CN117777245B

CN117777245B - 一种虫草素-抗菌肽偶合物及其合成方法和应用

Info

Publication number: CN117777245B
Application number: CN202310697925.5A
Authority: CN
Inventors: 谢昆; 王传铭
Original assignee: Honghe University
Current assignee: Honghe University
Priority date: 2023-06-13
Filing date: 2023-06-13
Publication date: 2024-06-07
Anticipated expiration: 2043-06-13
Also published as: CN117777245A

Abstract

本发明涉及药物合成技术领域，具体公开了一种虫草素‑抗菌肽偶合物及其合成方法和应用，通过对LL‑37的二级结构、跨膜区疏水性、C‑端两亲性、电荷偏移、螺旋长度、膜蛋白拓扑学等进行分析，改变LL‑37抗菌肽的螺旋区、β‑折叠区、跨膜结构、信号肽、电荷、疏水区和亲水区氨基酸，获得经分子改造后的新型抗菌肽LK‑24，然后利用有机合成技术，将3'‑dA结构式的5'‑OH改造为5'‑COOH，与LK‑24的氨基端缩合形成3'‑dA‑LK‑24。本发明合成的虫草素‑抗菌肽偶合物对宫颈癌细胞和胰腺癌细胞具有显著的抑癌效果。

Description

一种虫草素-抗菌肽偶合物及其合成方法和应用

技术领域

本发明涉及药物合成技术领域，具体涉及一种虫草素-抗菌肽偶合物及其合成方法和应用。

背景技术

癌症是人类健康的重大威胁，传统抗癌药物的毒副作用大大地限制其疗效的发挥，研究开发新的抗癌药物及治疗策略尤为急迫，其中联合用药可以大大降低药物的用量，发挥互补优势作用，增强抗癌疗效。目前一些小分子化合物如虫草素(Cordycepin,3'-dA)、抗菌肽(Antimicrobial peptide,AMP)等药物已被用于癌症的治疗当中，但虫草素的活性成分3'-脱氧腺苷(3'-dA)在体内容易被腺苷脱氨酶(Adenosinedeaminas,ADA)快速水解，只有极少量的药物被输送到癌细胞中发挥作用；AMP也存在性能不稳定，极易被蛋白酶水解而失去活性。因此需要对这些小分子物质进行修饰或改造，增加可溶性，防止被细胞内蛋白酶水解，提高抗癌活性，降低副作用。AMP是生物体经诱导而产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，能与带负电荷的癌细胞膜结合，破坏细胞膜或穿透细胞，攻击线粒体，导致细胞凋亡，但是癌细胞上的负电荷密度相对较低，天然抗菌肽对于癌细胞的亲和力弱于细菌，因此学者们通过对抗菌肽进行结构优化来达到增强抗癌效果的目的。以期合成抑癌活性更高的化合物。

发明内容

为合成抑癌活性更高的化合物，本发明提供了一种虫草素-抗菌肽偶合物及其合成方法和应用，本发明合成的虫草素-抗菌肽偶合物具有高效体外抑制SW1990人胰腺癌细胞和ME-180人子宫颈表皮癌细胞增殖的活性的作用，安全性好，能够作为一种新型抗癌药物。

本发明提供了一种虫草素-抗菌肽偶合物，通过对LL-37的二级结构、跨膜区疏水性、C-端两亲性、电荷偏移、螺旋长度、膜蛋白拓扑学进行分析，改变LL-37抗菌肽的螺旋区、β-折叠区、跨膜结构、信号肽、电荷、疏水区和亲水区氨基酸，获得经分子改造后的新型抗菌肽LK-24，然后利用有机合成技术，将3'-dA结构式的5'-OH改造为5'-COOH，与LK-24的氨基端缩合形成3'-dA-LK-24化合物，即为虫草素-抗菌肽偶合物。

进一步地，所述虫草素-抗菌肽偶合物为3'-dA-LK-24，分子式为：C₁₀H₁₀N₅O₃-LK-24，分子结构式为：

所述抗菌肽由24个氨基酸组成，命名为：LK-24，一级结构为：NH₂-LKRVWKRVKKLLKRYWRQLKKAKK-COOH。

本发明还提供了上述虫草素-抗菌肽偶合物的合成方法，包括如下步骤：

S1，通过对LL-37的二级结构、跨膜区疏水性、C-端两亲性、电荷偏移、螺旋长度、膜蛋白拓扑等进行分析，改变LL-37抗菌肽的螺旋区、β-折叠区、跨膜结构、信号肽、电荷、疏水区和亲水区氨基酸，获得经分子改造后的新型抗菌肽LK-24；

S2，3'-dA的化学修饰：将3'-dA结构中5'-羟基进行羧基化，形成5'-羧基，方便与LK-24的氨基端形成肽键；

S3，将修饰后的3'-dA与LK-24的氨基端缩合形成3'-dA-LK-24化合物，即为虫草素-抗菌肽偶合物。

进一步地，S1中，对LL-37的分子改造具体为：通过删除LL-37抗菌肽氨基端一段氨基酸序列和个别氨基酸替换后，获氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的SAAP-148抗菌肽，再进一步对SAAP-148羧基端进行氨基酸替换，获得氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的抗菌肽LK-24。

进一步地，所述3'-dA的化学修饰路线为：

进一步地，所述虫草素-抗菌肽偶合物的合成方法的合成路线为：

本发明还提供了上述虫草素-抗菌肽偶合物在制备治疗宫颈癌药物中的应用。

本发明还提供了抗菌肽LK-24在制备治疗宫颈癌药物中的应用，所述抗菌肽LK-24的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，一级结构为：NH₂-LKRVWKRVKKLLKRYWRQLKKAKK-COOH。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明通过生物信息学分析对LL-37抗菌肽和虫草素(3'-dA)两种小分子化合物进行分子改造和化学修饰，获得改造后的抗菌肽LK-24和虫草素3'-dA,进一步通过有机合成技术，获得一种虫草素-抗菌肽化合物(3'-dA-LK-24)，抑癌活性发现3'-dA-LK-24对宫颈癌细胞和胰腺癌细胞具有更强的抑癌效果，因此，虫草素-抗菌肽偶合物3'-dA-LK-24能够作为治疗宫颈癌的药物或药物原料。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为LL-37、SAAP-148和LK-24的二级结构及其类似物的二级结构预测结果，图中，A为LL-37的二级结构及其类似物的二级结构预测；B为SAAP-148为的二级结构及其类似物的二级结构预测；C为LK-24的二级结构及其类似物的二级结构预测。

图2为LK-24的一级结构图。

图3为虫草素(3'-dA)的修饰过程。

图4为3'-dA-LK-24化合物的合成过程。

图5为3'-dA-LK-24对SW1990的抑癌效果。

图6为3'-dA-LK-24对Me180的抑癌效果。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：一种虫草素-抗菌肽偶合物及其合成方法。

本发明提供的虫草素-抗菌肽偶合物为3'-dA-LK-24，分子式为C₁₀H₁₀N₅O₃-LK-24，分子结构为：

所述抗菌肽由24个氨基酸组成，命名为：LK-24，一级结构为：NH₂-LKRVWKRVKKLLKRYWRQLKKAKK–COOH。

一、LL-37的分子改造

根据文献报道和抗菌肽数据库(http://aps.unmc.edu/AP/main.php)，筛选出具有代表性的抗菌肽人LL-37(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)，运用DNAStar、TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)、Anthewin4.3等生物信息学软件对LL-37的二级结构、跨膜区疏水性、C-端两亲性、电荷偏移、螺旋长度、膜蛋白拓扑学等进行分析。通过改变抗菌肽-螺旋区、β-折叠区、跨膜结构、信号肽、电荷、疏水区和亲水区氨基酸，删除LL-37抗菌肽氨基端一段氨基酸序列和个别氨基酸替换后，获氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的SAAP-148抗菌肽，再进一步对SAAP-148羧基端进行氨基酸替换，最终获得由24个氨基酸组成的抗菌肽，命名为LK-24(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)。经生物信息学分析和预测(http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/和SWISS-MODEL和http://www.walenskylab.org/HNM/)LK-24的的净电荷、疏水性、氨基酸极性分布，预测发现，LK-24形成的二级结构以α-螺旋为主，除了氨基端和羧基端第一个氨基酸外，其余22个氨基酸均能形成α-螺旋，形成α-螺旋的氨基酸数目比例(92％)均高于LL-37(78％)和SAAP-148(75％)(如表1和图1)。

表1 LL-37、SAAP-148和LK-24的性质

名称

序列

长度

净电荷

疏水性

极性残基(N％)

非极性残基(N％)

LL-37

SEQ ID NO.1

37

6

0.201

23/62.16

14/37.84

SAAP-148

SEQ ID NO.2

24

11

0.301

12/50

LK-24

SEQ ID NO.3

24

13

0.077

14/58.33

10/41.16

SEQ ID NO.1：LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES；

SEQ ID NO.2：LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR；

SEQ ID NO.3：LKRVWKRVKKLLKRYWRQLKKAKK。

二、LK-24的合成

1、树脂的称量及溶胀

称量树脂(2-CTC resin)0.5g，加入到固相反应管中，加入5mL DCM(二氯甲烷)至30*15mm固相反应管，使树脂完全浸没在DCM溶剂中，用DCM洗瓶冲洗固相反应管内壁，与溶剂充分接触，溶胀10min。

2、肽链的起始及延伸

(1)Fmoc-lys(Boc)-resin的制备

洗涤：溶胀结束后，加入5mLDMF洗涤3次，每次30s；

缩合：将0.15mmol Fmoc-Lys(Boc)-oh用30mL DCM溶解，加入.0.5mmol的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)摇匀后加入装有树脂的固相反应管中，用氮气鼓泡反应2h，获得反应液；

洗涤：将反应液抽走，加入5mL N，N二甲基甲酰胺(DMF)洗涤5次，每次30s，第5次洗涤结束后抽干；

封头：按照体积比甲醇:DIEA:DCM＝1:1:2配制混合溶液3mL，将其加入到抽干的固相反应管中，氮气鼓泡反应30min；

洗涤：反应结束后，将混合溶液抽走，加入5mL DMF洗涤5次，每次30s，获得Fmoc-lys(Boc)-resin。

(2)Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-resin的制备

脱Fmoc：量取5mL 20％哌啶/DMF溶液加入到含有Fmoc-lys(Boc)-resin的固相反应管中，氮气鼓泡反应20min；

洗涤：反应结束后，抽干树脂，加入5mL DMF洗涤5次，每次30s；

检测：用胀吸管吸取10-20g树脂于试管中，分别滴入检测试剂A(2.5g茚三酮+50ml乙醇)、B(分析级吡啶)各两滴置于100℃的水中，水浴30s，树脂显色；

缩合：将0.5mmol Fmoc-Lys(Boc)-oh和0.5mmol的1-羟基苯并三唑(HOBT)放于固相反应管中，用5mL DMF溶解，再加入0.5mmol DIC，氮气鼓泡反应1h，获得反应液；

洗涤：反应结束后，将反应液抽走，加入5mL DMF洗涤5次，每次30s；

检测：用长吸管吸取10-20g树脂于试管中，分别滴入检测试剂A(2.5g茚三酮+50ml乙醇)、B(分析级吡啶)各两滴置100℃的水中，水浴30s，树脂不显色。

(3)重复(2)的步骤，依次偶联剩下的氨基酸得到以下树脂肽：

FMOC-LKRVWRVKKLLKRYRQLKAKK-resin。

(4)脱Fmoc

量取5mL 20％哌啶/DMF溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应20min；

检测：用胀吸管吸取10-20g树脂于试管中，分别滴入检测试剂A(2.5g茚三酮+50ml乙醇)、B(分析级吡啶)各两滴置于100℃的水中，水浴30s，树脂显色；得到氨基酸序列如SEQID NO.3所示的小肽LK-24，LK-24的一级结构如图2所示。

三、虫草素(3'-dA)的化学修饰

步骤1：叔丁基二甲基氯硅烷0.5mmol+三乙胺+DAMP+虫草素(1mmol)冰浴反应3h，得到产物a；

步骤2：产物a+NalO₄ RuC1₃.3H₂0 in CH₃CN-CC1₄-H₂O(CH₃CN：CC1₄：H₂O＝1：1：1.5)，反应7h得到产物b；

步骤3：产物b+AcOH-THF-H₂O(AcOH：THF：H₂O＝3:1:1)，于25℃条件下反应20h，旋蒸、冻干，制备得到修饰过的目标物c。

色谱柱:20*250mm diagesol 8微米

流动相:A:0.1％ TFA水B:0.1％TFA乙腈

流速:10mL/min

制备收集检测的样品峰，质谱显示目标物即可，将样品冻干备用，得到经过修饰的虫草素(3'-dA)。修饰过程如图3所示。

四、3'-dA-LK-24化合物的合成

1、修饰过的3'-dA链接LK-24

缩合：将0.5mmol虫草素(目标物c)和0.5mmol的HOBT放于上述装有样品LK-24的固相反应管中，固相反应管中加入5ml DMF溶解，再加入0.5mmol DIC，氮气鼓泡反应1h，获得反应液。

洗涤：反应结束后，将反应液抽走，加入5ml DMF洗涤5次，每次30s。

检测：用长吸管吸取10-20g树脂于试管中，分别滴入检测试剂A、B各两滴置100℃，水浴中30s，树脂不显色。

2、树脂的干燥

向固相反应管中加入30mL DMIF进行洗涤4次，每次30s；然后加入30mL甲醇洗涤3次，每次30s。抽走甲醇，继续抽干树脂30min。

3、切割试剂的配制

配制切割试剂(以100mL切割试剂为例)：

配方为:95mL TFA+1mL水+2mL EDT+2mLTis，备用，配置量一般为1g树脂加10mL切割试剂。1mL切割试剂用10mL乙醚洗涤。

4、沉降的准备

无水乙醚置于-20℃低温预冷[预冷时间≥2h]。1mL切割试剂用10mL乙醚沉降多肽。

5、多肽的切割

抽干后的树脂进行称重，加入切割液切割2h。然后用乙醚沉降，得到粗品3'-dA-LK-24。

6、3'-dA-LK-24的纯化

色谱柱:20*250mm diagesol 8微米

流动相:A:0.1％ TFA水B:0.1％TFA乙腈

流速:10mL/min

制备收集检测的样品峰，分析纯度大于90％。将样品冻干备用，得到最终目标产物3'-dA-LK-24，总合成路线见图4。

实施例2：虫草素-抗菌肽偶合物的抑癌活性研究。

收集对数期SW1990和Me180癌细胞，按次序加入1640(无血清)培养基30μL，加Actinomycin D 10μL，再分别加入3'-dA、LK-24、3'-dA-LK-24，使其终浓度为1.25μM，2.5μM，5μM，10μM，20μM，40μM，调节细胞悬液浓度1×10⁶/mL，加入96孔板，每孔100μL，每组实验做四个重复，置37℃，5％CO2孵育48小时，每孔加入10μL WST-1溶液(5mg/mL，即0.5％WST-1)，继续培养4h直接酶联免疫检测仪OD₅₇₀ nm测量各孔的吸光值，取平均值，评价3'-dA、LK-24、3'-dA-LK-24的抑癌效果。

结果如图5和图6所示，10μM浓度的3'-dA-LK-24化合物对SW1990和ME-180癌细胞增值的抑制率分别达到84.51％和87.65％，远高于单独使用3'-dA(62.25％和67.72％)和LK-24(76.11％和72.54％)的效果。

本发明对3'-dA进行化学修饰，将3'-dA结构中5'-羟基进行羧基化，形成5'-羧基，方便后续与LK-24的氨基端形成肽键；利用有机合成技术，将3'-dA结构式的5'-OH改造为5'-COOH，与LK-24的氨基端缩合形成3'-dA-LK-24化合物，为后续3'-dA-LK-24在癌症研究领域的应用奠定基础。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种虫草素-抗菌肽偶合物，其特征在于，通过对LL-37的二级结构、跨膜区疏水性、C-端两亲性、电荷偏移、螺旋长度、膜蛋白拓扑学进行分析，改变LL-37抗菌肽的螺旋区、β-折叠区、跨膜结构、信号肽、电荷、疏水区和亲水区氨基酸，获得经分子改造后的抗菌肽LK-24，然后利用有机合成技术，将3'-dA结构式的5'-OH改造为5'-COOH，与LK-24的氨基端缩合形成3'-dA-LK-24化合物，即为虫草素-抗菌肽偶合物；

所述虫草素-抗菌肽偶合物3'-dA-LK-24的分子式为：C₁₀H₁₀N₅O₃-LK-24，分子结构式为：

2.一种权利要求1所述的虫草素-抗菌肽偶合物的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，通过对LL-37的二级结构、跨膜区疏水性、C-端两亲性、电荷偏移、螺旋长度、膜蛋白拓扑学进行分析，改变LL-37抗菌肽的螺旋区、β-折叠区、跨膜结构、信号肽、电荷、疏水区和亲水区氨基酸，获得经分子改造后的抗菌肽LK-24；

3.根据权利要求2所述的虫草素-抗菌肽偶合物的合成方法，其特征在于，S1中，对LL-37的分子改造具体为：通过删除LL-37抗菌肽氨基端一段氨基酸序列和个别氨基酸替换后，获得氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的SAAP-148抗菌肽，再对SAAP-148抗菌肽羧基端进行氨基酸替换，获得氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的抗菌肽LK-24。

4.根据权利要求2所述的虫草素-抗菌肽偶合物的合成方法，其特征在于，所述3'-dA的化学修饰路线为：

5.根据权利要求2所述的虫草素-抗菌肽偶合物的合成方法，其特征在于，所述虫草素-抗菌肽偶合物的合成方法的合成路线为：

6.一种权利要求1所述的虫草素-抗菌肽偶合物在制备治疗宫颈癌药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗菌肽LK-24的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，一级结构为：NH₂-LKRVWKRVKKLLKRYWRQLKKAKK-COOH。