WO2018043698A1 - モールド成形体及びモールド成形体の製造方法 - Google Patents

モールド成形体及びモールド成形体の製造方法 Download PDF

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protein
seq
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伸治 平井
幸政 生方
あゆみ 安部
浩一 小鷹
有希 中山
純一 野場
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Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
テクノハマ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a molded article and a method for producing the molded article.
  • Patent Document 1 exhibits a reinforcing effect by containing fibers (reinforced fibers) in the matrix resin, and it is difficult to achieve high strength with the matrix resin itself. It was. Moreover, the molded object exceeding a bending elastic modulus 4.5GPa was not able to be obtained with biodegradable material.
  • an object of the present invention is to provide a biodegradable molded article that exhibits excellent bending elastic modulus and bending strength, and a method for producing the same.
  • the present invention provides the following [1] to [9].
  • Step 1 of adding water to a composition containing a structural protein Step 2 of molding the water-containing composition obtained in Step 1, and drying the molding composition obtained in Step 2 to form a molded product
  • a process for producing a molded article comprising: [2] The method according to [1], wherein the step 2 includes heating and pressing.
  • the structural protein includes a spider silk protein or a recombinant polypeptide thereof.
  • the molded article according to [5] which is a heat and pressure molded article.
  • the molded article according to any one of [5] to [7] which has a bending strength of 140 MPa or more.
  • the molded article is biodegradable, and is characterized by using a structural protein and / or a recombinant polypeptide thereof as a raw material, and molding the raw material. Due to these characteristics, the molded article exhibits a very high flexural modulus (for example, more than 6.9 GPa) without using additive materials such as reinforcing fibers. Furthermore, since it is possible to impart transparency to the molded product, it can be used in comparison with resins such as phenol resin and polyetheretherketone (PEEK) that have high strength but lack transparency. There is an advantage that increases significantly. In addition, since structural proteins can be modified in various ways, it is possible to easily optimize performance according to the end use.
  • PEEK polyetheretherketone
  • the said molded object means what was shape
  • a biodegradable molded article that exhibits an excellent bending elastic modulus and bending strength without using an additive material such as a reinforcing fiber, and a method for producing the same.
  • FIG. 1 It is a schematic cross section of a pressure molding machine.
  • A is a schematic cross-sectional view of a pressure molding machine before introduction of the composition, (b) immediately after introduction of the composition, and (c), a state in which the composition is heated and pressurized.
  • the molded article according to the present embodiment is obtained by introducing a composition containing a structural protein into a mold (mold) and performing a molding process or the like.
  • the structural protein is a protein having a role of constructing a biological structure, and is different from functional proteins such as enzymes, hormones, and antibodies.
  • Examples of the structural protein include naturally occurring structural proteins such as fibroin, collagen, resilin, elastin and keratin that exist in nature. Fibroin produced by insects and spiders is known as a naturally occurring fibroin.
  • the structural protein preferably includes a spider silk protein.
  • fibroin produced by insects include, for example, Bombyx mori, Kwako (Bombyx mandaraina), Tengea (Antherea yamanai), ⁇ ⁇ (Antereaperyi), ⁇ ⁇ (Eriothyraminey) ), Silkworms (Samia cythia), chestnut worms (Caligula japonica), Chussa moth (Anthereaea mylitta), silkworms produced by silkworms such as Antheraea assamata, vespasam worms Examples include silk proteins.
  • fibroin produced by insects include silkworm fibroin L chain (GenBank accession number M76430 (base sequence), AAA27840.1 (amino acid sequence)).
  • Spider silk protein is a large toughened spider protein (MaSp) having a high toughness, a small toroidal spider protein (minor ampule spider protein, MiSp), and a whip according to the source organ.
  • MoSp toughened spider protein
  • MiSp small toroidal spider protein
  • Flagellform (Flag) tubular, aggregate, aggregate, aciform and piriform spider silk proteins are named.
  • Fibroin produced by spiders includes, for example, spiders belonging to the genus spider (Araneus spp.) Such as the spider spider, the spider spider, the red spider spider, and the bean spider, the genus spiders of the genus Araneus, the spider spider spider, the spider spider genus e Spiders, spiders such as spiders, spiders belonging to the genus Spider, spiders belonging to the genus Pronos, spiders belonging to the genus Trinofunda, such as Torinofundamas (genus Cyrtarachne) Spiders belonging to the genus (Gasteracantha), spiders belonging to the genus Spider (Ordgarius genus), such as the spiders, the spiders, and the spiders belonging to the genus Ordgarius Spiders belonging to the genus Argiope, such as the genus Argiope, spiders belonging to the genus Arachnura, such as the white-tailed spider, spiders belonging to the
  • Spiders belonging to the genus Azumigumi (Menosira), spiders belonging to the genus Dyschiriognatha (genus Dyschiriognatha) such as the common spider spider, the black spider spider, the genus Spider genus belonging to the genus Spider belonging to the genus (L) and the genus Spider belonging to the genus (L) Produced by spiders belonging to the family Tetragnathidae such as spiders belonging to the genus Prostenops
  • Examples include spider silk protein.
  • the spider silk protein include dragline proteins such as MaSp (MaSp1 and MaSp2) and ADF (ADF3 and ADF4), MiSp (MiSp1 and MiSp2), and the like.
  • fibroin produced by spiders include, for example, fibroin-3 (adf-3) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession numbers AAC47010 (amino acid sequence), U47855 (base sequence)), fibroin- 4 (adf-4) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession number AAC47011 (amino acid sequence), U47856 (base sequence)), dragline silk protein spidolin 1 [derived from Nephila clavipes (GenBank accession number AAC4, amino acid sequence A04) U37520 (base sequence)), major angul11ate spidroin 1 [La rodectus hesperus origin] (GenBank accession number ABR68856 (amino acid sequence), EF595246 (base sequence)), dragline silk protein spidroin 2 [Nephila clavata origin] (GenBank accession number AAL32447, amino acid sequence 45, amino acid sequence) major
  • Naturally derived fibroin include fibroin whose sequence information is registered in NCBI GenBank.
  • sequence information is registered in NCBI GenBank.
  • spidin, sample, fibroin, “silk and polypeptide”, or “silk and protein” is described as a keyword in DEFINITION from sequences including INV as DIVISION among the sequence information registered in NCBI GenBank. It can be confirmed by extracting a character string of a specific product from the sequence, CDS, and a sequence in which the specific character string is described from SOURCE to TISSUE TYPE.
  • the structural protein may be a polypeptide derived from the natural structural protein, that is, a recombinant polypeptide.
  • recombinant fibroin is produced in several heterologous protein production systems, and as a production method thereof, a transgenic goat, a transgenic silkworm, or a recombinant plant or mammalian cell is used (non-patented). Reference 2).
  • Recombinant fibroin can be obtained, for example, by deleting one or more of the sequences encoding the (A) n motif from the cloned gene sequence of naturally occurring fibroin.
  • an amino acid sequence corresponding to the deletion of one or more (A) n motifs from the amino acid sequence of naturally derived fibroin is designed, and a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence is chemically synthesized. You can also.
  • one or more amino acid residues are further substituted, deleted, inserted and / or added. The amino acid sequence corresponding to this may be modified.
  • substitution, deletion, insertion and / or addition of amino acid residues can be carried out by methods well known to those skilled in the art such as partial-directed mutagenesis. Specifically, Nucleic Acid Res. 10, 6487 (1982), Methods in Enzymology, 100, 448 (1983), and the like.
  • Recombinant polypeptide of a large sputum dragline protein is, for example, a protein comprising a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m (where, in Formula 1, (A) n The motif represents an amino acid sequence composed of 4 to 20 amino acid residues, and (A) the number of alanine residues relative to the total number of amino acid residues in the n motif is 80% or more, and REP is 10 to 200 amino acid residues. M represents an integer of 8 to 300.
  • a plurality of (A) n motifs may be the same amino acid sequence or different amino acid sequences. It may be the same amino acid sequence or a different amino acid sequence.
  • a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 can be mentioned.
  • a protein comprising a domain sequence represented by Formula 2: [REP2] o (where, in Formula 2, o represents an integer of 5 to 300.
  • REP2 represents Gly-X -Y represents an amino acid sequence composed of Y, and X and Y represent any amino acid residue other than Gly.
  • Specific examples include a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 corresponds to the repeat part and motif of the partial sequence of human collagen type 4 (NCBI Genbank accession number: CAA56335.1, GI: 3702452) obtained from the NCBI database.
  • An amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (tag sequence and hinge sequence) is added to the N-terminal of the amino acid sequence from the 301st residue to the 540th residue.
  • REP3 As a recombinant polypeptide of resilin, for example, a protein comprising a domain sequence represented by Formula 3: [REP3] p (wherein, in Formula 3, p represents an integer of 4 to 300.
  • REP3 is Ser-J- An amino acid sequence composed of J-Tyr-Gly-U-Pro, wherein J represents an arbitrary amino acid residue, and is particularly preferably an amino acid residue selected from the group consisting of Asp, Ser, and Thr. Represents any amino acid residue, and is particularly preferably an amino acid residue selected from the group consisting of Pro, Ala, Thr, and Ser.
  • Plural REP3s may have the same or different amino acid sequences. Good).
  • Specific examples include a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 is the amino acid sequence of resilin (NCBI Genbank accession number NP 61157, Gl: 24654243), in which Thr at the 87th residue is replaced with Ser, and the Asn at the 95th residue.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (tag sequence and hinge sequence) is added to the N-terminal of the amino acid sequence from the 19th residue to the 321st residue of the sequence in which is replaced with Asp.
  • Examples of recombinant polypeptides of elastin include proteins having amino acid sequences such as NCBI Genbank accession numbers AAC98395 (human), I47076 (sheep), and NP786966 (bovine). Specific examples include a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 at the N-terminus of the amino acid sequence of residues 121 to 390 of the amino acid sequence of NCBI Genbank accession number AAC98395 (tag sequence). And a hinge arrangement).
  • Examples of the keratin recombinant polypeptide include Capra hircus type I keratin. Specific examples include a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 (amino acid sequence of NCBI Genbank accession number ACY30466).
  • the recombinant polypeptide is (i) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 10, or (ii) 90% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 10. It may be a recombinant fibroin containing an amino acid sequence having the following sequence identity.
  • a recombinant fibroin comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 10 will be described.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is separated from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 corresponding to naturally-occurring fibroin (corresponding to naturally-occurring fibroin) every two from the N-terminal side to the C-terminal side ( A)
  • the n motif is deleted, and one [(A) n motif-REP] is inserted before the C-terminal sequence.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is obtained by substituting all GGX in REP of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 with GQX.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 has two alanine residues inserted in the C-terminal side of each (A) n motif of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and a part of glutamine (Q) residues. Substituted with a serine (S) residue and a part of the amino acid at the N-terminal side is deleted so as to be almost the same as the molecular weight of SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is obtained by substituting all GGX in REP of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with GQX.
  • a recombinant fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 10 will be described.
  • the recombinant fibroin includes an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 10.
  • Recombinant fibroin is also a protein comprising a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the above-mentioned recombinant fibroin may contain a tag sequence at one or both of the N-terminal and C-terminal. This makes it possible to isolate, immobilize, detect and visualize recombinant fibroin.
  • tag sequences include affinity tags that use specific affinity (binding property, affinity) with other molecules.
  • affinity tag include a histidine tag (His tag).
  • His tag is a short peptide in which about 4 to 10 histidine residues are arranged, and has a property of specifically binding to a metal ion such as nickel. Therefore, a single tag of recombinant fibroin by metal chelating chromatography (chelating metal chromatography) is used. It can be used for separation.
  • Specific examples of the tag sequence include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (amino acid sequence containing a His tag).
  • GST glutathione-S-transferase
  • MBP maltose-binding protein
  • an “epitope tag” using an antigen-antibody reaction can also be used.
  • a peptide (epitope) exhibiting antigenicity as a tag sequence, an antibody against the epitope can be bound.
  • the epitope tag HA (peptide sequence of hemagglutinin of influenza virus) tag, myc tag, FLAG tag and the like can be mentioned.
  • recombinant fibroin can be easily purified with high specificity.
  • a tag sequence that can be separated with a specific protease can also be used.
  • Recombinant fibroin from which the tag sequence has been cleaved can also be recovered by treating the protein adsorbed via the tag sequence with a protease.
  • recombinant fibroin comprising a tag sequence, (iii) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, or (iv) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 And recombinant fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by
  • the recombinant polypeptide comprises (iii) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, or (iv) 90% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11. It may be a recombinant fibroin containing an amino acid sequence having the following sequence identity.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 9 and 11 are the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 5 at the N-terminus of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 and 10 (His tag). Is added).
  • Recombinant fibroin is also a protein comprising a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the structural protein preferably contains a recombinant polypeptide.
  • a recombinant polypeptide By including a recombinant polypeptide as a structural protein, it is possible to adjust the bending elastic modulus, bending strength, and hardness of the obtained molded product to desired numerical values.
  • the method for producing the recombinant polypeptide is described in detail below.
  • the target recombinant polypeptide can be obtained, for example, by a host transformed with an expression vector having a gene sequence encoding a structural protein and one or more regulatory sequences operably linked to the gene sequence. It can be produced by expressing a gene.
  • the method for producing the gene encoding the desired recombinant polypeptide is not particularly limited.
  • a gene encoding a natural structural protein can be used to produce the gene by a method of amplification and cloning by polymerase chain reaction (PCR) or the like, or chemical synthesis.
  • the method for chemically synthesizing the gene is not particularly limited.
  • AKTA oligopilot plus 10/100 manufactured by GE Healthcare Japan Co., Ltd.
  • a gene can be chemically synthesized by a method of linking oligonucleotides automatically synthesized by PCR or the like.
  • a gene encoding a polypeptide in which an amino acid sequence consisting of a start codon and a His10 tag is added to the N-terminus of the above amino acid sequence may be synthesized.
  • Regulatory sequences are sequences that control the expression of recombinant proteins in the host (for example, promoters, enhancers, ribosome binding sequences, transcription termination sequences, etc.), and can be appropriately selected depending on the type of host.
  • an inducible promoter that functions in a host cell and can induce expression of a target protein may be used.
  • An inducible promoter is a promoter that can control transcription by the presence of an inducer (expression inducer), absence of a repressor molecule, or physical factors such as an increase or decrease in temperature, osmotic pressure or pH value.
  • the type of expression vector can be appropriately selected according to the type of host, such as a plasmid vector, virus vector, cosmid vector, fosmid vector, artificial chromosome vector, and the like.
  • Suitable expression vectors are those that can replicate autonomously in the host cell or can be integrated into the host chromosome and contain a promoter at a position where the gene encoding the desired recombinant polypeptide can be transcribed. Used for.
  • any of prokaryotes and eukaryotes such as yeast, filamentous fungi, insect cells, animal cells and plant cells can be preferably used.
  • prokaryotes include bacteria belonging to the genus Escherichia, Brevibacillus, Serratia, Bacillus, Microbacterium, Brevibacterium, Corynebacterium, Pseudomonas and the like.
  • vectors for introducing a gene encoding a desired recombinant polypeptide include pBTrp2 (manufactured by Boehringer Mannheim), pGEX (manufactured by Pharmacia), pUC18, pBluescriptII, pSupex, pET22b, pCold, pUB110, pNCO2 (special And the like.
  • Examples of eukaryotic hosts include yeast and filamentous fungi (molds, etc.).
  • yeast examples include yeasts belonging to the genus Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces and the like.
  • filamentous fungi examples include filamentous fungi belonging to the genus Aspergillus, the genus Penicillium, the genus Trichoderma and the like.
  • vectors examples include YEP13 (ATCC 37115) and YEp24 (ATCC 37051).
  • Any method can be used for introducing an expression vector into the host cell as long as it is a method for introducing DNA into the host cell.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], electroporation method, spheroplast method, protoplast method, lithium acetate method, competent method, and the like.
  • the target recombinant polypeptide can be obtained, for example, by culturing a host transformed with the expression vector of the present invention in a culture medium, producing and accumulating the protein in the culture medium, and collecting the protein from the culture medium. Can be manufactured.
  • the method of culturing the host according to the present invention in a culture medium can be performed according to a method usually used for culturing a host.
  • the host culture medium according to the present invention contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the host. Any natural or synthetic medium may be used as long as the medium can efficiently culture the host.
  • Any carbon source may be used as long as it can be assimilated by the above-mentioned transformed microorganism.
  • Examples thereof include glucose, fructose, sucrose, and carbohydrates such as molasses, starch and starch hydrolyzate, acetic acid and propionic acid, etc.
  • Organic acids and alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • nitrogen source examples include ammonium salts of inorganic acids or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digested products thereof can be used.
  • inorganic acids or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digested products thereof can be used.
  • inorganic salts examples include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
  • Cultivation of prokaryotes such as E. coli or eukaryotes such as yeast can be performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration and agitation culture.
  • the culture temperature is, for example, 15 to 40 ° C.
  • the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH of the culture medium during the culture is preferably maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH of the culture medium can be adjusted using an inorganic acid, an organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the culture medium as needed during the culture.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside is used when cultivating a microorganism transformed with an expression vector using the lac promoter
  • indole acrylic is used when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the trp promoter.
  • An acid or the like may be added to the medium.
  • the recombinant polypeptide according to the present invention can be isolated and purified by a method usually used for protein isolation and purification.
  • a method usually used for protein isolation and purification For example, when the recombinant polypeptide is expressed in a dissolved state in the cell, the host cell is recovered by centrifugation after culturing and suspended in an aqueous buffer, followed by an ultrasonic crusher, a French press. Then, the host cells are disrupted with a Manton Gaurin homogenizer, dynomill, or the like to obtain a cell-free extract. From the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, a purified preparation can be obtained by using methods commonly used for protein isolation and purification alone or in combination.
  • Examples of such methods include solvent extraction methods, salting-out methods using ammonium sulfate, desalting methods, precipitation methods using organic solvents, resins such as diethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Kasei Co., Ltd.), etc.
  • Anion exchange chromatography method used cation exchange chromatography method using resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia), hydrophobic chromatography method using resin such as butyl sepharose, phenyl sepharose, molecular sieve
  • Examples thereof include gel filtration methods, affinity chromatography methods, chromatofocusing methods, and electrophoresis methods such as isoelectric focusing.
  • the host cell when the recombinant polypeptide is expressed in the form of an insoluble substance in the cell, the host cell is similarly recovered, crushed, and centrifuged to obtain an insoluble recombinant polypeptide as a precipitate fraction. Recover.
  • the recovered recombinant polypeptide insoluble matter can be solubilized with a protein denaturant. After the operation, a purified product of the recombinant polypeptide can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the recombinant polypeptide When the recombinant polypeptide is secreted outside the cell, the recombinant polypeptide can be recovered from the culture supernatant. That is, a culture supernatant is obtained by treating the culture with a technique such as centrifugation, and a purified preparation can be obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above.
  • the method for producing a molded body includes a step 1 of adding water to a composition containing a structural protein, a step 2 of introducing the water-containing composition obtained in step 1 into a mold (mold), and molding the mold.
  • Step 3 includes drying the molding composition obtained in Step 2 to obtain a molded product.
  • Step 1 is a step of adding water to the composition containing the structural protein.
  • the composition only needs to contain a structural protein.
  • the composition may be a structural protein alone or may contain a structural protein and optional additive components (for example, a plasticizer, a colorant, a filler, a synthetic resin, etc.).
  • the content of the additive component is preferably 50% by mass or less of the total amount of structural proteins.
  • the composition typically has a powdery shape (such as freeze-dried powder) or a fibrous shape (fibers obtained by spinning, etc.), and the molded article contains a structural protein of such shape. It can be a fused body of the composition.
  • the amount of water added in step 1 is preferably 10 to 40 wt%, more preferably 20 to 30 wt%, based on the mass of the structural protein.
  • Step 2 is a step in which the water-containing composition obtained in Step 1 above is introduced into a mold and molded.
  • the composition may be heated and / or pressurized.
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view of a pressure molding machine that can be used to manufacture a molded body.
  • a pressure molding machine 10 shown in FIG. 1 includes a mold 2 in which a through hole is formed and which can be heated, and an upper pin 4 and a lower pin 6 that can move up and down in the through hole of the mold 2. It is.
  • the water-containing composition obtained in Step 1 is introduced into the gap formed by inserting the upper pin 4 or the lower pin 6 into the through hole of the mold 2, and the upper pin 4 and the lower pin are heated while the mold 2 is heated.
  • a molded body can be obtained by compressing the water-containing composition with the side pins 6.
  • FIG. 2 shows a process chart for obtaining a molded product.
  • A is before the introduction of the water-containing composition
  • (b) is immediately after the introduction of the water-containing composition
  • (c) is a case where the water-containing composition is heated and heated.
  • It is a schematic cross section of the pressure molding machine of the state which is pressing.
  • the water-containing composition is introduced into the through-hole with only the lower pin 6 inserted into the through-hole of the mold 2, but water is added before or after introduction. Stir. Subsequently, as shown in FIG.
  • the upper pin 4 is inserted into the through hole of the mold 2 and lowered, the heating of the mold 2 is started, and the water-containing composition 8a before heating and pressurizing is penetrated. Heat and press in the hole.
  • the upper pin 4 is lowered until reaching a predetermined pressing force, and heating and pressurization are continued until the water-containing composition reaches a predetermined temperature in the state shown in FIG. Composition 8b is obtained. Thereafter, the temperature of the mold 2 is lowered using a cooler (for example, a spot cooler), and when the water-containing composition 8b reaches a predetermined temperature, the upper pin 4 or the lower pin 6 is removed from the mold 2 and the contents Take out things.
  • a cooler for example, a spot cooler
  • the pressurization may be performed by lowering the upper pin 4 with the lower pin 6 fixed, but both the lowering of the upper pin 4 and the raising of the lower pin 6 may be performed.
  • the taken out contents are dried to obtain a molded product.
  • the pressurization may be performed by lowering the upper pin 4 with the lower pin 6 fixed, but both the lowering of the upper pin 4 and the raising of the lower pin 6 may be performed.
  • the heating is preferably performed at a mold temperature of 80 to 300 ° C, more preferably 100 to 180 ° C, and still more preferably 100 to 130 ° C.
  • the pressurization is preferably performed at a pressure of 20 MPa or more.
  • Step 3 is a step in which the molding composition obtained in Step 2 is dried to obtain a molded product. Drying is preferably allowed to stand for 1 minute to 10 days in a vacuum and / or in an environment of 100 ° C.
  • the gene encoding PRT410 was commissioned for synthesis.
  • a gene having an NdeI site immediately upstream of the 5 'end and an EcoRI site immediately downstream of the 3' end was obtained.
  • the gene was cloned into a cloning vector (pUC118), treated with restriction enzymes with NdeI and EcoRI, and recombined into a protein expression vector pET-22b (+).
  • the obtained seed culture solution was added to a jar fermenter to which 500 mL of the production medium shown in Table 2 was added so that the OD 600 was 0.05.
  • the temperature of the culture solution was maintained at 37 ° C. and controlled to be constant at pH 6.9, and the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • Adecanol LG-295S manufactured by ADEKA Corporation was used as an antifoaming agent.
  • a feed solution (glucose 455 g / 1 L, Yeast Extract 120 g / 1 L) was added at a rate of 1 mL / min.
  • the culture solution temperature was maintained at 37 ° C., and the culture was performed at a constant pH of 6.9.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration, and cultured for 20 hours.
  • 1M isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) aqueous solution was added to the culture solution to a final concentration of 1 mM to induce expression of the target protein.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • the culture solution was centrifuged, and the cells were collected. SDS-PAGE was performed using cells prepared from the culture solution before and after the addition of IPTG, and the expression of the target protein was confirmed by the appearance of a band of the desired protein size depending on the addition of IPTG.
  • the washed precipitate was suspended in 8M guanidine buffer (8M guanidine hydrochloride, 10 mM sodium dihydrogen phosphate, 20 mM NaCl, 1 mM Tris-HCl, pH 7.0) to a concentration of 100 mg / mL, and 60 ° C. And stirred for 30 minutes with a stirrer to dissolve. After dissolution, dialysis was performed with water using a dialysis tube (cellulose tube 36/32 manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.). The white aggregated protein obtained after dialysis was recovered by centrifugation, the water was removed with a freeze dryer, and the lyophilized powder was recovered.
  • 8M guanidine buffer 8M guanidine hydrochloride, 10 mM sodium dihydrogen phosphate, 20 mM NaCl, 1 mM Tris-HCl, pH 7.0
  • Example 1 A sample obtained by adding 30 wt% pure water to 1.35 g of the above lyophilized powder was used as a mold 2 of the pressure molding machine 10 shown in FIG. Has a circular through-hole having a diameter of 20 mm.). After all the samples are introduced into the through holes, heating of the mold 2 is started, and the sample is pressed by inserting the upper pins 4 and the lower pins 6 into the through holes using a hot press machine. Went. At this time, the pressure condition of the sample was controlled to be 31 MPa.
  • Comparative Example 1 The amount of freeze-dried powder was changed to 0.8 g in order to match the thickness of the resulting molded product, and the ultimate temperature during heating and compression was set to 170 ° C in order to control the temperature rise during molding Except for the above, the freeze-dried powder was heated and pressed in the same manner as in Example 1 to obtain a molded product. In Comparative Example 1, drying after heating and pressing was not performed.
  • test piece The surface of the molded body is polished and smoothed using # 600 and # 1000 (based on the particle size distribution of fine powder for precision polishing according to JIS R6001: 1998), smoothed, and 4 mm wide including a disk-shaped center line.
  • the plate was processed (cut) to obtain a test piece of about 20 mm ⁇ 4 mm ⁇ 2 mm.
  • the obtained test piece was subjected to a three-point bending test with an autograph (manufactured by Shimadzu Corporation, trade name: AGS-X). At this time, the distance between fulcrums of the three-point bending was fixed to 14 mm, and the measurement speed was 1 mm / min. Moreover, after measuring the dimension of the test piece with the micrometer, it installed in the fulcrum and measured the bending elastic modulus and bending strength.
  • Example 3 shows the measurement results.
  • the molded articles of Example 1 and Comparative Example 1 had the same moisture content.
  • Example 1 both the flexural modulus and the bending strength were remarkably improved as compared with Comparative Example 1.

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Abstract

本発明は、構造タンパク質を含む組成物に水を加える工程１と、前記工程１で得られる含水組成物を成形する工程２と、前記工程２で得られる成形組成物を乾燥して、モールド成形体を得る工程３と、を含む、モールド成形体の製造方法を提供する。

Description

モールド成形体及びモールド成形体の製造方法
　本発明は、モールド成形体及びモールド成形体の製造方法に関する。
　軽量化、コストダウン、成形加工の容易化等を目的として、金属材料を有機材料で代替する試みがなされている。このような有機材料としては、硬度の高いフェノール樹脂が用いられることが多く、曲げ弾性率や曲げ強度を更に上昇させるため、フェノール樹脂を含有するマトリックス樹脂に、フェノール樹脂繊維を添加する手法が知られている（例えば、特許文献１参照）。また、環境保全意識の高まりから、非石油系材料であるバイオプラスチックが注目されており、例えば、シルク粉末を樹脂化することで曲げ弾性率４．５ＧＰａの成形体を得られることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
特開２０１４－８０４９１号公報
平井伸治、月刊機能材料誌、２０１４年６月、「廃棄物由来動物タンパク質を用いた環境調和型シルクおよび羊毛樹脂」 Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２年，２９５巻，ｐｐ．４７２－４７６
　しかしながら、特許文献１に開示されるような材料は、マトリックス樹脂に繊維（強化繊維）を含有することにより補強効果を発揮するものであり、マトリックス樹脂自体で高強度を達成することは困難であった。また、生分解性材料により曲げ弾性率４．５ＧＰａを超える成形体を得ることはできなかった。
　そこで、本発明の目的は、優れた曲げ弾性率及び曲げ強度を発揮する生分解性の成形体及びその製造方法を提供することにある。
　本発明は、以下の［１］～［９］を提供する。
［１］　構造タンパク質を含む組成物に水を加える工程１と、前記工程１で得られる含水組成物を成形する工程２と、前記工程２で得られる成形組成物を乾燥して、モールド成形体を得る工程３と、を含む、モールド成形体の製造方法。
［２］　上記工程２が、加熱加圧することを含む、［１］に記載の方法。
［３］　上記構造タンパク質が、スパイダーシルクタンパク質又はその組換えポリペプチドを含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］　［１］～［３］のいずれかに記載の方法によって得られる、モールド成形体。
［５］　構造タンパク質を含む組成物のモールド成形体であって、曲げ弾性率が６．９ＧＰａを超えるモールド成形体。
［６］　加熱加圧成形体である、［５］に記載のモールド成形体。
［７］　上記構造タンパク質が、スパイダーシルクタンパク質又はその組換えポリペプチドを含む、［５］又は［６］に記載のモールド成形体。
［８］　曲げ強度が１４０ＭＰａ以上である、［５］～［７］のいずれかに記載のモールド成形体。
［９］　ビッカース硬さが４５ＨＶ以上である、［５］～［８］のいずれかに記載のモールド成形体。
　上記モールド成形体は、生分解性を有しており、また構造タンパク質及び／又はその組換えポリペプチドを原料とすること、そして当該原料をモールド成形したものであることを特徴としている。上記モールド成形体は、これらの特徴に起因して、強化繊維等の添加材料を用いなくとも、非常に高い曲げ弾性率（例えば、６．９ＧＰａ超）を発揮する。更に、モールド成形体に透明性を付与することも可能であることから、フェノール樹脂やポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）など、高強度でありながら透明性に欠ける樹脂に比較して、適用可能な用途が格段に増えるという利点がある。加えて、構造タンパク質は種々の遺伝子改変が可能なことから、最終用途に合わせて性能の最適化を容易に図ることができる。
　モールド成形体の製造工程において、組成物に水を添加し、成形後に乾燥することにより、曲げ弾性率及び曲げ強度の優れた成形体となる。上記モールド成形体は、鋳型（モールド）で成形されたもの等を意味するが、加熱及び加圧を行うことにより、更に曲げ弾性率の優れた成形体となる。
　本発明によれば、強化繊維等の添加材料を用いなくとも、優れた曲げ弾性率及び曲げ強度を発揮する生分解性の成形体、及びその製造方法が提供される。
加圧成形機の模式断面図である。 （ａ）は組成物の導入前、（ｂ）は組成物の導入直後、（ｃ）は組成物を加熱及び加圧している状態、の加圧成形機の模式断面図である。
　以下、本発明の好適な実施形態について説明する。ただし、本発明は下記実施形態に何ら限定されるものではない。
　本実施形態に係るモールド成形体は、構造タンパク質を含む組成物を鋳型（モールド）に導入し、成形加工等により得られるものである。
［構造タンパク質］
　構造タンパク質とは、生体構造を構築する役割を有するタンパク質であり、酵素、ホルモン、抗体等の機能タンパク質とは異なる。構造タンパク質としては、例えば、天然に存在するフィブロイン、コラ－ゲン、レシリン、エラスチン及びケラチン等の天然型構造タンパク質を挙げることができる。天然に存在するフィブロインとして、昆虫及びクモ類が産生するフィブロインが知られている。本実施形態において、構造タンパク質はスパイダーシルクタンパク質を含むことが好ましい。
　昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ　ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ　ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ　Ｃｙｎｔｈｉａ　ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ　ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、スズメバチ（Ｖｅｓｐａ　ｓｉｍｉｌｌｉｍａ　ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
　昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、ＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。
　クモには最大７種類の絹糸腺が存在し、それぞれ性質の異なるフィブロイン（スパイダーシルクタンパク質）を産生する。スパイダーシルクタンパク質は、その源泉の器官にしたがって、高い靭性を有する大瓶状スパイダータンパク質（ｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭａＳｐ）、高度な伸長力を有する小瓶状スパイダータンパク質（ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭｉＳｐ）、並びに鞭状（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ（Ｆｌａｇ））、管状（ｔｕｂｕｌｉｆｏｒｍ）、集合（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）、ブドウ状（ａｃｉｎｉｆｏｒｍ）及びナシ状（ｐｙｒｉｆｏｒｍ）の各スパイダーシルクタンパク質と命名されている。
　クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。
　クモ類が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ－３（ａｄｆ－３）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ－４（ａｄｆ－４）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｎｇｕ１１ａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ　ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｎｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ　ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）等が挙げられる。
　天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ　ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。
　構造タンパク質は、上記天然型構造タンパク質に由来するポリペプチド、すなわち組換えポリペプチドであってもよい。例えば、組換えフィブロインは、いくつかの異種タンパク質生産系で産生されており、その製造方法として、トランスジェニック・ヤギ、トランスジェニック・カイコ、又は組換え植物若しくは哺乳類細胞が利用されている（非特許文献２参照）。
　組換えフィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から（Ａ）ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている方法に準じて行うことができる。
　大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えポリペプチドは、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式１中、（Ａ）ｎモチーフは４～２０アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは８～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）として表すことができる。具体的には配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をあげることができる。
　コラーゲンの組換えポリペプチドとして、例えば、式２：［ＲＥＰ２］ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式２中、ｏは５～３００の整数を示す。ＲＥＰ２は、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ２は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号１３で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
　レシリンの組換えポリペプチドとして、例えば、式３：［ＲＥＰ３］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式３中、ｐは４～３００の整数を示す。ＲＥＰ３はＳｅｒ－Ｊ－Ｊ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｕ－Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号１４で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ　６１１１５７、Ｇｌ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のＴｈｒをＳｅｒに置換し、かつ９５残基目のＡｓｎをＡｓｐに置換した配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
　エラスチンの組換えポリペプチドとして、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。具体的には、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
　ケラチンの組換えポリペプチドとして、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ　ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。具体的には、配列番号１６で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＣＹ３０４６６のアミノ酸配列）を含むタンパク質を挙げることができる。
　組換えポリペプチドは、（ｉ）配列番号２、配列番号４若しくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列、又は（ｉｉ）配列番号２、配列番号４若しくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えフィブロインであってもよい。
　（ｉ）配列番号２、配列番号４若しくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含む、組換えフィブロインについて説明する。配列番号２で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、配列番号４で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号４の分子量とほぼ同じとなるようにＮ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。なお、配列番号３で示されるアミノ酸配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。
　（ｉｉ）配列番号２、配列番号４若しくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えフィブロインについて説明する。（ｉｉ）組換えフィブロインは、配列番号２、配列番号４又は配列番号１０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（ｉｉ）組換えフィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　上述の組換えフィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、組換えフィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
　タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ｍｅｔａｌ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による組換えフィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含むアミノ酸配列）が挙げられる。
　また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
　さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に組換えフィブロインを精製することができる。
　さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した組換えフィブロインを回収することもできる。
　タグ配列を含む組換えフィブロインのより具体的な例として、（ｉｉｉ）配列番号７、配列番号９若しくは配列番号１１で示されるアミノ酸配列、又は（ｉｖ）配列番号７、配列番号９若しくは配列番号１１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えフィブロインを挙げることができる。
　組換えポリペプチドは、（ｉｉｉ）配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列、又は（ｉｖ）配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えフィブロインであってもよい。
　配列番号６、７、８、９及び１１で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３、４及び１０で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含む）を付加したものである。（ｉｖ）組換えフィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　構造タンパク質は、組換えポリペプチドを含むことが好ましい。構造タンパク質として組換えポリペプチドを含むことにより、得られるモールド成形体の曲げ弾性率、曲げ強度及び硬度を所望の数値に調整することが可能である。
［構造タンパク質を発現する組換え細胞］
　組換えポリペプチドの製造方法について、以下に詳述する。目的とする組換えポリペプチドは、例えば、構造タンパク質をコードする遺伝子配列と、当該遺伝子配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該遺伝子を発現させることにより生産することができる。
　目的とする組換えポリペプチドをコードする遺伝子の製造方法は特に制限されない。例えば、天然の構造タンパク質をコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングする方法、又は、化学的な合成によって、遺伝子を製造することができる。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した構造タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ　１０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したポリペプチドをコードする遺伝子を合成してもよい。
　調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、目的とするタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いても良い。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
　発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、目的とする組換えポリペプチドをコードする遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
　宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
　原核生物の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。
　目的とする組換えポリペプチドをコードする遺伝子を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報参照）等を挙げることができる。
　真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。
　酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
　ベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。
　上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，６９，２１１０　（１９７２）参照〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。
　発現ベクターで形質転換された宿主による遺伝子の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
　目的とする組換えポリペプチドは、例えば、本発明に係る発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。本発明に係る宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
　本発明に係る宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、本発明に係る宿主の培養培地として、該宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、該宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、上記形質転換微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。
　窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。
　無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
　大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５～４０℃である。培養時間は、通常１６時間～７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０～９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
　また、培養中必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　本発明に係る組換えポリペプチドは、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法で単離及び精製することができる。例えば、当該組換えポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。このような方法としては、溶媒抽出法、硫酸アンモニウム等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等が挙げられる。
　また、組換えポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として組換えポリペプチドの不溶体を回収する。回収した組換えポリペプチドの不溶体は蛋白質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法により組換えポリペプチドの精製標品を得ることができる。
　組換えポリペプチドが細胞外に分泌された場合には、培養上清から組換えポリペプチドを回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
［モールド成形体の製造方法］
　一実施形態であるモールド成形体の製造方法は、構造タンパク質を含む組成物に水を加える工程１と、工程１で得られた含水組成物を鋳型（モールド）に導入し、成形する工程２と、工程２で得られた成形組成物を乾燥して、モールド成形体を得る工程３を含む。
　工程１は、構造タンパク質を含む組成物に水を加える工程である。組成物は、構造タンパク質を含んでいればよい。組成物は、構造タンパク質のみであっても、構造タンパク質及び任意の添加成分（例えば、可塑剤、着色剤、フィラー、合成樹脂等）を含んでいてもよい。上記添加成分の含有量は、構造タンパク質の合計量の５０質量％以下にすることが好ましい。組成物は、典型的には粉末状（凍結乾燥粉末等）又は繊維状（紡糸して得られる繊維等）の形状を有しており、モールド成形体は、そのような形状の構造タンパク質を含む組成物の融着体であり得る。
　工程１における水の添加量は、構造タンパク質の質量に対して１０～４０ｗｔ％であることが好ましく、２０～３０ｗｔ％であることがより好ましい。
　工程２は、上記工程１で得られる含水組成物を鋳型（モールド）に導入し、成形加工する工程である。成形加工において、組成物を加熱及び／又は加圧してもよい。
　工程２では、例えば、加圧成形機を用いて成形することができる。図１は、モールド成形体を製造するために用いることのできる加圧成形機の模式断面図である。図１に示す加圧成形機１０は、貫通孔が形成され加温可能な金型２と、金型２の貫通孔内で上下動が可能な上側ピン４及び下側ピン６とを備えるものである。金型２の貫通孔に上側ピン４又は下側ピン６を挿入して生じる空隙に、工程１で得られる含水組成物を導入して、金型２を加温しつつ、上側ピン４及び下側ピン６で当該含水組成物を圧縮することで、モールド成形体を得ることができる。
　図２は、モールド成形体を得る工程図を示すものであり、（ａ）は含水組成物の導入前、（ｂ）は含水組成物の導入直後、（ｃ）は含水組成物を加熱及び加圧している状態の加圧成形機の模式断面図である。図２（ａ）に示すように、金型２の貫通孔に下側ピン６のみを挿入した状態で貫通孔内に含水組成物を導入するが、導入前または導入後に水分を加えた上で撹拌する。続いて図２（ｂ）に示すように、金型２の貫通孔に上側ピン４を挿入して下降させ、金型２の加熱を開始して、加熱加圧前の含水組成物８ａを貫通孔内で加熱加圧する。あらかじめ定めた加圧力に至るまで上側ピン４を下降させ、図２（ｃ）に示す状態で含水組成物が所定の温度に達するまで、加熱及び加圧を継続して、加熱加圧後の含水組成物８ｂを得る。その後、冷却器（例えばスポットクーラー）を用いて金型２の温度を下降させ、含水組成物８ｂが所定の温度になったところで、上側ピン４又は下側ピン６を金型２から抜き取り、内容物を取り出す。加圧に関しては、下側ピン６を固定した状態で上側ピン４を下降させて実施してもよいが、上側ピン４の下降と下側ピン６の上昇の両方を実施してもよい。取り出した内容物を乾燥させて、モールド成形体を得る。加圧に関しては、下側ピン６を固定した状態で上側ピン４を下降させて実施してもよいが、上側ピン４の下降と下側ピン６の上昇の両方を実施してもよい。
　加熱は、金型の温度が８０～３００℃で行うことが好ましく、１００～１８０℃がより好ましく、１００～１３０℃が更に好ましい。加圧は、２０ＭＰａ以上の圧力で行うことが好ましい。
　工程３は、工程２で得られる成形組成物を乾燥してモールド成形体を得る工程である。乾燥は、真空中及び／又は１００℃の環境下に１分から１０日間静置することが好ましい。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（１）構造タンパク質発現株の作製
　ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列をＧｅｎＢａｎｋのウェブデータベースより取得した後、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施し、さらにＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加して、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する組換えフィブロイン（以下、「ＰＲＴ４１０」ともいう。）を設計した。
　次に、ＰＲＴ４１０をコードする遺伝子を合成委託した。その結果、遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅＩサイト、及び３’末端直下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した遺伝子を得た。当該遺伝子をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした後、ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、タンパク質発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）に組み換えた。
（２）タンパク質の発現
　上記で得られたＰＲＴ４１０をコードする遺伝子を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。形質転換された大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養後、同培養液を、表１に示すシード培養用培地１００ｍＬに、ＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液の温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコにて、さらに約１５時間培養を行い、シード培養液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　得られたシード培養液を、表２に示す生産培地５００ｍＬを添加したジャーファーメンターに、ＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液の温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定になるように制御し、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにして培養した。なお、消泡剤として、アデカノールＬＧ－２９５Ｓ（（株）ＡＤＥＫＡ製）を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　１２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）水溶液を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のタンパク質を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするタンパク質サイズのバンドの出現により、目的とするタンパク質の発現を確認した。
（３）構造タンパク質の精製
　ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ　Ｎｉｒｏ　Ｓｏａｖｉ社）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ　グアニジン緩衝液（８Ｍグアニジン塩酸塩、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。
＜モールド成形体の作製＞
（実施例１）
　上記凍結乾燥粉末１．３５ｇに３０ｗｔ％の純水を加えて得られたサンプルを、図１に示す加圧成形機１０の金型２（金型２は、円柱形状の金型であり、断面が直径２０ｍｍの円形状の貫通孔を有する。）の貫通孔内に導入した。全てのサンプルを貫通孔内に導入した後、金型２の加熱を開始するとともに、ホットプレス機を用いて、上側ピン４と下側ピン６を貫通孔内に挿入することでサンプルの加圧を行った。この際、サンプルの加圧条件が３１ＭＰａとなるように制御した。サンプルの温度が１７０℃になったところで加熱を中止し、冷却した後に金型からサンプルを取り出した後、真空加熱炉に投入し、真空中１００℃で１６時間乾燥させて、直径２０ｍｍ、厚さ２ｍｍの円板形状のモールド成形体を得た。
（比較例１）
　得られる成形体の厚さを合わせるために凍結乾燥粉末の量を０．８gに変更したこと、及び、成形時の温度上昇を制御するために加熱圧縮時の到達温度を１７０℃に設定したこと以外は、実施例１と同様にして、上記凍結乾燥粉末を加熱加圧してモールド成形体を得た。比較例１では、加熱加圧後の乾燥を行わなかった。
＜試験片の作製＞
　上記モールド成形体の表面を＃６００及び＃１０００（ＪＩＳ　Ｒ６００１：１９９８の精密研磨用微粉の粒度分布に基づく。）の研磨紙を用いて研磨、平滑化し、円板形状中心線を含む幅４ｍｍの板状に加工（切断）し、約２０ｍｍ×４ｍｍ×２ｍｍの試験片を得た。
＜曲げ弾性率及び曲げ強度の測定＞
　得られた試験片について、オートグラフ（島津製作所株式会社製、商品名：ＡＧＳ－Ｘ）にて、三点曲げ試験を行った。この際、三点曲げの支点間距離を１４ｍｍに固定し、測定速度を１ｍｍ／分とした。また、試験片の寸法をマイクロメーターで測定した後、支点に設置して曲げ弾性率及び曲げ強度を測定した。
＜マイクロビッカース硬さの測定＞
　得られた試験片について、マイクロビッカース硬さ試験機（島津製作所株式会社製、商品名：ＨＭＶ－Ｇ）にてビッカース硬さを測定した。
＜水分率の測定＞
　曲げ強度の測定時の試験片の水分率を、カールフィッシャー式水分計（Ｍｅｔｒｏｈｍ社製、商品名：８６０　ＫＦ　Ｔｈｅｒｍｏｐｒｅｐ、８５１　Ｔｉｔｒａｎｄｏ、８０１　Ｓｔｉｒｒｅｒ）を用いて測定した。このとき試験片を１８０℃に加熱した。
　各測定結果を表３に示す。実施例１及び比較例１のモールド成形体は、同程度の水分率を有していた。実施例１は、曲げ弾性率及び曲げ強度のいずれにおいても比較例１に対して顕著に向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　２…金型、４…上側ピン、６…下側ピン、８ａ…加熱加圧前の含水組成物、８ｂ…加熱加圧後の含水組成物、１０…加圧成形機。

Claims (7)

  1. 　構造タンパク質を含む組成物に水を加える工程１と、
    　前記工程１で得られる含水組成物を成形する工程２と、
    　前記工程２で得られる成形組成物を乾燥して、モールド成形体を得る工程３と、を含む、モールド成形体の製造方法。
  2. 　前記工程２が、加熱加圧することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記構造タンパク質が、スパイダーシルクタンパク質又はその組換えポリペプチドを含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の方法によって得られる、モールド成形体。
  5. 　構造タンパク質を含む組成物のモールド成形体であって、曲げ弾性率が６．９ＧＰａを超えるモールド成形体。
  6. 　加熱加圧成形体である、請求項５に記載のモールド成形体。
  7. 　前記構造タンパク質が、スパイダーシルクタンパク質又はその組換えポリペプチドを含む、請求項５又は６に記載のモールド成形体。
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