CN108026152A - 环状rgd细胞结合基序及其用途 - Google Patents

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Abstract

一种重组融合蛋白，其包含蜘蛛丝片段和对整联蛋白例如α5β1整联蛋白具有选择性的环状RGD细胞结合基序。所述融合蛋白可用作细胞支架材料，以及用于培养在其细胞表面上展示整联蛋白的细胞。

Description

环状RGD细胞结合基序及其用途
发明的技术领域
本发明涉及真核细胞培养和组织工程领域。本发明提供新的蛋白、包含该蛋白的细胞支架材料以及用于培养细胞的方法，其中使用该新蛋白的聚合物作为细胞支架材料。
发明背景
细胞的表型很大程度上受其展示的整联蛋白的影响。通过在其表面上表达多种类型的整联蛋白，细胞能够结合多种配体，从而解释来自周围的细胞外基质(ECM)的并行信号。体外培养的细胞通常表达与体内相应细胞不同种类的整联蛋白模式。为了维持细胞的原始表型或者为了实现特定细胞应答(例如分化、增殖)，在体外培养过程中也能进行整联蛋白结合是很重要的。这最通常通过用ECM蛋白如层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白或玻连蛋白或者其模拟物涂覆细胞培养塑料(cell culture plastic)来完成。ECM涂层将为各种整联蛋白提供配体，从而激活不同的细胞通路。然而，在许多细胞培养准则中，希望找到方法在确定的基质上完成这一点，而不使用动物来源的基底(substrates)。
WO 2011/129756公开了用于真核细胞培养的基于微型蜘蛛丝蛋白的方法及细胞支架材料。该蛋白可以含有各种短(3-5个氨基酸残基)的细胞结合肽。
WO 2012/055854公开了由含有微型蜘蛛丝蛋白(spider silk protein)和多于30个氨基酸残基的大的非蛛丝蛋白(spidroin)片段的融合蛋白组成的聚合物，所述非蛛丝蛋白片段提供对另一分子的亲和力。该融合蛋白可以另外含有各种细胞结合肽。
WO 2015/036619公开了由含有微型蜘蛛丝蛋白和包含氨基酸残基RGD的细胞结合肽的融合蛋白组成的聚合物。该融合蛋白可用于培养人多能干细胞(hPSC)。
已经尝试了几种策略来实现对特定整联蛋白具有高亲和力和选择性的配体。例如，表达含有RGD的肽的噬菌体文库已经用于淘选实验。然而，该实验的结果取决于该噬菌体文库中序列覆盖的限制。此外，当使用基于抑制在溶液中的肽与涂覆的整联蛋白的结合的选择方法时，可能会遗漏促进细胞粘附的表位。细胞与周围ECM之间的相互作用是一种串扰，其中初始结合引起了细胞内信号传导，导致整联蛋白激活和构象改变，这影响了对配体的亲和力。因此，具有涂覆的整联蛋白的无细胞系统可能错过对活化形式的整联蛋白具有最高亲和力的肽。Ivanov,B.等Bioconjugate Chem.6：269-277(1995)和Koivunen E.等Biotechnology 13(3)：265-270(1995)公开了各种含有RGD的肽。
已经设计和合成了多种肽模拟物和非肽类小分子，目的是发现有效和选择性的整联蛋白配体。某些整联蛋白的配体的合理设计由于缺乏确定的结构而受到阻碍。
在大多数以往的研究中，目标是得到特异性整联蛋白结合的有效抑制剂，例如以阻止肿瘤细胞侵入或不想要的血管生成。在这些情况下，不需要功能性的整联蛋白结合；而是，目标是一种可溶性分子，其为有效的整联蛋白拮抗剂。WO 2013/185027公开了对整联蛋白具有拮抗剂活性即阻断或降低整联蛋白活性例如细胞粘附的人纤连蛋白的可溶性变体。
尽管在该领域取得了这些进展，但本领域中仍然需要新的细胞支架，特别是因为各种细胞类型可能偏好不同的支架，并且因为需要有效的细胞支架以用于伤口愈合。
发明概述
本发明的目的是提供促进细胞特别是原代细胞的增殖、分化和迁移的蛋白和细胞支架。
本发明的一个特别的目的是提供支持角质形成细胞的增殖、分化和迁移的蛋白和细胞支架。
本发明进一步的目的是实现对细胞支架提高的细胞粘附能力。
本发明的一个特别的目的是提供提供粘附细胞的早期附着的蛋白和细胞支架。
本发明的另一个目的是提供可用于体外有效扩增粘附细胞的蛋白和细胞支架。
本发明的另一个目的是提供可用于将细胞以细胞片层(cell sheet)转移到例如体内伤口区的蛋白和细胞支架。
本发明的一个目的是提供将用于迁移的固有细胞例如从伤口边缘吸引到伤口区的蛋白和细胞支架，在伤口愈合期间，通常从所述伤口边缘募集皮肤角质形成细胞。
为了这些目的和从以下公开内容将变得明显的其他目的，本发明提供一种环状RGD细胞结合基序，该细胞结合基序包含氨基酸序列：
C1X1X2RGDX3X4X5C2
其中，X1、X2、X3、X4和X5中的每一个独立地选自除半胱氨酸以外的天然氨基酸残基；且
C1和C2通过二硫键连接。所述细胞结合基序对整联蛋白例如α5β1整联蛋白具有选择性。
意想不到地发现：包含该环状RGD细胞结合基序的重组蛋白可用于培养在其细胞表面上展示整联蛋白的细胞。
并不限于此，优选的细胞选自骨骼肌细胞、内皮细胞、干细胞、成纤维细胞、角质形成细胞及细胞系。
不希望受限于任何具体的理论，设想，在本文呈现的细胞结合基序通过将半胱氨酸定位在相邻于RGD序列处以允许形成二硫桥键而将链约束成类似的转角环(turn loop)类型来模拟纤连蛋白的α5β1特异性RGD环基序。该环状RGD细胞结合基序提高了对由含该细胞结合基序的蛋白例如重组产生的蜘蛛丝蛋白构成的基质的细胞粘附功效。
根据一方面，本发明提供一种重组蛋白，其包含所述对整联蛋白例如α5β1整联蛋白具有选择性的所述细胞结合基序。这种重组蛋白意想不到地可用于培养在其细胞表面上展示整联蛋白的细胞。
根据一方面，本发明提供一种重组融合蛋白，其包含一种蛛丝蛋白片段和对整联蛋白例如α5β1整联蛋白具有选择性的所述细胞结合基序。这种重组融合蛋白意想不到地可用于培养在其细胞表面上展示整联蛋白的细胞。
在本发明的优选实施方案中，X1、X2、X3、X4和X5中的每一个独立地选自于由下列组成的氨基酸残基组：G、A、V、S、T、D、E、M、P、N和Q。
在本发明的其他优选实施方案中，X1和X3中的每一个独立地选自于由下列组成的氨基酸残基组：G、S、T、M、N和Q；且X2、X4和X5中的每一个独立地选自于由下列组成的氨基酸残基组：G、A、V、S、T、P、N和Q。
在本发明的某些优选实施方案中，X1选自于由下列组成的氨基酸残基组：G、S、T、N和Q；X3选自于由下列组成的氨基酸残基组：S、T和Q；X2、X4和X5中的每一个独立地选自于由下列组成的氨基酸残基组：G、A、V、S、T、P和N。
在本发明的一些优选实施方案中，X1是S或T；X2是G、A或V，优选G或A，更优选G；X3是S或T，优选S；X4是G、A、V或P，优选G或P，更优选P；且X5是G、A或V，优选G或A，更优选A。
在本发明的某些优选实施方案中，所述细胞结合基序包含氨基酸序列：CTGRGDSPAC(SEQ ID NO:10)。
根据本发明的进一步优选的环状RGD细胞结合基序显示与CTGRGDSPAC(SEQ IDNO:10)至少60％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％的同一性，前提条件是第1位和第10位总是C；第4位总是R；第5位总是G；第6位总是D；且第2-3位和第7-9位均不是半胱氨酸。应该理解的是，在第2-3位和第7-9位中的不同位点可以如上所述自由选择。
在根据本发明的一些优选的融合蛋白中，所述细胞结合基序设置在所述蛛丝蛋白片段的N端。
在根据本发明的某些优选的融合蛋白中，所述蛛丝蛋白片段包含蛋白部分REP和CT，其中
REP是从70至300个氨基酸残基的重复片段，其选自L(AG)nL、L(AG)nAL、L(GA)nL和L(GA)nGL组成的组，其中
n是从2至10的整数；
每个单独的A区段是从8至18个氨基酸残基的氨基酸序列，其中0至3个氨基酸残基不是Ala，且其余的氨基酸残基是Ala；
每个单独的G区段是从12至30个氨基酸残基的氨基酸序列，其中至少40％的氨基酸残基是Gly；并且
每个单独的L区段是从0至30个氨基酸残基的接头氨基酸序列；以及
CT是从70至120个氨基酸残基的片段，与SEQ ID NO:3具有至少70％的同一性。
在根据本发明的一些优选的融合蛋白中，所述蛛丝蛋白片段与SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:13的第18-277位氨基酸残基具有至少70％的同一性。
根据另一方面，本发明提供一种包含蛋白聚合物的细胞支架材料，所述蛋白聚合物含有根据本发明的重组融合蛋白作为重复单元。
在根据本发明的细胞支架材料的优选实施方案中，所述蛋白聚合物为选自膜(film)、涂层、泡沫、纤维和纤维网(fiber-mesh)组成的组的物理形态。
在根据本发明的细胞支架材料的一个优选实施方案中，所述蛋白聚合物的物理形态为自支撑基质(free-standing matrix)。
根据相关方面，本发明提供一种用于细胞培养的方法，其包括以下步骤：
-提供细胞样品；
-将样品加到细胞支架材料上；和
-将其上施加有细胞的细胞支架材料保持在适于细胞培养的条件下；
其中，所述细胞支架材料包含蛋白聚合物，所述蛋白聚合物含有根据本发明的重组蛋白例如重组融合蛋白作为重复结构单元。
意想不到地发现：含有该环状RGD细胞结合基序的重组蛋白可用于培养在其细胞表面上展示整联蛋白的细胞。并不限于此，优选的细胞选自骨骼肌细胞、内皮细胞、干细胞、成纤维细胞、角质形成细胞及细胞系。
根据另一方面，本发明提供根据本发明的重组融合蛋白、根据本发明的细胞支架材料或者根据本发明的重组蛋白用于培养在其细胞表面上展示整联蛋白的细胞的用途。
意想不到地发现：含有该环状RGD细胞结合基序的重组蛋白例如重组融合蛋白可用于培养在其细胞表面上展示整联蛋白的细胞。固定化(即不在溶液中)的细胞结合基序促进整联蛋白活化和细胞结合。
并不限于此，优选的细胞选自骨骼肌细胞、内皮细胞、干细胞、成纤维细胞、角质形成细胞及细胞系。
在根据本发明的方法或用途的优选实施方案中，所述细胞在其细胞表面上展示α5β1整联蛋白；且所述重组融合蛋白的细胞结合基序对α5β1整联蛋白具有选择性。
附图简述
图1表示具有来源于纤连蛋白的细胞结合基序的丝构建体。
图2显示了FNCC丝(SEQ ID NO:13)基质的显微照片和FTIR谱。
图3显示了内皮细胞(EC)、间充质干细胞(MSC)和角质形成细胞(KC)在与野生型(WT)丝(SEQ ID NO:2)膜或者经RGD(SEQ ID NO:16)或FNCC(SEQ ID NO:13)功能化的丝膜粘附1小时后的显微照片和覆盖密度。
图4显示了角质形成细胞(KC)在与经FNCC(SEQ ID NO:13)功能化的丝、牛纤连蛋白涂覆的表面(BFN)或组织培养物处理的细胞塑料(tissue culture treated cellplastic)(TCT)粘附1小时后的显微照片和细胞覆盖面积。
图5显示了角质形成细胞(KC)在与野生型(WT)丝(SEQ ID NO:2)或经FNCC(SEQ IDNO:13)、FNVS(SEQ ID NO:15)、FNSS(SEQ ID NO:14)或RGD(SEQ ID NO:16)功能化的丝粘附1小时后的显微照片和细胞覆盖面积。
图6显示了角质形成细胞(KC)在与野生型(WT)丝(SEQ ID NO:2)或经FNCC(SEQ IDNO:13)、FNVS(SEQ ID NO:15)、FNSS(SEQ ID NO:14)或RGD(SEQ ID NO:16)功能化的丝粘附3小时后的细胞覆盖面积和应力纤维排序。
图7显示了在野生型(WT)丝(SEQ ID NO:2)膜或经FNCC(SEQ ID NO:13)、FNVS(SEQID NO:15)、FNSS(SEQ ID NO:14)或RGD(SEQ ID NO:16)功能化的丝膜上粘附3小时后，角质形成细胞中粘附斑(focal adhesion)的形成的图。
图8显示了接种在野生型(WT)丝(SEQ ID NO:2)膜或FNCC丝(SEQ ID NO:13)膜上的角质形成细胞的阿尔玛蓝(Alamar blue)活力测定的图。
图9显示了蛛丝蛋白C端结构域的序列比对。
所附序列的列表
SEQ ID NO:
SEQ ID NO:
*Widhe M等，Biomaterials 34(33):8223-8234(2013)
发明详述
重组产生的蛛丝和很多其他材料可用作哺乳动物细胞培养的基质。将来源于细胞外基质(ECM)的细胞粘附基序包含在这样的材料中，通过与细胞表面上的整联蛋白的相互作用来提高细胞的粘附和增殖。整联蛋白不仅提供细胞与周围之间的物理连接，还介导控制例如细胞生长、极性、增殖和存活的信号。而且，整联蛋白通过作为细胞的“足”对于细胞迁移是必需的。
最广泛表征的细胞粘附基序是RGD肽，其首先在纤连蛋白中被发现。RGD基序也在天然ECM的很多其他分子中例如在玻连蛋白、纤维蛋白原中和在I型胶原蛋白和许多层粘连蛋白α链的隐蔽位点中均被发现。已表明，几乎一半的已知整联蛋白，包括α3β1、α5β1、α8β1、αvβ1、αIIbβ3、αvβ3、αvβ5、αvβ6a和αvβ8，以RGD依赖性的方式结合ECM。然而，在初步证明RGD作为总体的细胞粘附基序之后，很快就明白整联蛋白与较大的包含RGD的蛋白的结合亲和力通常要远远高于与短的RGD肽的结合亲和力。结合的优选条件在不同的整联蛋白之间也表现为是不同的。
本发明是基于设计的细胞结合基序。不希望受限于任何具体的理论，设想在本文呈现的细胞结合基序通过将半胱氨酸定位在与RGD序列相邻的准确位置上允许形成二硫桥键而将链约束成类似的转角环来模拟纤连蛋白的α5β1特异性RGD环基序。该环状RGD细胞结合基序提高了对由含该细胞结合基序的蛋白例如重组产生的蜘蛛丝蛋白或合成肽构成的基质的细胞粘附功效。
本文使用的术语“环状”(cyclic)是指其中两个氨基酸残基经由其侧链共价键合的肽，更具体地通过两个半胱氨酸残基之间的二硫键共价键合的肽。
本文显示，通过在连接有半胱氨酸的环上引入环状RGD细胞结合基序，材料的细胞粘附性能与添加线性RGD肽时相比显著提高。此外，本文呈现的环状RGD细胞结合基序促进原代细胞的增殖和迁移二者。与包含线性RGD肽的相同材料相比，在含有环状RGD细胞结合基序的细胞支架材料上培养的人原代细胞显示出提高的附着、铺展、应力纤维形成和粘附斑。
本文呈现的环状RGD细胞结合基序也适于制备自支撑基质，特别是含有蛛丝的基质，在该基质上细胞可以容易地形成单层培养物。这种自支撑基质可用于细胞片层转移。因此，含有本文呈现的环状RGD细胞结合基序的材料，例如蜘蛛丝材料，可用于需要有效扩增粘附细胞的体外环境中，以及细胞需要作为细胞片层转移到例如伤口区的体内情形下。结果也支持：含有本文呈现的环状RGD细胞结合基序的材料，例如蜘蛛丝材料，能够有效地将待迁移的固有细胞例如从伤口边缘吸引到伤口区，其中，在伤口愈合期间，皮肤角质形成细胞通常从伤口边缘被募集。已表明，细胞与含有本文呈现的环状RGD细胞结合基序的细胞支架的结合涉及α5β1整联蛋白，并且支持角质形成细胞的增殖和迁移。
本发明人使用了DNA技术来修饰纤连蛋白的细胞结合基序，其中RGD基序呈现在转角环上。这是通过在纤连蛋白的第10个III型结构域RGD侧翼的氨基酸序列作为基础实现的(图1b)。首先，将与纤连蛋白的转角环中的相同的十肽(VTGRGDSPAS；SEQ ID NO:9)引入到蛋白的N端，得到称为FNVS的构建体(图1a)。不希望受限于任何具体的理论，假设通过分别定位缬氨酸和丝氨酸残基于RGD基序之前第3位和之后第4位使之在空间上彼此非常靠近可以使细胞结合基序更有效。因此，本发明人将这2个残基突变为半胱氨酸(图1a、c)，使得含RGD的基序在每侧都侧接一个半胱氨酸。半胱氨酸在空间上的距离小于2埃，因此将肽链连接成二硫键桥接的环(称为FNCC；SEQ ID NO:10)。作为对照，也构建了将这两个半胱氨酸交换为丝氨酸的变体(称为FNSS；SEQ ID NO:11)。本发明人研究了将这些FN基序引入到蛋白基质中后其对在人源原代粘附细胞中早期附着(包括铺展、应力纤维形成、粘附斑和整联蛋白结合)的各种机制的影响。发现与对照FNVS和FNSS相比，含有环状RGD细胞结合基序的FNCC变体提高了对由含有所述细胞结合基序的蛋白制成的基质的细胞粘附功效。
从由Leahy DJ等Cell,84(1):155-164(1996)确定的纤连蛋白第9个和第10个结构域的晶体结构可知，分别位于RGD基序之前第3位和之后第4位的缬氨酸和丝氨酸残基在空间上彼此非常靠近(图1c)。再次不希望受限于任何具体的理论，因此认为本文呈现的细胞结合基序通过将半胱氨酸定位在与RGD序列相邻以允许形成二硫桥键而将链约束成类似的转角环类型来模拟纤连蛋白的α5β1特异性RGD环基序。因此，其结论是本文呈现的细胞结合基序尤其对α5β1整联蛋白具有选择性。
因此，具有来源于纤连蛋白的细胞结合基序的相关丝构建体如图1所示。图1a示意地显示了具有不同RGD基序遗传引入到其N端的丝蛋白4RepCT。图1a中的“RGD”表示Widhe M等Biomaterials 34(33):8223-8234(2013)中使用的含RGD的肽(SEQ ID NO 12)。“FNVS”表示来自纤连蛋白的含RGD的十肽(SEQ ID NO:9)。“FNCC”表示将V和S交换为C的相同肽(SEQID NO:10)。“FNSS”表示将V和S交换为S的相同肽(SEQ ID NO:11)。图1b显示了纤连蛋白第9个和第10个结构域的结构，展示了含RGD基序的转角环(SEQ ID NO:60)。图1c显示了取自纤连蛋白的RGD环的结构模型，其中残基V和S突变为C(从1FNF.pdb改造)。
本文呈现的细胞结合基序对与呈现在细胞表面上的整联蛋白，例如并优选与α5β1整联蛋白的结合是选择性的。在本发明的上下文中，细胞结合基序与其靶整联蛋白的“特异性”(specific)或“选择性”(selective)的相互作用是指，该相互作用使得特异性和非特异性相互作用之间或选择性和非选择性相互作用之间的区别变得有意义。两种蛋白间的相互作用有时通过解离常数来测量。解离常数描述两个分子间的结合强度(或亲和力)。通常，抗体与其抗原间的解离常数为10-7至10-11M。然而，高特异性并不一定需要高亲和力。已证明与其对应物具有低亲和力(在摩尔范围)的分子与具有高很多的亲和力的分子一样是特异性的。在本发明的情况下，特异性或选择性相互作用是指在给定条件及在天然存在的或处理过的生物或生化液体的样品中在其他蛋白或细胞的存在下，特定方法能够用于优先结合展示所述靶整联蛋白或其片段的特定蛋白或细胞类型的程度。换言之，特异性或选择性是在相关蛋白与展示相关蛋白的细胞类型间区分的能力。在本说明书中，特异性和选择性有时可以互换使用。
所述环状RGD细胞结合基序包含下列氨基酸序列、或者由该氨基酸序列组成：
C1X1X2RGDX3X4X5C2
其中
X1、X2、X3、X4和X5中的每一个独立地选自除半胱氨酸以外的天然氨基酸残基；以及
C1和C2通过二硫键连接。
优选地，X1、X2、X3、X4和X5中的每一个独立地选自于由下列组成的氨基酸残基组：G、A、V、S、T、D、E、M、P、N和Q。
更优选地，X1和X3中的每一个独立地选自于由下列组成的氨基酸残基组：G、S、T、M、N和Q；以及X2、X4和X5中的每一个独立地选自于由下列组成的氨基酸残基组：G、A、V、S、T、P、N和Q。所得的细胞结合基序不含可对细胞结合功效不利的任何带电荷或大体积(bulky)残基。
特别优选地：
-X1选自于由下列组成的氨基酸残基组：
G、S、T、N和Q；
-X3选自于由下列组成的氨基酸残基组：
S、T和Q；以及
-X2、X4和X5中的每一个独立地选自于由下列组成的氨基酸残基组：G、A、V、S、T、P和N。
更优选地：
-X1是S或T；
-X2是G、A或V，优选G或A，更优选G；
-X3是S或T，优选S；
-X4是G、A、V或P，优选G或P，更优选P；以及
-X5是G、A或V，优选G或A，更优选A。
特别优选的环状RGD细胞结合基序包含下列氨基酸序列、或者由该氨基酸序列组成：CTGRGDSPAC(FNCC；SEQ ID NO:10)。
根据本发明进一步优选的环状RGD细胞结合基序显示与CTGRGDSPAC(FNCC；SEQ IDNO:10)至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％的同一性，前提条件是第1位和第10位总是C；第4位总是R；第5位总是G；第6位总是D；以及，第2-3位和第7-9位均不是半胱氨酸。应该理解的是，在第2-3位和第7-9位中的不同位点可以如上所述自由选择。
这样鉴定的环状RGD细胞结合基序可用于任何重组或合成蛋白或肽中，以提供对整联蛋白，特别是α5β1整联蛋白的选择性结合。因此，提供了一种重组蛋白，其含有对整联蛋白例如α5β1整联蛋白具有选择性的细胞结合基序。所述重组蛋白可用于在其细胞表面上展示整联蛋白，特别是α5β1整联蛋白的细胞的培养，例如哺乳动物细胞的培养。
并不限于此，优选的细胞选自骨骼肌细胞、内皮细胞、干细胞、成纤维细胞、角质形成细胞及细胞系。
纤连蛋白被整联蛋白家族的至少10种细胞表面受体所识别，其中5种(α3β1、α4β1、α5β1、α8β1、αvβ1)包括β1亚单位。所述α5亚单位被发现仅与β1组合，且α5β1整联蛋白是独特的，因其仅专门结合纤连蛋白，因此最初称为纤连蛋白受体。α5β1与纤连蛋白间的特异性相互作用表现为是脊椎动物发育的基础，因为缺乏α5β1和/或纤连蛋白导致早期胚胎死亡。纤连蛋白和α5β1也显示出在呼吸道上皮创伤修复过程中的重要性，其中已观察到两者完全由创伤区域中的迁移细胞表达，并且在体外(in vitro)内皮细胞迁移和体内(in vivo)血管生成中起关键作用。
提供了重组或合成蛋白或肽，所述重组或合成蛋白或肽含有对整联蛋白例如α5β1整联蛋白具有选择性的细胞结合基序，其中所述细胞结合基序如上所述。
优选的重组蛋白含有对整联蛋白例如α5β1整联蛋白具有选择性的细胞结合基序，其中所述细胞结合基序具有氨基酸序列：
C1X1X2RGDX3X4X5C2
其中
X1选自于由下列组成的氨基酸残基组：
G、S、T、N和Q；
X3选自于由下列组成的氨基酸残基组：
S、T和Q；以及
X2、X4和X5中的每一个独立地选自于由下列组成的氨基酸残基组：G、A、V、S、T、P和N；以及
C1和C2通过二硫键连接。
本文呈现了所述细胞结合基序的优选实施方案。特别是，优选：
X1是S或T，优选T；
X2是G、A或V，优选G或A，更优选G；
X3是S或T，优选S
X4是G、A、V或P，优选G或P，更优选P；
X5是G、A或V，优选G或A，更优选A。
特别优选的细胞结合基序包含氨基酸序列CTGRGDSPAC(FNCC；SEQID NO:10)。
所述重组蛋白可用于细胞支架材料。其也可用于培养在其细胞表面上展示整联蛋白的细胞，特别是其中所述细胞在其细胞表面上展示α5β1整联蛋白。
并不限于此，优选的细胞选自骨骼肌细胞、内皮细胞、干细胞、成纤维细胞、角质形成细胞及细胞系。
所述重组或合成蛋白也可以由包含细胞结合基序或甚至由细胞结合基序组成的较短的肽构成，较短的肽例如含有10-50、或者10-30个氨基酸残基。如本领域公知的，这些肽可以化学偶联或固定到表面。有利的是，所述肽含有间隔区或偶联至间隔区，其允许更好地接近细胞结合基序。这样固定的(即不在溶液中)重组蛋白意想不到地能够用于培养在其细胞表面上展示整联蛋白的细胞，特别是其中所述细胞在其细胞表面上展示α5β1整联蛋白。
所述细胞结合基序有利地作为融合蛋白的一部分与蜘蛛丝蛋白，特别是微型蜘蛛丝蛋白一同呈现。本文使用的术语“蛛丝蛋白”(spidroin)和“蜘蛛丝蛋白”(spider silkprotein)在整个说明书中可互换使用，并且包括所有已知蜘蛛丝蛋白，包括大壶腹腺蜘蛛丝蛋白，其通常地缩写为“MaSp”，或者在十字园蛛的情况下缩写为“ADF”。这些大壶腹腺蜘蛛丝蛋白通常有两种类型：1和2。这些术语进一步包括与已知蜘蛛丝蛋白具有高度同一性和/或相似性的非天然蛋白。
如上所述，提供了一种重组融合蛋白，其包含蛛丝蛋白片段和如上所述的对整联蛋白例如α5β1整联蛋白具有选择性的细胞结合基序。所述蛛丝蛋白片段优选包含蛋白部分REP和CT或者由蛋白部分REP和CT组成，其中
REP是70至300个氨基酸残基的重复片段，其选自L(AG)nL、L(AG)nAL、L(GA)nL和L(GA)nGL组成的组，其中
n是2至10的整数；
每个单独的A区段是8至18个氨基酸残基的氨基酸序列，其中0至3个氨基酸残基不是Ala，并且其余的氨基酸残基是Ala；
每个单独的G区段是12至30个氨基酸残基的氨基酸序列，其中至少40％的氨基酸残基是Gly；以及
每个单独的L区段是0至30个氨基酸残基的接头氨基酸序列；以及
CT是70至120个氨基酸残基的片段，与SEQ ID NO:3具有至少70％的同一性。
根据本发明的融合蛋白具有所述细胞结合基序中所需的选择性细胞结合活性和所述蛛丝蛋白片段中的内部固体支持活性二者。当在结构上重新排列形成聚合的固体结构时，所述融合蛋白的结合活性被保持。这些蛋白结构或者蛋白聚合物，还提供对整联蛋白例如α5β1整联蛋白具有选择性相互作用活性的所述细胞结合基序的高且可预测的密度。这样固定的细胞结合基序促进整联蛋白活化和细胞结合。用RGD功能化的生物材料刺激不同细胞应答的方式不仅受所使用的RGD基序类型的影响，而且还受所得到的配体表面浓度的影响。由于本研究所使用的相当小的丝蛋白自组装成多层，其中每个分子携带RGD基序，预计会有密集的表面呈现。然而，如果需要较为稀疏的表面浓度，可以简单地通过以不同比率混合具有和不具有本文公开的环状RGD细胞结合基序的丝蛋白来实现任何可能的表面密度，从而引导感兴趣的细胞应答。
在大多数已经被工程化为含有RGD的蛋白中，所述基序已经作为线性延伸添加到N端或C端，由于对来自蛋白其余部分的链的限制最小，因此有高的暴露可能性和柔性。已经制备了具有置于蛋白折叠中的所述RGD基序的几种构建体，以降低RGD基序的柔性，但是同时也减少了其暴露。本文公开的所述环状RGD细胞结合基序能够有利地呈现为N端或C端的线性延伸，因此有高的暴露可能性。同时，其环状特性限制了柔性，并认为有助于非常有用的细胞结合特性。此外，所述肽共价掺入到折叠的蛋白链可能有助于显然有效的整联蛋白介导的细胞结合，包括α5β1。
术语“融合蛋白”在本文是指通过由重组核酸，即通过组合正常情况下不会一起出现的两个或更多个核酸序列(遗传工程)而人工创造的DNA或RNA表达而制备的蛋白。根据本发明的融合蛋白是重组蛋白，因此其不同于天然存在的蛋白。特别是，野生型蛛丝蛋白因为不是由上述重组核酸表达的，因此其不是根据本发明的融合蛋白。所述组合的核酸序列编码具有某些功能特性的不同蛋白、部分蛋白或多肽。所得的融合蛋白或者重组融合蛋白是具有来源于每个原始蛋白、部分蛋白或多肽的功能特性的单一蛋白。此外，根据本发明的融合蛋白与相应的基因是嵌合的，即所述蛋白/基因的部分来源于至少两种不同的物种。
融合蛋白通常由170至2000个氨基酸残基组成，例如170至1000个氨基酸残基，例如170至600个氨基酸残基，优选170至500个氨基酸残基，例如170至400个氨基酸残基。小尺寸是有利的，因为含有蜘蛛丝蛋白片段的较长蛋白可形成无定形聚集体，其需要使用苛刻溶剂(harsh solvent)来增溶和聚合。
融合蛋白可含有一个或更多个接头肽，或者L区段。所述接头肽可以被设置在融合蛋白的任何部分之间，例如REP与CT部分之间，在融合蛋白的任一末端处，或者在所述蛛丝蛋白片段与所述细胞结合基序之间。所述接头可以在融合蛋白的功能单元之间提供间隔区，但是也可以构成用于鉴定和纯化该融合蛋白的工具，例如His和/或Trx标签。如果融合蛋白含有用于鉴定和纯化融合蛋白的两个或更多个接头肽，优选它们被间隔序列隔开，例如His6-间隔区-His6-。所述接头还可构成将融合蛋白引导到膜和/或致使融合蛋白从宿主细胞分泌到周围培养基中的信号肽，例如信号识别颗粒。融合蛋白还可以在其氨基酸序列中包含裂解位点，其允许裂解和去除接头和/或其他相关部分。各种裂解位点是本领域技术人员已知的，例如针对化学剂的裂解位点，例如CNBr的裂解位点在Met残基之后，羟胺的裂解位点在Asn-Gly残基之间，蛋白酶例如凝血酶或蛋白酶3C的裂解位点，以及自我剪接序列例如内含肽(intein)自我剪接序列。
所述蛛丝蛋白片段和所述细胞结合基序相互间直接或间接连接。直接连接是指所述部分间直接共价结合而无间插序列，例如接头。间接连接也是指，所述部分通过共价键连接，但存在间插序列，例如接头和/或一个或更多另外的部分，例如1-2个NT部分。
所述细胞结合基序可以被设置在融合蛋白的内部或任一端，即设置在C端或设置在N端。优选所述细胞结合基序被设置在融合蛋白的N端。如果融合蛋白含有用于融合蛋白鉴定和纯化的一个或更多个接头肽，例如His或Trx标签，优选其被设置在融合蛋白的N端。
优选的融合蛋白具有N端设置的细胞结合基序的形式，通过0-30个氨基酸残基例如0-10个氨基酸残基的接头肽与REP部分偶联。任选地，融合蛋白具有可带有纯化标签例如His标签和裂解位点的N端或C端接头肽。
所述重组蛋白可用于细胞支架材料。其也可用于培养在其细胞表面上展示整联蛋白的细胞，特别是其中所述细胞在其细胞表面上展示α5β1整联蛋白。
并不限于此，优选的细胞选自骨骼肌细胞、内皮细胞、干细胞、成纤维细胞、角质形成细胞及细胞系。
不希望受限于任何具体的理论，设想，所述细胞结合基序在所得的细胞支架材料的表面上被功能性展示，其在本文中意想不到地显示出有利于哺乳动物细胞的结合能力，参看实施例6-9。
含有本文所呈现的环状RGD细胞结合基序的细胞支架材料的显著性积极作用在原代细胞的初始附着(0.5-3小时内)时已经明显。已经提出细胞牢固和快速地粘附到材料上对于各种临床应用来说是相当重要的，这些临床应用中细胞的目前环境远未达到最佳状态，且细胞存活需要快速建立。一个实例是慢性伤口的压力环境，通常具有高细菌负荷和坏死。其中，迁移的角质形成细胞可能受益于构成含有环状RGD细胞结合基序的适当设计的生物材料的支持，例如蜘蛛丝融合蛋白。而且在封闭环境意味着物理性应力的临床环境中，如通过流体的速度，例如通过心脏中支架的血液或血管植入物中的血液，促进内皮细胞快速并牢固地粘附到植入物的材料可能是关键的，因此甚至对于成功结果也是决定性的。
用于组织工程的支架显然会经受比在细胞培养环境中更苛刻的处理和环境，这是为什么观察到含有环状RGD细胞结合基序的蜘蛛丝材料的改进的稳定性是有价值的原因。与野生型丝相比，这种稳定性的提高允许制备可转移的支架，例如本文所证明的自支撑膜。
蛋白部分REP是具有重复性的片段，在富含丙氨酸的链段和富含甘氨酸的链段之间交替。REP片段通常含有多于70，例如多于140，以及少于300，优选少于240，例如少于200的氨基酸残基，并且本身可以分成几个L(接头)区段，A(富含丙氨酸)片段和G(富含甘氨酸)片段，这将在下面更详细地解释。通常，所述接头区段(其是任选的)位于REP片段末端，而其余片段继而富含丙氨酸和富含甘氨酸。因此，REP片段通常可以具有以下结构中的任一个，其中n是整数：
L(AG)nL，例如LA1G1A2G2A3G3A4G4A5G5L；
L(AG)nAL，例如LA1G1A2G2A3G3A4G4A5G5A6L；
L(GA)nL，例如LG1A1G2A2G3A3G4A4G5A5L；或
L(GA)nGL，例如LG1A1G2A2G3A3G4A4G5A5G6L。
因而，富含丙氨酸或富含甘氨酸的区段是否与N端或C端接头区段相邻并不重要。优选n是2至10的整数，优选2至8，还优选4至8，更优选4至6，即n＝4，n＝5或n＝6。
在一些实施方案中，REP片段的丙氨酸含量高于20％，优选高于25％，更优选高于30％，以及低于50％，优选低于40％，更优选低于35％。设想，更高的丙氨酸含量提供更硬和/或更坚固和/或更少延展的纤维。
在某些实施方案中，REP片段不含脯氨酸残基，即REP片段中没有Pro残基。
现在转到构成REP片段的区段，应当强调的是每个区段是单独的，即特定REP片段的任何两个A区段、任何两个G区段或任何两个L区段可以相同或可以不相同。因此，在特定REP片段内每个类型的区段都相同不是蛛丝蛋白的一般特征。而是，以下公开内容为技术人员提供了如何设计单独区段并将其集合到REP片段中的指导原则，所述REP片段是可用于细胞支架材料的功能性蜘蛛丝蛋白的一部分。
每个单独的A区段是具有8至18个氨基酸残基的氨基酸序列。优选每个单独的A区段含有13-15个氨基酸残基。A区段中的大多数或多于两个含有13至15个氨基酸残基，并且A区段的少数例如一个或两个含有8至18个氨基酸残基，如8-12或16-18个氨基酸残基，也是可能的。绝大多数这些氨基酸残基是丙氨酸残基。更具体而言，0至3个氨基酸残基不是丙氨酸残基，且剩余的氨基酸残基是丙氨酸残基。因此，每个单独A区段中的所有氨基酸残基都是丙氨酸残基，无一例外或者除了一个、两个或三个氨基酸残基可以是任何的氨基酸之外。优选丙氨酸置换氨基酸为天然氨基酸，优选独立地选自丝氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸的组，更优选丝氨酸。当然，一个或更多个A区段是全部丙氨酸区段，而其余的A区段含有1-3个非丙氨酸残基，如丝氨酸、谷氨酸、半胱氨酸或甘氨酸，是可能的。
在一个实施方案中，每个A区段包含13-15个氨基酸残基，包括10-15个丙氨酸残基和0-3个如上所述的非丙氨酸残基。在更优选的实施方案中，每个A区段包含13-15个氨基酸残基，包括12-15个丙氨酸残基和0-1个如上所述的非丙氨酸残基。
优选每个单独的A区段与选自于下列组的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选95％、最优选100％的同一性：SEQ ID NO:5的第7-19位、第43-56位、第71-83位、第107-120位、第135-147位、第171-183位、第198-211位、第235-248位、第266-279位、第294-306位、第330-342位、第357-370位、第394-406位、第421-434位、第458-470位、第489-502位、第517-529位、第553-566位、第581-594位、第618-630位、第648-661位、第676-688位、第712-725位、第740-752位、第776-789位、第804-816位、第840-853位、第868-880位、第904-917位、第932-945位、第969-981位、第999-1013位、第1028-1042位和第1060-1073位氨基酸残基。该组的每个序列对应于Euprosthenops australis MaSp1蛋白的天然存在的序列区段，该蛋白从克隆相应的cDNA推导出，参看WO 2007/078239。或者，每个单独的A区段与选自于下列组的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选95％、最优选100％的同一性：SEQ ID NO:2的第25-36位、第55-69位、第84-98位、第116-129位和第149-158位氨基酸残基。该组的每个序列对应于表达的非天然蜘蛛丝蛋白的区段，该蛋白具有在适当条件下形成丝纤维的能力。因此，在蛛丝蛋白的某些实施方案中，每个单独的A区段与选自上述氨基酸区段的氨基酸序列相同。不希望受限于任何特定的理论，设想，根据本发明的A区段形成螺旋结构或β折叠。
此外，从实验数据可得出结论，每个单独的G区段是12至30个氨基酸残基的氨基酸序列。每个单独的G区段优选由14至23个氨基酸残基组成。每个G区段的至少40％的氨基酸残基是甘氨酸残基。通常，每个单独的G区段的甘氨酸含量在40％-60％的范围内。
优选每个单独的G区段与选自下列组的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选95％、最优选100％的同一性：SEQ ID NO:5的第20-42位、第57-70位、第84-106位、第121-134位、第148-170位、第184-197位、第212-234位、第249-265位、第280-293位、第307-329位、第343-356位、第371-393位、第407-420位、第435-457位、第471-488位、第503-516位、第530-552位、第567-580位、第595-617位、第631-647位、第662-675位、第689-711位、第726-739位、第753-775位、第790-803位、第817-839位、第854-867位、第881-903位、第918-931位、第946-968位、第982-998位、第1014-1027位、第1043-1059位和第1074-1092位氨基酸残基。该组的每个序列对应于Euprosthenops australis MaSp1蛋白的天然存在的序列区段，该蛋白从克隆相应的cDNA推导出，参看WO 2007/078239。或者，每个单独的G区段与选自于下列组的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选95％、最优选100％的同一性：SEQ ID NO:2的第1-24位、第37-54位、第70-83位、第99-115位和第130-148位氨基酸残基。该组的每个序列对应于表达的非天然蜘蛛丝蛋白的区段，该蛋白具有在适当条件下形成丝纤维的能力。因此，在细胞支架材料中的蛛丝蛋白的某些实施方案中，每个单独的G区段与选自上述氨基酸区段的氨基酸序列相同。
在某些实施方案中，每个G区段前两个氨基酸残基不是-Gln-Gln-。
G区段有三个亚型。这种分类是基于对Euprosthenops australis MaSp1蛋白序列的仔细分析(参看WO 2007/078239)，并且已经在构建新的非天然蜘蛛丝蛋白中运用和验证该信息。
G区段的第一亚型由氨基酸单字母共有序列GQG(G/S)QGG(Q/Y)GG(L/Q)GQGGYGQGAGSS(SEQ ID NO:6)表示。该第一个也通常是最长的G区段亚型通常含有23个氨基酸残基，但可含有少至17个氨基酸残基，以及不含带电荷残基或含有一个带电荷残基。因此，优选该第一个G区段亚型含有17-23个氨基酸残基，但是设想其可以含有少至12个或多达30个氨基酸残基。不希望受限于任何特定的理论，设想这种亚型形成卷曲(coil)结构或31-螺旋结构。该第一亚型的代表性G区段是下列氨基酸残基：SEQID NO:5的第20-42位、第84-106位、第148-170位、第212-234位、第307-329位、第371-393位、第435-457位、第530-552位、第595-617位、第689-711位、第753-775位、第817-839位、第881-903位、第946-968位、第1043-1059位和第1074-1092位氨基酸残基。在某些实施方案中，根据本发明的该第一亚型的每个G区段的前两个氨基酸残基不是-Gln-Gln-。
G区段的第二亚型由氨基酸单字母共有序列GQGGQGQG(G/R)YGQG(A/S)G(S/G)S(SEQ ID NO:7)表示。该第二个也通常是中间长度的G区段亚型通常地含有17个氨基酸残基，以及不含带电荷残基或含有一个带电荷残基。优选该第二个G区段亚型含有14-20个氨基酸残基，但是设想其可以含有少至12个或多达30个氨基酸残基。不希望受限于任何特定的理论，设想这种亚型形成卷曲(coil)结构。该第二亚型的代表性G区段是下列氨基酸残基：SEQ ID NO:5的第249-265位、第471-488位、第631-647位和第982-998位氨基酸残基。
G区段的第三亚型由氨基酸单字母共有序列G(R/Q)GQG(G/R)YGQG(A/S/V)GGN(SEQID NO:8)表示。第三个G区段亚型通常地含有14个氨基酸残基，并且通常是最短的G区段亚型。优选该第三个G区段亚型含有12-17个氨基酸残基，但是设想其可以含有多达23个氨基酸残基。不希望受限于任何特定的理论，设想这种亚型形成转角(turn)结构。该第三亚型的代表性G区段是下列氨基酸残基：SEQ ID NO:5的57-70位、第121-134位、第184-197位、第280-293位、第343-356位、第407-420位、第503-516位、第567-580位、第662-675位、第726-739位、第790-803位、第854-867位、第918-931位、第1014-1027位氨基酸残基。
因此，在细胞支架材料中的蛛丝蛋白的优选实施方案中，每个单独的G区段与选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少80％、优选90％、更优选95％的同一性。
在REP片段的A和G区段的交替序列的实施方案中，每个第二个G区段是第一亚型，而剩余的G区段是第三亚型，例如...A1G短A2G长A3G短A4G长A5G短…。在REP片段的另一个实施方案中，通过插入第二亚型的一个G区段来中断G区段的规则性，例如...A1G短A2G长A3G中A4G短A5G长…。
每个单独的L区段表示任选的接头氨基酸序列，其可含有0至30个氨基酸残基，例如0至20个氨基酸残基。虽然这一区段是任选的，并且对于蜘蛛丝蛋白的功能不是重要的，其存在仍允许形成纤维、膜、泡沫和其他结构的功能完整的蜘蛛丝蛋白及其聚合物。在来自Euprosthenopsaustralis的MaSp1蛋白的推导氨基酸序列的重复部分(SEQ ID NO:5)中也存在接头氨基酸序列。特别是，接头区段的氨基酸序列可以类似于任何所述的A或G区段，但通常不足以满足如本文所定义的标准。
如WO 2007/078239中所示，设置在REP片段的C端部分的接头区段可以由富含丙氨酸的氨基酸单字母共有序列ASASAAASAASTVANSVS(SEQ ID NO:22)和ASAASAAA(SEQ ID NO:23)表示。事实上，根据本文的定义，第二个序列可被认为是A区段，而根据该定义，第一个序列与A区段具有高度的相似性。接头区段的另一个实例具有单字母氨基酸序列GSAMGQGS(SEQ ID NO:24)，其富含甘氨酸且根据本文的定义与G区段具有高度相似性。接头区段的另一个实例是SASAG(SEQ ID NO:25)。
代表性的L区段是SEQ ID NO:5的第1-6位和第1093-1110位氨基酸残基；以及SEQID NO:2的第159-165位氨基酸残基，但是本领域技术人员将容易认识到，这些区段存在许多合适的替代氨基酸序列。在REP片段的一个实施方案中，L区段之一包含0个氨基酸，即L区段之一是无效的。在REP片段的另一个实施方案中，两个L区段都含有0个氨基酸，即两个L区段都是无效的。因此，根据本发明的REP片段的这些实施方案可以示意性地表示如下：(AG)nL、(AG)nAL、(GA)nL、(GA)nGL；L(AG)n、L(AG)nA、L(GA)n、L(GA)nG；以及(AG)n、(AG)nA、(GA)n、(GA)nG。这些REP片段中的任何一个适用于与以下定义的任何CT片段一起使用。
细胞支架材料中蛛丝蛋白的CT片段与蜘蛛丝蛋白的C端氨基酸序列具有高度的相似性。如WO 2007/078239所示，该氨基酸序列在各种物种和蜘蛛丝蛋白中是非常保守的，所述蜘蛛丝蛋白包括MaSp1和MaSp2。以SEQ ID NO:4提供MaSp1和MaSp2的C端区域的共有序列。在图9中，对以下MaSp蛋白进行比对在适用的情况下用GenBank登录条目表示：
表1-蛛丝蛋白CT片段
*Comparative Biochemistry and Physiology,Part B 138:371–376(2004)
在细胞支架材料中的蜘蛛丝蛋白中存在哪种特定CT片段并不重要。因此，CT片段可以选自图9和表1中所示的任何氨基酸序列或者具有高度相似性的序列。蜘蛛丝蛋白中可以使用多种C端序列。
CT片段的序列与共有氨基酸序列SEQ ID NO:4具有至少50％的同一性、优选至少60％、更优选至少65％的同一性，或者甚至至少70％的同一性，所述共有氨基酸序列SEQ IDNO:4是基于图9的氨基酸序列。
代表性的CT片段是Euprosthenops australis序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:13的第180-277位氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，CT片段与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:13的第180-277位氨基酸残基或者图9和表1的任何单独氨基酸序列具有至少70％、例如至少80％、例如至少85％、优选至少90％、例如至少95％的同一性。例如，CT片段可与SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:13的第180-277位氨基酸残基或者图9和表1的任何单独氨基酸序列相同。
CT片段通常地由70至120个氨基酸残基组成。优选CT片段含有至少70个或者多于80个、优选多于90个氨基酸残基。还优选CT片段含有至多120个或者少于110个氨基酸残基。典型的CT片段含有大约100个氨基酸残基。
本文使用的术语“％同一性”如下计算。查询序列与靶序列比对使用CLUSTAL W算法(Thompson等，Nucleic Acids Research 22:4673-4680(1994))。在与比对的序列中最短的对应窗口进行比较。比较每个位置的氨基酸残基，并将在查询序列与靶序列中与具有相同对应性的位置的百分比报告为％同一性。
除了以下之外，本文使用的术语“％相似性”按照上述的“％同一性”进行计算：疏水残基Ala、Val、Phe、Pro、Leu、Ile、Trp、Met和Cys相似；碱性残基Lys、Arg与His相似；酸性残基Glu与Asp相似；以及亲水、不带电荷残基Gln、Asn、Ser、Thr和Tyr相似。在这一上下文中，剩余的天然氨基酸Gly与任何其他氨基酸都不相似。
在整个说明书中，根据本发明的替代实施方案满足指定百分比的相似性而不是相应百分比的同一性。其他替代实施方案满足指定百分比的同一性，以及另一个更高百分比的相似性，选自对于每个序列的优选百分比同一性的组。例如，一个序列可以与另一个序列70％相似；或可以与另一个序列70％相同；或其可以与另一个序列70％相同且与另一个序列90％相似。
在根据本发明的优选的融合蛋白中，REP-CT片段与SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:13的第18-277位氨基酸残基具有至少70％、例如至少80％、例如至少85％、优选至少90％、例如至少95％的同一性。
在一个根据本发明的优选的融合蛋白中，蛋白与SEQ ID NO:13具有至少70％、例如至少80％、例如至少85％、优选至少90％、例如至少95％的同一性。在特别优选的实施方案中，根据本发明的融合蛋白是SEQ ID NO:13。
根据本发明的细胞支架材料包含展示环状RGD细胞结合基序的根据本发明的蛋白或肽。环状RGD细胞结合基序可以暴露自短的合成肽或更长的合成或重组蛋白，所述合成或重组蛋白可以继而附着到基质或支持物或与基质或支持物缔合。
所述细胞支架材料优选包含蛋白聚合物，所述蛋白聚合物继而含有根据本发明的重组融合蛋白作为重复结构单元，即蛋白聚合物含有根据本发明的重组融合蛋白的聚合物或由其组成。这是指蛋白聚合物含有根据本发明的有序多个(an ordered plurality of)融合蛋白或由其组成，通常远高于100个融合蛋白单元，例如1000个融合蛋白单元或更多。在一个优选的实施方案中，根据本发明的细胞支架材料由蛋白聚合物组成。
聚合物中融合蛋白单元的量级是指蛋白聚合物获得很大尺寸。在一个优选的实施方案中，蛋白聚合物在至少两个维度上具有至少0.01μm的尺寸。因此，本文使用的术语“蛋白聚合物”(protein polymer)涉及厚度为至少0.01μm的融合蛋白聚合物，优选人肉眼可见的宏观聚合物，即具有至少1μm的厚度。术语“蛋白聚合物”不包含非结构化聚集体或沉淀物。尽管融合蛋白的单体/二聚体是水溶性的，但是应该理解的是，根据本发明的蛋白聚合物是固体结构，即不溶于水。蛋白聚合物含有根据本发明的重组融合蛋白的单体作为重复结构单元。
根据本发明的蛋白聚合物通常以选自纤维、膜、涂层、泡沫、网(net)、纤维网、球和胶囊组成的组的物理形态提供。根据一个实施方案，优选根据本发明的蛋白聚合物是纤维、膜或纤维网。根据某些实施方案，蛋白聚合物优选具有三维形态，例如泡沫或纤维网。一个优选实施方案涉及由蛋白聚合物制成的薄(通常为0.01-0.1μm厚)涂层，其可用于支架和其他医疗装置的涂层。术语“泡沫”(foam)包括具有连接泡沫气泡的通道的多孔泡沫，有时达到甚至可以视为三维网或纤维网的程度。
在一个优选的实施方案中，所述蛋白聚合物是自支撑基质的物理形态，例如自支撑膜。这是非常有用的，因为其允许在需要时转移细胞片层，例如在其中细胞需要作为细胞片层转移到例如伤口区的体内情况下。
纤维、膜或纤维网通常具有至少0.1μm的厚度，优选至少1μm。纤维、膜或纤维网的厚度优选在1-400μm，优选60-120μm的范围中。优选纤维具有0.5-300cm、优选1-100cm的范围中的长度。其他优选的范围是0.5-30cm和1-20cm。纤维具有在物理操作过程中保持完整的能力，即可用于纺纱(spinning)、编织(weaving)、加捻(twisting)、钩编(crocheting)及类似的操作。该膜的优点在于它是一致的并粘附到固体结构上，例如，微量滴定板中的塑料。该膜的这种性质有利于洗涤和再生过程，并且对于分离目的是非常有用的。
根据本发明的融合蛋白具有环状RGD细胞结合基序中的所需的细胞结合活性和REP-CT部分中的内部固体支持活性二者，并且将这些活性应用于细胞支架材料中。细胞支架材料提供了对有机靶的选择性相互作用活性的高且可预测的密度。由于所有表达的蛋白部分都与细胞支架材料缔合，因此具有选择性相互作用活性的有价值的蛋白部分的损失被最小化。
由根据本发明的融合蛋白形成的聚合物是固体结构并且由于它们的物理性质有用，特别是高强度、弹性和轻重量的有用组合。一个特别有用的特征是融合蛋白的REP-CT部分在生化上稳健并且适于再生，例如用酸、碱或离液剂，以及适用于加热消毒，例如120℃高压灭菌20分钟。还可利用聚合物对于支持细胞粘附和生长的能力。
来源于REP-CT部分的特性在开发新材料以用于医疗或技术目的方面具有吸引力。特别地，根据本发明的细胞支架材料可用作细胞固定、细胞培养、细胞分化、组织工程和引导细胞再生的支架。它们也可用于制备和分析分离过程，如层析、细胞捕获、选择和培养，主动过滤器(active filter)，以及诊断。根据本发明的细胞支架材料也可以例如作为涂层用于医疗装置，例如植入物和支架。
在一个优选的实施方案中，所述细胞支架材料包含蛋白聚合物，其由根据本发明的重组融合蛋白作为重复结构单元组成。并且在进一步优选的实施方案中，细胞支架材料是蛋白聚合物，其由根据本发明的重组融合蛋白作为重复结构单元组成。
根据另一方面，本发明提供一种细胞培养的方法，包括以下步骤：
-提供细胞样品；
-将样品加到细胞支架材料上；以及
-将其上施加有细胞的细胞支架材料保持在适于细胞培养的条件下；
其中，所述细胞支架材料包含蛋白聚合物，其包含根据本发明的重组蛋白作为重复结构单元，所述重组蛋白例如是重组融合蛋白。
在一个优选的实施方案中，所述细胞在其细胞表面上展示α5β1整联蛋白；以及所述重组融合蛋白的细胞结合基序对α5β1整联蛋白具有选择性。
在优选的实施方案中，含有该环状RGD细胞结合基序的重组蛋白被固定到例如固体支持物(即不在溶液中)、例如细胞培养装置的表面或需要细胞结合和生长的任何类型的表面。所得的这样固定的环状RGD细胞结合基序的暴露意想不到地促进整联蛋白活化和细胞与含有该环状RGD细胞结合基序的固定的重组蛋白的结合。
含有该环状RGD细胞结合基序的重组融合蛋白特别适用于培养在其细胞表面上展示整联蛋白的细胞，因为内部蛛丝蛋白片段允许融合蛋白被带入有序的聚合物中，从而为固定的(即不在溶液中)细胞结合基序提供内部固体支持物。所得的固定的环状RGD细胞结合基序的暴露意想不到地促进整联蛋白活化和细胞与所述重组融合蛋白聚合物的结合。
并不限于此，优选的细胞选自骨骼肌细胞、内皮细胞、干细胞、成纤维细胞、角质形成细胞及细胞系，特别是人源性的。
并不限于此，该方法可用于培养内皮细胞、人间充质干细胞和角质形成细胞、特别是人源性的。它特别适用于培养角质形成细胞。
该细胞培养方法可有利地在体外和体内进行。
下面将通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。
实施例
统计
使用用于Windows的GraphPad Prism版本6.05，GraphPad Software，La JollaCalifornia USA，www.graphpad.com进行单因素方差分析，然后进行Tukey多重比较检验。
实施例1-将来源于纤连蛋白的细胞结合基序遗传掺入到重组蜘蛛丝中
重组蜘蛛丝蛋白4RepCT(SEQ ID NO:2，在此称为WT)以四种略微不同的形式(图1)的含有RGD的细胞结合基序进行遗传功能化，所述细胞结合基序来自于III型纤连蛋白模块10。在第一种(FNCC-4RepCT；SEQ ID NO:13)中，侧接RGD序列的两个氨基酸被半胱氨酸取代以使该基序(CTGRGDSPAC；SEQ ID NO:10)能够形成环。在第二种(FNSS-4RepCT；SEQ ID NO:14)中，引入的半胱氨酸被丝氨酸取代以产生线性对照(STGRGDSPAS；SEQ ID NO:11)。此处选择氨基酸丝氨酸是由于其与半胱氨酸具有相似性却缺乏形成二硫键的能力。在第三种(FNVS-4RepCT；SEQ ID NO:15)中，纤连蛋白基序(VTGRGDSPAS；SEQ ID NO:9)的原始序列被用作线性的天然对照。在第四种(RGD-4RepCT；SEQ ID NO:16)中，用在Widhe M等在Biomaterials 34(33)：8223-8234(2013)中的含RGD的肽(SEQ ID NO 12)被用作另一个线性对照。
通过将编码不同基序的寡核苷酸克隆到编码4RepCT的载体(4RepCT DNA-SEQ IDNO:1)中并使用限制性内切酶来制备编码功能化变体(FNCC-4RepCT DNA-SEQ ID NO:17；FNSS-4RepCT DNA-SEQ ID NO:18；FNVS-4RepCT DNA-SEQ ID NO:19；和RGD-4RepCT DNA-SEQID NO:20)的基因。新序列引入到4RepCT的N末端并通过测序证实。
实施例2-含有来源于纤连蛋白的细胞结合基序的融合蛋白的表达
基本上按照Hedhammar M等在Biochemistry 47(11)：3407-3417(2008)和Hedhammar M等在Biomacromolecules 11:953-959(2010)中所描述的进行实施例1中获得的遗传构建体在大肠杆菌中的蛋白生产和随后的纯化。
简而言之，将带有靶蛋白表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)细胞(MerckBiosciences)于30℃在含有卡那霉素的Luria-Bertani培养基中生长至OD600为0.8-1，然后用异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导并进一步孵育至少2小时。此后，收集细胞并重悬于补充有溶菌酶和DNA酶I的20mM Tris-HCl(pH 8.0)中。完全裂解后，将15,000g离心得到的上清液加载到装有镍-琼脂糖凝胶(Ni Sepharose)(GE Healthcare，Uppsala，瑞典)的柱上。对柱进行充分洗涤，然后用300mM咪唑洗脱结合的蛋白。将含有靶蛋白的级分合并，并用20mM Tris-HCl(pH 8.0)透析。靶蛋白通过蛋白水解从标签上释放。为了除去释放下来的HisTrxHis标签，将裂解混合物加载到第二个镍-琼脂糖凝胶(Ni Sepharose)柱上并收集洗脱液。蛋白含量由在280nm处的吸光度确定。
如Hedhammar等在Biomacromolecules 11：953-959(2010)中所述的，将获得的蛋白溶液从脂多糖(lps)中纯化出来。将蛋白溶液进行无菌过滤(0.22μm)，随后用于制备支架(膜、泡沫、涂层或纤维)。
重组蜘蛛丝蛋白在大肠杆菌中成功表达并以与原始4RepCT(WT；SEQ ID NO:2)相似的产率和纯度纯化。
实施例3-细胞培养基质的制备
在纯化之后，如Widhe M等在Biomaterials 31(36)：9575-9585(2010)和Widhe M等在Biomaterials 34(33)：8223-8234(2013)中所述的，将实施例2中获得的蛋白溶液过滤除菌(0.22μm)并通过离心过滤(Amicon Ultra，Millipore)浓缩，然后制备膜。
简而言之，在室温用浓度为0.3mg/ml的重组蜘蛛丝溶液涂覆皮氏培养皿以产生膜。通过快速吹打该丝溶液来制造泡沫，并通过在15毫升管中轻轻摇动后切成较小的片来形成纤维。
为了研究早期附着和再增殖(repopulation)，将蛋白浓度为0.3mg/ml的溶液分别在预涂覆有1％普朗尼克的96和24孔细胞培养板(Sarstedt，悬浮细胞)中铸造(cast)为膜以限制细胞与塑料表面粘附。在对照实验中，在制备膜之前直接将还原剂(5mM二硫苏糖醇、20mMβ-巯基乙醇或10mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐)加入到蛋白溶液中。
为了进行显微研究，将蛋白在腔室玻璃载片(LabTekII)中铸造为膜。为了进行需要整个孔包覆的阿尔玛蓝实验，将细胞培养孔用0.3mg/ml的包覆蛋白溶液(coveringprotein solution)涂覆2小时，然后除去液体。在无菌条件下使膜和涂覆的表面在25℃和30％相对湿度干燥过夜，然后用无菌的20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)洗涤两次，并在接种细胞之前用完全细胞培养基在37℃、5％CO2预温育1小时。
通过将一滴蛋白溶液(3mg/ml)加到挂钩在96孔板的孔中的3mm宽的金属线框上并在无菌条件下使其在25℃、30％相对湿度干燥过夜，来制备自支撑膜。
将对照牛纤连蛋白(Sigma-Aldrich F1137)以推荐浓度(5μg/cm2)在37℃涂覆过夜。
观察到用二硫键成环的RGD基序功能化的蜘蛛丝蛋白自组装成稳定的基质。如图2a中的显微照片所示，FNCC-4RepCT(SEQ ID NO:13)蛋白可以以纤维(上)、膜(中)和自支撑膜(下)的形式呈现为基质。图2a中的比例尺表示500微米(上和中)和1000微米(下)。令人惊讶的是，与线性RGD丝蛋白(RGD-4RepCT，SEQ ID NO:16)和WT丝蛋白(4RepCT，SEQ ID NO:2)相比，FNCC-4RepCT蛋白可以形成具有明显更高稳定性和完整性的纤维、膜和泡沫。使用FNCC-4RepCT蛋白甚至可以形成自支撑膜。在随后的细胞粘附实验中使用光滑的膜形式(铸造和自支撑)以排除基质形态的影响。
实施例4-基质的结构分析
将实施例3中获得的纤维、铸造膜和自支撑膜的傅立叶变换红外光谱(FTIR)的光谱记录在FTIR光谱仪(Bruker)上。将膜置于晶体上以通过衰减的全反射来测量IR光谱。对于每个光谱，取100次扫描的平均值。进一步分析酰胺I区以分别比较α-螺旋(1654cm-1)和β-折叠(1629cm-1)结构的峰高。
图2b示出了纤维(上)、膜(中)和自支撑膜(下)形式的FNCC-4RepCT(SEQ ID NO:13)丝基质的FTIR光谱。α-螺旋和β-折叠的典型信号的峰分别用线表示。有趣的是，图2b中的FTIR数据显示，自支撑膜与铸造膜相反，完全转化为β-折叠结构。
实施例5-细胞培养
在用明胶(Sigma Aldrich)涂覆的培养瓶中在含5％胎牛血清(PromoCell GmbH，德国)的完全内皮细胞培养基MV中，培养从成人供体的真皮分离的人真皮微血管内皮细胞(EC)(HDMEC，PromoCell GmbH，德国)。
在用CELLstart(Gibco)涂覆的培养瓶中在含有25ng/μl成纤维细胞生长因子β(Gibco)和2mM Glutamax(Gibco)的完全StemPro MSC无血清培养基CTS(Gibco)中，培养来自骨髓的人间充质干细胞(hMSC，Gibco)。
来自成人皮肤的正常人表皮角质形成细胞(NHEK-ad)购自Lonza。在包含牛垂体提取物的KGM-Gold(Lonza)中进行继代培养、增殖和迁移实验，而在补充有CaCl2以产生1.2mMCa2+的KGM-CD(化学定义的)中进行粘附实验。
角质形成细胞和间充质干细胞培养以及实验在无血清条件下进行，以避免基质和血清蛋白之间可能的相互作用，该相互作用可能潜在地导致细胞粘附增加。
培养基每2-3天更换一次。当达到80％汇合时，用TrypLE(Life Technologies)收获细胞用于继代培养或实验。所有实验均在37℃、5％CO2和95％湿度进行。
实施例6-基质对粘附细胞早期附着的影响
A.早期附着测定
在3-8代收获细胞，以20000/cm2接种并允许其在细胞培养箱中粘附到膜或对照1小时，然后用预温热的磷酸盐缓冲盐水(PBS)轻轻洗涤两次，随后用96％乙醇固定10分钟。在水中洗涤三次后，用含0.1％结晶紫的水将细胞染色30分钟。在水中充分洗涤后将板干燥。
通过在倒置明视场显微镜中以2倍和10倍放大倍率拍摄显微照片来记录结合到实施例3中获得的膜上的细胞的附着和形态。然后将颜色溶于40μL 20％乙酸中10分钟，并将35μL该溶液转移至384孔板中以在595nm处测量光密度(TECAN Infinite M200)。将没有预洗的固定有细胞的孔用作阳性对照。没有细胞的孔用作空白。实验一式六份进行并重复三次。
使用软件NIS elements BR(尼康)在显微照片(2倍放大倍率)的指定面积(9.12mm2)内确定细胞覆盖面积。
B.细胞染色
在3-8代收获细胞，以3500/cm2接种并允许其在腔室载玻片中粘附到膜20分钟、1小时或3小时。轻轻洗涤后，将细胞用4％多聚甲醛固定，用PBS中0.1％Triton X-100透化，并用PBS中1％牛血清白蛋白(BSA，AppliChem)封闭。
在1％BSA中以下列浓度使用第一抗体：小鼠抗人纽蛋白(vinculin)(SigmaV9131)9.5μg/ml、小鼠抗人β1-整联蛋白(活化构象，克隆HUTS-4)3.3μg/mL、或者小鼠抗人α5-整联蛋白(配体结合构象，克隆SNAKA-51)2.5μg/mL，均购自Millipore。
第二抗体是以1：500使用的交叉吸附的AlexaFlour488山羊抗小鼠IgG(H+L)(Invitrogen)。以1:40使用鬼笔环肽-AlexaFluor594(Life Technologies)检测丝状肌动蛋白。DAPI用于核染色。将载玻片封固在荧光封固介质(Dako，Copenhagen)中。
使用倒置显微镜(Nikon Eclipse Ti)在4倍和10倍放大倍率分析染色的细胞。对于红色荧光使用在563/45nm的激发和在625/50nm的检测，而使用在387/11nm的激发和在447/60nm的检测来监测蓝色荧光。
为了显微分析细胞粘附(粘附斑和应力纤维的形成)，以10倍和63倍放大倍率使用共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM 710)。
应力纤维的存在被定义为强烈染色的突出和厚的f-肌动蛋白丝，并且从0-4级分级，其中0＝无、1＝少数至一些、2＝许多、3＝大多数、4＝所有细胞都表现出应力纤维。
粘附斑的存在以显示粘附斑的细胞的百分比来估算。粘附斑的质量关于以下的存在从1-4级分级：小且微弱的粘附斑(＝1p)、小且明显的粘附斑(＝2p)、丰富的粘附斑(＝3p)、大且明亮的粘附斑(＝4p)，并与表达该特定类型粘附斑的阳性细胞的部分(portion)相乘(0-4，其中，0≈无、1≈四分之一、2≈一半、3≈四分之三、4≈全部的粘附斑-阳性细胞)。
C.FNCC丝促进粘附细胞的早期附着
首先，我们想要研究与实施例3中获得的线性RGD蛋白(RGD-4RepCT，SEQ ID NO:16)和WT丝蛋白(4RepCT，SEQ ID NO:2)相比，粘附细胞在FNCC-丝(FNCC-4RepCT，SEQ ID NO:13)上附着和铺展的程度如何。在细胞培养板中制备这三个不同变体的丝膜，允许人原代内皮细胞(EC)、间充质干细胞(MSC)或角质形成细胞(KC)粘附1小时，随后固定和染色。
图3a显示了在与WT丝(SEQ ID NO:2)膜或用RGD(SEQ ID NO:16)或FNCC(SEQ IDNO:13)功能化的丝膜粘附1小时后用结晶紫染色后的EC、MSC和KC的显微照片(10倍放大倍率)。比例尺50微米。
图3b显示了从粘附于EC(上图)和MSC(中图)的不同丝变体的细胞溶解出来的结晶紫的OD，以及在指定面积(9.12mm2)内KC(下图)的细胞覆盖面积。EC和MSC：一式三份或一式两份，KC：一式四份。所有细胞类型n＝3。接种密度20000/cm2。盒形图：线＝中位值，盒：25％-75％，须＝平均值和最大值。统计：*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001。
从图3a所示的显微照片可以看出，对于所有三种细胞类型，与RGD和WT相比，在FNCC膜上的粘附明显改善。成像后，溶解分别被EC和MSC捕获的颜色并捕获OD，将该OD用作结合的细胞的数量的量度(图3b，上图和中图)。对于两种细胞类型，与WT丝相比，1小时后有明显更多的细胞与FNCC丝结合(对于EC，P<0.01，对于MSC，P<0.05)。与RGD丝相比，也有明显更多的EC粘附于FNCC丝(p<0.01)。这种比色法不太适用于KC，因为使用这种细胞类型，一些细胞尽管没有结合到丝膜上，但也粘附在膜表面外，因此提高OD值。代替该方法，如图3b(下图)所示，通过2倍放大倍率的图像分析来测量结合到膜上的细胞的面积。与FNCC结合的KC的面积明显大于WT丝和RGD丝(P<0.0001)。
D.原代KC与FNCC丝和牛纤连蛋白二者的粘附同样良好
在看到引入的FNCC基序的这种阳性效果之后，我们想要知道FNCC丝与天然的全长纤连蛋白(其中RGD呈现在由该结构约束的转角环上)相比程度如何。因此，我们使用来自牛血浆的纤连蛋白(BFN)涂布细胞培养孔以及在其上可以培养KC的用裸细胞培养物处理过的塑料(TCT)作为对照。选择无血清的实验条件以避免基质和血清蛋白之间可能的相互作用，该相互作用可能潜在导致细胞粘附增加。
在与用FNCC功能化的丝、牛纤连蛋白涂覆的表面(BFN)或组织培养物处理的细胞塑料(TCT)粘附1小时之后的KC的结果呈现在图4中。图4a显示了用结晶紫染色后10倍放大倍率的显微照片。接种密度40000/cm2。比例尺50微米。图4b显示了指定面积(9.12mm2)内的细胞覆盖面积(一式四份，n＝3)。接种密度20000/cm2。盒形图：线＝中位值，盒：25％-75％，须＝平均值和最大值。统计(对TCT)：****P<0.0001。
当比较细胞覆盖面积时，显然KC在粘附1h后与BFN和FNCC丝粘附得同样良好，并且重要的是二者均明显优于TCT(P<0.0001)(图4)。
实施例7-半胱氨酸成环的构象对FNCC-丝中RGD呈现的影响
受到这些结果的鼓舞，我们想进一步研究FNCC丝(SEQ ID NO:13)为细胞创造有吸引力的表面的机制。为此，我们使用了两种期待呈现线性RGD的FN丝变体(图1a)。第一种变体(FNVS；SEQ ID NO:15)含有纤连蛋白中含RGD的基序的原始序列，以显示天然侧翼氨基酸的影响，而不是环构象的影响。在第二个变体(FNSS；SEQ ID NO:14)中，FNCC中的两个侧翼半胱氨酸取代为丝氨酸，其类似于半胱氨酸但缺少-SH-基团，因此不能形成二硫键桥。用原代KC评估不同的FN丝变体、以及RGD丝(SEQ ID NO:16)和WT丝(SEQ ID NO:2)。对细胞进行早期附着(图5)、铺展和应力纤维形成(图6)和粘附斑(图7)的分析。如实施例6中详述的进行早期附着测定和细胞染色。
A.早期附着
KC与WT丝(SEQ ID NO:2)膜或经FNCC(SEQ ID NO:13)、FNVS(SEQ ID NO:15)、FNSS(SEQ ID NO:14)或RGD(SEQ ID NO:16)功能化的丝膜粘附1小时后的结果显示在图5中。图5a显示了用结晶紫染色后10倍放大倍率的显微照片。接种密度20000/cm2。图5b显示了指定面积(9.12mm2)内的细胞覆盖面积(一式四份，n＝3)。盒形图：线＝中位值，盒：25％-75％，须＝平均值和最大值。统计：****P<0.0001。
在最初的实验中，允许KC在WT、RGD-和FN丝变体的膜上粘附1h，并用结晶紫染色以检测和形态学研究(图5a)。当汇集来自3个实验(一式六份)的图像分析数据时，与FNSS和FNVS相比，FNCC丝显示了提高的粘附(即被细胞覆盖的面积)(P<0.0001，图5b)。与RGD丝相比，FNCC丝也显示了明显提高的KC粘附(P<0.0001)。与WT丝相比，所有FN丝变体均显示出显著提高的粘附(P<0.0001)。
此外，从8个实验汇集的数据(其中结晶紫从细胞中溶解出来并且在板读数器中测量其OD)显示了非常相似的结果(FNCC对FN-对照，P<0.0001)，尽管这些实验中的细胞一定程度上也粘附在丝-膜外的细胞塑料上(数据未显示)。
B.细胞铺展和应力纤维的形成
KC与WT丝(SEQ ID NO:2)膜或经FNCC(SEQ ID NO:13)、FNVS(SEQ ID NO:15)、FNSS(SEQ ID NO:14)或RGD(SEQ ID NO:16)功能化的丝膜粘附3小时后的结果显示在图6中。图6a显示了细胞覆盖面积，一式两份，n＝4。盒形图：线＝中位值，盒：25％-75％，须＝平均值和最大值。图6b显示了应力纤维排序(平均和标准偏差，单孔，n＝3)。接种密度3500/cm2。统计：***P<0.001，*P<0.05。
通过对F-肌动蛋白染色，研究了3小时粘附后KC中细胞铺展和应力纤维的形成(图6)。结果显示，当测量4倍放大的显微照片中的总细胞面积时(n＝4，一式两份)，与RGD-膜(p<0.05)和WT-膜(p<0.001)相比，FNCC膜而不是FNSS或FNVS膜显示了显著提高的KC铺展(图6a)。与FNSS丝相比，KC在FNCC丝上的铺展也显著提高(p<0.05)。RGD、FNSS-和FNVS丝上的KC显示了具有圆形外观的细胞的比例更高，而在FNCC丝上，大多数细胞具有很好的展开形态，具有明显的肌动蛋白丝。
还分析了F-肌动蛋白染色的KC中应力纤维的存在，作为建立附着的指标(图6b)。应力纤维的存在被定义为厚且被明亮染色的肌动蛋白细丝(束)，通过在63倍放大倍率检查来进行分析(n＝3)。该分析显示了与面积测量相似的结果，但没有发现统计学显著差异。
C.粘附斑的形成
3小时后，通过将F-肌动蛋白联合作为粘附斑复合物的主要组分之一的纽蛋白(vinculin)的染色，分析细胞内粘附斑的形成。因此，F-肌动蛋白和纽蛋白的共同染色是整联蛋白参与的良好建立的细胞与底层基质结合的标志。粘附斑呈现为F-肌动蛋白丝的黄绿色伸长，通常位于细胞膜附近。
在与WT丝(SEQ ID NO:2)膜或经FNCC(SEQ ID NO:13)、FNVS(SEQ ID NO:15)、FNSS(SEQ ID NO:14)或RGD(SEQ ID NO:16)功能化的丝膜粘附3小时后，KC中粘附斑的形成和表征的分析结果显示在图7中。用共聚焦显微镜以10倍扫描载玻片进行概览(图7a)，用63倍扫描载玻片观察细节(图7b)。进行细胞中粘附斑的两种类型分级。
首先，通过以10倍放大倍率目视检查每个孔中的整个膜来评估显示粘附斑的细胞百分比。来自三个实验的汇集数据显示了与RGD和WT相比，在FNCC丝上显示粘附斑的细胞百分比显著提高(p<0.05)(图7a)。图7a是给出了显示粘附斑的细胞百分比(平均值和标准偏差)的图。实验一式两份进行，n＝3。统计：*P<0.05。
其次，由于不同的丝变体之间不仅显示粘附斑的细胞的丰度而且细胞内观察到的粘附斑的特征也表现出不同，所以我们决定对其进行进一步检查。因此，根据分级系统评估每个阳性细胞内粘附斑的外观。简而言之，分级从小且暗淡、表现为在细胞内稀疏出现(“稀薄”)跨度到大且明亮、表现为在细胞内大量出现(“显著”)。通过这种方式，我们可以独立于膜上展示这些结构的细胞的数量来判断粘附斑的质量。这种分析的结果显示，与其他丝类型相比，粘附于FNCC丝的细胞中的粘附斑趋向于更加显著。图7b是显示粘附斑分级的图，其与发现的阳性细胞总数无关(平均值和标准偏差)。分级在单孔中进行，n＝3。
结果显示，RGD、FNSS和FNVS上的细胞中的粘附斑质量变化比FNCC丝的大，这反映了FNSS和FNVS上的细胞中存在显著和稀薄的粘附斑二者，而FNCC丝上几乎只有显著的粘附斑。有趣的是，这种显著的粘附斑早在FNCC上接种后20分钟就出现了。
在每个单独的实验中，FNCC丝毫无例外地给出了测试膜的最有效的粘附。相比之下，FNSS-和FNVS丝上的粘附从与RGD丝相似到仅比FNCC丝上的粘附略低。
为了进一步阐明半胱氨酸连接的环在呈现RGD基序方面的作用，我们进行了在铸造之前直接将还原剂加入到FNCC丝溶液中的实验。此想法是为了防止这些膜中形成二硫化物而产生线性的非环状基序。然而，没有检测到与未还原的FNCC膜的差异。当考虑到在生产过程中薄膜完全干燥时，人们可以推定还原剂在缺乏缓冲剂的情况下不再能防止形成二硫化物发生。因此，我们认为FNSS是可得到的最合适的非环状对照物。
实施例8-整联蛋白α5β1在KC粘附到FNCC丝中的作用
由于已知整联蛋白α5β1选择性地与纤连蛋白结合，因此我们决定研究该整联蛋白是否参与KC与FNCC丝(SEQ ID NO:13)的结合。为此，我们选择了两种单克隆抗体，分别开发以特异性识别α5整联蛋白(SNAKA-51)的配体结合构象和β1整联蛋白(HUTS-4)的活化构象，并如实施例6-7中所述将它们组合用于对粘附至FNCC丝的KC染色3小时，并与鬼笔环肽对F-肌动蛋白染色组合。细胞分析显示类似于纽蛋白染色时所见的模式的一周但独特的染色模式。
实施例9-FNCC丝的应用
由关于粘附细胞早期附着发现的FNCC丝的这种优异的结合特性的吸引，我们进行了一些试点研究，以了解其支持各种细胞培养应用的能力。首先，我们想评估FNCC基序对细胞增殖的影响。
A.用阿尔玛蓝进行细胞活力分析
将原代角质形成细胞(NHEK)以初始低接种密度3500个细胞/cm2接种到用WT丝(SEQ ID NO:2)膜或FNCC丝(SEQ ID NO:13)膜包覆的96孔板的孔内之后，在培养期间每三天用阿尔玛蓝细胞活力测定(Molecular Probes)监测细胞生长。与阿尔玛蓝(在细胞培养基中以1:10稀释)孵育4小时后，使用荧光读板仪(CLARIOstar，BMG Labtech)，使用544nm处的激发和595nm处的发射来测量90μL培养物上清液的荧光强度。进行两次独立的实验，其中膜以一式六份进行分析。随时间绘制与每个孔中活细胞的数量相关的荧光强度，生成接种在具有不同细胞结合基序的丝上的细胞的生长曲线。如图8中呈现的结果显示，与WT丝相比，FNCC丝上活细胞的水平增加(第3天P<0.001和第6天P<0.0001；****P<0.0001，***P<0.001)，表明通过FNCC基序对支持细胞增殖的能力得到改善。
B.再增殖分析
为了评价不同丝变体支持开放伤口区域再增殖的能力，在24孔板中在以20000个细胞/cm2将真皮角质形成细胞(NHEK)接种到FNCC丝(SEQ ID NO:13)和WT丝(SEQ ID NO:2)的膜上之前，用Oregon green cell trace(Life Technologies)对真皮角质形成细胞(NHEK)进行染色。将伤口区域插入物(CytoSelectTM Wound healing assay，CellBiolabs)加入孔中，以在细胞接种之前在细胞单层中产生0.9mm宽的开放伤口区域，同时保持膜完整。16小时后，移除插入物，每天追踪再增殖过程，并在第0天(移除插入物)、第2天和第4天通过倒置荧光显微术记录。在第6天，根据测定方案将细胞固定并染色，并由倒置明场显微术成像。
因此，将绿色追踪的细胞以高密度接种到具有插入物的孔中，防止细胞到达丝膜的限定部分即“伤口区域”。在伤口区域外单层形成之后，移除插入物，并在培养6天期间记录间隙再增殖，从而允许细胞迁移和增殖二者。角质形成细胞有效地再增殖FNCC丝上的伤口区域，在实验结束时伤口区域几乎完全被细胞覆盖。
C.可转移的细胞单层
在以20000个细胞/cm2接种到安装在金属框架上的FNCC丝(SEQ ID NO:13)的自支撑膜上之前，收获NHEK并用AMCAorange cell tracker(Life Technologies)追踪。通过倒置荧光显微术记录形成的单层。
接种到这种自支撑膜上的原代角质形成细胞形成可以容易地在培养孔之间转移的单层。
实施例10-细胞粘附到具有固定肽的表面
使用有机硅烷(例如3-氨基丙基三乙氧基硅烷APTES)活化硅(SiO)表面，然后用例如EDC/NHS化学反应固定氨基反应性肽(经由它们的N端)。
用于固定的肽设计为带有甘氨酸间隔区，如下：
1.GGGGGCTGRGDSPAC(SEQ ID NO:21)
2.GGGGGVTGRGDSPAS(SEQ ID NO:22)
3.GGGGGSTGRGDSPAS(SEQ ID NO:23)
4.GGGGGCDWRGDNQFC(SEQ ID NO:24)
使用以20000/cm2接种的人角质形成细胞(HaCAT)分析向带有固定的肽的表面的早期附着。然后允许细胞在细胞培养箱中粘附1小时，然后用预温热的磷酸盐缓冲盐水(PBS)温和洗涤两次，然后用96％乙醇固定10分钟。在水中洗涤3次后，用含0.1％结晶紫的水将细胞染色30分钟。
通过在倒置明场显微镜中以2倍和10倍放大倍率拍摄显微照片来记录细胞的粘附和形态。然后将结晶紫色溶于40μL的20％乙酸中10分钟，并将35μL溶液转移到384孔板中，在595nm处测量光密度(TECAN Infinite M200)。不经预洗涤的固定细胞用作阳性对照(参考)。
实施例11-FNcc丝基质上的细胞培养
纯化后，使用FNcc丝蛋白(SEQ ID NO:13)的溶液涂覆细胞培养板(Sarstedt，用于悬浮细胞的疏水板)。简而言之，将蛋白溶液在Tris缓冲液中稀释至0.1mg/ml，并允许在室温孵育30分钟，然后取出并洗涤。
使用胰蛋白酶消化(TrpLE)收集细胞并以合适的细胞密度(3-10000个细胞/cm2)接种到FNcc丝涂层上。用阿尔玛蓝细胞活力测定(Molecular Probes)定期(每2-3天)监测细胞生长。在终点处，在7-14天后，进行活细胞/死细胞染色。以下细胞类型显示正性生长曲线，并且在终点处大部分(>80％)为活细胞：
人骨骼肌卫星细胞
人皮肤微血管内皮细胞
人间充质干细胞
小鼠间充质干细胞
人皮肤成纤维细胞
HaCaT角质形成细胞
MIN6-m9胰腺细胞系。
序列表
<110> 思百博技术股份公司
<120> 环状RGD细胞结合基序及其用途
<130> PC-21083276
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 789
<212> DNA
<213> Euprosthenops australis
<400> 1
ggtccgaatt caggtcaagg aggatatggt ggactaggtc aaggagggta tggacaaggt 60
gcaggaagtt ctgcagccgc tgccgccgcc gcagcagccg ccgcagcagg tggacaaggt 120
ggacaaggtc aaggaggata tggacaaggt tcaggaggtt ctgcagccgc cgccgccgcc 180
gcagcagcag cagcagctgc agcagctgga cgaggtcaag gaggatatgg ccaaggttct 240
ggaggtaatg ctgctgccgc agccgctgcc gccgccgccg ccgctgcagc agccggacag 300
ggaggtcaag gtggatatgg tagacaaagc caaggtgctg gttccgctgc tgctgctgct 360
gctgctgctg ccgctgctgc tgctgcagga tctggacaag gtggatacgg tggacaaggt 420
caaggaggtt atggtcagag tagtgcttct gcttcagctg ctgcgtcagc tgctagtact 480
gtagctaatt cggtgagtcg cctctcatcg ccttccgcag tatctcgagt ttcttcagca 540
gtttctagct tggtttcaaa tggtcaagtg aatatggcag cgttacctaa tatcatttcc 600
aacatttctt cttctgtcag tgcatctgct cctggtgctt ctggatgtga ggtcatagtg 660
caagctctac tcgaagtcat cactgctctt gttcaaatcg ttagttcttc tagtgttgga 720
tatattaatc catctgctgt gaaccaaatt actaatgttg ttgctaatgc catggctcaa 780
gtaatgggc 789
<210> 2
<211> 263
<212> PRT
<213> Euprosthenops australis
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(158)
<223> REP片段
<220>
<221> DOMAIN
<222> (159)..(165)
<223> 间隔区片段
<220>
<221> DOMAIN
<222> (166)..(263)
<223> CT片段
<400> 2
Gly Pro Asn Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly
1 5 10 15
Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly
35 40 45
Gln Gly Ser Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
50 55 60
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
85 90 95
Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Arg Gln Ser Gln Gly
100 105 110
Ala Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
115 120 125
Ala Gly Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr
130 135 140
Gly Gln Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr
145 150 155 160
Val Ala Asn Ser Val Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ser Ala Val Ser Arg
165 170 175
Val Ser Ser Ala Val Ser Ser Leu Val Ser Asn Gly Gln Val Asn Met
180 185 190
Ala Ala Leu Pro Asn Ile Ile Ser Asn Ile Ser Ser Ser Val Ser Ala
195 200 205
Ser Ala Pro Gly Ala Ser Gly Cys Glu Val Ile Val Gln Ala Leu Leu
210 215 220
Glu Val Ile Thr Ala Leu Val Gln Ile Val Ser Ser Ser Ser Val Gly
225 230 235 240
Tyr Ile Asn Pro Ser Ala Val Asn Gln Ile Thr Asn Val Val Ala Asn
245 250 255
Ala Met Ala Gln Val Met Gly
260
<210> 3
<211> 98
<212> PRT
<213> Euprosthenops australis
<400> 3
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ser Ala Val Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Ser Leu Val Ser Asn Gly Gln Val Asn Met Ala Ala Leu Pro Asn
20 25 30
Ile Ile Ser Asn Ile Ser Ser Ser Val Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ala
35 40 45
Ser Gly Cys Glu Val Ile Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Ile Thr Ala
50 55 60
Leu Val Gln Ile Val Ser Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile Asn Pro Ser
65 70 75 80
Ala Val Asn Gln Ile Thr Asn Val Val Ala Asn Ala Met Ala Gln Val
85 90 95
Met Gly
<210> 4
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自已知MaSp1和MaSp2蛋白的共有序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(71)
<223> 已知物种变体中存在的序列长度
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> Glu
<400> 4
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Gln Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Leu Ser Asn
20 25 30
Thr Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Ser Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Val His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Ala Thr Gln Ile Val Gly Gln Ser Val Ala Gln Ala
85 90 95
Leu Gly Glu Phe
100
<210> 5
<211> 1110
<212> PRT
<213> Euprosthenops australis
<220>
<221> REPEAT
<222> (7)..(19)
<220>
<221> REPEAT
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
<222> (421)..(434)
<220>
<221> REPEAT
<222> (435)..(457)
<220>
<221> REPEAT
<222> (458)..(470)
<220>
<221> REPEAT
<222> (471)..(488)
<220>
<221> REPEAT
<222> (489)..(502)
<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
<222> (517)..(529)
<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
<222> (804)..(816)
<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
<222> (840)..(853)
<220>
<221> REPEAT
<222> (854)..(867)
<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
<222> (969)..(981)
<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
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<220>
<221> REPEAT
<222> (1014)..(1027)
<220>
<221> REPEAT
<222> (1028)..(1042)
<220>
<221> REPEAT
<222> (1043)..(1059)
<220>
<221> REPEAT
<222> (1060)..(1073)
<220>
<221> REPEAT
<222> (1074)..(1092)
<400> 5
Gln Gly Ala Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln
20 25 30
Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
35 40 45
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly
50 55 60
Gln Gly Ser Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
65 70 75 80
Ala Ala Ser Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln
85 90 95
Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
100 105 110
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gln Gly Arg Tyr Gly
115 120 125
Gln Gly Ala Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
130 135 140
Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Leu Gly Gln
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Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln
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Gly Ala Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
195 200 205
Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln
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Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
225 230 235 240
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly
245 250 255
Arg Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
260 265 270
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln
275 280 285
Gly Ala Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
290 295 300
Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Leu Gly Gln Gly
305 310 315 320
Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
325 330 335
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly
340 345 350
Ala Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Ala
355 360 365
Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly
370 375 380
Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
385 390 395 400
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly
405 410 415
Ala Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
420 425 430
Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly
435 440 445
Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
450 455 460
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Arg
465 470 475 480
Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
485 490 495
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly
500 505 510
Ser Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
515 520 525
Ser Gly Gln Gly Ser Gln Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly
530 535 540
Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
545 550 555 560
Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly
565 570 575
Ala Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
580 585 590
Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly
595 600 605
Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
610 615 620
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr
625 630 635 640
Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
645 650 655
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser
660 665 670
Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser
675 680 685
Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr
690 695 700
Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
705 710 715 720
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala
725 730 735
Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
740 745 750
Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly Tyr
755 760 765
Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
770 775 780
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Val
785 790 795 800
Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
805 810 815
Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly Tyr
820 825 830
Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
835 840 845
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser
850 855 860
Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser
865 870 875 880
Gly Gln Gly Ser Gln Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr
885 890 895
Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
900 905 910
Ala Ala Ala Ala Ser Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala
915 920 925
Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
930 935 940
Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly
945 950 955 960
Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
965 970 975
Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly
980 985 990
Gln Gly Ser Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
995 1000 1005
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly
1010 1015 1020
Ser Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1025 1030 1035
Ala Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Arg Gln
1040 1045 1050
Ser Gln Gly Ala Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1055 1060 1065
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln
1070 1075 1080
Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala
1085 1090 1095
Ala Ser Ala Ala Ser Thr Val Ala Asn Ser Val Ser
1100 1105 1110
<210> 6
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来源于Euprosthenops australis MaSp1的内部重复的共有序列
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> Ser
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> Tyr
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> Gln
<400> 6
Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly Tyr
1 5 10 15
Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser
20
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来源于Euprosthenops australis MaSp1的内部重复的共有序列
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(9)
<223> Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> (14)..(14)
<223> Ser
<220>
<221> VARIANT
<222> (16)..(16)
<223> Gly
<400> 7
Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser
1 5 10 15
Ser
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来源于Euprosthenops australis MaSp1的内部重复的共有序列
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> Gln
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> Ser
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> Val
<400> 8
Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Gly Asn
1 5 10
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 从智人(Homo sapiens)修改
<220>
<221> DISULFID
<222> (1)..(10)
<400> 10
Cys Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Cys
1 5 10
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 从智人(Homo sapiens)修改
<400> 11
Ser Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser
1 5 10
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Widhe等人, 2013
<400> 12
Gly Pro Asn Ser Arg Gly Asp Ala Gly Ala Ala Ser
1 5 10
<210> 13
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<220>
<221> DISULFID
<222> (5)..(14)
<400> 13
Gly Pro Asn Ser Cys Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Cys Gly Ser
1 5 10 15
Ala Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly Tyr Gly
20 25 30
Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
35 40 45
Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly
50 55 60
Ser Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
65 70 75 80
Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
100 105 110
Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Arg Gln Ser Gln Gly Ala Gly
115 120 125
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly
130 135 140
Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln
145 150 155 160
Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr Val Ala
165 170 175
Asn Ser Val Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ser Ala Val Ser Arg Val Ser
180 185 190
Ser Ala Val Ser Ser Leu Val Ser Asn Gly Gln Val Asn Met Ala Ala
195 200 205
Leu Pro Asn Ile Ile Ser Asn Ile Ser Ser Ser Val Ser Ala Ser Ala
210 215 220
Pro Gly Ala Ser Gly Cys Glu Val Ile Val Gln Ala Leu Leu Glu Val
225 230 235 240
Ile Thr Ala Leu Val Gln Ile Val Ser Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
245 250 255
Asn Pro Ser Ala Val Asn Gln Ile Thr Asn Val Val Ala Asn Ala Met
260 265 270
Ala Gln Val Met Gly
275
<210> 14
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 14
Gly Pro Asn Ser Ser Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Gly Ser
1 5 10 15
Ala Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly Tyr Gly
20 25 30
Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
35 40 45
Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly
50 55 60
Ser Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
65 70 75 80
Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
100 105 110
Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Arg Gln Ser Gln Gly Ala Gly
115 120 125
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly
130 135 140
Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln
145 150 155 160
Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr Val Ala
165 170 175
Asn Ser Val Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ser Ala Val Ser Arg Val Ser
180 185 190
Ser Ala Val Ser Ser Leu Val Ser Asn Gly Gln Val Asn Met Ala Ala
195 200 205
Leu Pro Asn Ile Ile Ser Asn Ile Ser Ser Ser Val Ser Ala Ser Ala
210 215 220
Pro Gly Ala Ser Gly Cys Glu Val Ile Val Gln Ala Leu Leu Glu Val
225 230 235 240
Ile Thr Ala Leu Val Gln Ile Val Ser Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
245 250 255
Asn Pro Ser Ala Val Asn Gln Ile Thr Asn Val Val Ala Asn Ala Met
260 265 270
Ala Gln Val Met Gly
275
<210> 15
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 15
Gly Pro Asn Ser Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Gly Ser
1 5 10 15
Ala Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly Tyr Gly
20 25 30
Gln Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
35 40 45
Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly
50 55 60
Ser Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
65 70 75 80
Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly
85 90 95
Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
100 105 110
Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Arg Gln Ser Gln Gly Ala Gly
115 120 125
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly
130 135 140
Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln
145 150 155 160
Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr Val Ala
165 170 175
Asn Ser Val Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ser Ala Val Ser Arg Val Ser
180 185 190
Ser Ala Val Ser Ser Leu Val Ser Asn Gly Gln Val Asn Met Ala Ala
195 200 205
Leu Pro Asn Ile Ile Ser Asn Ile Ser Ser Ser Val Ser Ala Ser Ala
210 215 220
Pro Gly Ala Ser Gly Cys Glu Val Ile Val Gln Ala Leu Leu Glu Val
225 230 235 240
Ile Thr Ala Leu Val Gln Ile Val Ser Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
245 250 255
Asn Pro Ser Ala Val Asn Gln Ile Thr Asn Val Val Ala Asn Ala Met
260 265 270
Ala Gln Val Met Gly
275
<210> 16
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 16
Gly Pro Asn Ser Arg Gly Asp Ala Gly Ala Ala Ser Gly Gln Gly Gly
1 5 10 15
Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ser Ser
20 25 30
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly
35 40 45
Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly Ser Ala Ala
50 55 60
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Gly
65 70 75 80
Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ser Gly Gly Asn Ala Ala Ala Ala Ala
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly
100 105 110
Gly Tyr Gly Arg Gln Ser Gln Gly Ala Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala
115 120 125
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln Gly Gly Tyr
130 135 140
Gly Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Ala Ser Ala Ser
145 150 155 160
Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr Val Ala Asn Ser Val Ser Arg Leu
165 170 175
Ser Ser Pro Ser Ala Val Ser Arg Val Ser Ser Ala Val Ser Ser Leu
180 185 190
Val Ser Asn Gly Gln Val Asn Met Ala Ala Leu Pro Asn Ile Ile Ser
195 200 205
Asn Ile Ser Ser Ser Val Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ala Ser Gly Cys
210 215 220
Glu Val Ile Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Ile Thr Ala Leu Val Gln
225 230 235 240
Ile Val Ser Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ala Val Asn
245 250 255
Gln Ile Thr Asn Val Val Ala Asn Ala Met Ala Gln Val Met Gly
260 265 270
<210> 17
<211> 831
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 17
ggtccgaatt catgcacagg tcgtggtgat tctccggcgt gcggatccgc tagcggtcaa 60
ggaggatatg gtggactagg tcaaggaggg tatggacaag gtgcaggaag ttctgcagcc 120
gctgccgccg ccgcagcagc cgccgcagca ggtggacaag gtggacaagg tcaaggagga 180
tatggacaag gttcaggagg ttctgcagcc gccgccgccg ccgcagcagc agcagcagct 240
gcagcagctg gacgaggtca aggaggatat ggccaaggtt ctggaggtaa tgctgctgcc 300
gcagccgctg ccgccgccgc cgccgctgca gcagccggac agggaggtca aggtggatat 360
ggtagacaaa gccaaggtgc tggttccgct gctgctgctg ctgctgctgc tgccgctgct 420
gctgctgcag gatctggaca aggtggatac ggtggacaag gtcaaggagg ttatggtcag 480
agtagtgctt ctgcttcagc tgctgcgtca gctgctagta ctgtagctaa ttcggtgagt 540
cgcctctcat cgccttccgc agtatctcga gtttcttcag cagtttctag cttggtttca 600
aatggtcaag tgaatatggc agcgttacct aatatcattt ccaacatttc ttcttctgtc 660
agtgcatctg ctcctggtgc ttctggatgt gaggtcatag tgcaagctct actcgaagtc 720
atcactgctc ttgttcaaat cgttagttct tctagtgttg gatatattaa tccatctgct 780
gtgaaccaaa ttactaatgt tgttgctaat gccatggctc aagtaatggg c 831
<210> 18
<211> 831
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 18
ggtccgaatt caagcacagg tcgtggtgat tctccggcga gcggatccgc tagcggtcaa 60
ggaggatatg gtggactagg tcaaggaggg tatggacaag gtgcaggaag ttctgcagcc 120
gctgccgccg ccgcagcagc cgccgcagca ggtggacaag gtggacaagg tcaaggagga 180
tatggacaag gttcaggagg ttctgcagcc gccgccgccg ccgcagcagc agcagcagct 240
gcagcagctg gacgaggtca aggaggatat ggccaaggtt ctggaggtaa tgctgctgcc 300
gcagccgctg ccgccgccgc cgccgctgca gcagccggac agggaggtca aggtggatat 360
ggtagacaaa gccaaggtgc tggttccgct gctgctgctg ctgctgctgc tgccgctgct 420
gctgctgcag gatctggaca aggtggatac ggtggacaag gtcaaggagg ttatggtcag 480
agtagtgctt ctgcttcagc tgctgcgtca gctgctagta ctgtagctaa ttcggtgagt 540
cgcctctcat cgccttccgc agtatctcga gtttcttcag cagtttctag cttggtttca 600
aatggtcaag tgaatatggc agcgttacct aatatcattt ccaacatttc ttcttctgtc 660
agtgcatctg ctcctggtgc ttctggatgt gaggtcatag tgcaagctct actcgaagtc 720
atcactgctc ttgttcaaat cgttagttct tctagtgttg gatatattaa tccatctgct 780
gtgaaccaaa ttactaatgt tgttgctaat gccatggctc aagtaatggg c 831
<210> 19
<211> 831
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 19
ggtccgaatt cagttacagg tcgtggtgat tctccggcga gcggatccgc tagcggtcaa 60
ggaggatatg gtggactagg tcaaggaggg tatggacaag gtgcaggaag ttctgcagcc 120
gctgccgccg ccgcagcagc cgccgcagca ggtggacaag gtggacaagg tcaaggagga 180
tatggacaag gttcaggagg ttctgcagcc gccgccgccg ccgcagcagc agcagcagct 240
gcagcagctg gacgaggtca aggaggatat ggccaaggtt ctggaggtaa tgctgctgcc 300
gcagccgctg ccgccgccgc cgccgctgca gcagccggac agggaggtca aggtggatat 360
ggtagacaaa gccaaggtgc tggttccgct gctgctgctg ctgctgctgc tgccgctgct 420
gctgctgcag gatctggaca aggtggatac ggtggacaag gtcaaggagg ttatggtcag 480
agtagtgctt ctgcttcagc tgctgcgtca gctgctagta ctgtagctaa ttcggtgagt 540
cgcctctcat cgccttccgc agtatctcga gtttcttcag cagtttctag cttggtttca 600
aatggtcaag tgaatatggc agcgttacct aatatcattt ccaacatttc ttcttctgtc 660
agtgcatctg ctcctggtgc ttctggatgt gaggtcatag tgcaagctct actcgaagtc 720
atcactgctc ttgttcaaat cgttagttct tctagtgttg gatatattaa tccatctgct 780
gtgaaccaaa ttactaatgt tgttgctaat gccatggctc aagtaatggg c 831
<210> 20
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 20
ggtccgaatt cacgcggcga tgcaggagcg gctagcggtc aaggaggata tggtggacta 60
ggtcaaggag ggtatggaca aggtgcagga agttctgcag ccgctgccgc cgccgcagca 120
gccgccgcag caggtggaca aggtggacaa ggtcaaggag gatatggaca aggttcagga 180
ggttctgcag ccgccgccgc cgccgcagca gcagcagcag ctgcagcagc tggacgaggt 240
caaggaggat atggccaagg ttctggaggt aatgctgctg ccgcagccgc tgccgccgcc 300
gccgccgctg cagcagccgg acagggaggt caaggtggat atggtagaca aagccaaggt 360
gctggttccg ctgctgctgc tgctgctgct gctgccgctg ctgctgctgc aggatctgga 420
caaggtggat acggtggaca aggtcaagga ggttatggtc agagtagtgc ttctgcttca 480
gctgctgcgt cagctgctag tactgtagct aattcggtga gtcgcctctc atcgccttcc 540
gcagtatctc gagtttcttc agcagtttct agcttggttt caaatggtca agtgaatatg 600
gcagcgttac ctaatatcat ttccaacatt tcttcttctg tcagtgcatc tgctcctggt 660
gcttctggat gtgaggtcat agtgcaagct ctactcgaag tcatcactgc tcttgttcaa 720
atcgttagtt cttctagtgt tggatatatt aatccatctg ctgtgaacca aattactaat 780
gttgttgcta atgccatggc tcaagtaatg ggc 813
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> DISULFID
<222> (6)..(15)
<400> 21
Gly Gly Gly Gly Gly Cys Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Cys
1 5 10 15
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 22
Gly Gly Gly Gly Gly Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser
1 5 10 15
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 23
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser
1 5 10 15
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> DISULFID
<222> (6)..(15)
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Gly Cys Asp Trp Arg Gly Asp Asn Gln Phe Cys
1 5 10 15
<210> 25
<211> 18
<212> PRT
<213> Euprosthenops australis
<400> 25
Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr Val Ala Asn Ser
1 5 10 15
Val Ser
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> Euprosthenops australis
<400> 26
Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ala
1 5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> Euprosthenops australis
<400> 27
Gly Ser Ala Met Gly Gln Gly Ser
1 5
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> Euprosthenops australis
<400> 28
Ser Ala Ser Ala Gly
1 5
<210> 29
<211> 100
<212> PRT
<213> Euprosthenops sp
<400> 29
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Glu Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Leu Ser Ser
20 25 30
Thr Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Gly Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Ile His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Ala Thr Gln Leu Val Gly Gln Ser Val Tyr Gln Ala
85 90 95
Leu Gly Glu Phe
100
<210> 30
<211> 98
<212> PRT
<213> Euprosthenops australis
<400> 30
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ser Ala Val Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Ser Leu Val Ser Asn Gly Gln Val Asn Met Ala Ala Leu Pro Asn
20 25 30
Ile Ile Ser Asn Ile Ser Ser Ser Val Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ala
35 40 45
Ser Gly Cys Glu Val Ile Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Ile Thr Ala
50 55 60
Leu Val Gln Ile Val Ser Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile Asn Pro Ser
65 70 75 80
Ala Val Asn Gln Ile Thr Asn Val Val Ala Asn Ala Met Ala Gln Val
85 90 95
Met Gly
<210> 31
<211> 99
<212> PRT
<213> 三带金蛛(Argiope trifasciata)
<400> 31
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Gly Ala Ala Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Thr Ser Leu Val Ser Ser Gly Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Leu Ser
20 25 30
Asn Thr Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Ser Ser Ser Asn Pro Gly
35 40 45
Leu Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Ile Val Ser
50 55 60
Ala Leu Val His Ile Leu Gly Ser Ala Asn Ile Gly Gln Val Asn Ser
65 70 75 80
Ser Gly Val Gly Arg Ser Ala Ser Ile Val Gly Gln Ser Ile Asn Gln
85 90 95
Ala Phe Ser
<210> 32
<211> 89
<212> PRT
<213> 泉字云斑蛛(Cyrtophora moluccensis)
<400> 32
Ser His Leu Ser Ser Pro Glu Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Ser Thr Asn Ser Ala Ala Leu Pro Asn
20 25 30
Thr Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Ser Ser Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Ile His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Ala Thr Gln Ile Val
85
<210> 33
<211> 98
<212> PRT
<213> 几何寇蛛(Latrodectus geometricus)
<400> 33
Ser Ala Leu Ala Ala Pro Ala Thr Ser Ala Arg Ile Ser Ser His Ala
1 5 10 15
Ser Thr Leu Leu Ser Asn Gly Pro Thr Asn Pro Ala Ser Ile Ser Asn
20 25 30
Val Ile Ser Asn Ala Val Ser Gln Ile Ser Ser Ser Asn Pro Gly Ala
35 40 45
Ser Ser Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Leu Val Thr Ala
50 55 60
Leu Leu Thr Ile Ile Gly Ser Ser Asn Val Gly Asn Val Asn Tyr Asp
65 70 75 80
Ser Ser Gly Gln Tyr Ala Gln Val Val Ser Gln Ser Val Gln Asn Ala
85 90 95
Phe Val
<210> 34
<211> 98
<212> PRT
<213> Latrodectus hesperus
<400> 34
Ser Ala Leu Ser Ala Pro Ala Thr Ser Ala Arg Ile Ser Ser His Ala
1 5 10 15
Ser Ala Leu Leu Ser Ser Gly Pro Thr Asn Pro Ala Ser Ile Ser Asn
20 25 30
Val Ile Ser Asn Ala Val Ser Gln Ile Ser Ser Ser Asn Pro Gly Ala
35 40 45
Ser Ala Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Leu Val Thr Ala
50 55 60
Leu Leu Thr Ile Ile Gly Ser Ser Asn Ile Gly Ser Val Asn Tyr Asp
65 70 75 80
Ser Ser Gly Gln Tyr Ala Gln Val Val Thr Gln Ser Val Gln Asn Val
85 90 95
Phe Gly
<210> 35
<211> 93
<212> PRT
<213> 赫氏粒突蛛(Macrothele holsti)
<400> 35
Ser His Leu Ser Ser Pro Glu Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ser Gly Gly Ser Thr Asn Ser Ala Ala Leu Pro Asn
20 25 30
Thr Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Ser Ser Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Ile His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asp Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Ala Thr Gln Ile Val Gly Gln Ser Ala
85 90
<210> 36
<211> 98
<212> PRT
<213> 棒络新妇蛛(Nephila clavipes)
<400> 36
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Gln Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ala Ser Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Leu Ser Ser
20 25 30
Thr Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Gly Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Ile Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Ile Gln Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Ala Thr Gln Ile Val Gly Gln Ser Val Tyr Gln Ala
85 90 95
Leu Gly
<210> 37
<211> 89
<212> PRT
<213> 斑络新妇蛛(Nephila pilipes)
<400> 37
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Glu Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Leu Ser Asn
20 25 30
Thr Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Ser Ser Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Ile His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Ala Thr Gln Ile Val
85
<210> 38
<211> 87
<212> PRT
<213> 马达加斯加络新妇蛛(Nephila madagascariensis)
<400> 38
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Gln Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ala Ser Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Leu Ser Ser
20 25 30
Thr Ile Ser Asn Ala Val Ser Gln Ile Gly Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Ile Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Ile His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Ala Thr Gln
85
<210> 39
<211> 87
<212> PRT
<213> 塞内加尔络新妇蛛(Nephila senegalensis)
<400> 39
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Glu Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Leu Ser Ser
20 25 30
Thr Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Gly Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Ile Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Val His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Ala Thr Gln
85
<210> 40
<211> 89
<212> PRT
<213> 变异涡蛛(Octonoba varians)
<400> 40
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Glu Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Leu Ser Asn
20 25 30
Thr Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Ser Ser Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Pro Ile His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Ala Thr Gln Ile Val
85
<210> 41
<211> 89
<212> PRT
<213> 中华缕网蛛(Psechrus sinensis)
<400> 41
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Glu Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Leu Pro Asn
20 25 30
Thr Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Ser Ser Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Ile His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Ala Thr Gln Ile Val
85
<210> 42
<211> 88
<212> PRT
<213> 考艾肖蛸(Tetragnatha kauaiensis)
<400> 42
Ser Leu Leu Ser Ser Pro Ala Ser Asn Ala Arg Ile Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Ala Leu Ala Ser Gly Ala Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Leu Ser Ser
20 25 30
Val Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Val Ser Ser Asn Ser Gly Gly Leu
35 40 45
Val Gly Cys Asp Thr Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Ala Ala Ala Ala
50 55 60
Leu Val His Val Leu Ala Ser Ser Ser Gly Gly Gln Val Asn Leu Asn
65 70 75 80
Thr Ala Gly Tyr Thr Ser Gln Leu
85
<210> 43
<211> 88
<212> PRT
<213> 多色肖蛸(Tetragnatha versicolor)
<400> 43
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ala Ser Asn Ala Arg Ile Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Ala Leu Ala Ser Gly Gly Ala Ser Ser Pro Gly Tyr Leu Ser Ser
20 25 30
Ile Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Val Ser Ser Asn Asn Asp Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Thr Val Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Ala Ala Ala
50 55 60
Leu Val His Val Leu Ala Ser Ser Asn Ile Gly Gln Val Asn Leu Asn
65 70 75 80
Thr Ala Gly Tyr Thr Ser Gln Leu
85
<210> 44
<211> 89
<212> PRT
<213> 双世纪圆蛛(Araneus bicentenarius)
<400> 44
Ser Arg Leu Ser Ser Ser Ala Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Ser Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Thr Pro Ala Ala Leu Ser Asn
20 25 30
Thr Ile Ser Ser Ala Val Ser Gln Ile Ser Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Val His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Val Gly Gln Ile Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ala Ser Ala Gln Tyr Ala Gln Met Val
85
<210> 45
<211> 97
<212> PRT
<213> 悦目金蛛(Argiope amoena)
<400> 45
Arg Leu Ser Ser Pro Gln Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val Ser
1 5 10 15
Thr Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Asn Pro Ala Ser Leu Ser Asn Ala
20 25 30
Ile Gly Ser Val Val Ser Gln Val Ser Ala Ser Asn Pro Gly Leu Pro
35 40 45
Ser Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Ile Val Ser Ala Leu
50 55 60
Val His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Ile Asn Tyr Ser Ala
65 70 75 80
Ser Ser Gln Tyr Ala Arg Leu Val Gly Gln Ser Ile Ala Gln Ala Leu
85 90 95
Gly
<210> 46
<211> 82
<212> PRT
<213> 蔽日蛛(Argiope aurantia)
<400> 46
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Gln Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Thr Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Asn Pro Ala Ala Leu Ser Asn
20 25 30
Ala Ile Ser Ser Val Val Ser Gln Val Ser Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Leu Val Ser Ala
50 55 60
Leu Val His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Ile Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Ala Ser
<210> 47
<211> 98
<212> PRT
<213> 三带金蛛(Argiope trifasciata)
<400> 47
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Gln Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Thr Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Asn Pro Ala Ser Leu Ser Asn
20 25 30
Ala Ile Ser Ser Val Val Ser Gln Val Ser Ser Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Ile Val Ser Ala
50 55 60
Leu Val His Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Ile Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Ala Ser Ser Gln Tyr Ala Gln Leu Val Gly Gln Ser Leu Thr Gln Ala
85 90 95
Leu Gly
<210> 48
<211> 89
<212> PRT
<213> 乳突棘腹蛛(Gasteracantha mammosa)
<400> 48
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Gln Ala Gly Ala Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Ala Leu Val Ala Ser Gly Pro Thr Ser Pro Ala Ala Val Ser Ser
20 25 30
Ala Ile Ser Asn Val Ala Ser Gln Ile Ser Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Ile Val Ser Ala
50 55 60
Leu Val Ser Ile Leu Ser Ser Ala Ser Ile Gly Gln Ile Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ala Ser Gly Gln Tyr Ala Ala Met Ile
85
<210> 49
<211> 90
<212> PRT
<213> 几何寇蛛(Latrodectus geometricus)
<400> 49
Ser Ala Leu Ser Ser Pro Thr Thr His Ala Arg Ile Ser Ser His Ala
1 5 10 15
Ser Thr Leu Leu Ser Ser Gly Pro Thr Asn Ser Ala Ala Ile Ser Asn
20 25 30
Val Ile Ser Asn Ala Val Ser Gln Val Ser Ala Ser Asn Pro Gly Ser
35 40 45
Ser Ser Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Leu Ile Thr Ala
50 55 60
Leu Ile Ser Ile Val Asp Ser Ser Asn Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ser Gly Gln Tyr Ala Gln Met Val Gly
85 90
<210> 50
<211> 98
<212> PRT
<213> Latrodectus hesperus
<400> 50
Ser Ala Leu Ser Ser Pro Thr Thr His Ala Arg Ile Ser Ser His Ala
1 5 10 15
Ser Thr Leu Leu Ser Ser Gly Pro Thr Asn Ala Ala Ala Leu Ser Asn
20 25 30
Val Ile Ser Asn Ala Val Ser Gln Val Ser Ala Ser Asn Pro Gly Ser
35 40 45
Ser Ser Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Ile Ile Thr Ala
50 55 60
Leu Ile Ser Ile Leu Asp Ser Ser Ser Val Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ser Gly Gln Tyr Ala Gln Ile Val Gly Gln Ser Met Gln Gln Ala
85 90 95
Met Gly
<210> 51
<211> 97
<212> PRT
<213> 棒络新妇蛛(Nephila clavipes)
<400> 51
Ser Arg Leu Ala Ser Pro Asp Ser Gly Ala Arg Val Ala Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Ser Ser Ala Ala Leu Ser Ser
20 25 30
Val Ile Ser Asn Ala Val Ser Gln Ile Gly Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Ile Gln Ala Leu Leu Glu Ile Val Ser Ala
50 55 60
Cys Val Thr Ile Leu Ser Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ala Ala Ser Gln Phe Ala Gln Val Val Gly Gln Ser Val Leu Ser Ala
85 90 95
Phe
<210> 52
<211> 82
<212> PRT
<213> 马达加斯加络新妇蛛(Nephila madagascariensis)
<400> 52
Ser Arg Leu Ala Ser Pro Asp Ser Gly Ala Arg Val Ala Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Ser Ser Ala Ala Leu Ser Ser
20 25 30
Val Ile Ser Asn Ala Val Ser Gln Ile Gly Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Ile Gln Ala Leu Leu Glu Ile Val Ser Ala
50 55 60
Cys Val Thr Ile Leu Ser Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ala Ala
<210> 53
<211> 82
<212> PRT
<213> 塞内加尔络新妇蛛(Nephila senegalensis)
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(56)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 53
Ser Arg Leu Ala Ser Pro Asp Ser Gly Ala Arg Val Ala Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Ser Ser Ala Ala Leu Ser Ser
20 25 30
Val Ile Xaa Asn Ala Val Ser Gln Ile Gly Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Ile Xaa Ala Leu Leu Glu Ile Val Ser Ala
50 55 60
Cys Val Thr Ile Leu Ser Ser Ser Ser Ile Gly Gln Val Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ala Ala
<210> 54
<211> 71
<212> PRT
<213> Dolomedes tenebrosus
<400> 54
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Glu Ala Ala Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Ser Leu Val Ser Asn Gly Gln Val Asn Val Asp Ala Leu Pro Ser
20 25 30
Ile Ile Ser Asn Leu Ser Ser Ser Ile Ser Ala Ser Ala Thr Thr Ala
35 40 45
Ser Asp Cys Glu Val Leu Val Gln Val Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Val Gln Ile Val Cys Ser
65 70
<210> 55
<211> 97
<212> PRT
<213> Dolomedes tenebrosus
<400> 55
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Gln Ala Ala Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Ser Leu Val Ser Asn Gly Gln Val Asn Val Ala Ala Leu Pro Ser
20 25 30
Ile Ile Ser Ser Leu Ser Ser Ser Ile Ser Ala Ser Ser Thr Ala Ala
35 40 45
Ser Asp Cys Glu Val Leu Val Gln Val Leu Leu Glu Ile Val Ser Ala
50 55 60
Leu Val Gln Ile Val Ser Ser Ala Asn Val Gly Tyr Ile Asn Pro Glu
65 70 75 80
Ala Ser Gly Ser Leu Asn Ala Val Gly Ser Ala Leu Ala Ala Ala Met
85 90 95
Gly
<210> 56
<211> 93
<212> PRT
<213> 十字园蛛(Araneus diadematus)
<400> 56
Asn Arg Leu Ser Ser Ala Gly Ala Ala Ser Arg Val Ser Ser Asn Val
1 5 10 15
Ala Ala Ile Ala Ser Ala Gly Ala Ala Ala Leu Pro Asn Val Ile Ser
20 25 30
Asn Ile Tyr Ser Gly Val Leu Ser Ser Gly Val Ser Ser Ser Glu Ala
35 40 45
Leu Ile Gln Ala Leu Leu Glu Val Ile Ser Ala Leu Ile His Val Leu
50 55 60
Gly Ser Ala Ser Ile Gly Asn Val Ser Ser Val Gly Val Asn Ser Ala
65 70 75 80
Leu Asn Ala Val Gln Asn Ala Val Gly Ala Tyr Ala Gly
85 90
<210> 57
<211> 98
<212> PRT
<213> 十字园蛛(Araneus diadematus)
<400> 57
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ser Ala Ala Ala Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Leu Val Ser Asn Gly Gly Pro Thr Ser Pro Ala Ala Leu Ser Ser
20 25 30
Ser Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Ser Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Ile Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Ile Ile Ser Ala
50 55 60
Leu Val His Ile Leu Gly Ser Ala Asn Ile Gly Pro Val Asn Ser Ser
65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Ser Ala Ser Ile Val Gly Gln Ser Val Tyr Arg Ala
85 90 95
Leu Ser
<210> 58
<211> 98
<212> PRT
<213> 十字园蛛(Araneus diadematus)
<400> 58
Ser Arg Leu Ser Ser Pro Ala Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Ser Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Lys His Ala Ala Leu Ser Asn
20 25 30
Thr Ile Ser Ser Val Val Ser Gln Val Ser Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
50 55 60
Leu Val Ser Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Ile Asn Tyr Gly
65 70 75 80
Ala Ser Ala Gln Tyr Thr Gln Met Val Gly Gln Ser Val Ala Gln Ala
85 90 95
Leu Ala
<210> 59
<211> 94
<212> PRT
<213> 十字园蛛(Araneus diadematus)
<400> 59
Ser Val Tyr Leu Arg Leu Gln Pro Arg Leu Glu Val Ser Ser Ala Val
1 5 10 15
Ser Ser Leu Val Ser Ser Gly Pro Thr Asn Gly Ala Ala Val Ser Gly
20 25 30
Ala Leu Asn Ser Leu Val Ser Gln Ile Ser Ala Ser Asn Pro Gly Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asp Ala Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Leu Val Ser Ala
50 55 60
Leu Val Ala Ile Leu Ser Ser Ala Ser Ile Gly Gln Val Asn Val Ser
65 70 75 80
Ser Val Ser Gln Ser Thr Gln Met Ile Ser Gln Ala Leu Ser
85 90
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 60
Ser Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Val
1 5 10

Claims (20)

1.一种重组融合蛋白，其包含蛛丝蛋白片段和对整联蛋白具有选择性的细胞结合基序，其中所述细胞结合基序包含氨基酸序列：
C1X1X2RGDX3X4X5C2
其中，
X1是S或T；
X2是G、A或V；
X3是S或T；
X4是G、A、V或P；以及
X5是G、A或V；以及
C1和C2通过二硫键连接；
并且其中，所述蛛丝蛋白片段包含蛋白部分REP和CT，其中
REP是70至300个氨基酸残基的重复片段，其选自L(AG)nL、L(AG)nAL、L(GA)nL和L(GA)nGL组成的组，其中
n是2至10的整数；
每个单独的A区段是8至18个氨基酸残基的氨基酸序列，其中0至3个氨基酸残基不是Ala，且其余的氨基酸残基是Ala；
每个单独的G区段是12至30个氨基酸残基的氨基酸序列，其中至少40％的氨基酸残基是Gly；以及
每个单独的L区段是0至30个氨基酸残基的接头氨基酸序列；以及
CT是70至120个氨基酸残基的片段，与SEQ ID NO:3具有至少70％的同一性。
2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中X2是G或A。
3.根据权利要求2所述的重组融合蛋白，其中X2是G。
4.根据前述权利要求中任一项所述的重组融合蛋白，其中X3是S。
5.根据前述权利要求中任一项所述的重组融合蛋白，其中X4是G或P。
6.根据权利要求5所述的重组融合蛋白，其中X4是P。
7.根据前述权利要求中任一项所述的重组融合蛋白，其中X5是G或A。
8.根据权利要求7所述的重组融合蛋白，其中X5是A。
9.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中，所述细胞结合基序包含氨基酸序列：CTGRGDSPAC(SEQ ID NO:10)。
10.根据前述权利要求中任一项所述的重组融合蛋白，其中所述细胞结合基序对α5β1整联蛋白具有选择性。
11.一种细胞支架材料，包含蛋白聚合物，所述蛋白聚合物含有权利要求1-10中任一项所述的重组融合蛋白作为重复单元。
12.根据权利要求11所述的细胞支架材料，其中所述蛋白聚合物为选自膜、涂层、泡沫、纤维和纤维网组成的组的物理形态。
13.根据权利要求11-12中任一项所述的细胞支架材料，其中所述蛋白聚合物为自支撑基质的物理形态。
14.一种细胞培养的方法，包括以下步骤：
-提供细胞样品；
-将所述样品加到细胞支架材料上；以及
-将其上施加有细胞的细胞支架材料保持在适于细胞培养的条件下；
其中，所述细胞支架材料包含蛋白聚合物，所述蛋白聚合物含有权利要求1-10中任一项所述的重组融合蛋白作为重复结构单元。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述细胞在其细胞表面上展示α5β1整联蛋白；并且，其中所述重组融合蛋白的细胞结合基序对α5β1整联蛋白具有选择性。
16.根据权利要求14-15中任一项所述的方法，其中所述细胞选自骨骼肌细胞、内皮细胞、干细胞、成纤维细胞、角质形成细胞及细胞系。
17.固定的重组融合蛋白用于培养在其细胞表面上展示整联蛋白的细胞的用途，所述固定的重组融合蛋白包含氨基酸序列：
C1X1X2RGDX3X4X5C2
其中，
X1是S或T；
X2是G、A或V；
X3是S或T；
X4是G、A、V或P；以及
X5是G、A或V；以及
C1和C2通过二硫键连接。
18.根据权利要求1-10中任一项所述的重组融合蛋白或者根据权利要求11-13中任一项所述的细胞支架材料用于培养在其细胞表面上展示整联蛋白的细胞的用途。
19.根据权利要求17-18中任一项所述的用途，其中所述细胞支架材料或所述重组蛋白的细胞结合基序对α5β1整联蛋白具有选择性；并且，其中所述细胞在其细胞表面上展示α5β1整联蛋白。
20.根据权利要求17-19中任一项的用途，其中所述细胞选自骨骼肌细胞、内皮细胞、干细胞、成纤维细胞、角质形成细胞及细胞系。
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