WO2018159695A1 - 微生物増殖抑制剤、微生物の増殖を抑制する方法、耐紫外線性向上剤、耐紫外線性を向上させる方法、人工タンパク質成形体及びその製造方法、人工タンパク質溶液、並びに、着色剤 - Google Patents
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Abstract
本発明は、一態様において、キサンツレン酸を含む微生物増殖抑制剤である。
Description
本発明は、微生物増殖抑制剤、微生物の増殖を抑制する方法、耐紫外線性向上剤、耐紫外線性を向上させる方法、人工タンパク質成形体及びその製造方法、人工タンパク質溶液、並びに、着色剤に関する。
従来、医薬品をはじめとして、家庭用品、設備機器等の各種の物品には、細菌やカビ等の微生物の増殖を抑制する効果が付与されたものが多い。このような効果は、一般に、各種の物品に対して、いわゆる微生物増殖抑制剤を含ませることにより得られている(例えば特許文献1)。また、特に屋外で使用される物品には、耐紫外線性を有することが要求される場合がある。耐紫外線性は、例えば、いわゆる耐紫外線性向上剤を使用することに実現されている(例えば特許文献2)。
ところで、近年では、環境問題の観点から、天然乃至は天然由来の素材が各種の分野で採用されており、微生物増殖抑剤や耐紫外線性向上剤についても、天然乃至は天然由来であることが望まれている。
本発明の主な目的は、新規な微生物増殖抑制剤及び耐紫外線性向上剤を提供することである。
本発明者らは、キサンツレン酸に微生物の増殖を抑制する効果があることを見出した。すなわち、本発明は、一態様において、キサンツレン酸を含む微生物増殖抑制剤である。また、本発明は、他の一態様において、物品における微生物の増殖を抑制する方法であって、物品にキサンツレン酸を含ませる工程を備える方法である。
また、本発明者らは、キサンツレン酸に耐紫外線性を向上させる効果があることを見出した。すなわち、本発明は、他の一態様において、キサンツレン酸を含む耐紫外線性向上剤である。また、本発明は、他の一態様において、物品における耐紫外線性を向上させる方法であって、物品にキサンツレン酸を含ませる工程を備える方法である。
本発明は、他の一態様において、人工タンパク質とキサンツレン酸とを含む人工タンパク質成形体である。本発明は、他の一態様において、人工タンパク質とキサンツレン酸とを含む溶液を準備する工程と、溶液を用いて成形を行う工程と、を備える人工タンパク質成形体の製造方法である。本発明は、他の一態様において、人工タンパク質とキサンツレン酸とを含む人工タンパク質溶液である。
本発明は、他の一態様において、キサンツレン酸を含む着色剤である。
本発明によれば、新規な微生物増殖抑制剤及び耐紫外線性向上剤が提供される。
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
微生物増殖抑制剤は、キサンツレン酸のみからなっていてもよく、微生物増殖抑制効果を阻害しない範囲でその他の成分を更に含んでいてもよい。本実施形態に係る物品における微生物の増殖を抑制する方法は、物品にキサンツレン酸を含ませる工程を備える。
微生物は、特に制限されず、例えば、細菌等であってもよく、真菌等であってもよい。細菌は、グラム陰性菌であってもグラム陽性菌であってもよい。グラム陰性菌としては、例えば大腸菌等が挙げられる。グラム陽性菌としては、例えば枯草菌等が挙げられる。
本実施形態に係る耐紫外線性向上剤は、キサンツレン酸を含む。耐紫外線性向上剤は、キサンツレン酸のみからなっていてもよく、耐紫外線性向上効果を阻害しない範囲でその他の成分を更に含んでいてもよい。本実施形態に係る物品の耐紫外線性を向上させる方法は、物品にキサンツレン酸を含ませる工程を備える。
上述の微生物の増殖を抑制する方法及び耐紫外線性を向上させる方法における「物品」は、互いに共通であるため、以下でまとめて説明する。
物品は、特に限定されず、例えば、医薬品、医療用具、家庭用品、設備機器、電化製品、電子機器、衣料、寝具、装飾品、食品、着色剤、自動車や列車等の各種乗り物用部品等の用途に供されるものであって、人体と接触するような物品等であってもよい。上述の微生物の増殖を抑制する方法又は耐紫外線性を向上させる方法によれば、キサンツレン酸を含む、医薬品、医療用具、家庭用品、設備機器、電化製品、電子機器、衣料、寝具、装飾品、食品、着色剤、自動車や列車等の各種乗り物用部品などが得られる。
物品の一例として、タンパク質を含む物品が挙げられる。タンパク質は、特に限定されないが、例えば構造タンパク質であってよい。構造タンパク質とは、生体内で構造、形態等を形成又は保持するタンパク質を意味する。このような構造タンパク質は、例えば、フィブロイン、ケラチン、コラーゲン、エラスチン、レシリン等であってよい。これらのタンパク質が、構造タンパク質として、それぞれ単独で、もしくは適宜に組み合わされて用いられる。構造タンパク質は、好ましくは、フィブロインである。
フィブロインは、例えば、絹フィブロイン、クモ糸フィブロイン、及びホーネットシルクフィブロインからなる群より選択される少なくとも1種であってよい。特に、構造タンパク質は、絹フィブロイン、クモ糸フィブロイン又はこれらの組み合わせであってもよい。絹フィブロインとクモ糸フィブロインとを併用する場合、絹フィブロインの割合は、例えば、クモ糸フィブロイン100質量部に対して、40質量部以下、30質量部以下、又は10質量部以下であってよい。
絹糸は、カイコガ(Bombyx mori)の幼虫である蚕の作る繭から得られる繊維(繭糸)である。一般に、1本の繭糸は、2本の絹フィブロインと、これらを外側から覆うニカワ質(セリシン)とから構成される。絹フィブロインは、多数のフィブリルで構成される。絹フィブロインは、4層のセリシンで覆われる。実用的には、精錬により外側のセリシンを溶解して取り除いて得られる絹フィラメントが、衣料用途に使用されている。一般的な絹糸は、1.33の比重、平均3.3decitexの繊度、及び1300~1500m程度の繊維長を有する。絹フィブロインは、天然若しくは家蚕の繭、又は中古若しくは廃棄のシルク生地を原料として得られる。
絹フィブロインは、セリシン除去絹フィブロイン、セリシン未除去絹フィブロイン、又はこれらの組み合わせであってもよい。セリシン除去絹フィブロインは、絹フィブロインを覆うセリシン、及びその他の脂肪分などを除去して精製したものである。このようにして精製した絹フィブロインは、好ましくは、凍結乾燥粉末として用いられる。セリシン未除去絹フィブロインは、セリシンなどが除去されていない未精製の絹フィブロインである。
クモ糸フィブロインは、天然クモ糸タンパク質、及び天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドからなる群より選ばれるクモ糸ポリペプチドを含有していてもよい。
天然クモ糸タンパク質としては、例えば、大吐糸管しおり糸タンパク質、横糸タンパク質、及び小瓶状腺タンパク質が挙げられる。大吐糸管しおり糸は、結晶領域と非晶領域(無定形領域とも言う。)からなる繰り返し領域を持つため、高い応力と伸縮性を併せ持つ。クモ糸の横糸は、結晶領域を持たず、非晶領域からなる繰り返し領域を持つという特徴を有する。横糸は、大吐糸管しおり糸に比べると応力は劣るが、高い伸縮性を持つ。
大吐糸管しおり糸タンパク質は、クモの大瓶状腺で産生され、強靭性に優れるという特徴を有する。大吐糸管しおり糸タンパク質としては、例えば、アメリカジョロウグモ(Nephila clavipes)に由来する大瓶状腺スピドロインMaSp1及びMaSp2、並びに二ワオニグモ(Araneus diadematus)に由来するADF3及びADF4が挙げられる。ADF3は、ニワオニグモの2つの主要なしおり糸タンパク質の一つである。天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは、これらのしおり糸タンパク質に由来するポリペプチドであってもよい。ADF3に由来するポリペプチドは、比較的合成し易く、また、強伸度及びタフネスの点で優れた特性を有する。
横糸タンパク質は、クモの鞭毛状腺(flagelliform gland)で産生される。横糸タンパク質としては、例えばアメリカジョロウグモ(Nephila clavipes)に由来する鞭毛状絹タンパク質(flagelliform silk protein)が挙げられる。
天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは、組換えクモ糸タンパク質であってよい。組換えクモ糸タンパク質としては、天然型クモ糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体等が挙げられる。このようなポリペプチドの好適な一例は、大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えクモ糸タンパク質(「大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチド」ともいう)である。
フィブロイン様タンパク質である、大吐糸管しおり糸由来のタンパク質あるいはカイコシルク由来のタンパク質としては、例えば、式1:[(A)nモチーフ-REP]m、又は式2:[(A)nモチーフ-REP]m-(A)nモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。ここで、(A)nモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、nは2~27である。nは、2~20、4~27、4~20、8~20、10~20、4~16、8~16、又は10~16の整数であってよい。また、(A)nモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は40%以上であればよく、60%以上、70%以上、80%以上、83%以上、85%以上、86%以上、90%以上、95%以上、又は100%(アラニン残基のみで構成されることを意味する。)であってもよい。ドメイン配列中に複数存在する(A)nモチーフは、少なくとも7つがアニン残基のみで構成されてもよい。REPは2~200アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。REPは、10~200アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。mは2~300の整数を示し、10~300の整数であってもよい。複数存在する(A)nモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するREPは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。具体的には配列番号1で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。
横糸タンパク質に由来するタンパク質としては、例えば、式3:[REP2]oで表されるドメイン配列を含むタンパク質(ここで、式3中、REP2はGly-Pro-Gly-Gly-Xから構成されるアミノ酸配列を示し、Xはアラニン(Ala)、セリン(Ser)、チロシン(Tyr)及びバリン(Val)からなる群から選ばれる一つのアミノ酸を示す。oは8~300の整数を示す。)を挙げることができる。具体的には配列番号2で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号2で示されるアミノ酸配列は、NCBIデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分的な配列(NCBIアクセッション番号:AAF36090、GI:7106224)のリピート部分及びモチーフに該当するN末端から1220残基目から1659残基目までのアミノ酸配列(PR1配列と記す。)と、NCBIデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分配列(NCBIアクセッション番号:AAC38847、GI:2833649)のC末端から816残基目から907残基目までのC末端アミノ酸配列を結合し、結合した配列のN末端に配列番号6で示されるアミノ酸配列(タグ配列及びヒンジ配列)が付加されたものである。
コラーゲン由来のタンパク質として、例えば、式4:[REP3]pで表されるドメイン配列を含むタンパク質(ここで、式4中、pは5~300の整数を示す。REP3は、Gly-X-Yから構成されるアミノ酸配列を示し、X及びYはGly以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するREP3は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。)を挙げることができる。具体的には、配列番号3で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号3で示されるアミノ酸配列は、NCBIデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ4の部分的な配列(NCBIのGenBankのアクセッション番号:CAA56335.1、GI:3702452)のリピート部分及びモチーフに該当する301残基目から540残基目までのアミノ酸配列のN末端に配列番号6で示されるアミノ酸配列(タグ配列及びヒンジ配列)が付加されたものである。
レシリン由来のタンパク質として、例えば、式5:[REP4]qで表されるドメイン配列を含むタンパク質(ここで、式5中、qは4~300の整数を示す。REP4はSer-J-J-Tyr-Gly-U-Proから構成されるアミノ酸配列を示す。Jは任意のアミノ酸残基を示し、特にAsp、Ser及びThrからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Uは任意のアミノ酸残基を示し、特にPro、Ala、Thr及びSerからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するREP4は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。)を挙げることができる。具体的には、配列番号4で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号4で示されるアミノ酸配列は、レシリン(NCBIのGenBankのアクセッション番号NP 611157、Gl:24654243)のアミノ酸配列において、87残基目のThrをSerに置換し、かつ95残基目のAsnをAspに置換した配列の19残基目から321残基目までのアミノ酸配列のN末端に配列番号6で示されるアミノ酸配列(タグ配列及びヒンジ配列)が付加されたものである。
エラスチン由来のタンパク質として、例えば、NCBIのGenBankのアクセッション番号AAC98395(ヒト)、I47076(ヒツジ)、NP786966(ウシ)等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。具体的には、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号5で示されるアミノ酸配列は、NCBIのGenBankのアクセッション番号AAC98395のアミノ酸配列の121残基目から390残基目までのアミノ酸配列のN末端に配列番号6で示されるアミノ酸配列(タグ配列及びヒンジ配列)が付加されたものである。
タンパク質原料繊維に主成分として含まれるタンパク質は、例えば、当該タンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された1又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。
タンパク質原料繊維に主成分として含まれるタンパク質をコードする遺伝子の製造方法は、特に制限されない。例えば、天然の構造タンパク質をコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などで増幅しクローニングする方法、又は、化学的な合成によって、遺伝子を製造することができる。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、NCBIのウェブデータベースなどより入手した構造タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、AKTA oligopilot plus 10/100(GEヘルスケア・ジャパン株式会社)などで自動合成したオリゴヌクレオチドをPCRなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のN末端に開始コドン及びHis10タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質、をコードする遺伝子を合成してもよい。
調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等)であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、目的とするタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いても良い。誘導性プロモーターは、誘導物質(発現誘導剤)の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはpH値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、目的とするタンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
原核生物の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ等を挙げることができる。ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ等を挙げることができる。セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス等を挙げることができる。バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス等を挙げることができる。ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等を挙げることができる。ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム等を挙げることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス等を挙げることができる。シュードモナス(Pseudomonas)属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ等を挙げることができる。
タンパク質原料繊維に主成分として含まれるタンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、pBTrp2(ベーリンガーマンハイム社製)、pGEX(Pharmacia社製)、pUC18、pBluescriptII、pSupex、pET22b、pCold、pUB110、pNCO2(特開2002-238569号公報)等を挙げることができる。
真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌(カビ等)を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ(Trichoderma)属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
ベクターとしては、例えば、YEP13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)等を挙げることができる。上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69,2110 (1972)]、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。
発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第2版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
タンパク質は、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、上記形質転換微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、15~40℃である。培養時間は、通常16時間~7日間である。培養中の培養培地のpHは3.0~9.0に保持することが好ましい。培養培地のpHの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
また、培養中必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
タンパク質の単離、精製は通常用いられている方法で行うことができる。例えば、当該タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)-セファロース、DIAION HPA-75(三菱化成社製)等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(Pharmacia社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
また、タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてタンパク質の不溶体を回収する。回収したタンパク質の不溶体は蛋白質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法によりタンパク質の精製標品を得ることができる。当該タンパク質が細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該タンパク質を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、その培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
なお、上記したようなタンパク質を主成分として含むタンパク質原料繊維は、公知の手法によって製造される。即ち、例えば、クモ糸フィブロインを含むタンパク質原料繊維を製造する際には、先ず、前記発現ベクターで形質転換した宿主等を用いて製造されるクモ糸フィブロインをジメチルスルホキシド(DMSO)や、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、或いはヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、ギ酸等の溶媒に、溶解促進剤としての無機塩と共に添加し、溶解してドープ液を作製する。次いで、このドープ液を用いて、湿式紡糸や乾式紡糸、乾湿式紡糸等の公知の紡糸手法により紡糸して、タンパク質原料を得ることができる。
物品の形状は、限定されるものではなく、例えば、繊維、フィルム、モールド成形体、ゲル、多孔質体、パーティクル等であってよい。
上述の微生物の増殖を抑制する方法及び耐紫外線性を向上させる方法における「物品にキサンツレン酸を含ませる工程」は、互いに共通であるため、以下でまとめて説明する。
本工程では、物品にキサンツレン酸を含ませる。本明細書において、「物品にキサンツレン酸を含ませる」とは、所望の効果(微生物増殖抑制効果又は耐紫外線性向上効果)が得られるように物品とキサンツレン酸とを互いに共存させることを意味し、例えば、物品とキサンツレン酸とを互いに混在させること、物品の表面又は内部にキサンツレン酸を存在させること等を包含する。
一実施形態において、本工程では、物品とキサンツレン酸とを互いに混合することにより、物品にキサンツレン酸を含ませる(物品とキサンツレン酸とを、例えば、液体の状態や粉粒体の状態等で互いに混在させる)ことができる。他の一実施形態において、本工程では、物品の表面上にキサンツレン酸を付与(例えばキサンツレン酸を含む溶液を塗布)することにより、物品にキサンツレン酸を含ませる(物品の表面にキサンツレン酸を存在させる)ことができる。他の一実施形態において、本工程では、物品を製造するための原料中にキサンツレン酸を添加することにより、物品にキサンツレン酸を含ませる(物品の内部にキサンツレン酸を存在させる)ことができる。
本工程では、物品の内部にキサンツレン酸を存在させることが好ましい。以下では、物品がタンパク質を含む場合を例に挙げて、物品の形状ごとに、物品の内部にキサンツレン酸を存在させる方法の具体例をより詳細に説明する。
物品がタンパク質を含む繊維である場合、まず、所定の溶媒中に、タンパク質を溶解させると共に、キサンツレン酸を溶解又は分散させてドープ液を作製する。溶媒は、タンパク質を溶解可能な溶媒であれば特に限定されず、例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO)、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)等であってよい。
ドープ液は、必要に応じて無機塩を更に含有していてもよい。無機塩としては、例えば、ルイス酸とルイス塩基とからなる無機塩が挙げられる。ルイス塩基としては、例えば、オキソ酸イオン(硝酸イオン、過塩素酸イオン等)、金属オキソ酸イオン(過マンガン酸イオン等)、ハロゲン化物イオン、チオシアン酸イオン、シアン酸イオン等が挙げられる。ルイス酸としては、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン等の金属イオン、アンモニウムイオン等の多原子イオン、錯イオン等が挙げられる。ルイス酸とルイス塩基とからなる無機塩の具体例としては、塩化リチウム、臭化リチウム、ヨウ化リチウム、硝酸リチウム、過塩素酸リチウム、及びチオシアン酸リチウム等のリチウム塩、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硝酸カルシウム、過塩素酸カルシウム、及びチオシアン酸カルシウム等のカルシウム塩、塩化鉄、臭化鉄、ヨウ化鉄、硝酸鉄、過塩素酸鉄、及びチオシアン酸鉄等の鉄塩、塩化アルミニウム、臭化アルミニウム、ヨウ化アルミニウム、硝酸アルミニウム、過塩素酸アルミニウム、及びチオシアン酸アルミニウム等のアルミニウム塩、塩化カリウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、硝酸カリウム、過塩素酸カリウム、及びチオシアン酸カリウム等のカリウム塩、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びチオシアン酸ナトリウム等のナトリウム塩、塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、硝酸亜鉛、過塩素酸亜鉛、及びチオシアン酸亜鉛等の亜鉛塩、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、硝酸マグネシウム、過塩素酸マグネシウム、及びチオシアン酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化バリウム、臭化バリウム、ヨウ化バリウム、硝酸バリウム、過塩素酸バリウム、及びチオシアン酸バリウム等のバリウム塩、並びに塩化ストロンチウム、臭化ストロンチウム、ヨウ化ストロンチウム、硝酸ストロンチウム、過塩素酸ストロンチウム、及びチオシアン酸ストロンチウム等のストロンチウム塩が挙げられる。
ドープ液の粘度は、紡糸方法に応じて適宜設定すればよく、例えば、35℃において100~15,000cP(センチポイズ)とすることができる。ドープ液の粘度は、例えば京都電子工業社製の商品名“EMS粘度計”を使用して測定することができる。
このドープ液を用いて、湿式紡糸、乾式紡糸、乾湿式紡糸等の公知の紡糸手法により紡糸する。好ましい紡糸方法としては、湿式紡糸を挙げることができる。
湿式紡糸では、ドープ液を紡糸口金(ノズル)から凝固液(凝固液槽)の中に押出して、凝固液中でタンパク質を固めることにより糸の形状の未延伸糸を得ることができる。凝固液としては、脱溶媒できる溶液であればよく、例えば、メタノール、エタノール及び2-プロパノール等の炭素数1~5の低級アルコール、並びにアセトン等を挙げることができる。凝固液には、適宜水を加えてもよい。凝固液の温度は、0~30℃であることが好ましい。紡糸口金として、直径0.1~0.6mmのノズルを有するシリンジポンプを使用する場合、押し出し速度は1ホール当たり、0.2~6.0ml/時間が好ましく、1.4~4.0ml/時間であることがより好ましい。凝固液槽の長さは、脱溶媒が効率的に行える長さがあればよく、例えば、200~500mmである。未延伸糸の引き取り速度は、例えば、1~20m/分であってよく、1~3m/分であることが好ましい。滞留時間は、例えば、0.01~3分であってよく、0.05~0.15分であることが好ましい。また、凝固液中で延伸(前延伸)をしてもよい。低級アルコールの蒸発を抑えるため凝固液を低温に維持し、未延伸糸の状態で引き取ってもよい。凝固液槽は多段設けてもよく、また延伸は必要に応じて、各段、又は特定の段で行ってもよい。
上記の方法で得られた未延伸糸(又は前延伸糸)は、延伸工程を経て延伸糸(フィブロイン繊維)とすることができる。延伸方法としては、湿熱延伸、乾熱延伸等をあげることができる。
湿熱延伸は、温水中、温水に有機溶剤等を加えた溶液中、スチーム加熱中で行うことができる。温度としては、例えば、50~90℃であってよく、75~85℃が好ましい。湿熱延伸では、未延伸糸(又は前延伸糸)を、例えば、1~10倍延伸することができ、2~8倍延伸することが好ましい。
乾熱延伸は、電気管状炉、乾熱板等を使用して行うことができる。温度としては、例えば、140℃~270℃であってよく、160℃~230℃が好ましい。乾熱延伸では、未延伸糸(又は前延伸糸)を、例えば、0.5~8倍延伸することができ、1~4倍延伸することが好ましい。
湿熱延伸及び乾熱延伸はそれぞれ単独で行ってもよく、またこれらを多段で、又は組み合わせて行ってもよい。すなわち、一段目延伸を湿熱延伸で行い、二段目延伸を乾熱延伸で行う、又は一段目延伸を湿熱延伸行い、二段目延伸を湿熱延伸行い、更に三段目延伸を乾熱延伸で行う等、湿熱延伸及び乾熱延伸を適宜組み合わせて行うことができる。
延伸工程における最終的な延伸倍率は、未延伸糸(又は前延伸糸)に対して、例えば、5~20倍であり、6~11倍であることが好ましい。
タンパク質は、延伸して繊維とした後、タンパク質の繊維内のポリペプチド分子間で化学的に架橋させてもよい。架橋させることができる官能基は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、チオール基及びヒドロキシ基等が挙げられる。例えば、ポリペプチドに含まれるリジン側鎖のアミノ基は、グルタミン酸又はアスパラギン酸側鎖のカルボキシル基と脱水縮合によりアミド結合で架橋できる。真空加熱下で脱水縮合反応を行なうことにより架橋してもよいし、カルボジイミド等の脱水縮合剤により架橋させてもよい。
ポリペプチド分子間の架橋は、カルボジイミド、グルタルアルデヒド等の架橋剤を用いて行ってもよく、トランスグルタミナーゼ等の酵素を用いて行ってもよい。カルボジイミドは、一般式R1N=C=NR2(但し、R1及びR2は、それぞれ独立に、炭素数1~6のアルキル基、シクロアルキル基を含む有機基を示す。)で示される化合物である。カルボジイミドの具体例として、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリノエチル)カルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)等が挙げられる。これらの中でも、EDC及びDICはポリペプチド分子間のアミド結合形成能が高く、架橋反応し易いことから好ましい。
架橋処理は、タンパク質繊維に架橋剤を付与して真空加熱乾燥で架橋するのが好ましい。架橋剤は純品をフィブロイン繊維に付与してもよいし、炭素数1~5の低級アルコール及び緩衝液等で0.005~10質量%の濃度に希釈したものをフィブロイン繊維に付与してもよい。架橋処理は、温度20~45℃で3~42時間行うのが好ましい。架橋処理により、フィブロイン繊維に更に高い応力(強度)を付与することができる。
以上のようにして得られた繊維は、繊維又は糸として、織物、編物、組み物、不織布等に応用でき、また、ロープ、手術用縫合糸、電気部品用の可撓性止め具、さらには移植用生理活性材料(例えば、人工靭帯及び大動脈バンド)等の高強度用途にも応用できる。
物品がフィルムである場合、まず、物品が繊維である場合と同様に、所定の溶媒中に、タンパク質を溶解させると共に、キサンツレン酸を溶解又は分散させてドープ液を作製する。
その後、ドープ液を基材表面にキャスト成形し、乾燥及び/又は脱溶媒を行う。具体的には、まず、ドープ液を基材表面に所定の厚さで(例えば、乾燥及び/又は脱溶媒後の厚さで1~1000μmとなるように)塗布する。
基材は、樹脂基板、ガラス基板、金属基板等であってよい。基材は、キャスト成形後のフィルムを容易に剥離できる観点から、好ましくは樹脂基板である。樹脂基板としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート(PET)フィルム、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素樹脂フィルム、ポリプロピレン(PP)フィルム、又はこれらのフィルム表面にシリコーン化合物を固定化させた剥離フィルムであってよい。基材は、DMSO溶媒に対して安定であり、ドープ溶液を安定してキャスト成形でき、成形後のフィルムを容易に剥離できる観点から、より好ましくは、PETフィルム又はPETフィルム表面にシリコーン化合物を固定化させた剥離フィルムである。
乾燥及び/又は脱溶媒は、例えば、真空乾燥、熱風乾燥、風乾、及び液中浸漬から選ばれる少なくとも一種の手段で行われる。液中浸漬は、水中、メタノール、エタノール、2-プロパノールなどの炭素数1~5の低級アルコールなどのアルコール液でもよいし、水とアルコール混合液などにキャストフィルムを浸漬して脱溶媒させてもよい。脱溶媒液(凝固液)の温度は、好ましくは0~90℃である。溶媒はできるだけ脱離したほうが好ましい。なお、フィルムを液中で延伸する場合、脱溶媒は延伸と同時に行うこともできる。また、脱溶媒は、フィルムを延伸させた後に行ってもよい。
乾燥及び/又は脱溶媒後の未延伸フィルムは、水中で1軸延伸又は2軸延伸することができる。2軸延伸は、逐次延伸でも同時2軸延伸でもよい。2段以上の多段延伸をしてもよい。延伸倍率は、縦、横ともに、好ましくは1.01~6倍、より好ましくは1.05~4倍である。この範囲であると応力-歪のバランスがとりやすい。水中延伸は、20~90℃の水温で行われることが好ましい。延伸後のフィルムは、50~200℃の乾熱で5~600秒間熱固定することが好ましい。この熱固定により、常温における寸法安定性が得られる。なお、1軸延伸したフィルムは1軸配向フィルムとなり、2軸延伸したフィルムは2軸配向フィルムとなる。
フィルムは、カラーフィルムであってもよい。この場合、染料などの着色剤を例えばDMSO溶媒に溶解又は分散させてDMSO着色液を作製し、この着色液とドープ液とを混合して得られた溶液を、上述したのと同様にキャスト成形によりフィルムを作製する。その後、乾燥及び/又は脱溶媒して未延伸着色フィルムにするか、又は延伸して延伸フィルムとする。カラーフィルムは、反射板、マーカー、紫外線防止膜、スリット糸などに応用できる。
物品がモールド成形体である場合、タンパク質とキサンツレン酸とを含む組成物を加圧成形機の金型に導入した後、金型を加熱すると共に組成物に対して加圧する。所定の加圧下で組成物が所定の温度に達するまで加熱及び加圧を継続して、加熱加圧された組成物を得る。次いで、冷却器(例えばスポットクーラー)を用いて金型の温度を下降させ、組成物が所定の温度になったところで、内容物を取り出してモールド成形体を得る。
加熱は、80~300℃で行うことが好ましく、100~180℃がより好ましく、100~130℃が更に好ましい。加圧は、5kN以上で行うことが好ましく、10kN以上がより好ましく、20kN以上が更に好ましい。また、所定の加熱加圧条件に達した後、その条件での処理を続ける時間(保温条件)は、0~100分間が好ましく、1~50分間がより好ましく5~30分間が更に好ましい。
物品がゲルである場合、まず、所定の溶媒中に、タンパク質を溶解させると共に、キサンツレン酸を溶解又は分散させてタンパク質溶液を作製する。溶媒は、例えば、ジメチルスルホキシド溶媒、ジメチルスルホキシドに無機塩を加えた溶媒、N,N-ジメチルホルムアミドに無機塩を加えた溶媒等であってよい。溶媒は、これらの溶媒に加えて、アルコール及び/又は水を更に含んでもよい。
次いで、タンパク質溶液中の溶媒を水溶性溶媒に置換する。水溶性溶媒は、水を含む溶媒をいい、例えば、水、水溶性緩衝液、生理食塩水等が挙げられる。水溶性溶媒は、人体への適応性が高い観点から、好ましくは水である。水としては、特に限定されないが、純水、蒸留水、超純水等を用いることができる。
水溶性溶媒に置換する工程は、タンパク質溶液を透析膜内に入れ、水溶性溶媒中に浸漬し、水溶性溶媒を1回以上入れ替える方法により行われることが好ましい。具体的には、タンパク質溶液を透析膜に入れ、溶液の100倍以上の量の水溶性溶媒(1回分)の中に3時間静置し、この水溶性溶媒入れ替えを計3回以上繰り返すことがより好ましい。透析膜は、タンパク質が透過させないものであればよく、例えばセルロース透析膜等であってよい。水溶性溶媒の置換を繰り返すことにより、タンパク質溶液中に存在していた溶媒の量をゼロに近づけることができる。水溶性溶媒に置換する工程の後半では、透析膜は使用しなくてもよい。
タンパク質溶液を作成する工程と溶媒を水溶性溶媒に置換する工程との間に、タンパク質を型枠に流し込み所定の形状に成形する工程を設けるか、あるいは、溶媒を水溶性溶媒に置換する工程の後にゲルを切断して所定の形状に成形する工程を設けてもよい。
以上のようにして、例えば水分率が85.0~99.9質量%のタンパク質のゲルを得ることができる。このような水分率を有するゲルは、生体の人工軟骨や人工皮膚、創傷治癒剤、ドラッグデリバリーシステムにおける薬物封入キャリアー、緩衝材などに有用である。
物品が多孔質体である場合、上述の方法により得られたゲルを乾燥する乾燥工程を更に設ける。乾燥工程において脱離する水分により透過孔が形成され、例えば連続孔を有する多孔質体が得られる。
乾燥工程では、真空凍結乾燥を用いることが好ましい。真空凍結乾燥時の真空度は、好ましくは200パスカル(Pa)以下、より好ましくは150パスカル以下、更に好ましくは100パスカル以下である。真空乾燥によりタンパク質ゲルから水分が蒸発し、この蒸発潜熱により温度が下がり凍結状態となる。真空凍結乾燥時のポリペプチドの温度は、好ましくは70℃以下、より好ましくは60℃以下、更に好ましくは50℃以下である。なお、真空凍結乾燥に先立って、-10~-45℃の温度で10~36時間程度予備凍結を行ってもよい。凍結乾燥後の多孔質体における水分率は、好ましくは5.0質量%以下、より好ましくは3.0質量%以下である。
物品がパーティクルである場合、まず、物品がゲルの場合と同様に、所定の溶媒中に、タンパク質を溶解させると共に、キサンツレン酸を溶解又は分散させてタンパク質溶液を作製する。次いで、タンパク質溶液中の溶媒を水溶性溶媒に置換することによりタンパク質の水溶液を得る工程と、タンパク質の水溶液を乾燥する工程とを更に設ける。
タンパク質溶液を水溶性溶媒に置換することによりタンパク質の水溶液を得る工程は、物品がゲルである場合のタンパク質溶液中の溶媒を水溶性溶媒に置換する工程と同様であってよい。タンパク質の水溶液を乾燥する工程は、物品が多孔質体である場合の乾燥工程と同様であってよい。
以上説明したような物品にキサンツレン酸を含ませる工程においては、物品の全質量に対するキサンツレン酸の含有量の下限値は、好ましくは0.02質量%以上、より好ましくは0.1質量%以上、更に好ましくは0.2質量%以上、特に好ましくは0.4質量%以上である。一方、当該含有量の上限値は、特に限定されるものではないが、好ましくは2.0質量%以下である。当該含有量は、0.02~2.0質量%、0.1~2.0質量%、0.2~2.0質量%、又は0.4~2.0質量%であってもよい。
以上のとおり、本実施形態では、物品にキサンツレン酸を含ませることによって、物品における微生物の増殖を抑制することができ、また、物品の耐紫外線性を向上させることができる。
このようなキサンツレン酸の特性を利用して、一実施形態においては、微生物の増殖を抑制することができ、かつ、耐紫外線性を向上させることができる人工タンパク質成形体が提供される。すなわち、一実施形態に係る人工タンパク質成形体は、人工タンパク質とキサンツレン酸とを含む。なお、「人工タンパク質」とは、例えば、遺伝子組換え技術により微生物等で製造したタンパク質や、化学合成により製造されたタンパク質等を意味する。
人工タンパク質は上述した構造タンパク質であってよく、好ましい構造タンパク質の態様も上述したのと同様である。人工タンパク質成形体は、例えば、繊維、フィルム、モールド成形体、ゲル、多孔質体、パーティクル等であってよい。
人工タンパク質成形体におけるキサンツレン酸の含有量の下限値は、人工タンパク質成形体の全質量に対して、好ましくは0.02質量%以上、より好ましくは0.1質量%以上、更に好ましくは0.2質量%以上、特に好ましくは0.4質量%以上である。一方、当該含有量の上限値は、特に限定されるものではないが、人工タンパク質成形体の全質量に対して、好ましくは2.0質量%以下である。当該含有量は、人工タンパク質成形体の全質量に対して、0.02~2.0質量%、0.1~2.0質量%、0.2~2.0質量%、又は0.4~2.0質量%であってもよい。
繊維、フィルム、モールド成形体、ゲル、多孔質体、パーティクル等の人工タンパク質成形体の製造方法は、それぞれ上述したのと同様であってよい。すなわち、人工タンパク質成形体の製造方法は、一実施形態(人工タンパク質成形体の内部にキサンツレン酸を存在させる場合)において、人工タンパク質とキサンツレン酸とを含む溶液(人工タンパク質溶液)を準備する工程と、溶液を用いて成形を行う工程とを備えている。
溶液を準備する工程において、溶液中のキサンツレン酸の含有量の下限値は、溶液の全質量に対して、好ましくは0.02質量%以上、より好ましくは0.1質量%以上、更に好ましくは0.2質量%以上、特に好ましくは0.4質量%以上である。一方、当該含有量の上限値は、特に限定されるものではないが、溶液の全質量に対して、好ましくは2.0質量%以下である。当該含有量は、溶液の全質量に対して、0.02~2.0質量%、0.1~2.0質量%、0.2~2.0質量%、又は0.4~2.0質量%であってもよい。
以上説明した人工タンパク質成形体は、上述した種々の用途に好適に用いられ、その中でも、微生物の増殖を抑制すべき用途及び耐紫外線性を必要とする用途に特に好適に用いられる。
以下、実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
<微生物増殖抑制効果>
(実施例1)
大腸菌(Escherichia coli)野生株(W3110)を、10μg/mlのチアミンを含むM9培地(7mg/mlのK2HPO4,3mg/mlのKH2PO4,0.5mg/mlのNaCl,1mg/mlのNH4Cl,1mg/mlのグルコース,1mMのMgSO4・7H2O,14.7μg/mlのCaCl2)で培養した。なお、培地を調製する際、キサンツレン酸の溶解性を考慮して、水に代えてトリス塩酸緩衝液(pH8)を用いた。得られた一晩培養物を、1mMのキサンツレン酸(和光純薬工業(株))を含む新たな培地20mlで0.8%となるように希釈して試料溶液を得た。この試料溶液について、Nano Photometer(Implen社)を用いて1時間ごとに吸光度(OD600)を測定した。
(実施例1)
大腸菌(Escherichia coli)野生株(W3110)を、10μg/mlのチアミンを含むM9培地(7mg/mlのK2HPO4,3mg/mlのKH2PO4,0.5mg/mlのNaCl,1mg/mlのNH4Cl,1mg/mlのグルコース,1mMのMgSO4・7H2O,14.7μg/mlのCaCl2)で培養した。なお、培地を調製する際、キサンツレン酸の溶解性を考慮して、水に代えてトリス塩酸緩衝液(pH8)を用いた。得られた一晩培養物を、1mMのキサンツレン酸(和光純薬工業(株))を含む新たな培地20mlで0.8%となるように希釈して試料溶液を得た。この試料溶液について、Nano Photometer(Implen社)を用いて1時間ごとに吸光度(OD600)を測定した。
(比較例1)
キサンツレン酸を含まない新たな培地で一晩培養物を希釈した以外は、実施例1と同様にして、試料溶液の作製及び測定を行った。
キサンツレン酸を含まない新たな培地で一晩培養物を希釈した以外は、実施例1と同様にして、試料溶液の作製及び測定を行った。
実施例1及び比較例1における吸光度(OD600)の測定結果を図1に示す。図1より、実施例1では、比較例1に比べて、吸光度(OD600)が小さくなっており、大腸菌の増殖が抑制されていることが分かる。
(実施例2)
1.クモ糸タンパク質(クモ糸フィブロイン:PRT410)の製造
(クモ糸タンパク質をコードする遺伝子の合成、及び発現ベクターの構築)
ネフィラ・クラビペス(Nephila clavipes)由来のフィブロイン(GenBankアクセッション番号:P46804.1、GI:1174415)の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号1で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン(以下、「PRT410」ともいう。)を設計した。
1.クモ糸タンパク質(クモ糸フィブロイン:PRT410)の製造
(クモ糸タンパク質をコードする遺伝子の合成、及び発現ベクターの構築)
ネフィラ・クラビペス(Nephila clavipes)由来のフィブロイン(GenBankアクセッション番号:P46804.1、GI:1174415)の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号1で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン(以下、「PRT410」ともいう。)を設計した。
配列番号1で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列と、そのN末端に付加された配列番号6で示されるアミノ酸配列(タグ配列及びヒンジ配列)とを有する。
設計したPRT410をコードする核酸を合成した。当該核酸には、5’末端にNdeIサイト及び終止コドン下流にEcoRIサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター(pUC118)にクローニングした。その後、同核酸をNdeI及びEcoRIで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターpET-22b(+)に組換えて発現ベクターを得た。
得られたpET22b(+)発現ベクターによって、大腸菌BLR(DE3)を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む2mLのLB培地で15時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む100mLのシード培養用培地(表1)にOD600が0.005となるように添加した。培養液温度を30℃に保ち、OD600が5になるまで約15時間、フラスコ培養を行って、シード培養液を得た。
当該シード培養液を500mlの生産培地(表2)を添加したジャーファーメンターにOD600が0.05となるように添加した。培養液温度を37℃に保ち、pH6.9で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液(グルコース455g/1L、Yeast Extract 120g/1L)を1mL/分の速度で添加した。培養液温度を37℃に保ち、pH6.9で一定に制御して培養した。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の20%に維持しながら、20時間培養を行った。その後、1Mのイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)を培養液に対して終濃度1mMになるよう添加し、PRT799を発現誘導させた。IPTG添加後20時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。IPTG添加前とIPTG添加後の培養液から調製した菌体を用いてSDS-PAGEを行い、IPTG添加に依存したPRT799に相当するサイズのバンドの出現により、PRT799の発現を確認した。
(クモ糸フィブロインの精製)
IPTGを添加してから2時間後に回収した菌体を20mM Tris-HCl buffer(pH7.4)で洗浄した。洗浄後の菌体を約1mMのPMSFを含む20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.4)に懸濁させ、高圧ホモジナイザー(GEA Niro Soavi社)で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.4)で洗浄した。洗浄後の沈殿物を100mg/mLの濃度になるように8M グアニジン緩衝液(8M グアニジン塩酸塩、10mM リン酸二水素ナトリウム、20mM NaCl、1mM Tris-HCl、pH7.0)で懸濁し、60℃で30分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ(三光純薬株式会社製のセルロースチューブ36/32)を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質(PRT799)を遠心分離により回収した。回収した凝集タンパク質から凍結乾燥機で水分を除き、PRT799の凍結乾燥粉末を得た。
IPTGを添加してから2時間後に回収した菌体を20mM Tris-HCl buffer(pH7.4)で洗浄した。洗浄後の菌体を約1mMのPMSFを含む20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.4)に懸濁させ、高圧ホモジナイザー(GEA Niro Soavi社)で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.4)で洗浄した。洗浄後の沈殿物を100mg/mLの濃度になるように8M グアニジン緩衝液(8M グアニジン塩酸塩、10mM リン酸二水素ナトリウム、20mM NaCl、1mM Tris-HCl、pH7.0)で懸濁し、60℃で30分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ(三光純薬株式会社製のセルロースチューブ36/32)を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質(PRT799)を遠心分離により回収した。回収した凝集タンパク質から凍結乾燥機で水分を除き、PRT799の凍結乾燥粉末を得た。
2.クモ糸タンパク質フィルムの製造
添加する必要量のキサンツレン酸(東京化成工業株式会社:CAS 59-00-7)を0.1N水酸化ナトリウムに溶解させて、キサンツレン酸溶液を調製した。上記のようにして得たクモ糸タンパク質粉末(PRT410)を約9w/v%溶液になるように30%エタノール水溶液に加え、ガラスバイアル中で撹拌してタンパク質溶液を得た。
添加する必要量のキサンツレン酸(東京化成工業株式会社:CAS 59-00-7)を0.1N水酸化ナトリウムに溶解させて、キサンツレン酸溶液を調製した。上記のようにして得たクモ糸タンパク質粉末(PRT410)を約9w/v%溶液になるように30%エタノール水溶液に加え、ガラスバイアル中で撹拌してタンパク質溶液を得た。
得られたキサンツレン酸溶液及びタンパク質溶液を、キサンツレン酸の含有量がタンパク質の含有量に対して1.21w/w%となるように、ガラスバイアル中で混合した。次いで、ガラスバイアルを密閉し、95℃に加熱してタンパク質を溶解させた後、ガラスバイアルを開封し、シャーレ上に溶液を展開した状態で、室温で2日間放置して乾燥させた。得られたフィルムを、70%メタノール水溶液に30分間以上浸漬した。浸漬後、メタノール水溶液を捨て、フィルムを乾燥させた。
大腸菌BLRを、20μg/mlのカナマイシンを含むLB培地5mlに接種し、37℃で一晩培養した。次いで、CDA-1000(Sysmex社)を用いて菌数が約1×109個であることを確認した後、菌数(接種直後生菌数)が約1×105個となるように希釈し、培養液を得た。
続いて、JIS Z 2801を参考にして、抗菌活性値の測定を行った。具体的には、まず、100mg分のフィルム(サンプルフィルム)をシャーレ中で培養液500μlに浸した。培養液が乾かわないようにPETフィルムをサンプルフィルムに載せ、シャーレをパラフィルムで密封し、37℃で24時間培養した。サンプルフィルムと培養液を50mlチューブに移動させ、シャーレに20mlの希釈液(Sysmex社 セルパック)を加え、シャーレに残った培養液を洗い、その液を50mlチューブに移した後、チューブを氷上で保存した。次いで、サンプルを200倍に更に希釈して、CDA-1000(Sysmex社)を用いて菌数(培養後生菌数)を測定した。測定結果から、下記式に従って抗菌活性値を算出した。
抗菌活性値={log(対照試料の培養後生菌数)-log(対照試料の接種直後生菌数)}-{log(試験試料の培養後生菌数)-log(試験試料の接種直後生菌数)}
なお、対照試料には、キサンツレン酸溶液を用いなかった以外は実施例1と同様にして作製したフィルムを用いた。
抗菌活性値={log(対照試料の培養後生菌数)-log(対照試料の接種直後生菌数)}-{log(試験試料の培養後生菌数)-log(試験試料の接種直後生菌数)}
なお、対照試料には、キサンツレン酸溶液を用いなかった以外は実施例1と同様にして作製したフィルムを用いた。
(比較例2,3)
キサンツレン酸に代えて、比較例2ではラナセット(株式会社田中直染料店)、比較例3ではデルクス(株式会社田中直染料店)をそれぞれ30%エタノール水溶液に溶解させた溶液を用いた以外は、実施例1と同様にしてフィルムの作製及び抗菌活性値の測定を行った。
キサンツレン酸に代えて、比較例2ではラナセット(株式会社田中直染料店)、比較例3ではデルクス(株式会社田中直染料店)をそれぞれ30%エタノール水溶液に溶解させた溶液を用いた以外は、実施例1と同様にしてフィルムの作製及び抗菌活性値の測定を行った。
(実施例3)
大腸菌の培養時に、カナマイシンを含むLB培地に代えて、カナマイシンを含まないLB培地を用いた以外は、実施例1と同様にしてフィルムの作製及び抗菌活性値の測定を行った。この場合、培養液は、大腸菌以外の細菌も含んでいた。
大腸菌の培養時に、カナマイシンを含むLB培地に代えて、カナマイシンを含まないLB培地を用いた以外は、実施例1と同様にしてフィルムの作製及び抗菌活性値の測定を行った。この場合、培養液は、大腸菌以外の細菌も含んでいた。
(比較例4,5)
キサンツレン酸に代えて、比較例4ではラナセット(株式会社田中直染料店)、比較例5ではデルクス(株式会社田中直染料店)をそれぞれ30%エタノール水溶液に溶解させた溶液を用いた以外は、実施例3と同様にしてフィルムの作製及び抗菌活性値の測定を行った。
キサンツレン酸に代えて、比較例4ではラナセット(株式会社田中直染料店)、比較例5ではデルクス(株式会社田中直染料店)をそれぞれ30%エタノール水溶液に溶解させた溶液を用いた以外は、実施例3と同様にしてフィルムの作製及び抗菌活性値の測定を行った。
実施例2及び比較例2,3の抗菌活性値を図2(a)に、実施例3及び比較例4,5の抗菌活性値を図2(b)にそれぞれ示す。図2より、キサンツレン酸を含むフィルム(実施例2,3)は、キサンツレン酸を含まないフィルム(比較例2~5)に比べて、抗菌活性値が大きく、大腸菌あるいはそれ以外の細菌に対して増殖抑制効果を示すことが分かる。
<耐紫外線性向上効果>
(実施例4)
[タンパク質繊維の製造]
(ドープ液の調製)
ジメチルスルホキシド(DMSO)に、上述のクモ糸フィブロイン(PRT410)を濃度24質量%となるよう添加した後、溶解促進剤としてLiClを濃度4.0質量%添加し、さらに色素を濃度0.2質量%、酢酸亜鉛二水和物を濃度0.22質量%添加し、スターラーを使用して20時間溶解させた。その後、ゴミと泡を取り除き、ドープ液とした。ドープ液の溶液粘度は90℃において7000cP(センチポアズ)であった。
(実施例4)
[タンパク質繊維の製造]
(ドープ液の調製)
ジメチルスルホキシド(DMSO)に、上述のクモ糸フィブロイン(PRT410)を濃度24質量%となるよう添加した後、溶解促進剤としてLiClを濃度4.0質量%添加し、さらに色素を濃度0.2質量%、酢酸亜鉛二水和物を濃度0.22質量%添加し、スターラーを使用して20時間溶解させた。その後、ゴミと泡を取り除き、ドープ液とした。ドープ液の溶液粘度は90℃において7000cP(センチポアズ)であった。
(紡糸)
上記のようにして調整したドープ液をシリンジに充填し、0.2mm径のモノホールノズルからギアポンプを用い100質量%メタノール凝固浴槽中へ吐出させた。吐出量は41~67mg/分に調整した。凝固後、100質量%メタノール洗浄浴槽で洗浄及び延伸を行った。洗浄及び延伸後、60度のホットローラーを用いて乾燥させ、得られた繊維を巻き取った。
上記のようにして調整したドープ液をシリンジに充填し、0.2mm径のモノホールノズルからギアポンプを用い100質量%メタノール凝固浴槽中へ吐出させた。吐出量は41~67mg/分に調整した。凝固後、100質量%メタノール洗浄浴槽で洗浄及び延伸を行った。洗浄及び延伸後、60度のホットローラーを用いて乾燥させ、得られた繊維を巻き取った。
[UV照射条件]
岩崎電気株式会社製超促進耐候性試験機「アイスーパーUVテスターSUV-W161」を用いて、温度63℃、湿度65%rh、照度115mW/平方センチメートル、0.5~17時間の条件で、巻き取った繊維にUVを照射した。
岩崎電気株式会社製超促進耐候性試験機「アイスーパーUVテスターSUV-W161」を用いて、温度63℃、湿度65%rh、照度115mW/平方センチメートル、0.5~17時間の条件で、巻き取った繊維にUVを照射した。
[繊維強度測定条件]
得られた繊維をつかみ具間距離20mmの試験紙片に接着剤で固定し、温度20℃、相対湿度65%の条件で、インストロン社製引張試験機3342を用いて引張速度10cm/分で応力・伸度・タフネス測定を行った。ロードセル容量10N、つかみ冶具はクリップ式とした。測定値はサンプル数n=5の平均値とした。
得られた繊維をつかみ具間距離20mmの試験紙片に接着剤で固定し、温度20℃、相対湿度65%の条件で、インストロン社製引張試験機3342を用いて引張速度10cm/分で応力・伸度・タフネス測定を行った。ロードセル容量10N、つかみ冶具はクリップ式とした。測定値はサンプル数n=5の平均値とした。
タフネスは、次の算出式に従って求めた。
タフネス=[E/(r2×π×L)×1000](単位:MJ/m3)
ここで、
E:破壊エネルギー(単位:J)
r:繊維の半径(単位:mm)
π:円周率
L:引張り試験測定時のつかみ具間距離:20mm
タフネス=[E/(r2×π×L)×1000](単位:MJ/m3)
ここで、
E:破壊エネルギー(単位:J)
r:繊維の半径(単位:mm)
π:円周率
L:引張り試験測定時のつかみ具間距離:20mm
(比較例6)
キサンツレン酸を用いなかった以外は、実施例4と同様にして、サンプルの作製及び評価を行った。
キサンツレン酸を用いなかった以外は、実施例4と同様にして、サンプルの作製及び評価を行った。
実施例4及び比較例6について、UV照射開始から0.5時間後と4時間後の伸度及びタフネスから、下記式に従って算出した伸度及びタフネスの維持率を表3に示す。
伸度の維持率(%)=0.5時間後の伸度(%)/4時間後の伸度(%)×100
タフネスの維持率(%)=0.5時間後のタフネス(MJ/m3)/4時間後のタフネス(MJ/m3)×100
伸度の維持率(%)=0.5時間後の伸度(%)/4時間後の伸度(%)×100
タフネスの維持率(%)=0.5時間後のタフネス(MJ/m3)/4時間後のタフネス(MJ/m3)×100
表3より、キサンツレン酸を含む繊維(実施例4)は、キサンツレン酸を含まない繊維(比較例6)に比べて、伸度及びタフネスのいずれについても維持率が高く、耐紫外線性向上効果を示すことが分かる。
Claims (33)
- キサンツレン酸を含む、微生物増殖抑制剤。
- 物品における微生物の増殖を抑制する方法であって、前記物品にキサンツレン酸を含ませる工程を備える方法。
- 前記物品がタンパク質を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記タンパク質が構造タンパク質である、請求項3に記載の方法。
- 前記構造タンパク質がフィブロインを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記フィブロインがクモ糸フィブロインである、請求項5に記載の方法。
- 前記物品の全質量に対して0.02~2.0質量%の割合で前記キサンツレン酸を含ませる、請求項2~6の何れか1項に記載の方法。
- 前記物品が繊維である、請求項2~7の何れか1項に記載の方法。
- キサンツレン酸を含む、耐紫外線性向上剤。
- 物品の耐紫外線性を向上させる方法であって、前記物品にキサンツレン酸を含ませる工程を備える方法。
- 前記物品がタンパク質を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記タンパク質が構造タンパク質である、請求項11に記載の方法。
- 前記構造タンパク質がフィブロインを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記フィブロインがクモ糸フィブロインである、請求項13に記載の方法。
- 前記物品の全質量に対して0.02~2.0質量%の割合で前記キサンツレン酸を含ませる、請求項12~14の何れか1項に記載の方法。
- 前記物品が繊維である、請求項12~15の何れか1項に記載の方法。
- 人工タンパク質とキサンツレン酸とを含む、人工タンパク質成形体。
- 前記人工タンパク質が構造タンパク質である、請求項17に記載の人工タンパク質成形体。
- 前記構造タンパク質がフィブロインを含む、請求項18に記載の人工タンパク質成形体。
- 前記フィブロインがクモ糸フィブロインである、請求項19に記載の人工タンパク質成形体。
- 前記キサンツレン酸の含有量が、前記人工タンパク質成形体の全質量に対して0.02~2.0質量%である、請求項17~20の何れか1項に記載の人工タンパク質成形体。
- 前記人工タンパク質成形体が繊維である、請求項17~21の何れか1項に記載の人工タンパク質成形体。
- 人工タンパク質とキサンツレン酸とを含む溶液を準備する工程と、
前記溶液を用いて成形を行う工程と、を備える、人工タンパク質成形体の製造方法。 - 前記人工タンパク質が構造タンパク質である、請求項23に記載の人工タンパク質成形体の製造方法。
- 前記構造タンパク質がフィブロインを含む、請求項24に記載の人工タンパク質成形体の製造方法。
- 前記フィブロインがクモ糸フィブロインである、請求項25に記載の人工タンパク質成形体の製造方法。
- 前記溶液中の前記キサンツレン酸の含有量が前記溶液の全質量に対して0.02~2.0質量%である、請求項24~26の何れか1項に記載の人工タンパク質成形体の製造方法。
- 人工タンパク質とキサンツレン酸とを含む、人工タンパク質溶液。
- 前記人工タンパク質が構造タンパク質である、請求項28に記載の人工タンパク質溶液。
- 前記構造タンパク質がフィブロインを含む、請求項29に記載の人工タンパク質溶液。
- 前記フィブロインがクモ糸フィブロインである、請求項30に記載の人工タンパク質溶液。
- 前記キサンツレン酸の含有量が前記人工タンパク質溶液の全質量に対して0.02~2.0質量%である、請求項28~31の何れか1項に記載の人工タンパク質溶液。
- キサンツレン酸を含む、着色剤。
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