有160μl红细胞悬液的96孔板中(抗菌肽衍生物的终浓度分别为100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.13μM、1.56μM和0.78μM，红细胞的终浓度为1％(v/v))，实验过程中避免交叉污染。
3)设置不加抗菌肽及抗菌肽衍生物的孔为阴性对照组，加Triton X-100(终浓度为0.1％，v/v)孔为阳性对照组，设置3个平行孔，于37℃孵育30min。
4)将96孔板450×g离心5min，取100μl上清于新的96孔板中，在多功能酶标仪上检测各孔在450nm处的吸光度，计算各抗菌肽衍生物在不同浓度时的溶血率。溶血率＝(抗菌肽组OD450－阴性对照OD450)/(阳性对照OD450－阴性对照OD450)×100％。GF-17抗菌肽及GF-17抗菌肽衍生物的红细胞溶血率检测结果如表3所示。
表3、GF-17抗菌肽及其衍生物的红细胞溶血率
Figure BDA0002631031140000082
Figure BDA0002631031140000091
结果表明：相较抗菌肽GF-17，本发明的抗菌肽衍生物中除了aGF10对红细胞溶破能力增强外，其余均有不同程度的降低，其中，多肽aGF5、aGF6、aGF7及aGF8对红细胞溶破能力降低尤为显著。在抗菌肽或抗菌肽衍生物浓度为100μM时，抗菌肽GF-17的溶血率达到100％，而此时抗菌肽衍生物aGF5、aGF6、aGF7及aGF8的溶血率为3.85％，5.8％、8.7％和9.1％，说明GF-17对应位置的氨基酸替换成Lys残基有助于降低其对红细胞的溶血作用。
2、GF-17抗菌肽衍生物的杀菌活性测定
供试抗菌肽衍生物：实施例1制备的GF-17抗菌肽衍生物aGF1-aGF12，以GF-17抗菌肽作为对照。
供试菌种：大肠杆菌(Escherichia coli，购买自中国普通微生物保藏管理中心，ATCC编号为1.8732)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，购买自中国普通微生物保藏管理中心，ATCC编号为1.8721)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa，购买自中国普通微生物保藏管理中心，ATCC编号为1.2421)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis，购买自中国普通微生物保藏管理中心，ATCC编号为1.4260)和肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae，购买自中国普通微生物保藏管理中心，ATCC编号为1.1736)。
按微量稀释法用96孔板测定GF-17抗菌肽及GF-17抗菌肽衍生物对不同细菌的最小抑菌浓度。具体步骤如下：
1)菌种复苏，划线接种至LB平板，于微生物培养箱中37℃过夜培养，挑单克隆菌落于普通LB液体培养基中，于恒温摇床37℃，200×rpm培养细菌至对数生长期，用LB液体培养基稀释菌液至106CFU/ml。
2)将抗菌肽或抗菌肽衍生物溶于PBS缓冲液中，使其浓度分别为200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.5625μM，得到不同浓度的抗菌肽或抗菌肽衍生物溶液。
3)将50μl不同浓度的抗菌肽或抗菌肽衍生物溶液分别与50μl稀释后的菌液于无菌96孔板中混匀，37℃共孵育20小时后用多功能酶标仪检测96孔板各孔在600nm处的吸光度。设置不加抗菌肽或抗菌肽衍生物、仅添加50μl PBS缓冲液和50μl稀释后的菌液组为阳性对照，不加抗菌肽或抗菌肽衍生物、仅添加50μl PBS缓冲液和50μl LB培养基组为阴性对照。通过检测各孔OD600值，与阴性对照和阳性对照对比，得出抗菌肽及抗菌肽衍生物的最小抑菌浓度(MIC)。按照步骤1中的方法计算抗菌肽及抗菌肽衍生物的最小溶血浓度(MHC)，并计算几何均数(GM)和治疗指数(TI)。几何均数(GM)是对各变量值的连乘积开项数次方根，具体计算公式如下：几何均数
Figure BDA0002631031140000101
其中，n为5；x1、x2、x3、x4和x5分别代表五种细菌的最小抑菌浓度(MIC)。治疗指数(TI)＝最小溶血浓度(MHC)/几何平均数(GM)。结果如表4所示。
表4、GF-17抗菌肽及其衍生物对五种细菌的最小抑菌浓度(μM)治疗指数
Figure BDA0002631031140000102
二、SAAP-148抗菌肽衍生物的应用
1、SAAP-148抗菌肽衍生物的溶血能力测定
供试抗菌肽衍生物：实施例1制备的SAAP-148抗菌肽衍生物SAAP1-SAAP12，以SAAP-148抗菌肽作为对照。
按照步骤一的1中的方法分别测定SAAP-148抗菌肽衍生物SAAP1-SAAP12的溶血能力(对红细胞溶破作用能力)。
SAAP-148抗菌肽及SAAP-148抗菌肽衍生物的红细胞溶血率检测结果如表5所示。
表5、SAAP-148抗菌肽及其衍生物的红细胞的溶血率
Figure BDA0002631031140000103
Figure BDA0002631031140000111
结果表明：相较SAAP-148抗菌肽，本发明的SAAP-148抗菌肽衍生物中除了SAAP13对红细胞溶破能力增强外，其余均有不同程度的降低，其中，抗菌肽衍生物SAAP7对红细胞溶破能力降低尤为显著。在SAAP-148抗菌肽或SAAP-148抗菌肽衍生物浓度为100μM时，SAAP-148抗菌肽的溶血率几乎达到100％，而此时多肽SAAP7的溶血率仅为10.11％。说明SAAP-148对应位置的氨基酸替换成Lys残基有助于降低其对红细胞的溶血作用。
2、SAAP-148抗菌肽衍生物的杀菌活性测定
供试抗菌肽衍生物：实施例1制备的SAAP-148抗菌肽衍生物SAAP1-SAAP12，以SAAP-148抗菌肽作为对照。
供试菌种：大肠杆菌(Escherichia coli，购买自中国普通微生物保藏管理中心，ATCC编号为1.8732)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，购买自中国普通微生物保藏管理中心，ATCC编号为1.8721)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa，购买自中国普通微生物保藏管理中心，ATCC编号为1.2421)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis，购买自中国普通微生物保藏管理中心，ATCC编号为1.4260)和肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae，购买自中国普通微生物保藏管理中心，ATCC编号为1.1736)。
按微量稀释法用96孔板测定SAAP-148抗菌肽衍生物SAAP1-SAAP12对不同细菌的最小抑菌浓度和最小溶血浓度，并计算治疗指数。具体步骤同步骤一的2中的方法。结果如表6所示。
表6、SAAP-148抗菌肽及其衍生物对五种细菌的最小抑菌浓度(μM)及其治疗指数
Figure BDA0002631031140000112
Figure BDA0002631031140000121
结果表明：SAAP-148抗菌肽及SAAP-148抗菌肽衍生物对金黄色葡萄球菌的杀菌作用都比较弱。SAAP-148抗菌肽的治疗指数为0.11，除了抗菌肽衍生物SAAP10-SAAP13的治疗指数低于SAAP-148外，其余SAAP-148抗菌肽衍生物的治疗指数均较SAAP-148增大，其中SAAP4的治疗指数为9.19，较SAAP-148提高了83倍。本发明合成的SAAP-148抗菌肽衍生物SAAP1-SAAP13对多种细菌具有广谱的杀伤效应，可以用于治疗对抗生素耐药菌感染引起的疾病。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
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<210>1
<211>17
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<400>1
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<210>2
<211>17
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<213>Artificial Sequence
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<210>3
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<213>Artificial Sequence
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<210>5
<211>17
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<210>6
<211>17
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<213>Artificial Sequence
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Lys
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20
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20
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<212>PRT
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Leu Lys Arg Val Trp Lys Arg Val Phe Lys Leu Leu Lys Arg Tyr Trp
1 5 10 15
Arg Gln Leu Lys Lys Lys Val Arg
20

Claims (10)

1.一种多肽，是将抗菌肽中除赖氨酸和精氨酸外的任意一个氨基酸残基替换为赖氨酸后得到的多肽；所述抗菌肽为GF-17抗菌肽或SAAP-148抗菌肽。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：当所述抗菌肽为GF-17抗菌肽时，
所述多肽为如下A1)-A12)中的任一种：
A1)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第1位氨基酸残基替换为赖氨酸；
A2)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第2位氨基酸残基替换为赖氨酸；
A3)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第5位氨基酸残基替换为赖氨酸；
A4)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第6位氨基酸残基替换为赖氨酸；
A5)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第9位氨基酸残基替换为赖氨酸；
A6)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第12位氨基酸残基替换为赖氨酸；
A7)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第13位氨基酸残基替换为赖氨酸；
A8)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第16位氨基酸残基替换为赖氨酸；
A9)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第17位氨基酸残基替换为赖氨酸；
A10)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第7位氨基酸残基替换为赖氨酸；
A11)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第11位氨基酸残基替换为赖氨酸；
A12)将GF-17抗菌肽氨基酸序列的第15位氨基酸残基替换为赖氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其特征在于：所述多肽为如下a1)-a12)中的任一种：
a1)序列表中序列1所示的多肽；
a2)序列表中序列2所示的多肽；
a3)序列表中序列3所示的多肽；
a4)序列表中序列4所示的多肽；
a5)序列表中序列5所示的多肽；
a6)序列表中序列6所示的多肽；
a7)序列表中序列7所示的多肽；
a8)序列表中序列8所示的多肽；
a9)序列表中序列9所示的多肽；
a10)序列表中序列10所示的多肽；
a11)序列表中序列11所示的多肽；
a12)序列表中序列12所示的多肽。
4.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：当所述抗菌肽为SAAP-148抗菌肽时，所述多肽为如下B1)-B12)中的任一种：
B1)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第1位氨基酸残基替换为赖氨酸；
B2)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第4位氨基酸残基替换为赖氨酸；
B3)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第5位氨基酸残基替换为赖氨酸；
B4)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第8位氨基酸残基替换为赖氨酸；
B5)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第9位氨基酸残基替换为赖氨酸；
B6)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第11位氨基酸残基替换为赖氨酸；
B7)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第12位氨基酸残基替换为赖氨酸；
B8)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第15位氨基酸残基替换为赖氨酸；
B9)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第16位氨基酸残基替换为赖氨酸；
B10)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第18位氨基酸残基替换为赖氨酸；
B11)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第19位氨基酸残基替换为赖氨酸；
B12)将SAAP-148抗菌肽氨基酸序列的第22位氨基酸残基替换为赖氨酸。
5.根据权利要求1或4所述的多肽，其特征在于：所述多肽为如下b1)-b12)中的任一种：
b1)序列表中序列13所示的多肽；
b2)序列表中序列14所示的多肽；
b3)序列表中序列15所示的多肽；
b4)序列表中序列16所示的多肽；
b5)序列表中序列17所示的多肽；
b6)序列表中序列18所示的多肽；
b7)序列表中序列19所示的多肽；
b8)序列表中序列20所示的多肽；
b9)序列表中序列21所示的多肽；
b10)序列表中序列22所示的多肽；
b11)序列表中序列23所示的多肽；
b12)序列表中序列24所示的多肽。
6.与权利要求1-5中任一所述多肽相关的生物材料，为下述C1)至C8)中的任一种：
C1)编码权利要求1-5中任一所述多肽的核酸分子；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体；
C4)含有C2)所述表达盒的重组载体；
C5)含有C1)所述核酸分子的重组微生物；
C6)含有C2)所述表达盒的重组微生物；
C7)含有C3)所述重组载体的重组微生物；
C8)含有C4)所述重组载体的重组微生物。
7.权利要求1-5任一所述的多肽或权利要求6所述的生物材料在如下S1)-S4)中任一种中的应用：
S1)制备预防和/或治疗细菌感染引起的疾病的产品；
S2)预防和/或治疗细菌感染引起的疾病；
S3)制备抑菌或杀菌或抗菌的产品；
S4)抑菌或杀菌或抗菌。
8.如下T1)或T2)所述的方法：
T1)一种降低抗菌肽对真核细胞毒性的方法，包括如下步骤：将抗菌肽中除赖氨酸和精氨酸外的任意一个氨基酸残基替换为赖氨酸，得到抗菌肽衍生物；所述抗菌肽衍生物对真核细胞的毒性低于所述抗菌肽；
T2)一种提高抗菌肽杀菌功效的方法，包括如下步骤：将抗菌肽中除赖氨酸和精氨酸外的任意一个氨基酸残基替换为赖氨酸，得到抗菌肽衍生物；所述抗菌肽衍生物对细菌的杀菌功效高于所述抗菌肽；
所述抗菌肽为GF-17抗菌肽或SAAP-148抗菌肽。
9.一种产品，其活性成分为权利要求1-5任一所述的多肽或权利要求6所述的生物材料；
所述产品的功能为如下X1)或X2)：
X1)预防和/或治疗细菌感染引起的疾病；
X2)抑菌或杀菌或抗菌。
10.根据权利要求7所述的应用或权利要求8所述的方法或权利要求9所述的产品，其特征在于：所述细菌包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。
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