JP7029748B2

JP7029748B2 - 植毛品及びその製造方法

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Publication number: JP7029748B2
Application number: JP2018011516A
Authority: JP
Inventors: 昌己竹本; 秀雄平田; 基裕小嶋
Original assignee: Spiber Inc
Current assignee: Spiber Inc
Priority date: 2018-01-26
Filing date: 2018-01-26
Publication date: 2022-03-04
Anticipated expiration: 2038-01-26
Also published as: JP2021080305A; WO2019146761A1

Description

本発明は、植毛品及びその製造方法に関する。

樹脂製の基材の表面に、接着剤を介してパイル（短繊維）を付着させた製品は、植毛品とも呼ばれ、住宅業界、自動車業界等で内装に利用されている。植毛は、断熱、消音、乱反射防止、結露防止、摩擦制動等の目的で実施される。また、このような基材の表面にパイルを植毛する方法としては、静電植毛法、ファイバーコーティング法等が知られている。

静電植毛法は、接着剤を塗布した基材の表面にパイルを付着させる際、基材付近およびパイルを収容したパイル供給容器の上部に設置された電極に高電圧をかける。具体的には、下部のパイル供給容器内のパイルを電気力線で浮遊させて基材の表面に付着させる方法、パイルを基材の表面に向けてその上方から散布するように落下させて付着させる方法等が知られている。

ファイバーコーティング法では、接着剤を塗布した基材に向けて、パイルを散布ガンから吹き付けて植毛する方法である（例えば、特許文献１、２参照。）。ファイバーコーティング法で得られた植毛品は、パイルが基材の表面に対して傾斜した状態で植毛されている。

基板の表面に植毛する際に使用する接着剤と基板との相性がよくない場合には、一般的に、接着性向上剤（プライマー）が使用される（例えば、特許文献３）。

特開平０８－１１７６４６号公報特開２００４－１６９６６号公報特開２００５－２８８７４２号公報

しかしながら、従来、接着性向上剤を使用する場合には、基材に塗布した接着性向上剤を約３０分間乾燥させた後に、接着剤を塗布して植毛を実施する必要があり、植毛品を短時間で効率的に製造することが困難であるという問題点がある。

そこで、本発明の目的は、植毛品の製造方法において、作業時間を短縮可能な新たな接着性向上剤を提供することである。

本発明は、以下の［１］～［５］を提供する。
［１］クモ糸フィブロインを含む接着性向上剤。
［２］粉末状である、［１］に記載の接着性向上剤。
［３］基材、接着剤層、及び、上記基材と上記接着剤層の間に接着性向上剤を備え、上記接着性向上剤がクモ糸フィブロインを含み、上記接着剤層にパイルが植毛されている、植毛品。
［４］基材上に、クモ糸フィブロインを含む接着性向上剤を定着させる工程と、上記接着性向上剤の上に接着剤を塗布して接着剤層を形成する工程と、上記接着剤層にパイルを植毛する工程と、を含む、植毛品の製造方法。
［５］上記接着性向上剤を定着させる工程が、接着性向上剤を付着した基材を加熱加圧する工程を含む、［４］に記載の方法。

本発明によれば、植毛品の製造方法において、作業時間を短縮可能な新たな接着性向上剤を提供できる。また、本発明によれば、植毛品の製造方法における接着性向上剤の乾燥工程を省略することができ、より短時間で植毛品を製造できる。

本発明の第一実施形態は、クモ糸フィブロインを含む接着性向上剤である。

（クモ糸フィブロイン）
クモ糸フィブロインは、天然クモ糸タンパク質、及び天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチド（人工クモ糸タンパク質）からなる群より選ばれるクモ糸ポリペプチドを含有していてもよい。

天然クモ糸タンパク質としては、例えば、大吐糸管しおり糸タンパク質、横糸タンパク質、及び小瓶状腺タンパク質が挙げられる。大吐糸管しおり糸は、結晶領域と非晶領域（無定形領域とも言う。）からなる繰り返し領域を持つため、高い応力と伸縮性を併せ持つ。クモ糸の横糸は、結晶領域を持たず、非晶領域からなる繰り返し領域を持つという特徴を有する。横糸は、大吐糸管しおり糸に比べると応力は劣るが、高い伸縮性を持つ。

大吐糸管しおり糸タンパク質は、クモの大瓶状腺で産生され、強靭性に優れるという特徴を有する。大吐糸管しおり糸タンパク質としては、例えば、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する大瓶状腺スピドロインＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２、並びに二ワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来するＡＤＦ３及びＡＤＦ４が挙げられる。ＡＤＦ３は、ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つである。天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは、これらのしおり糸タンパク質に由来するポリペプチドであってもよい。ＡＤＦ３に由来するポリペプチドは、比較的合成し易く、また、強伸度及びタフネスの点で優れた特性を有する。

横糸タンパク質は、クモの鞭毛状腺（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍｇｌａｎｄ）で産生される。横糸タンパク質としては、例えばアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する鞭毛状絹タンパク質（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ）が挙げられる。

天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは、組換えクモ糸タンパク質であってよい。組換えクモ糸タンパク質としては、天然型クモ糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体等が挙げられる。このようなポリペプチドの好適な一例は、大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えクモ糸タンパク質（「大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチド」ともいう。）である。

フィブロイン様タンパク質である大吐糸管しおり糸由来のタンパク質としては、例えば、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。ここで、式１中、（Ａ）_ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、ｎは２～２０、好ましくは４～２０、より好ましくは８～２０、更に好ましくは１０～２０、更により好ましくは４～１６、更によりまた好ましくは８～１６、特に好ましくは１０～１６の整数であってよい。また（Ａ）_ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることが更に好ましく、９０％以上であることが更により好ましく、１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ＲＥＰは２～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは２～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）_ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。大吐糸管しおり糸由来のタンパク質の具体例としては、配列番号１及び配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。

横糸タンパク質に由来するタンパク質としては、例えば、式２：［ＲＥＰ２］_ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式２中、ＲＥＰ２はＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｘから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘはアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選ばれる一つのアミノ酸を示す。ｏは８～３００の整数を示す。）を挙げることができる。具体的には配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号３で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分的な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＦ３６０９０、ＧＩ：７１０６２２４）のリピート部分及びモチーフに該当するＮ末端から１２２０残基目から１６５９残基目までのアミノ酸配列（ＰＲ１配列と記す。）と、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ３８８４７、ＧＩ：２８３３６４９）のＣ末端から８１６残基目から９０７残基目までのＣ末端アミノ酸配列を結合し、結合した配列のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びヒンジ配列からなるアミノ酸配列が付加されたものである。

クモ糸フィブロイン、すなわちクモ糸フィブロインに主成分として含まれるタンパク質は、例えば、当該タンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。

クモ糸フィブロインに主成分として含まれるタンパク質をコードする核酸の製造方法は、特に制限されない。例えば、天然の構造タンパク質をコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングする方法、又は、化学的に合成する方法によって、当該核酸を製造することができる。核酸の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した構造タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔｐｌｕｓ１０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製及び／又は確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸を合成してもよい。

調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、目的とするタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。

発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、目的とするタンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。

宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。

原核生物の宿主の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ等を挙げることができる。ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ等を挙げることができる。セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス等を挙げることができる。バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス等を挙げることができる。ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等を挙げることができる。ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム等を挙げることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス等を挙げることができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ等を挙げることができる。

原核生物を宿主とする場合、目的タンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（例えば、特開２００２－２３８５６９号公報を参照）等を挙げることができる。

真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。

真核生物を宿主とする場合、目的タンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。

発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。

タンパク質は、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。

宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。

炭素源としては、上記形質転換微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。

大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５～４０℃である。培養時間は、通常１６時間～７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０～９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。

また、培養中、必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。

発現させたタンパク質の単離、精製は通常用いられている方法で行うことができる。例えば、当該タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮＨＰＡ－７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。

また、タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてタンパク質の不溶体を回収する。回収したタンパク質の不溶体はタンパク質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法によりタンパク質の精製標品を得ることができる。当該タンパク質が細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該タンパク質を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、その培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。

クモ糸フィブロインは、粉末状（凍結乾燥粉末等）、又は繊維状（紡糸して得られる繊維等）のいずれであってもよい。粉末状のクモ糸フィブロインは、用途に応じたメッシュサイズの篩いを用いて、適切な粒子径を有する粉末を選別してもよい。

接着性向上剤は、クモ糸フィブロインのみからなっていてもよく、任意の添加剤を加えた組成物であってもよい。任意の添加剤としては、例えば、クモ糸フィブロインの安定化剤、溶剤、他のフィブロインが挙げられる。

溶剤は、クモ糸フィブロインを分散又は溶解できるものであればよく、基材の表面全体にわたってより均一に塗布又は散布させることができる成分である。溶剤としては、例えば、エタノール、メタノール等の第一級アルコール、２－プロパノール等の第二級アルコール、ｔｅｒｔ－ブチルアルコール等の第三級アルコール、アセトン、メチルエチルケトン、ジクロロメタンが挙げられる。

他のフィブロインは、例えば、絹フィブロイン、及びホーネットシルクフィブロインからなる群より選択される１種以上であってよい。クモ糸フィブロインと他のフィブロインを併用する場合、他のフィブロインの割合は、例えば、クモ糸フィブロイン１００質量部に対して、４０質量部以下、３０質量部以下、又は１０質量部以下であってよい。

絹糸は、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）の幼虫である蚕の作る繭から得られる繊維（繭糸）である。一般に、１本の繭糸は、２本の絹フィブロインと、これらを外側から覆うニカワ質（セリシン）とから構成される。絹フィブロインは、多数のフィブリルで構成される。絹フィブロインは、４層のセリシンで覆われる。実用的には、精錬により外側のセリシンを溶解して取り除いて得られる絹フィラメントが、衣料用途に使用されている。一般的な絹糸は、１．３３の比重、平均３．３ｄｅｃｉｔｅｘの繊度、及び１３００～１５００ｍ程度の繊維長を有する。絹フィブロインは、天然若しくは家蚕の繭、又は中古若しくは廃棄のシルク生地を原料として得られる。

絹フィブロインは、セリシン除去絹フィブロイン、セリシン未除去絹フィブロイン、又はこれらの組み合わせであってもよい。セリシン除去絹フィブロインは、絹フィブロインを覆うセリシン、及びその他の脂肪分などを除去して精製したものである。このようにして精製した絹フィブロインは、好ましくは、凍結乾燥粉末として用いられる。セリシン未除去絹フィブロインは、セリシンなどが除去されていない未精製の絹フィブロインである。

接着性向上剤は、粉末状であってもよい。接着性向上剤が粉末状である場合、粉末状のクモ糸フィブロインのみからなっていてもよく、粉末状の添加剤を加えた組成物であってもよい。粉末状の接着性向上剤であると、手作業で散布することにより基材の表面に付着させることができ、その使用量を容易に調節することも可能である。

接着性向上剤は、繊維状であってもよい。接着性向上剤が繊維状である場合、繊維状のクモ糸フィブロインのみからなっていてもよい。繊維状の接着性向上剤であると、基材の表面に途切れることなく連続して接着性向上剤を配置することが可能である。

（植毛品の製造方法）
本発明の第二実施形態は、植毛品の製造方法である。本実施形態に係る植毛品の製造方法は、基材上に接着性向上剤を定着させる工程と、定着した接着性向上剤の上に接着剤を塗布する工程と、塗布した接着剤の上に植毛を施す工程と、を含む。

基材の材質は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアミド、ＡＢＳ樹脂（アクリロニトリル、ブタジエン、スチレン共重合合成樹脂）等の熱可塑性樹脂；フェノール樹脂、尿素樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂等の熱硬化性樹脂；金属、ゴム又はセラミックであってもよい。また、基材は、繊維、繊維から作製した織布、不織布又は編布であってもよい。

植毛に使用されるパイルは、一般的に当業界で知られているものであればよく、例えば、ナイロン、ポリエステル製のパイルであってもよい。パイルの長さは、０．１～１０ｍｍ、０．０１～１００ｍｍ、０．０２～５０ｍｍ、０．０５～３０ｍｍ、０．１～１０ｍｍ、０．３～５ｍｍ、０．５～３ｍｍ、又は０．０８～２ｍｍであってもよい。パイルの繊度は、０．１～１０デシテックス、０．０１～１００デシテックス、０．０５～５０デシテックス、０．１～３０デシテックス、０．５～２０デシテックス、１～１０デシテックス、２～７デシテックス、又は２～４デシテックスであってもよい。

基材上に接着性向上剤を定着させる工程は、接着性向上剤を基材の表面上に付着させた後に、加熱加圧することにより、基材の表面上に接着性向上剤を定着させる工程である。接着性向上剤は、基材の表面に向けて上空から散布してもよく、刷毛やスプレーを用いて配置してもよい。その後、プレス機を用いて加熱条件下、接着性向上剤が付着した基材を加圧することにより実施される。加熱加圧する時間は、１０秒～５分、１５秒～１分、又は２０秒～４０秒であってもよい。接着性向上剤は、基材の表面（植毛される領域）の少なくとも５０％の範囲に定着されていればよい。接着性向上剤は、基材の表面の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の範囲に形成されていることが好ましく、基材の表面全面（植毛される領域）にわたって接着性向上剤層を形成していることがより好ましい。

接着性向上剤の付着量は、２５～１５０ｇ／ｍ^２であってもよい。

定着した接着性向上剤の上に接着剤を塗布する工程は、基材上に定着した接着性向上剤の上に、接着剤を塗布して接着剤層を形成させる工程である。

接着剤は、一般的に当業界で知られているものであればよく、例えば、ゴム系接着剤、エポキシ系接着剤、アクリル系接着剤、ウレタン系接着剤、又はシリコン系接着剤であってもよい。また、接着剤は、湿気硬化性１液型接着剤、２液混合型接着剤、エマルジョン型接着剤、又はホットメルト型接着剤であってもよい。

塗布した接着剤の上に植毛を施す工程は、前工程で形成された接着剤層に、植毛方法により、パイルを接着させる工程である。植毛方法は、一般的に当業界で知られている方法であってよく、静電植毛法、又はファイバーコーティング法であってもよい。

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

１．クモ糸フィブロイン（ＰＲＴ４１０）の製造
（１）構造タンパク質発現株の作製
ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する組換えフィブロイン（以下、「ＰＲＴ４１０」ともいう。）を設計した。

配列番号１で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列を有し、さらにＮ末端に配列番号４で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加されている。

次に、ＰＲＴ４１０をコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイトを、終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）に組み換えて発現ベクターを得た。

（２）タンパク質の発現
ＰＲＴ４１０をコードする核酸を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換された大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表１）に、ＯＤ_６００が０．００５となるように添加した。培養液の温度を３０℃に保ち、ＯＤ_６００が５になるまでフラスコ内で培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。

当該シード培養液を５００ｍＬの生産培地（表２）を添加したジャーファーメンターに、ＯＤ_６００が０．０５となるように添加した。培養液の温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。なお、消泡剤として、アデカノールＬＧ－２９５Ｓ（（株）ＡＤＥＫＡ製）を使用した。

生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ１２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）水溶液を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のタンパク質（ＰＲＴ４１０）を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存したＰＲＴ４１０に相当するサイズのバンドの出現により、ＰＲＴ４１０の発現を確認した。

（３）構造タンパク質の精製
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡＮｉｒｏＳｏａｖｉ社製）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍグアニジン緩衝液（８Ｍグアニジン塩酸塩、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質（ＰＲＴ４１０）を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。

３．植毛品の製造
以下のとおり、実施例１、比較例１及び２の植毛品を製造した。

実施例１
（１）基材の製造
ポリプロピレン（ＰＰ）（製品名：ＡＺ８６４、住友化学（株）製）を射出成形して得た板（厚さ：３ｍｍ）を７４ｍｍ×７４ｍｍの大きさに裁断し、基材を得た。
（２）接着性向上剤の定着
得られた基材上に、クモ糸フィブロインＰＲＴ４１０（６４ｇ／ｍ^２に相当する０．３５ｇ）を１００メッシュの篩いを用いて付着させた。その後、プレス機（商品名：Ｈ３００－０１、アズワン（株）製）を用いて、１８０℃（型の温度：１３０℃（実測値））、２５ｋｇ／ｃｍ^２で３０秒間加熱加圧して、クモ糸フィブロインを基材の表面に定着させ、室温に冷却した。
（３）接着剤層の形成
得られた基材のクモ糸フィブロインＰＲＴ４１０を定着させた面に、接着剤（商品名：ヨドゾールＡＡ７６Ｓ、ヘンケルジャパン（株）製）をエアースプレーガンを用いて、膜厚が２００μｍとなるように塗布した。
（４）植毛層の形成
簡易静電植毛実験装置（商品名：ＧＴ１００、（株）グリーンテクノ製）を用いて、出力電圧２００００Ｖの条件下、ナイロンパイル（太さ：３．３デシテックス、長さ：１ｍｍ、（株）中部パイル工業所製）を接着剤層に植毛した。植毛後、８０℃の乾燥炉内で３０分間、接着剤を乾燥させ、パイルが２００ｇ／ｍ^２で植毛された植毛品を得た。

比較例１
接着性向上剤を定着させる工程以外は、実施例１と同様にして、比較例１の植毛品を製造した。比較例１では、クモ糸フィブロインの加熱加圧による定着に代えて、エアスプレーガンを用いて、プライマー（商品名：ヨドゾール６５Ｋ２Ｋ、ヘンケルジャパン（株）製）を膜厚１０μｍ以下となるように塗布した後、８０℃の乾燥炉内で３０分間、プライマーを乾燥させた。

比較例２
接着性向上剤を定着させる工程を実施しなかったこと以外は、実施例１と同様にして、比較例２の植毛品を製造した。

４．接着性の評価
接着性の評価は、ＪＩＳＤ０２０２：１９８８（自動車部品の塗膜通則の碁盤目付着性試験）及びＪＩＳＫ５６００－５－６：１９９９（付着性（クロスカット法））に記載の方法に準拠して実施した。
得られた実施例１、比較例１及び２の各植毛品に、カッターナイフで縦横１１本ずつの切込みを施し、２ｍｍ×２ｍｍのマス目を１００個形成させた。その後、植毛されたパイルにセロハン粘着テープを貼り、一気に引っ張り、剥離させた。そのとき、接着剤層が剥離したマス目の数を計数した。

結果を表３に示す。実施例１と比較例１では、接着剤層が剥離したマス目の数が同程度であったことから、実施例１は比較例１と同程度の接着性向上効果を有することが明らかとなった。また、プライマーを備えていない比較例２では、カッターナイフで切り込みを施した時点で、ほとんどの接着剤層が剥離した。

Claims

クモ糸フィブロインを含む接着性向上剤。
粉末状である、請求項１に記載の接着性向上剤。
基材、接着剤層、及び、前記基材と前記接着剤層の間に接着性向上剤を備え、
前記接着性向上剤がクモ糸フィブロインを含み、
前記接着剤層にパイルが植毛されている、植毛品。
基材上に、クモ糸フィブロインを含む接着性向上剤を定着させる工程と、
前記接着性向上剤の上に接着剤を塗布して接着剤層を形成する工程と、
前記接着剤層にパイルを植毛する工程と、を含む、植毛品の製造方法。
前記接着性向上剤を定着させる工程が、接着性向上剤を付着した基材を加熱加圧する工程を含む、請求項４に記載の方法。