JP2022001669A - タンパク質繊維の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】紡糸安定性、延伸安定性に優れたタンパク質繊維の製造方法を提供すること。【解決手段】タンパク質、第１溶媒、第２溶媒及び任意に溶解促進剤を含有する紡糸原液を、第３溶媒及び任意に溶解促進剤を含有する凝固浴液に導入して、タンパク質を凝固させる工程を含み、第２溶媒が、低級アルコール、ケトン及び水からなる群より選択される少なくとも１種である、タンパク質繊維の製造方法。【選択図】なし

Description

本発明は、タンパク質繊維の製造方法に関する。

従来から、人造繊維の製造方法として、ノズルから吐出させた紡糸原液を凝固浴液中で凝固させて繊維を形成する湿式紡糸法及び乾湿式紡糸法が知られている。湿式紡糸法及び乾湿式紡糸法は、タンパク質を主成分として含むタンパク質繊維を製造する際にも利用されている（例えば、特許文献１参照）。

湿式紡糸法及び乾湿式紡糸法等によってタンパク質繊維を製造する方法として、タンパク質を溶媒に溶解させたタンパク質溶液をドープ液（紡糸原液）として使用し、ドープ液を口金から脱溶媒槽の凝固浴液に押し出し、ドープ液から溶媒を脱離させるとともに繊維形成して未延伸糸とし、タンパク質繊維を得ることが知られている（例えば、特許文献２参照）。

タンパク質を溶解する溶媒としては、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びギ酸等が知られている。また、湿式紡糸法及び乾湿式紡糸法によるタンパク質繊維の製造の際、溶媒を除去し、繊維形成させるためにメタノール、エタノール、２−プロパノール等の低級アルコールが凝固浴液として汎用されている。

特許第５５４０１５４号公報 国際公開第２０１３／０６５６５１号

一般的に、未延伸糸は、繊維を構成する分子の配列が整っておらず、その強度及び物性が一定となりにくい。そこで、延伸を行うことにより、糸に適度な強度及び性能を付与することが可能である。例えば、タンパク質繊維を延伸する際、その延伸倍率がより高くなるほど、延伸応力はより大きくなる。

しかし、延伸時の延伸応力が高くなると、延伸製糸時にタンパク質繊維が破断を生じやすくなる。そこで、本発明の目的は、紡糸安定性、延伸安定性に優れたタンパク質繊維の製造方法を提供することにある。

本発明は、以下の［１］〜［２１］を提供する。
［１］
タンパク質、第１溶媒、第２溶媒及び任意に溶解促進剤を含有する紡糸原液を、第３溶媒及び任意に溶解促進剤を含有する凝固浴液に導入して、タンパク質を凝固させる工程を含み、
第２溶媒が、低級アルコール、ケトン及び水からなる群より選択される少なくとも１種である、タンパク質繊維の製造方法。
［２］
第３溶媒が、低級アルコール、ケトン及び水からなる群より選択される少なくとも１種である、［１］に記載の方法。
［３］
第１溶媒が、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ヘキサフルオロイソプロパノール、ヘキサフルオロアセトン、ギ酸及び水からなる群より選択される少なくとも１種であり、
ただし、第１溶媒が水であるとき、紡糸原液は溶解促進剤を更に含有する、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
低級アルコールが、メタノール又はエタノールである、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
タンパク質が、構造タンパク質である、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
構造タンパク質が、フィブロインである、［５］に記載の方法。
［７］
フィブロインが、クモ糸フィブロインである、［６］に記載の方法。
［８］
第２溶媒の含有量が、タンパク質１００質量部に対して３５質量部以下である、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
第２溶媒の含有量が、タンパク質１００質量部に対して３質量部以上である、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］
第２溶媒が、メタノール、エタノール及びアセトンからなる群から選択される１種を含む、［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］
第２溶媒が、第３溶媒と同一の溶媒である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］
凝固させたタンパク質を延伸する工程を更に含む、［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］
タンパク質及び第１溶媒を含有する紡糸原液を、第２溶媒を含有する凝固浴液に導入して、タンパク質を凝固させる工程を含む、タンパク質繊維の製造方法であって、タンパク質が、平均粒子径４〜１５ｎｍの粒子形状で紡糸原液中に分散している、タンパク質繊維の製造方法。
［１４］
第２溶媒が、低級アルコール、ケトン及び水からなる群より選択される少なくとも１種である、［１３］に記載の方法。
［１５］
第３溶媒が、低級アルコール、ケトン及び水からなる群より選択される少なくとも１種である、［１３］又は［１４］に記載の方法。
［１６］
第１溶媒が、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ヘキサフルオロイソプロパノール、ヘキサフルオロアセトン、ギ酸及び水からなる群より選択される少なくとも１種であり、
ただし、第１溶媒が水であるとき、紡糸原液は溶解促進剤を更に含有する、［１３］〜［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］
タンパク質が、構造タンパク質である、［１３］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］
構造タンパク質が、フィブロインである、［１７］に記載の方法。
［１９］
フィブロインが、クモ糸フィブロインである、［１８］に記載の方法。
［２０］
凝固させたタンパク質を延伸する工程を更に含む、［１３］〜［１９］のいずれかに記載の方法。
［２１］
タンパク質を含有する紡糸原液であって、タンパク質が平均粒子径４〜１５ｎｍの粒子形状で紡糸原液中に分散している、紡糸原液。

本発明のタンパク質繊維の製造方法は、クモ糸タンパク質に対して優れた繊維形成能（製糸性）を有する。加えて、本発明のタンパク質繊維の製造方法は、繊維形成能（製糸性）が確保でき、従来の紡糸法と比べて、ノズルとローラー間で引き取り可能な最大延伸倍率が上がるため、より高速な製糸条件を採用することもできる。本発明のタンパク質繊維の製造方法により、タンパク質繊維を提供することができる。

タンパク質繊維を製造するための紡糸装置の一例を概略図である。

本発明の一実施形態に係るタンパク質繊維の製造方法について、以下に詳述する。

本明細書において、「優れた紡糸安定性」とは、紡糸原液から未延伸のタンパク質繊維を得る際に、糸切れが生じにくいことを意味する。

本明細書において、「優れた延伸安定性」とは、未延伸のタンパク質繊維を延伸する際に、糸が破断しにくいことを意味する。

本実施形態に係るタンパク質繊維の製造方法では、タンパク質、第１溶媒、第２溶媒及を含有する紡糸原液を、凝固浴液に導入して、タンパク質を凝固させる工程を含む。ここで、紡糸原液は、任意に溶解促進剤を更に含有してもよい。また、凝固浴液は、第２溶媒を含有し、任意に溶解促進剤を含有してもよい。

本実施形態で使用する紡糸原液は、タンパク質繊維の主原料となるタンパク質と、第１溶媒と、第２溶媒と、を含有する。

＜紡糸原液＞
（タンパク質）
タンパク質は、特に限定されるものではなく、遺伝子組換え技術により微生物等により製造されたものであってもよく、化学的に合成されたものであってもよく、また天然由来のタンパク質を精製したものであってもよい。

本明細書において、用語「主成分として含む」とは、タンパク質繊維の全質量の少なくとも５０質量％がタンパク質であることを意味する。タンパク質繊維におけるタンパク質が占める質量割合は、６０質量％以上、６５質量％以上、７０質量％以上、７５質量％以上、８０質量％以上、９０質量％以上であってもよい。

上記タンパク質は、例えば、構造タンパク質、又は当該構造タンパク質に由来する人造タンパク質であってもよい。構造タンパク質とは、生体内で構造、形態等を形成又は保持するタンパク質を意味する。構造タンパク質としては、例えば、フィブロイン、ケラチン、コラーゲン、エラスチン、レシリン等を挙げることができる。好ましいタンパク質は、フィブロイン、又はフィブロインに由来する人造タンパク質である。上述した構造タンパク質及び当該構造タンパク質に由来する人造タンパク質は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

フィブロインは、例えば、絹フィブロイン、クモ糸フィブロイン、及びホーネットシルクフィブロインからなる群より選択される１種以上であってよい。特に、構造タンパク質は、絹フィブロイン、クモ糸フィブロイン又はこれらの組み合わせであってもよい。絹フィブロインとクモ糸フィブロインとを併用する場合、絹フィブロインの割合は、例えば、クモ糸フィブロイン１００質量部に対して、４０質量部以下、３０質量部以下、又は１０質量部以下であってよい。

絹フィブロインとしては、セリシン除去絹フィブロイン、セリシン未除去絹フィブロイン、又はこれらの組み合わせであってもよい。セリシン除去絹フィブロインは、絹フィブロインを覆うセリシン、及びその他の脂肪分などを除去して精製したものである。このようにして精製した絹フィブロインは、好ましくは、凍結乾燥粉末として用いられる。セリシン未除去絹フィブロインは、セリシンなどが除去されていない未精製の絹フィブロインである。

クモ糸フィブロインは、天然クモ糸タンパク質、又は天然クモ糸タンパク質に由来する人造タンパク質であってもよい。

天然クモ糸タンパク質としては、例えば、大吐糸管しおり糸タンパク質、横糸タンパク質、及び小瓶状腺タンパク質が挙げられる。大吐糸管しおり糸タンパク質は、結晶領域と非晶領域（無定形領域とも言う。）からなる繰り返し領域を持つため、高い応力と伸縮性を併せ持つ。一方、横糸タンパク質は、結晶領域を持たず、非晶領域からなる繰り返し領域を持つという特徴を有する。横糸タンパク質は、大吐糸管しおり糸タンパク質と比べると応力は劣るが、高い伸縮性を持つ。

大吐糸管しおり糸タンパク質は、クモの大瓶状腺で産生され、強靭性に優れるという特徴も有する。大吐糸管しおり糸タンパク質としては、例えば、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する大瓶状腺スピドロインＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２、並びにニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来するＡＤＦ３及びＡＤＦ４が挙げられる。ＡＤＦ３は、ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つである。天然クモ糸タンパク質に由来する人造タンパク質は、これらのしおり糸タンパク質に由来する人造タンパク質であってもよい。ＡＤＦ３に由来する人造タンパク質は、比較的合成し易く、強伸度及びタフネスの点で優れた特性を有する。

横糸タンパク質は、クモの鞭毛状腺（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ ｇｌａｎｄ）で産生される。横糸タンパク質としては、例えばアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する鞭毛状絹タンパク質（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）が挙げられる。

天然クモ糸タンパク質に由来する人造タンパク質は、組換えクモ糸タンパク質であってよい。組換えクモ糸タンパク質としては、天然型クモ糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体等が挙げられる。このような人造タンパク質の好適な一例は、大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えクモ糸タンパク質である。例えば、組換えクモ糸タンパク質は、いくつかの異種タンパク質生産系で産生されており、その製造方法として、トランスジェニック・ヤギ、トランスジェニック・カイコ、又は組換え植物若しくは哺乳類細胞が利用されている。

組換えクモ糸タンパク質は、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から（Ａ）_ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から１又は複数の（Ａ）_ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）_ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている方法に準じて行うことができる。

大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えクモ糸タンパク質及びカイコシルクに由来する人造タンパク質としては、例えば、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。ここで、式１中、（Ａ）_ｎモチーフは、Ａはアラニン残基を示し、ｎは２〜２７、２〜２０、４〜２７、４〜２０、８〜２０、１０〜２０、４〜１６、８〜１６、又は１０〜１６の整数であってよい。また（Ａ）_ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ＲＥＰは２〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは２〜３００の整数を示す。式１で表されるアミノ酸配列中に含まれるグリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）及びアラニン（Ａｌａ）の合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して４０％以上が好ましく、６０％以上、又は７０％以上であってよい。複数存在する（Ａ）_ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。大吐糸管しおり糸に由来する人造タンパク質の具体例としては、配列番号１又は配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。

横糸タンパク質に由来するタンパク質としては、例えば、式２：［ＲＥＰ２］_ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式２中、ＲＥＰ２はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘはアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選ばれる一つのアミノ酸を示す。ｏは８〜３００の整数を示す。）を挙げることができる。横糸タンパク質に由来するポリペプチドとしては、式２：ＲＥＰ２で示されるアミノ酸配列の単位を１０以上、好ましくは２０以上、より好ましくは３０以上含むポリペプチドが挙げられる。横糸タンパク質に由来するポリペプチドは、大腸菌等の微生物を宿主とした組み換えタンパク質生産を行う場合、生産性の観点から、分子量が５００ｋＤａ以下であることが好ましく、より好ましくは３００ｋＤａ以下であり、さらに好ましくは２００ｋＤａ以下である。具体的には配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号３で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分的な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＦ３６０９０、ＧＩ：７１０６２２４）のリピート部分及びモチーフに該当するＮ末端から１２２０残基目から１６５９残基目までのアミノ酸配列（ＰＲ１配列と記す。）と、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ３８８４７、ＧＩ：２８３３６４９）のＣ末端から８１６残基目から９０７残基目までのＣ末端アミノ酸配列を結合し、結合した配列のＮ末端に配列番号４で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。

コラーゲンに由来するタンパク質として、例えば、式３：［ＲＥＰ３］_ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式３中、ｐは５〜３００の整数を示す。ＲＥＰ３は、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはグリシン（Ｇｌｙ）以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号５で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号６で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。

レシリンに由来するタンパク質として、例えば、式４：［ＲＥＰ４］_ｑで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式４中、ｑは４〜３００の整数を示す。ＲＥＰ４はＳｅｒ−Ｊ−Ｊ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｕ−Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、特にアスパラギン酸（Ａｓｐ）、セリン（Ｓｅｒ）及びスレオニン（Ｔｈｒ）からなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にプロリン（Ｐｒｏ）、アラニン（Ａｌａ）、スレオニン（Ｔｈｒ）及びセリン（Ｓｅｒ）からなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ４は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号７で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＰ ６１１１５７、Ｇｌ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のスレオニン（Ｔｈｒ）をセリン（Ｓｅｒ）に置換し、かつ９５残基目のアスパラギン（Ａｓｎ）をアスパラギン酸（Ａｓｐ）に置換した配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１３で示されるアミノ酸配列（タグ配列）が付加されたものである。

エラスチンに由来するタンパク質として、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。具体的には、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号６で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。

ケラチンに由来するタンパク質として、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。具体的には、配列番号９で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＣＹ３０４６６のアミノ酸配列）を含むタンパク質を挙げることができる。

（人造タンパク質の製造方法）
タンパク質繊維に含まれるタンパク質は、例えば、所望のタンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。

所望のタンパク質をコードする核酸の製造方法は、特に制限されない。例えば、天然の構造タンパク質をコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングする方法、又は、化学的に合成する方法によって、当該核酸を製造することができる。核酸の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した構造タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ ｐｌｕｓ １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製及び／又は確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸を合成してもよい。

調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、目的とするタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。

発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、目的とするタンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。

宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。

原核生物の宿主の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ等を挙げることができる。ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ等を挙げることができる。セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス等を挙げることができる。バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス等を挙げることができる。ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等を挙げることができる。ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム等を挙げることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス等を挙げることができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ等を挙げることができる。

原核生物を宿主とする場合、目的タンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）等を挙げることができる。

真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。

真核生物を宿主とする場合、所望のタンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。

発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。

タンパク質は、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。

所望の組換えタンパク質は、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。

宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。

炭素源としては、上記形質転換微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。

大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５〜４０℃である。培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。

また、培養中、必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。

形質転換された宿主により生産された組換えタンパク質は、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法で単離及び精製することができる。例えば、当該タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。

上記クロマトグラフィーとしては、フェニル−トヨパール（東ソー）、ＤＥＡＥ−トヨパール（東ソー）、セファデックスＧ−１５０（ファルマシアバイオテク）を用いたカラムクロマトグラフィーが好ましく用いられる。

また、タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてタンパク質の不溶体を回収する。回収したタンパク質の不溶体はタンパク質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法によりタンパク質の精製標品を得ることができる。当該タンパク質が細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該タンパク質を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、その培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。

（紡糸原液）
紡糸原液は、タンパク質、第１溶媒、第２溶媒及び任意に溶解促進剤を混合して、調製することができる。具体的には、タンパク質及び第１溶媒を混合し、任意に溶解促進剤を更に添加した後、第２溶媒を添加して調製することができる。必要に応じて、タンパク質及び第１溶媒の混合液を加温してもよい。加温する温度は、第１溶媒の沸点に応じて調整することができ、例えば、３５〜９０℃、３５〜５０℃、３５〜４５℃、３５〜４０℃、５０〜９０℃、６０〜８０℃、８０〜９０℃であってもよい。第２溶媒の添加は、第２溶媒の沸点に応じて調整することができ、例えば、１０〜９０℃、１０〜５０℃、５０〜９０℃、１０〜４０℃、６０〜８０℃、１０〜３０℃、１５〜３０℃、又は２０〜３０℃で行うことが好ましい。タンパク質は、紡糸原液中で第１溶媒及び第２溶媒の混合溶媒に溶解又は分散した状態で存在する。

タンパク質繊維は、上述したタンパク質を紡糸したものであり、上述したタンパク質を主成分として含む。

紡糸原液におけるタンパク質の含有量は、紡糸原液の全質量を基準として、１〜９０質量％であってもよい。また、タンパク質の含有量は、紡糸原液の全質量を基準して、１質量％以上、２質量％以上、４質量％以上、７質量％以上、１０質量％以上、又は１５質量％以上であってよく、４０質量％以下、３５質量％以下、３０質量％以下、又は２５質量％以下であってもよい。

第１溶媒は、タンパク質を溶解し得る溶媒であればよく、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ヘキサフルオロイソプロノール（ＨＦＩＰ）、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡｃ）、ギ酸（ＦＡ）及び水からなる群より選択される少なくとも１種であってもよい。第１溶媒は、１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。

紡糸原液における第１溶媒の含有量は、紡糸原液１００質量部に対して、５０〜９０質量部であってもよい。また、第１溶媒の含有量は、紡糸原液１００質量部に対して、５０質量部以上、６０質量部以上、７０質量部以上、又は８０質量部以上であってもよく、９０質量部以下、８０質量部以下、７０質量部以下、６０質量部以下、５０質量部以下であってもよい。第１溶媒の含有量は、紡糸原液１００質量部に対して、好ましくは６０〜９０質量部、より好ましくは６０〜８５質量部、更に好ましくは６５〜８５質量部、更により好ましくは７０〜８０質量部、更によりまた好ましくは７０〜７５質量部である。

第２溶媒は、紡糸原液から第１溶媒を除去してタンパク質を凝固（脱溶媒）できる溶媒であればよい。第２溶媒は、例えば、低級アルコール、ケトン及び水からなる群より選択される少なくとも１種であってもよい。第２溶媒は、１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。

低級アルコールは、炭素原子数１〜５の直鎖状又は分岐鎖状アルコールを意味し、具体的には、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、アミルアルコール、ネオペンチルアルコール等が挙げられる。好ましい低級アルコールはメタノール又はエタノールであり、より好ましい低級アルコールはエタノールである。

ケトンとは、式（１）：Ｒ^１−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ^２で表される化合物である。式（１）中、Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立に炭素原子数１〜６の直鎖状又は分岐鎖状アルキル基を示す。このようなケトンの具体例としては、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジイソブチルケトンが挙げられる。また、Ｒ^１及びＲ^２は、互いに単結合を介して環構造を形成していてもよい。このような環状ケトンの具体例としては、シクロペンタノン、シクロヘキサノンが挙げられる。好ましいケトンは、アセトン又はメチルエチルケトンである。

製造コストをより低減でき、かつ蒸留による回収のしやすさの観点から、アセトンを第２溶媒として使用することが好ましい。

紡糸原液における第２溶媒の含有量は、溶解するタンパク質１００質量部に対して、１〜９０質量部であってもよい。また、第２溶媒の含有量は、溶解するタンパク質１００質量部に対して、１質量部以上、５質量部以上、１０質量部以上、２０質量部以上、３０質量部以上、４０質量部以上、５０質量部以上、６０質量部以上、７０質量部以上、又は８０質量部以上であってもよく、９０質量部以下、８０質量部以下、７０質量部以下、６０質量部以下、５０質量部以下、４０質量部以下、３０質量部以下、２０質量部以下、１０質量部以下、又は５質量部以下であってもよい。第２溶媒の含有量は、溶解するタンパク質１００質量部に対して、好ましくは１〜５０質量部、より好ましくは１〜４０質量部、更に好ましくは５〜４０質量部、更により好ましくは５〜３０質量部、更によりまた好ましくは５〜２０質量部である。第２溶媒の含有量が、上述の範囲内である場合、タンパク質繊維の応力がより一層大きくなり、延伸安定性がよりよくなる。なお、本明細書における応力とは、タンパク質繊維が繊維軸方向の引張外力により破断するまでの最大荷重を、タンパク質繊維の９０００ｍあたりの質量で除した値（単位：ｇ／Ｄ）を意味する。

紡糸原液は、溶解促進剤を更に含有していてもよい。紡糸原液が溶解促進剤を含有することにより、タンパク質をより容易に、かつより多量に溶解させることができる。特に、第１溶媒が水である場合、紡糸原液は溶解促進剤を含有する。

溶解促進剤は、タンパク質及び溶解溶媒の種類等に応じて、適宜選択することができる。溶解促進剤は、例えば、以下に示すルイス酸とルイス塩基とからなる無機塩であってよい。ルイス塩基としては、例えば、オキソ酸イオン（硝酸イオン、過塩素酸イオン等）、金属オキソ酸イオン（過マンガン酸イオン等）、ハロゲン化物イオン、チオシアン酸イオン、シアン酸イオン等が挙げられる。ルイス酸としては、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン等の金属イオン、アンモニウムイオン等の多原子イオン、錯イオン等が挙げられる。溶解溶媒が有機溶媒である場合、無機塩としては、例えば、塩化リチウム、臭化リチウム、ヨウ化リチウム、硝酸リチウム、過塩素酸リチウム、及びチオシアン酸リチウム等のリチウム塩、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硝酸カルシウム、過塩素酸カルシウム、及びチオシアン酸カルシウム等のカルシウム塩、塩化鉄、臭化鉄、ヨウ化鉄、硝酸鉄、過塩素酸鉄、及びチオシアン酸鉄等の鉄塩、並びに、塩化アルミニウム、臭化アルミニウム、ヨウ化アルミニウム、硝酸アルミニウム、過塩素酸アルミニウム、及びチオシアン酸アルミニウム等のアルミニウム塩、塩化カリウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、硝酸カリウム、過塩素酸カリウム、及びチオシアン酸カリウム等のカリウム塩、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びチオシアン酸ナトリウム等のナトリウム塩、塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、硝酸亜鉛、過塩素酸亜鉛、及びチオシアン酸亜鉛等の亜鉛塩、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、硝酸マグネシウム、過塩素酸マグネシウム、及びチオシアン酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化バリウム、臭化バリウム、ヨウ化バリウム、硝酸バリウム、過塩素酸バリウム、及びチオシアン酸バリウム等のバリウム塩、塩化ストロンチウム、臭化ストロンチウム、ヨウ化ストロンチウム、硝酸ストロンチウム、過塩素酸ストロンチウム、及びチオシアン酸ストロンチウム等のストロンチウム塩などが挙げられる。これらの無機塩は、溶解溶媒に対するタンパク質の溶解促進剤として用いられる。紡糸原液が溶解促進剤（上記の無機塩）を含有することにより、タンパク質が紡糸原液中に高い濃度で溶解可能となる。これにより、タンパク質繊維の生産効率がより一層向上し、かつタンパク質繊維の高品質化と応力等の物性の向上等が期待される。無機塩は、塩化リチウム及び塩化カルシウムからなる群より選択される少なくとも１種であってよい。溶解促進剤は、１種単独、又は２種以上を組み合わせて用いたものであってよい。

溶解促進剤の含有量は、紡糸原液の全質量に対して、０．１質量％以上、１質量％以上、４質量％以上、７質量％以上、１０質量％以上、又は１５質量％以上であってよく、２０質量％以下、１６質量％以下、１２質量％以下、又は９質量％以下であってよい。

紡糸原液は、必要に応じて、各種の添加剤を更に含有していてよい。添加剤としては、例えば、可塑剤、レベリング剤、架橋剤、結晶核剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、着色剤、フィラー、合成樹脂が挙げられる。添加剤の含有量は、紡糸原液中のタンパク質全量１００質量部に対して、５０質量部以下であってよい。

＜タンパク質繊維の製造方法＞
本実施形態に係るタンパク質繊維の製造方法は、上述の紡糸原液を、第３溶媒及び任意に溶解促進剤を含有する凝固浴液に導入して、タンパク質を凝固させる工程（紡糸工程）を含む。本実施形態に係るタンパク質繊維の製造方法は、湿式紡糸、乾湿式紡糸等の公知の紡糸方法に準じて実施することができる。

＜紡糸工程＞
紡糸工程では、紡糸原液を凝固浴液に接触させ、タンパク質を凝固させる。紡糸工程を含め、本実施形態のタンパク質繊維の製造方法は、例えば、図１に示す紡糸装置を使用して実施することができる。

図１は、タンパク質繊維を製造するための紡糸装置の一例を概略的に示す説明図である。図１に示す紡糸装置１０は、乾湿式紡糸用の紡糸装置の一例であり、押出し装置１と、凝固浴槽２０と、洗浄浴槽（延伸浴槽）２１と、乾燥装置４とを上流側から順に有している。

押出し装置１は貯槽７を有しており、ここに紡糸原液（ドープ液）６が貯留される。凝固浴槽２０に凝固浴液１１が貯留される。紡糸原液６は、上述したタンパク質を溶解溶媒に溶解させて得られる。紡糸原液６は、貯槽７の下端部に取り付けられたギアポンプ８により、凝固浴液１１との間にエアギャップ１９を開けて設けられたノズル９から押し出される。押し出された紡糸原液６は、エアギャップ１９を経て、凝固浴槽２０の凝固浴液１１内に供給（導入）される。凝固浴液１１内で紡糸原液から溶媒が除去されてタンパク質が凝固する。凝固したタンパク質は、洗浄浴槽２１に導かれ、洗浄浴槽２１内の洗浄液１２により洗浄された後、洗浄浴槽２１内に設置された第一ニップローラ１３と第二ニップローラ１４により、乾燥装置４へと送られる。このとき、例えば、第二ニップローラ１４の回転速度を第一ニップローラ１３の回転速度よりも速く設定すると、回転速度比に応じた倍率で延伸されたタンパク質繊維３６が得られる。洗浄液１２中で延伸されたタンパク質繊維は、洗浄浴槽２１内を離脱してから、乾燥装置４内を通過する際に乾燥され、その後、ワインダーにて巻き取られる。このようにして、タンパク質繊維が、紡糸装置１０により、最終的にワインダーに巻き取られた巻回物５として得られる。なお、１８ａ〜１８ｇは糸ガイドである。

凝固浴液１１は、第３溶媒を含有する。第３溶媒として、第２溶媒で定義した溶媒を使用できる。第２溶媒と第３溶媒は、互いに同じものであってもよく、異なっていてもよい。凝固浴液１１は、適宜水を含んでいてもよい。

第３溶媒の含有量は、凝固浴液の全質量に対して、６０質量％以上であるのが好ましく、７０質量％以上であるのがより好ましく、８０質量％以上であるのが更に好ましく、９０質量％以上であるのが更により好ましく、９５質量％以上であるのが特に好ましい。凝固浴液１１は、第２溶媒のみからなるものであってもよい。

凝固浴液１１が水を含む場合、水の含有量は、凝固浴液の全質量に対して、３０質量％以下であるのが好ましい。水の含有量は、凝固浴液の全質量に対して、２０質量％以下であってもよく、１０質量％以下であってもよい。

凝固浴液１１は、溶解促進剤を更に含んでもよい。凝固浴液における溶解促進剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いたものであってもよい。

凝固浴液１１の温度は、特に限定されないが、４０℃以下、３０℃以下、２５℃以下、２０℃以下、１０℃以下、又は５℃以下であってよい。凝固浴液１１の温度は、特に限定されないが、−３０℃以上、−２０℃以上、又は−１０℃以上であってよく、作業性、冷却コスト等の観点から、０℃以上であることが好ましい。凝固浴液１１の温度が上記範囲内であれば、ボイドの発生が充分に抑制され、タンパク質繊維の応力がより増大し、かつ所望のタンパク質繊維を安定供給しやすくなる。なお、凝固浴液１１の温度は、例えば、熱交換器を内部に備える凝固浴槽２０と、冷却循環装置と、を有する紡糸装置１０を用いることにより調整することができる。例えば、凝固浴槽２０内に設置した熱交換器に冷却循環装置で所定の温度まで冷却した媒体を流すことにより、凝固浴液１１と熱交換器間での熱交換により温度を上記範囲内に調整することができる。この場合、媒体として凝固浴液１１に用いる溶媒（例えば、メタノール）を循環することでより効率的な冷却が可能となる。

凝固浴液１１が貯留される凝固浴槽２０は複数設けられていてもよい。この場合、ノズル９から押し出された紡糸原液６が直接供給（導入）される凝固浴槽２０の凝固浴液（第１凝固浴液）が、第３溶媒を含有していればよい。すなわち、凝固浴液１１が貯留される凝固浴槽２０は複数設けられている場合、第１凝固浴液以外の凝固浴液（他の凝固浴液）は、第３溶媒を含有していなくてもよい。他の凝固浴液の温度は、４０℃以下、３０℃以下、２５℃以下、２０℃以下、１０℃以下、又は５℃以下であってもよく、０℃以上、又は４０℃超であってもよい。作業性、冷却コスト等の観点から、凝固浴液の温度は０℃以上であることが好ましい。なお、凝固浴液１１の温度は、例えば、熱交換器を内部に備える凝固浴槽２０と、冷却循環装置と、を有する紡糸装置１０を用いることにより調整することができる。例えば、凝固浴槽２０内に設置した熱交換器に冷却循環装置で所定の温度まで冷却した媒体を流すことにより、凝固浴液１１と熱交換器間での熱交換により温度を上記範囲内に調整することができる。この場合、媒体として凝固浴液１１に用いる溶媒を循環することでより効率的な冷却が可能となる。

凝固したタンパク質は、凝固浴槽又は洗浄浴槽を離脱してから、そのままワインダーにて巻き取られてもよいし、乾燥装置を通過し、乾燥され、その後、ワインダーにて巻き取られてもよい。

凝固したタンパク質が凝固浴液１１中を通過する距離（実質的には、糸ガイド１８ａから糸ガイド１８ｂまでの距離）は、脱溶媒が効率的に行えるよく、ノズル９からの紡糸原液の押出速度（吐出速度）等に応じて決定されるものであってよい。凝固したタンパク質（又は紡糸原液）の凝固浴液１１中での滞留時間は、凝固したタンパク質が凝固浴液１１中を通過する距離、ノズル９からの紡糸原液６の押出速度等に応じて決定されるものであってよい。滞留時間は、例えば、０．０１〜３分であってよく、０．０５〜０．１５分であることが好ましい。また、凝固浴液１１中で延伸（前延伸）をしてもよい。

＜延伸工程＞
本実施形態のタンパク質繊維の製造方法は、凝固させたタンパク質を延伸する工程（延伸工程）を更に含むものであってよい。延伸工程は、例えば、凝固浴槽２０内で実施してもよく、洗浄浴槽２１内で実施してもよい。延伸工程はまた、空気中で実施することもできる。

洗浄浴槽２１内で実施される延伸は、温水中、温水に有機溶剤等を加えた溶液中等で行う、いわゆる湿熱延伸であってもよい。湿熱延伸の温度は５０〜９０℃であることが好ましい。該温度が５０℃以上であると、糸の細孔径を安定的に小さくすることができる。また、温度が９０℃以下であると、温度設定が容易であり紡糸安定性が向上する。温度は７５〜８５℃がより好ましい。

延伸工程における凝固させたタンパク質の延伸倍率が高いほど、槽内で走行する糸が弛まずに安定することから、隣接して走行する糸に干渉することなく工程通過性が向上する。なお、本実施形態のタンパク質繊維の製造方法では、最大延伸倍率を向上することができ、延伸倍率を制御する範囲が広げられるため、タンパク質繊維の繊維径を制御することができる。

最終的な延伸倍率は、その下限値が、未延伸糸（又は前延伸糸）に対して、好ましくは、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上のうちのいずれかであり、上限値が、好ましくは４０倍以下、３０倍以下、２０倍以下、１５倍以下、１４倍以下、１３倍以下、１２倍以下、１１倍以下、１０倍以下である。

乾燥及び／又は脱溶媒後の未延伸糸は、水中で延伸をしてもよく、２段以上の多段延伸をしてもよい。水中延伸は、２０〜９０℃の水温で行われることが好ましい。延伸後の糸は、５０〜２００℃の乾熱で５〜６００秒間熱固定することが好ましい。この熱固定により、常温における寸法安定性が得られる。

なお、タンパク質繊維を得る際に洗浄浴槽２１内で実施される延伸は、温水中、温水に有機溶剤等を加えた溶液中等で行う、いわゆる湿熱延伸であってもよい。この湿熱延伸の温度としては、例えば、５０〜９０℃であってよく、７５〜８５℃が好ましい。湿熱延伸では、未延伸糸（又は前延伸糸）を、例えば、１〜１０倍延伸することができる。

また、本発明は、タンパク質及び第１溶媒を含有する紡糸原液を、第２溶媒を含有する凝固浴液に導入して、タンパク質を凝固させる工程を含む、タンパク質繊維の製造方法であって、紡糸原液に含まれるタンパク質の平均粒子径が４〜１５ｎｍである、タンパク質繊維の製造方法という他の側面も備える。

紡糸原液において、タンパク質は、その平均粒子径が４〜１５ｎｍの大きさで分散している。タンパク質の平均粒子径は、４〜１３ｎｍであることが好ましく、４〜１０ｎｍであることがより好ましく、４〜８ｎｍであることが特に好ましい。タンパク質の平均粒子径が上記範囲であると、凝固後、延伸させて得られるタンパク質繊維の応力がより高くなり、タフネスも向上する。

タンパク質の平均粒子径を上記範囲内となるように調整する手段としては、例えば、紡糸原液に特定の量の第２溶媒を添加する方法が挙げられる。第１溶媒、第２溶媒の各定義は、上述のとおりである。

紡糸原液中のタンパク質の平均粒子径は、粒度分布の平均値である。本発明において、粒子径は、例えば、特定の粒子形状と特定の物理的な条件を仮定したときに導かれる物理学的法則を用いて測定した量に基づいて、算出されたものであってもよい。例えば、動的光散乱（光子相関法）を用いて、粒子に光を照射した時に得られる散乱光が示す揺らぎを光子相関法で解析することにより、粒子径や粒度分布を求めてもよい。タンパク質の平均粒子径は、ダイナミック光散乱光度計ＤＬＳ−８０００（商品名、大塚電子株式会社製）を用いた動的光散乱によって粒子径分布を測定し、散乱光強度基準の平均粒子径を算出することができる。

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

１．クモ糸タンパク質（クモ糸フィブロイン：ＰＲＴ７９９）の製造
（１）クモ糸タンパク質をコードする遺伝子の合成、及び発現ベクターの構築
ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（以下、「ＰＲＴ７９９」ともいう。）を設計した。

配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列と、そのＮ末端に付加された配列番号１１で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列を含むアミノ酸配）とを有する。配列番号１２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ７９９）は、配列番号１０で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含むアミノ酸配列）を付加したものである。

設計したＰＲＴ７９９をコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト及び終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。

得られたｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターによって、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表１）にＯＤ_６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ_６００が５になるまで約１５時間、フラスコ培養を行って、シード培養液を得た。

当該シード培養液を５００ｍｌの生産培地（表２）を添加したジャーファーメンターにＯＤ_６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持した。

生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持しながら、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、ＰＲＴ７９９を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存したＰＲＴ７９９に相当するサイズのバンドの出現により、ＰＲＴ７９９の発現を確認した。

（２）クモ糸フィブロインの精製
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ社）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ グアニジン緩衝液（８Ｍ グアニジン塩酸塩、１０ｍＭ リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質（ＰＲＴ７９９）を遠心分離により回収した。回収した凝集タンパク質から凍結乾燥機で水分を除き、ＰＲＴ７９９の凍結乾燥粉末を得た。

２．タンパク質繊維の製造
（１）紡糸原液の調製
改変フィブロイン（ＰＲＴ７９９）の凍結乾燥粉末２４質量％と、第１溶媒としてのギ酸（純度９８％）７６質量％とを混合し、４０℃のアルミブロックヒーターで１２時間加温し、ＰＲＴ７９９が溶解した溶液を得た。得られた溶液の温度が２３℃になるまで冷ました後、下記の質量比となるように第２溶媒を溶液に添加した。
（ａ）ＰＲＴ７９９：第２溶媒＝１００：５
（ｂ）ＰＲＴ７９９：第２溶媒＝１００：１０
（ｃ）ＰＲＴ７９９：第２溶媒＝１００：２０
すなわち、紡糸原液における第２溶媒の含有量は、それぞれ（ａ）５ｗ／ｗ％、（ｂ）１０ｗ／ｗ％、（ｃ）２０ｗ／ｗ％である。
１０〜１２時間混合した後、目開き１μｍの金属フィルターで濾過し、脱泡して、濃度の異なる３種類の紡糸原液（ドープ液）を調製した。

（２）紡糸
卓上の紡糸装置を用いて湿式紡糸を行なった。調製した紡糸原液をリザーブタンクに充填した。不活性ガス（窒素）を用いて、内径２０μｍの孔径のノズルから紡糸原液を吐出し、１００質量％エタノール凝固浴槽中へ吐出させた。タンパク質が凝固した後、凝固浴槽中で延伸を行った。ついで、メタノール洗浄浴、水洗浄浴で順次洗浄及び延伸した後、乾熱板を用いて乾燥させ、タンパク質繊維（原糸）を得て、これを巻き取った。
湿式紡糸の条件は以下のとおりである。
吐出圧：０．５ｂａｒ
凝固浴延伸倍率：０倍
水洗浄浴延伸倍率：７〜１０倍
凝固浴液の温度：５℃
乾燥温度：６０℃

（３）延伸と物性測定
光学顕微鏡を用いて繊維の直径を求めた。
温度：２５℃、相対湿度：６０％ＲＨの雰囲気温度で、引張り試験機（島津社製小型卓上試験機ＥＺ−Ｓ）を用いて、タンパク質繊維の応力を測定し、タフネスを算出した。サンプルは厚紙で型枠を作製したものに貼り付け、つかみ具間距離は２０ｍｍ、引張り速度は１０ｍｍ／ｍｉｎで行った。ロードセル容量１Ｎ、つかみ冶具はクリップ式とした。測定値はサンプル数ｎ＝５の平均値とした。
タフネスは、以下の式に基づいて算出した。
［Ｅ／（ｒ^２×π×Ｌ）×１０００］（単位：ＭＪ／ｍ^３）
但し、
Ｅ 破壊エネルギー（単位：Ｊ）
ｒ 繊維の半径（単位：ｍｍ）
π 円周率
Ｌ 引張り試験測定時のつかみ具間距離：２０ｍｍ

得られた各タンパク質繊維の応力（ＭＰａ）、タフネス（ＭＪ／ｍ^３）、巻き取り時間の評価結果を以下に示す。なお、表３〜５中、「第２溶媒の含有量」は、紡糸原液に含まれるタンパク質を１００質量部としたときの第２溶媒の含有量（質量部）を意味する。

（第２溶媒：エタノール、第３溶媒：エタノール）

表３中、応力及びタフネスは、対応する比較例の数値を１００％としたときの相対値で示す。また、比較例２及び３は延伸できなかったため、実施例２ａ、２ｂ、３の応力及びタフネスは、比較例１の数値を１００％としたときの相対値で示した。第２溶媒としてエタノールを用いて、第２溶媒を紡糸原液に添加した場合と添加しない場合について、３種類の延伸倍率の条件で延伸を行った。延伸倍率が７．８倍の場合では、実施例１で得られたタンパク質繊維は、比較例２で得られたタンパク質繊維に比べて、応力が大きく、巻き取り時間も長くなった。また、延伸倍率が８．２倍又は８．５倍の場合では、比較例２及び３では延伸ができなかった。これに対し、実施例２ａ、２ｂ、３の方法では、高い応力及びタフネスを有するタンパク質繊維が得られた。

（第２溶媒：メタノール、第３溶媒、メタノール）

表４中、応力及びタフネスは、対応する比較例の数値を１００％としたときの相対値で示す。また、比較例５は延伸できなかったため、実施例４及び５の応力及びタフネスは、比較例４の数値を１００％としたときの相対値で示した。第２溶媒としてメタノールを用いて、同様に延伸を行い、得られたタンパク質繊維の物性を評価した。実施例４で得られたタンパク質繊維は、比較例４で得られたタンパク質繊維と比べて、より細く、応力及びタフネスが優れていた。また、延伸倍率が９．０である条件では、比較例５では延伸ができなかった。一方、実施例５の方法では、高い応力及びタフネスを有するタンパク質繊維が得られた。

（第２溶媒：アセトン、第３溶媒：アセトン）

表５中、応力及びタフネスは、対応する比較例の数値を１００％としたときの相対値で示す。第２溶媒としてアセトンを用いて、同様に延伸を行い、得られたタンパク質繊維の物性を評価した。実施例６、７で得られたタンパク質繊維は、それぞれ比較例６、７で得られたタンパク質繊維と比べて、応力及びタフネスが優れていた。

（４）紡糸原液中のタンパク質粒子の粒子径測定
改変フィブロイン（ＰＲＴ７９９）の凍結乾燥粉末２４質量％と、第１溶媒（ギ酸）と、第２溶媒（エタノール）とを表６に記載の質量比で混合した後、４０℃のアルミブロックヒーターで１２時間加温し、ＰＲＴ７９９が溶解した紡糸原液１〜３を得た。

得られた紡糸原液１〜３中に分散しているタンパク質（ＰＲＴ７９９）の平均粒子径を、ダイナミック光散乱光度計ＤＬＳ−８０００（商品名、大塚電子株式会社製）を用いて測定した。各紡糸原液中の平均粒子径を表７に示す。

１…押出し装置、２…未延伸糸製造装置、３…湿熱延伸装置、４…乾燥装置、６…紡糸原液、１０…紡糸装置、２０…凝固浴槽、２１…洗浄浴槽、３６…タンパク質繊維。

Claims (6)

1. タンパク質、第１溶媒、第２溶媒及び任意に溶解促進剤を含有する紡糸原液を、第３溶媒及び任意に溶解促進剤を含有する凝固浴液に導入して、前記タンパク質を凝固させる工程を含み、
   前記第２溶媒が、低級アルコール、ケトン及び水からなる群より選択される少なくとも１種である、タンパク質繊維の製造方法。
2. 前記第３溶媒が、低級アルコール、ケトン及び水からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１溶媒が、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ヘキサフルオロイソプロパノール、ヘキサフルオロアセトン、ギ酸及び水からなる群より選択される少なくとも１種であり、
   ただし、前記第１溶媒が水であるとき、前記紡糸原液は前記溶解促進剤を含有する、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記タンパク質が、構造タンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記構造タンパク質が、フィブロインである、請求項４に記載の方法。
6. 前記フィブロインが、クモ糸フィブロインである、請求項５に記載の方法。
   

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