CN101817873A - 一种促进细胞黏附的多肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物材料、再生医学和药学技术领域，具体涉及到一种能够显著诱导并同时促进细胞特异性及非特异性黏附的多肽及其制备方法与应用。本发明所涉及的多肽包含两部分结构，一端是含有整合素亲和性的有利于细胞特异性黏附的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的环型肽链，另一端是可与细胞外被膜发生作用促进细胞非特异性黏附的线型肽链，同时侧链的末端具有可功能化修饰的基团，使此多肽可被固定于生物材料，例如金、聚乳酸-聚乙交酯等表面，可大大提高材料的生物相容性及有利于细胞黏附性。可用于生物材料的改性以及靶向药物。
Description
技术领域
本发明属于生物材料、再生医学与药学技术领域，具体涉及到一种能够显著促进细胞黏附的多肽及其制备方法与应用。
背景技术
细胞与材料的相互作用是生物材料研究中的一个重要的基础研究。细胞黏附于生物材料表面作为细胞对材料的第一步响应，并影响细胞后续的铺展、生长、迁移、凋亡等细胞行为，分为特异性黏附与非特异性黏附。特异性黏附是通过细胞膜上整合素与细胞外基质上的配体发生选择性的结合而实现的。整合素是细胞表面与细胞骨架相结合的一系列跨膜蛋白，它是由α，、β亚基组成的异二聚体。整合素通过胞内细胞骨架与细胞外基质分子的结合从而调控细胞的分化、迁移、凋亡等行为。整合素在多种类型细胞中有表达。
配体可以有多种，其中最常见的配体包含RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列。该序列也是细胞外基质上纤维连接蛋白(fibronectin)中的一段序列，是整合素在细胞外基质上可以识别的最小序列。1984年，Pierschbacher和Ruoslahti(Pierschbacher，M.D.；Ruoslahti，E.，1984 Nature，309：30-33)用人工方法合成含有RGDS(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸)的短肽。固定了RGDS的生物材料表面可以促进细胞在其上的黏附、生长和分化。Kessler等认为，环状的带有RGD的多肽比线型的RGD系列多肽在体内更稳定，和整合素的结合活性更高。(Haubner，R.；Schmitt，W.；Holzemann，G.；Goodman，S.L.；Jonczyk，A.；Kessler，H.，1996 J.Am.Chem.Soc.，118：7881-7891)但目前的环状的RGD系列多肽只是与细胞的整合素发生特异性作用，含有环状RGD的试剂的亲和效率仍然有待提高。
细胞在培养板等表面多表现为非特异性黏附。Geiger课题组的研究发现，细胞与外界材料初始接触的过程是受到一层较厚的含透明质酸的细胞外被膜(PCC)所介导的非特异性黏附(Cohen，M.；Joester，D.；Geiger，B.；Addadi，L.，2004 ChemBioChem 5：1393-1399)。PCC在生理条件下荷负电。
带有PCC的细胞与材料初始接触以后才可能实现整合素介导的特异性黏附。可以利用细胞的这一特质，开发出利用与细胞透明质酸外膜带有相反电荷的物质来促进细胞的初始黏附，并强化细胞进一步发生特异性黏附等后续的细胞行为。本发明即利用了这种协同效应。
为了显著诱导细胞在材料表面的黏附，本发明设计了以带有RGD的环五肽作为主体，接上功能化的侧链。通过生理条件下荷正电的侧链来诱导细胞的透明质酸外膜发生细胞的初始非特异性黏附，再通过带有RGD的环五肽来诱导细胞的整合素与多肽的结合，促进细胞的特异性黏附。这样的双重诱导作用可以显著有效地提高细胞的黏附率。功能化的端基，可以使多肽固定在材料表面或进一步连接药物分子。这样的多肽分子，可以在生物材料的表面修饰与整合素靶向药物上可得到广泛的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种可显著高效地诱导细胞黏附、以用于材料改性的含多肽或进一步含有功能基团的多肽连接分子(后面有时也简称为多肽)。
本发明提出的多肽分子包含至少两个部分，一部分可以促进特异性细胞黏附，另外一部分可以促进非特异性细胞黏附。其中，可促进特异性细胞黏附的多肽含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)多肽序列；可促进非特异性细胞黏附的部分为含有荷正电荷的多肽。对于含有多肽的连接分子还包含可以进一步连接其它分子或表面的功能基团。
本发明特别设计了以带有RGD的环五肽作为主体，接上功能化的侧链。通过侧链来诱导细胞的透明质酸外膜发生细胞的初始非特异性黏附，再通过带有RGD的环五肽来诱导细胞的整合素与多肽的结合，促进细胞的特异性黏附。这样的双重诱导作用可以利用两种不同黏附类型之间的协同效应显著有效地提高细胞的黏附率。功能化的端基，可以使多肽固定在材料表面或进一步连接其它分子。这样的多肽适用于诱导并促进大多数细胞的黏附。
作为此类多肽分子的特殊形式，本发明设计了以下化学结构(但并不限于下述具体的化学结构式)，
其中，n为1-20之间的自然数。
X1可以是带苯环的右旋氨基酸，例如D-苯丙氨酸(D-Phenylalanine，Phe，f)，D-色氨酸(D-Tryptophan，简称Trp或w)，D-酪氨酸(Tyrosine，简称Tyr或y)。(本发明的简称除非特殊说明以外，符合生物化学对于氨基酸的常规简写方式；此外，根据生物化学的惯例，不常见的D型氨基酸采用小写字母的单字符表示，而常见的L-型氨基酸采用大写字母的单字符表示；以下同)
X2是带有侧链的氨基酸，可以是赖氨酸(Lysine，Lys，K)，天冬氨酸(Aspartic acid，Asp，D)或谷氨酸(Glutamic acid，Glu，E)
X3可以是赖氨酸或精氨酸。
X4可以是含有巯基(-SH)，氨基(-NH2)，或羧基(-COOH)功能化基团的分子。
X2与X3之间和/或X3与X4之间可以通过酰胺键连接，也可以通过另外的分子连接。
其结构式包括但不限于下述中的任何一种：
| Cyclo[R-G-D-f-K(K)n]-SH | Cyclo[R-G-D-f-D(K)n]-SH | Cyclo[R-G-D-f-E(K)n]-SH |
| Cyclo[R-G-D-f-K(R)n]-SH | Cyclo[R-G-D-f-D(R)n]-SH | Cyclo[R-G-D-f-E(R)x]-SH |
| Cyclo[R-G-D-w-K(K)n]-SH | Cyclo[R-G-D-w-D(K)n]-SH | Cyclo[R-G-D-w-E(K)n]-SH |
| Cyclo[R-G-D-f-K(K)n]-SH | Cyclo[R-G-D-f-D(K)n]-SH | Cyclo[R-G-D-f-E(K)n]-SH |
| Cyclo[R-G-D-w-K(R)n]-SH | Cyclo[R-G-D-w-D(R)n]-SH | Cyclo[R-G-D-w-E(R)n]-SH |
| Cyclo[R-G-D-y-K(K)n]-SH | Cyclo[R-G-D-y-D(K)n]-SH | Cyclo[R-G-D-y-E(K)n]-SH |
| Cyclo[R-G-D-y-K(R)n]-SH | Cyclo[R-G-D-y-D(R)n]-SH | Cyclo[R-G-D-y-E(R)n]-SH |
或
| Cyclo[R-G-D-f-K(K)n]-COOH | Cyclo[R-G-D-f-D(K)n]-COOH | Cyclo[R-G-D-f-E(K)n]-COOH |
| Cyclo[R-G-D-f-K(R)n]-COOH | Cyclo[R-G-D-f-D(R)n]-COOH | Cyclo[R-G-D-f-E(R)n]-COOH |
| Cyclo[R-G-D-w-K(K)n]-COOH | Cyclo[R-G-D-w-D(K)n]-COOH | Cyclo[R-G-D-w-E(K)n]-COOH |
| Cyclo[R-G-D-w-K(R)n]-COOH | Cyclo[R-G-D-w-D(R)n]-COOH | Cyclo[R-G-D-w-E(R)n]-COOH |
| Cyclo[R-G-D-y-K(K)n]-COOH | Cyclo[R-G-D-y-D(K)n]-COOH | Cyclo[R-G-D-y-E(K)n]-COOH |
| Cyclo[R-G-D-y-K(R)n]-COOH | Cyclo[R-G-D-y-D(R)n]-COOH | Cyclo[R-G-D-y-E(R)n]-COOH |
或
| Cyclo[R-G-D-f-K(K)n]-NH2 | Cyclo[R-G-D-f-D(K)n]-NH2 | Cyclo[R-G-D-f-E(K)n]-NH2 |
| Cyclo[R-G-D-f-K(R)n]-NH2 | Cyclo[R-G-D-f-D(R)n]-NH2 | Cyclo[R-G-D-f-E(R)n]-NH2 |
| Cyclo[R-G-D-w-K(K)n]-NH2 | Cyclo[R-G-D-w-D(K)n]-NH2 | Cyclo[R-G-D-w-E(K)n]-NH2 |
| Cyclo[R-G-D-w-K(R)n]-NH2 | Cyclo[R-G-D-w-D(R)n]-NH2 | Cyclo[R-G-D-w-E(R)n]-NH2 |
| Cyclo[R-G-D-y-K(K)n]-NH2 | Cyclo[R-G-D-y-D(K)n]-NH2 | Cyclo[R-G-D-y-E(K)n]-NH2 |
| Cyclo[R-G-D-y-K(R)n]-NH2 | Cyclo[R-G-D-y-D(R)n]-NH2 | Cyclo[R-G-D-y-E(R)n]-NH2 |
本发明还提供上述多肽分子的合成方法，具体步骤如下：
(1)首先利用Fmoc固相合成的方法在二氯三苯甲基树脂上，通过逐步接肽及脱除保护基条件的选择，合成带有不同保护基团的含有RGD的并带有侧链的线型多肽，连接侧链的同时接上巯基、氨基或羧基功能化基团；
(2)用三氟乙酸(TFA)将线型多肽从树脂上切割下来；
(3)通过甘氨酸的羧基与天冬氨酸的氨基的缩合反应，使得线型多肽中的一部分在二甲基亚砜的溶液中发生环化反应，形成带保护基团的环状多肽；
(4)最后，使用三氟乙酸将环状多肽的保护基团去除得到的产物通过制备级高效液相色谱纯化，真空干燥。
本发明还提供上述多肽分子的应用。例如，在金表面的活性修饰，其方法是将所述的多肽分子，溶解于水中，滴加于干净的金表面，在4C~6℃环境中反应12~15小时，形成金表面的生物活性修饰。又如，该多肽分子可固定于聚合物表面，其方法是将所述的多肽分子，按一定比例大单体混合于水中，在紫外光照射下，诱发大单体聚合，完成多肽分子在聚合物中的固定；或者修饰前大单体分子链中包含NHS或碳碳双键，多肽分子端基的双键可通过紫外光引发聚合。
本发明的多肽分子与现有的用于材料改性的多肽分子相比有以下几个特点：
(1)此类多肽可诱导细胞在材料表面初始接触，增加细胞在材料表面的黏附能力
(2)此类多肽可诱导并促进细胞的整合素与材料表面发生特异性结合，并有效促进细胞的进一步伸展，生长等细胞行为。
(3)此类多肽在生物体内具有比线型多肽更高的稳定性与生物活性。
(4)此类多肽可在非常温和的条件下固定于金等基质材料的表面，提高材料的细胞黏附性。
(5)此类多肽可通过光引发固定于特定的聚合物表面，提高聚合物的生物相容性及生物活性。
(6)此类多肽可通过热引发固定于特定的聚合物表面，提高聚合物的生物相容性及生物活性。
(7)此类多肽可作为带有靶头的连接分子，用于整合素靶向的药物和药物载体的合成。
本发明设计了一类多肽，至少包含两部分结构，一部分可以促进特异性细胞黏附，另外一部分可以促进非特异性细胞黏附。其中，促进特异性细胞黏附的部分含有可与细胞膜上整合素(Integrin)结合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，尤其是包含RGD的环型肽链；可促进非特异性细胞黏附的部分主要为可与细胞外被膜(pericellular coat，PCC)发生作用的线型肽链，同时侧链的末端还可以包含可用于进一步功能化修饰的基团，使此多肽可进一步连接其他物质或被固定于材料表面，例如金、聚乳酸-聚乙交酯(PLGA)等表面，可大大提高材料的生物相容性及有利于细胞黏附性。可用于生物材料的改性以及作为合成靶向药物时使用的连接靶头。
附图说明
图1为合成多肽RGD-K的1HNMR核磁图。
图2为合成多肽RGD-K的MOLDI-TOF MS图。
图3为合成多肽RGD-K的HPLC的纯化图。
图4为鼠成纤维NIH 3T3细胞分别在固定了RGD-K环状多肽的金表面、未固定多肽的金表面、玻璃及培养板(TCP)上的荧光显微镜图。实验条件为：在材料表面加入浓度5×105的NIH3T3细胞，培养基为1％胎牛血清(FBS)的DMEM。在37℃下5％CO2恒温培养箱，培养3小时。取出后用PBS轻轻冲洗去未黏附的细胞，用4％多聚甲醛固定细胞10分钟后用PBS冲洗。随后用Triton-X 100破膜10分钟。接着用Phalloidin-TRITC和DAPI进行细胞骨架及细胞核的染色。染色后的细胞通过荧光倒置显微镜观察细胞在上述材料表面的黏附情况。
具体实施方式
下面通过实例来进一步描述本发明，但不限于这些实施例
实施例1
简称为RGD-K的环肽/直链肽杂合多肽分子(1)的详细结构式可见图1，采用氨基酸残基单字符后，结构式可表示为：
合成步骤包括：
1)直链多肽
NH2-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys[-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-thiol]-Arg(Pbf)-Gly-OH的合成
直链多肽的合成是在二氯三苯甲基树酯上用9-芴-甲氧基酰基(Fmoc)的方法来合成。首先将一定量的树酯用无水的二氯甲烷浸泡20分钟，加入预先溶解在无水二氯甲烷中的Fmoc保护甘氨酸，及N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)，室温反应2小时。随后用醇与树酯上未反应的活性位点反应15分钟，进行封端。反应完毕后，用二甲基亚砜(DMF)、二氯甲烷(DCM)、甲醇清洗树酯，并真空干燥树酯，称取树酯反应前后的质量差，求出第一个氨基酸在树酯上负载量为。加入20％的哌啶/DMF溶液，反应15分钟，以去除甘氨酸上氨基的Fmoc保护基，用DMF洗涤干净树酯，取小量树酯进行茚三酮反应显蓝色，证明Fmoc已被脱除，露出甘氨酸上的游离氨基。
将Fmoc-Arg(Pbf)-OH用DMF溶解后，加入苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)及DIPEA混合均匀后，滴加入上述树酯中，进行氨基与羧基的缩聚反应30分钟。反应结束后，用DMF洗涤干净并加入20％哌啶/DMF溶液脱除Fmoc保护基，然后用DMF洗涤干净树酯，取小量树酯进行茚三酮反应显蓝色，证明Fmoc已被脱除，露出精氨酸上的游离氨基。此时，树酯上连接的多肽序列为NH2-Arg(Pbf)-Gly-resin。
按照上述反应步骤与配比，依次加入Aloc-Lys(Fmoc)-OH，Fmoc-Lys(Pbf)-OH，Fmoc-Lys(Pbf)-OH，Fmoc-Lys(Pbf)-OH，3-Tritylmercapto-Propionic acid。每次缩聚反应结束后，都必须进行茚三酮检测，以确保反应已完全。至此，树酯上的连接的序列为Aloc-Lys[-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-thiol]-Arg(Pbf)-Gly-resin。
上诉逐步接肽反应结束后，将树酯用无水DCM充分洗涤干净后，在Ar氛围下，滴加PhSiH3/Pd(PPh3)4/DCM的混合溶液，反应15分钟脱除树酯上赖氨酸的Aloc保护基，DMF洗涤后，进行茚三酮检测。
最后依次进行Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH与树酯上多肽的缩合反应。去除了天冬氨酸上Fmoc保护基后，树酯上直链多肽序列NH2-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys[-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-thiol(Trt)]-Arg(Pbf)-Gly-resin的合成已经完成。
2)直链多肽的切割
将上述连有直链多肽的树酯真空干燥后加入5％的TFA/DCM，搅拌反应一小时，过滤后收集滤液。滤液用DCM沉淀后，离心收集到直链的带保护基团的多肽NH2-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys[-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-thiol(Trt)]-Arg(Pbf)-Gly-OH。MOLDI-TOF MS：m/z＝2312.3[M+H+]
3)部分序列的环化
将带保护基团的直链多肽溶解于DMF中，加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)及DIPEA，室温反应12小时。反应结束后，将溶剂旋蒸干后，用水沉淀，离心收集沉淀物，冷冻干燥得到带保护基团的环状肽。MOLDI-TOF MS：m/z＝2293.5[M+H+]
4)保护基的去除
将混合切割剂(95％(v/v)TFA，2.5％(v/v)水，2.5％(v/v)茴香硫醚)10mL滴加入上述冷冻干燥后的带保护基团的环状肽中，反应3小时脱除所有保护基。旋蒸去大部分溶剂后，无水乙醚沉淀，离心收集沉淀，真空干燥得粗产物(0.24g，0.22mmol，MOLDI-TOF MS：m/z＝1077.7[M+H+]
4)环肽/直链肽杂合多肽的纯化
将上述粗产物用制备级HPLC纯化，得到白色的纯品，纯度为98％。MALDI-TOF MS：m/z＝1077.07for[M+H]+，1H NMR(500MHz，DMSO)：δin ppm＝8.30-7.55(NH of thepeptide backbone)，7.44-7.43(NHε-Arg)，7.3-7.14(aromat，CH-D-Phe)，6.78(NH2-Arg)，4.45-4.05(CH2 α-Asp，CH2 α-D-Phe CH2 α-Arg，CH2 α-Gly，CH2 α-Lys，CH2 ε-Lys)，3.78 & 3.24(CH2 α-Gly)，3.10-3.07(CH2 δ-Arg，CH2 ε-Lys)，2.96(CH2 β-D-Phe)，2.85-2.65(CH2 ε-Lys，CH2 β-D-Phe，CH2 αMpa，CH2 β-Asp)，2.45-2.2(CH2 β-Mpa，CH2 β-Asp)，1.82-1.65(CH2 β-Arg，CH2 β-Lys，CH2 δ-Lys)，1.51-1.21(CH2 β-Lys，CH2 β-Arg，CH2 γ-Arg，CH2 δ-Lys，CH2 γ-Lys)。
实施例2
多肽分子(2)的合成，结构式如下：
直链多肽NH2-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys[-[Lys(Boc)]20-thiol(Trt)]-Arg(Pbf)-Gly-OH的合成与实例1中直链多肽的合成步骤类似，只是侧链的反应时，加入的氨基酸的序列变为，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Aloc-Lys(Fmoc)-OH，重复Fmoc-Lys(Boc)-OH的缩聚反应20次，3-Tritylmercapto-Propionic acid，Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH。直链的带保护基团的多肽，环化并去除保护基后的环肽/直链肽杂合多肽经制备级HPLC纯化后得到最终白色纯品的纯度为98％。MALDI-TOF MS：m/z＝2949.89for[M+H]+。
实施例3
多肽分子(3)的合成，结构式如下：
直链多肽NH2-Asp(OtBu)-D-Tyr-Lys[-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-thiol(Trt)]-Arg(Pbf)-Gly-OH的合成与实例1中直链多肽的合成步骤类似，只是侧链的反应时，加入的氨基酸的序列变为，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Aloc-Lys(Fmoc)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH 3-Tritylmercapto-Propionic acid，Fmoc-D-Tyr-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH。直链的带保护基团的多肽，环化并去除保护基后的环状肽经制备级HPLC纯化后得到最终白色纯品的纯度为98％。MALDI-TOF MS：m/z＝1177.07for[M+H]+。
实施例4
多肽分子(4)的合成，结构式如下：
直链多肽
NH2-Asp(OtBu)-D-Trp-Lys[-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)]-Arg(Pbf)-Gly-OH的合成与实例1中直链多肽的合成步骤类似，只是侧链的反应时，加入的氨基酸的序列变为Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Aloc-Lys(Fmoc)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Lys(boc)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OPbf，Fmoc-D-Trp-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH。得到的直链的带保护基团的多肽，环化后并去除保护基团的环状肽经制备级HPLC纯化后，最终得到的白色的纯品，纯度为98％。MALDI-TOF MS：m/z＝1158.47for[M+H]+。
实施例5
多肽分子(5)的合成，结构式如下：
直链多肽
NH2-Asp(OtBu)-D-Trp-Lys[-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)]-Arg(Pbf)-Gly-OH的合成与实例1中直链多肽的合成步骤类似，只是侧链的反应时，加入的氨基酸的序列变为Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Aloc-Lys(Fmoc)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Lys(boc)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OPbf，Fmoc-D-Trp-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH。得到的直链的带保护基团的多肽，环化后并去除保护基团的环状肽经制备级HPLC纯化后，最终得到的白色的纯品，纯度为98％。MALDI-TOF MS：m/z＝1230.2for[M+H]+。
实施例6：
多肽分子(6)的合成，结构式如下：
直链多肽
NH2-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys[-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-thiol(Trt)]-Arg(Pbf)-Gly-OH的合成与实例1中直链多肽的合成步骤类似，只是侧链的反应时，加入的氨基酸的序列变为Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Aloc-Lys(Fmoc)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH Fmoc-Lys(boc)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-D-Trp-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH。得到的直链的带保护基团的多肽，环化后并去除保护基团的环状肽经制备级HPLC纯化后，最终得到的白色的纯品，纯度为98％。MALDI-TOF MS：m/z＝1354.38for[M+H]+。
实施例7：
多肽分子(7)的合成，结构式如下：
首先合成直链多肽
NH2-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys[-(CH2)5-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-thiol(Trt)]-Arg(Pbf)-Gly-OH。其步骤与实例1中直链多肽的合成步骤类似，只是侧链的反应时，加入的氨基酸的序列变为Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Aloc-Lys(Fmoc)-OH，Fmoc-(CH2)5-OH(Fmoc保护的氨基己酸)，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Lys(boc)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH。得到的直链的带保护基团的多肽，环化后并去除保护基团的环状肽经制备级HPLC纯化后，最终得到的白色的纯品，纯度为98％。MALDI-TOF MS：m/z＝1459.4for[M+H]+。
实施例8：
多肽分子(8)的合成，结构式如下：
直链多肽
NH2-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys[-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-(CH2CH2O)4-thiol(Trt)]-Arg(Pbf)-Gly-OH的合成与实例1中直链多肽的合成步骤类似，只是侧链的反应时，加入的氨基酸的序列变为Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Aloc-Lys(Fmoc)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Lys(boc)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-(CH2CH2O)4-OPbf，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH。得到的直链的带保护基团的多肽，环化后并去除保护基团的环状肽经制备级HPLC纯化后，最终得到的白色的纯品，纯度为98％。MALDI-TOF MS：m/z＝1530.38for[M+H]+。
实施例9：
多肽分子(9)的合成，结构式如下：
首先合成直链多肽
NH2-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys[-(CH2)5-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-(CH2CH2O)4-thiol(Trt)]-Arg(Pbf)-Gly-OH。其步骤与实例1中直链多肽的合成步骤类似，只是侧链的反应时，加入的氨基酸的序列变为Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Aloc-Lys(Fmoc)-OH，Fmoc-(CH2)5-OH(Fmoc保护的氨基己酸)，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Lys(boc)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-(CH2CH2O)4-OPbf，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH。得到的直链的带保护基团的多肽，环化后并去除保护基团的环状肽经制备级HPLC纯化后，最终得到的白色的纯品，纯度为98％。MALDI-TOF MS：m/z＝1636.38for[M+H]+。
实施例10：多肽用于金表面的生物活性修饰
将实施例1中制备的化合物，按照25μmol/L的浓度溶于纯净水中，滴加在干净的金表面，在4℃~6℃下反应12~15小时。反应结束后，用纯净水轻轻冲洗金表面，去除未反应的多肽分子即可。
实施例11
多肽用于PLGA-PEG-PLGA(polylactide/glycolide acid(PLGA)-polyethylene glycol(PEG)-PLGA，)水凝胶的生物活性修饰。
将实施例3中制备的化合物，与两端NHS化改性的NHS-PLGA-PEG-PLGA-NHS，按照2∶1的配比投入pH＝8.0的PBS中，室温搅拌反应4h。反应结束后，通过透析除去未反应的多肽，冷冻干燥得到产物多肽接枝的PLGA-PEG-PLGA。将产物配制成10％-30％的水溶液，在20℃-40℃之间能形成多肽活性修饰的PLGA-PEG-PLGA水凝胶。
Claims (8)
1.一种可促进细胞黏附的多肽分子，其特征在于包含至少两个部分，一部分可以促进特异性细胞黏附，另外一部分可以促进非特异性细胞黏附，其中，所述可促进特异性细胞黏附的多肽含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽序列，所述可促进非特异性细胞黏附的部分为含有荷正电荷的多肽。
2.根据权利要求1所述的可促进细胞黏附的多肽分子，其特征在于，还包含可以进一步连接材料表面或其它分子的功能基团。
3.根据权利要求1所述的可促进细胞黏附的多肽分子，其特征在于具有以下化学结构，
其中，
R代表精氨酸残基，G代表甘氨酸残基，D代表天冬氨酸残基；
X1是带苯环的右旋氨基酸；
X2是带有侧链的氨基酸；
X3是赖氨酸或精氨酸；
n为1-20之间的数字；
X4为含有巯基、氨基或羧基功能化基团的分子。
4.根据权利要求3所述的可促进细胞黏附的多肽分子，其特征在于X2与X3之间和/或X3与X4之间通过酰胺键连接，其结构式为：
或
或
当中的任何一种，其中，n为1-20之间的数字。
5.一种如权利要求1所述的多肽分子的合成方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)首先利用Fmoc固相合成的方法在二氯三苯甲基树脂上，通过逐步接肽及脱除保护基条件的选择，合成带有不同保护基团的含有RGD的并带有侧链的线型多肽，连接侧链的同时接上巯基、氨基或羧基功能化基团；
(2)用三氟乙酸将线型多肽从树脂上切割下来；
(3)通过甘氨酸的羧基与天冬氨酸的氨基的缩合反应，使得线型多肽中的一部分在二甲基亚砜的溶液中发生环化反应，形成带保护基团的环状多肽；
(4)最后，使用三氟乙酸将环状多肽的保护基团去除得到的产物通过制备级高效液相色谱纯化，真空干燥。
6.一种如权利要求1所述的多肽分子在金表面的固定方法，其特征在于：
将所述的多肽分子，溶解于水中，滴加于干净的金表面，在4℃~6℃环境中反应12~15小时，形成金表面的生物活性修饰。
7.一种如权利要求1所述的多肽分子在聚合物中的固定化方法，其特征在于：修饰前大单体分子链中包含NHS或碳碳双键，多肽分子端基的双键可通过紫外光引发聚合。
8.一种如权利要求1所述的多肽分子在聚合物中的固定方法，其特征在于：将所述的多肽分子，按一定比例大单体混合于水中，在紫外光照射下，诱发大单体聚合，完成多肽分子在聚合物中的固定。
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