WO2024034631A1 - 改変フィブロイン - Google Patents

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WO2024034631A1
WO2024034631A1 PCT/JP2023/029040 JP2023029040W WO2024034631A1 WO 2024034631 A1 WO2024034631 A1 WO 2024034631A1 JP 2023029040 W JP2023029040 W JP 2023029040W WO 2024034631 A1 WO2024034631 A1 WO 2024034631A1
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WO
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motif
amino acid
modified fibroin
residues
acid sequence
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Application number
PCT/JP2023/029040
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Inventor
浩之 中村
知香子 佐藤
雄介 伊藤
圭司 沼田
和晴 荒川
暢明 河野
Original Assignee
Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
国立大学法人京都大学
慶應義塾
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Publication date
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    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01F—CHEMICAL FEATURES IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OF CARBON FILAMENTS
    • D01F4/00—Monocomponent artificial filaments or the like of proteins; Manufacture thereof
    • D01F4/02—Monocomponent artificial filaments or the like of proteins; Manufacture thereof from fibroin

Definitions

  • the present invention relates to modified fibroin.
  • Fibroin is a main component of threads produced by insects and spiders, and is a type of fibrous protein. Fibroin has excellent properties such as strength and elongation, and is expected to be applied to various fields such as medicine, aviation, and clothing.
  • Patent Document 1 describes a modified fibroin comprising a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , in which the domain sequence is REP This corresponds to substitution of one or more amino acid residues with amino acid residues with a large hydrophobicity index and/or insertion of one or more amino acid residues with a large hydrophobicity index into REP.
  • a modified fibroin having an amino acid sequence that includes a region with a locally large hydrophobicity index.
  • modified fibroin disclosed in Patent Document 1 has improved bending strength when formed into a molded product.
  • modified fibroin that can improve the crystal orientation of a molded body has not been known so far.
  • an object of the present invention is to provide a modified fibroin that allows a molded article with an improved degree of crystal orientation to be obtained.
  • the present invention is based on the discovery that there is an inverse correlation between the GQ motif content and the degree of crystal orientation of a molded body. That is, by reducing the GQ motif content of the modified fibroin, the degree of crystal orientation of a molded article containing the modified fibroin can be improved and stable spinning can be achieved.
  • the present invention relates to the following inventions, for example.
  • Formula 1 [(A) n motif-REP] m
  • Formula 2 [(A) n motif-REP] m - (A) comprising a domain sequence represented by n motif, A modified fibroin having a GQ motif content of 12.5% or less.
  • (A) n motif represents an amino acid sequence composed of 4 to 27 amino acid residues
  • (A) alanine residue, serine residue, relative to the total number of amino acid residues in n motif The total number of threonine residues and valine residues is 80% or more.
  • REP indicates an amino acid sequence composed of 10 to 200 amino acid residues.
  • m represents an integer from 8 to 300.
  • a plurality of (A) n motifs may have the same or different amino acid sequences.
  • a plurality of REPs may have the same or different amino acid sequences.
  • [2] The modified fibroin according to [1], which contains a PX 3 motif (X 3 represents an amino acid residue other than a proline residue).
  • [3] The modified fibroin according to [2], wherein X 3 is an alanine residue.
  • the modified fibroin according to [3] which has a PX 3 motif content of 10% or more.
  • [5] The modified fibroin according to any one of [1] to [4], which has a PQ motif content of 5% or less.
  • [6] The modified fibroin according to any one of [1] to [5], which contains a GP motif.
  • An expression vector comprising the nucleic acid according to [7] and a nucleic acid having one or more regulatory sequences operably linked to the nucleic acid sequence.
  • the expression vector according to [8] which is a plasmid vector or a virus vector.
  • [11] A composition comprising the modified fibroin according to any one of [1] to [6].
  • the composition according to [12] which is in the form of a fiber, a film, a porous body, or a molded body.
  • a molded article with an improved degree of crystal orientation can be obtained, and modified fibroin that can be stably spun can be provided.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram schematically showing an example of a spinning device for producing modified fibroin fibers.
  • the modified fibroin according to this embodiment has a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m - (A) n motif. and the GQ motif content is 12.5% or less. Since the modified fibroin according to the present embodiment has a reduced GQ motif content, the degree of crystal orientation of a molded article containing the modified fibroin is improved.
  • the modified fibroin according to this embodiment refers to fibroin whose domain sequence is different from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin.
  • "Naturally derived fibroin” as used herein is also represented by formula 1: [(A) n motif-REP] m or formula 2: [(A) n motif-REP] m - (A) n motif. It is a protein that contains a domain sequence that is
  • domain sequence refers to a crystalline region (typically corresponding to the (A) n motif of the amino acid sequence) and an amorphous region (typically corresponding to the REP of the amino acid sequence) unique to fibroin. ), and is an amino acid sequence represented by formula 1: [(A) n motif-REP] m or formula 2: [(A) n motif-REP] m - (A) n motif. means an array.
  • each [(A) n motif-REP] is (i) The ratio of the number of alanine residues to the total number of amino acid residues is 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21 %, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, It may be 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% or 50%, (ii) The ratio of the number of glycine residues to the total number of amino acid residues is 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31 %, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 4
  • the ratio of the number of tyrosine residues to the total number of amino acid residues is 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% or 10%.
  • the ratio of the number of glutamine residues to the total number of amino acid residues is 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16 %, 17%, 18%, 19% or 20%
  • the ratio of the number of arginine residues to the total number of amino acid residues may be 0%, 1%, 2%, 3%, 4% or 5%.
  • the n motif indicates an amino acid sequence composed of 4 to 27 amino acid residues.
  • the n motif is preferably an amino acid sequence composed of 4 to 20 amino acid residues, more preferably an amino acid sequence composed of 4 to 16 amino acid residues, and even more preferably 4 to 12 amino acid residues. It is an amino acid sequence composed of residues.
  • the (A) n motif may have a total number of alanine residues, serine residues, threonine residues, and valine residues of 80% or more, but 85% or more of the total number of amino acid residues in the (A) n motif. It is preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, and 100% (selected from alanine residue, serine residue, threonine residue and valine residue). ) is even more preferred.
  • the number of alanine residues relative to the total number of amino acid residues in the (A) n motif may be 80% or more, 85% or more, or 90% or more.
  • At least seven of the (A) n motifs present in the domain sequence are composed of only alanine residues. Consisting only of alanine residues means that the (A) n motif is (A) n (A represents an alanine residue, n is an integer of 4 to 27, preferably an integer of 4 to 20, more preferably (indicates an integer from 4 to 16).
  • the multiple (A) n motifs present in the modified fibroin according to this embodiment may have the same or different amino acid sequences.
  • REP indicates an amino acid sequence composed of 10 to 200 amino acid residues.
  • the REP may have a total number of glycine residues, serine residues, glutamine residues, and alanine residues of 40% or more, and 45% or more of the total number of amino acid residues in the REP. Often, it may be 50% or more, 55% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more.
  • the REP may have a total number of glycine residues, serine residues, proline residues, and tyrosine residues of 50% or more, and 55% or more of the total number of amino acid residues in the REP. Often, it may be 60% or more, it may be 65% or more, it may be 70% or more, it may be 75% or more, it may be 80% or more, it may be 85% or more, It may be 90% or more, and may be 95% or more.
  • REP may have the same amino acid sequence as the amorphous region unique to naturally-derived fibroin, or may have a different amino acid sequence.
  • the modified fibroin according to this embodiment preferably includes at least one consensus sequence selected from the group consisting of (a), (b), and (c) below in at least two REPs.
  • (a) GPZ 1 is any amino acid residue, preferably each independently from an alanine residue, a serine residue, a glycine residue, a tyrosine residue, a proline residue and a glutamine residue. selected.
  • (b) GGZ 2 is any amino acid residue, preferably tyrosine residue, proline residue, arginine residue, serine residue, alanine residue, threonine residue, asparagine residue and each independently selected from glutamine residues.
  • (c) GQQ is any amino acid residue, preferably tyrosine residue, proline residue, arginine residue, serine residue, alanine residue, threonine residue, asparagine residue and each independently selected from glutamine residues.
  • a plurality of REPs present in the modified fibroin according to this embodiment may have the same amino acid sequence or may have different amino acid sequences.
  • m in Formulas 1 and 2 means the number of repeats of the amino acid sequence represented by [(A) n motif-REP], and is an integer from 8 to 300.
  • the modified fibroin according to this embodiment may further have an amino acid sequence (N-terminal sequence and C-terminal sequence) added to either or both of the N-terminal side and C-terminal side of the domain sequence.
  • N-terminal sequence and C-terminal sequence are not limited thereto, typically they are regions that do not have repeated amino acid motifs characteristic of fibroin, and consist of about 100 amino acid residues.
  • the modified fibroin according to this embodiment may be a protein produced by a heterologous host using genetic recombination technology.
  • the modified fibroin according to this embodiment may be a composition containing modified fibroin and unavoidable contaminants derived from a host (heterologous host). Examples of contaminants include proteins derived from the host (heterologous host) (proteins other than the desired recombinant protein), lipids, and nucleic acids.
  • the modified fibroin according to this embodiment has a GQ motif content of 12.5% or less.
  • GQ motif refers to an amino acid sequence consisting of X 1 GQX 2 (where X 1 represents an amino acid residue other than a glycine residue, and X 1 and X 2 may be the same or different.
  • the amino acid sequence consisting of X 1 GQX 2 is GQ
  • if there is no amino acid residue on the C-terminal side of Q it is defined as an amino acid sequence consisting of X 1 GQ.
  • GQ motif content is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m - (A)
  • All REPs contained in the sequence from the n motif to the C-terminus of the domain sequence are removed from the domain sequence as the target region, and the amino acid sequence consisting of X 1 GQX 2 contained in the target region is extracted. do.
  • the number w is obtained by multiplying the extracted number by the number of amino acid residues 2 (corresponding to the number of amino acid residues in the amino acid sequence consisting of GQ).
  • y is the total number of amino acid residues contained in the target region.
  • GQ motif content is calculated as w/y (%).
  • the GQ motif content of the modified fibroin according to this embodiment is preferably 10% or less, 7.5% or less, 5% or less, 4% or less, 2.5% or less, or 0%.
  • the modified fibroin according to this embodiment may contain a PX 3 motif.
  • PX 3 motif refers to an amino acid sequence consisting of PX 3 (wherein, X 3 represents an amino acid residue other than a proline residue).
  • PX 3 motif content is a value calculated by the same method as the above-mentioned "GQ motif content”.
  • X 3 in the PX 3 motif may be an alanine residue.
  • the PX 3 motif content of the modified fibroin according to the present embodiment may be, for example, 10% or more, 12% or more, 15% or more, 18% or more, 20% or more, or 25% or more.
  • the PX 3 motif content of the modified fibroin according to the present embodiment is not particularly limited to an upper limit, but may be 50% or less, 45% or less, 40% or less, 35% or less, or 30% or less.
  • the modified fibroin according to this embodiment may have a PQ motif content of 5% or less.
  • PQ motif refers to an amino acid sequence consisting of X 4 PQX 5 (where X 4 represents an amino acid residue other than a proline residue, and Indicates that X 4 and X 5 may be the same or different.
  • the amino acid sequence consisting of X 4 PQX 5 is Similarly, if there is no amino acid residue on the C-terminal side of Q, it is an amino acid sequence consisting of X 4 PQ).
  • “PQ motif content” is a value calculated by the same method as the above-mentioned "GQ motif content”.
  • the PQ motif content of the modified fibroin according to this embodiment is preferably 4% or less, 3% or less, 2% or less, 1% or less, or 0%. By reducing the PQ motif content, the degree of crystal orientation of the molded article containing the modified fibroin is further improved.
  • the modified fibroin according to this embodiment may contain a GP motif.
  • GP motif refers to an amino acid sequence consisting of GPX 6 (wherein, X 6 indicates an amino acid residue other than a proline residue). If there is no amino acid residue on the C-terminal side, the amino acid sequence consists of GP.
  • GP motif content is a value calculated by the same method as the above-mentioned "GQ motif content”.
  • the GP motif content of the modified fibroin according to this embodiment is preferably 20% or more, more preferably 25% or more, and even more preferably 30% or more.
  • the modified fibroin according to the present embodiment preferably has a glutamine residue content of 5% or more, more preferably 8% or more, and even more preferably 10% or more.
  • glutamine residue content is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m - (A)
  • the most C-terminal side In all REPs included in the domain sequence excluding the sequence from the n motif to the C-terminus of the domain sequence, the total number of glutamine residues included in that region is u, and the most C-terminal
  • the sequence from the (A) n motif located in The content rate is calculated as u/t.
  • the modified fibroin according to this embodiment has an alanine residue content of 13 to 42%, a glycine residue content of 25 to 55%, a proline residue content of 10 to 20%, and a tyrosine residue content of 1 to 42%. 10%, and the glutamine residue content may be between 5 and 20%.
  • alanine residue content”, “glycine residue content”, “proline residue content” and “tyrosine residue content” are determined by the same method as for the above-mentioned "glutamine residue content”. This is the calculated value.
  • the modified fibroin according to this embodiment may include a tag sequence at either or both of the N-terminus and C-terminus. This makes it possible to isolate, immobilize, detect, visualize, etc. the modified fibroin.
  • tag sequences include affinity tags that utilize specific affinity (binding properties, affinity) with other molecules.
  • affinity tag is a histidine tag (His tag). His tag is a short peptide with about 4 to 10 histidine residues arranged in a row, and has the property of specifically binding to metal ions such as nickel, so it is easy to isolate modified fibroin by chelating metal chromatography. It can be used for.
  • tag sequences such as glutathione-S-transferase (GST), which specifically binds to glutathione, and maltose binding protein (MBP), which specifically binds to maltose, can also be used.
  • GST glutathione-S-transferase
  • MBP maltose binding protein
  • epitope tags that utilize antigen-antibody reactions can also be used. By adding a peptide (epitope) exhibiting antigenicity as a tag sequence, an antibody against the epitope can be bound.
  • epitope tags include HA (peptide sequence of influenza virus hemagglutinin) tag, myc tag, FLAG tag, and the like. By using epitope tags, modified fibroin can be easily purified with high specificity.
  • Tag sequence whose tag sequence can be cleaved with a specific protease.
  • Modified fibroin from which the tag sequence has been removed can also be recovered by treating the modified fibroin adsorbed via the tag sequence with a protease.
  • the modified fibroin according to this embodiment may contain a secretion signal for releasing the recombinant protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretion signal can be appropriately set depending on the type of host.
  • modified fibroin having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 (PRT2949) or the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 3 (PRT2955).
  • the modified fibroin according to this embodiment can be transformed, for example, with an expression vector containing a nucleic acid having a nucleic acid sequence encoding the modified fibroin and a nucleic acid having one or more regulatory sequences operably linked to the nucleic acid sequence. It can be produced by expressing the modified fibroin in a transformed host.
  • a nucleic acid having a nucleic acid sequence encoding modified fibroin can be obtained by, for example, linking oligonucleotides synthesized with AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare Japan Co., Ltd.) using polymerase chain reaction (PCR). Can be synthesized.
  • the regulatory sequence is a sequence that controls the expression of the recombinant protein in the host (eg, promoter, enhancer, ribosome binding sequence, transcription termination sequence, etc.), and can be appropriately selected depending on the type of host.
  • an inducible promoter that functions in the host cell and can induce expression of the recombinant protein may be used.
  • An inducible promoter is a promoter whose transcription can be controlled by the presence of an inducer (expression inducer), the absence of a repressor molecule, or a physical factor such as an increase or decrease in temperature, osmotic pressure, or pH value.
  • the type of expression vector can be appropriately selected depending on the type of host, such as a plasmid vector, a virus vector, a cosmid vector, a fosmid vector, or an artificial chromosome vector.
  • a plasmid vector a virus vector
  • a cosmid vector a fosmid vector
  • an artificial chromosome vector a vector that is capable of autonomous replication in the host cell or can be integrated into the chromosome of the host, and contains a promoter at a position where the nucleic acid sequence encoding the modified fibroin can be transcribed is preferably used.
  • any of prokaryotes and eukaryotes such as yeast, filamentous fungi, insect cells, animal cells, and plant cells can be suitably used.
  • prokaryotes include bacteria belonging to the genus Escherichia, Brevibacillus, Serratia, Bacillus, Microbacterium, Brevibacterium, Corynebacterium, Pseudomonas, and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia include Escherichia coli.
  • microorganisms belonging to the genus Brevibacillus include Brevibacillus agri.
  • microorganisms belonging to the genus Serratia include Serratia liquefaciens.
  • microorganisms belonging to the genus Bacillus include Bacillus subtilis.
  • microorganisms belonging to the genus Microbacterium include Microbacterium ammoniaphyllum.
  • microorganisms belonging to the genus Brevibacterium include Brevibacterium divaricatum.
  • microorganisms belonging to the genus Corynebacterium include Corynebacterium ammoniagenes.
  • microorganisms belonging to the genus Pseudomonas include Pseudomonas putida.
  • expression vectors for introducing a nucleic acid having a nucleic acid sequence encoding modified fibroin include, for example, pBTrp2 (manufactured by Boehringer Mannheim), pGEX (manufactured by Pharmacia), pUC18, pBluescript II, pSupex, pET22b. , pCold, pUB110, pNCO2 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2002-238569).
  • Examples of eukaryotic hosts include yeast and filamentous fungi (molds, etc.).
  • yeast include yeasts belonging to the genus Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces, and the like.
  • Examples of filamentous fungi include filamentous fungi belonging to the genus Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, and the like.
  • examples of expression vectors for introducing a nucleic acid having a nucleic acid sequence encoding modified fibroin include YEP13 (ATCC 37115) and YEp24 (ATCC 37051).
  • Any method for introducing DNA into the host cells can be used as a method for introducing the expression vector into the host cells.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]
  • electroporation method electroporation method
  • spheroplast method protoplast method
  • lithium acetate method competent method, and the like.
  • methods for expressing modified fibroin by a host transformed with an expression vector include secretory production, fusion protein expression, etc. according to the method described in Molecular Cloning, 2nd edition. can.
  • Modified fibroin can be produced, for example, by culturing a host transformed with an expression vector in a culture medium, producing and accumulating modified fibroin in the culture medium, and collecting it from the culture medium.
  • the host can be cultured in a culture medium according to a method commonly used for culturing hosts.
  • the culture medium contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the host, and allows efficient culture of the host.
  • Either a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • the carbon source may be anything that can be assimilated by the transformed microorganisms, such as carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, starch and starch hydrolysates, and acetic acid and propionic acid.
  • carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, starch and starch hydrolysates, and acetic acid and propionic acid.
  • Organic acids and alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • nitrogen sources include ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, as well as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolysates, soybean meal and soybean meal hydrolysates, various fermented microbial cells, and digested products thereof can be used.
  • the inorganic salt for example, potassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate can be used.
  • the culture of prokaryotes such as Escherichia coli or eukaryotes such as yeast can be carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration agitation culture.
  • the culture temperature is, for example, 15 to 40°C.
  • the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH of the culture medium during culture is preferably maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH of the culture medium can be adjusted using inorganic acids, organic acids, alkaline solutions, urea, calcium carbonate, ammonia, and the like.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the culture medium as necessary during culture.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside is used when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the lac promoter
  • indole acrylate is used when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the trp promoter.
  • An acid or the like may be added to the medium.
  • Isolation and purification of the expressed modified fibroin can be performed by methods commonly used for isolation and purification of recombinant proteins. For example, when the modified fibroin is expressed in a dissolved state in cells, after the completion of culture, the host cells are collected by centrifugation, suspended in an aqueous buffer, and then processed using an ultrasonicator, French press, or Manton. Host cells are disrupted using a Gaulin homogenizer, Dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • cation exchange chromatography hydrophobic chromatography using resins such as butyl Sepharose and phenyl Sepharose, gel filtration using molecular sieves, affinity chromatography, chromatofocusing, and electrophoresis such as isoelectric focusing.
  • Purified specimens can be obtained using methods such as electrophoresis alone or in combination.
  • the modified fibroin is expressed by forming an insoluble body within the cells, the host cells are similarly collected, disrupted, and centrifuged to recover the insoluble body of the modified fibroin as a precipitate fraction.
  • the recovered insoluble modified fibroin can be solubilized with a protein denaturant.
  • a purified sample of modified fibroin can be obtained by the same isolation and purification method as above.
  • the modified fibroin can be recovered from the culture supernatant. That is, a culture supernatant is obtained by processing a culture using techniques such as centrifugation, and a purified sample can be obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above.
  • the molded article according to this embodiment contains the modified fibroin according to the present invention.
  • the molded article may contain only one type of modified fibroin or a combination of two or more types.
  • the molded article according to the present embodiment may further contain other additives depending on its shape, use, etc.
  • additives include plasticizers, leveling agents, crosslinking agents, crystal nucleating agents, antioxidants, ultraviolet absorbers, colorants, fillers, and synthetic resins.
  • the content of the additive may be 50 parts by mass or less based on 100 parts by mass of modified fibroin.
  • the shape of the molded body according to this embodiment is not particularly limited, and may be, for example, a fiber, a film, a porous body, a molded body, or the like.
  • the molded article according to the present embodiment may be a twisted yarn, woven fabric (including woven fabric), knitted fabric (including knitted fabric), braid, nonwoven fabric, etc. obtained by twisting, weaving, or knitting the above-mentioned fibers. .
  • the fibers can also be applied in high strength applications such as ropes, surgical sutures, flexible fasteners for electrical components, and bioactive materials for implants (eg, artificial ligaments and aortic bands).
  • the molded article according to the present embodiment can be produced, for example, by a manufacturing method that includes a step of molding a raw material (e.g., dope solution) containing modified fibroin and other additives as necessary to obtain a molded article. can.
  • a raw material e.g., dope solution
  • the dope solution contains at least modified fibroin, other additives as necessary, and a solvent.
  • the dope solution may further contain a solubility promoter.
  • solvents examples include hexafluoroisopropanol (HFIP), hexafluoroacetone (HFA), dimethyl sulfoxide (DMSO), N,N-dimethylformamide (DMF), formic acid, as well as urea, guanidine, sodium dodecyl sulfate (SDS), Examples include aqueous solutions containing lithium bromide, calcium chloride, lithium thiocyanate, and the like. These solvents may be used alone or in combination of two or more.
  • HFIP hexafluoroisopropanol
  • HFA hexafluoroacetone
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMF N,N-dimethylformamide
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • solvents include aqueous solutions containing lithium bromide, calcium chloride, lithium thiocyanate, and the like. These solvents may be used alone or in combination of two or more.
  • the content of modified fibroin in the dope solution may be 10% by mass or more, 15% by mass or more, or 20% by mass or more, based on the total mass of the dope solution.
  • the content of the modified fibroin may be 50% by mass or less, 45% by mass or less, or 40% by mass or less based on the total mass of the dope, from the viewpoint of production efficiency of the dope.
  • solubility promoter examples include the following inorganic salts consisting of a Lewis acid and a Lewis base.
  • Lewis bases include oxo acid ions (nitrate ions, perchlorate ions, etc.), metal oxo acid ions (permanganate ions, etc.), halide ions, thiocyanate ions, cyanate ions, and the like.
  • Lewis acids include metal ions such as alkali metal ions and alkaline earth metal ions, polyatomic ions such as ammonium ions, and complex ions.
  • inorganic salts consisting of Lewis acids and Lewis bases include lithium salts such as lithium chloride, lithium bromide, lithium iodide, lithium nitrate, lithium perchlorate, and lithium thiocyanate, calcium chloride, and calcium bromide.
  • lithium salts such as lithium chloride, lithium bromide, lithium iodide, lithium nitrate, lithium perchlorate, and lithium thiocyanate, calcium chloride, and calcium bromide.
  • calcium salts such as calcium iodide, calcium nitrate, calcium perchlorate, and calcium thiocyanate
  • iron salts such as iron chloride, iron bromide, iron iodide, iron nitrate, iron perchlorate, and iron thiocyanate
  • Aluminum salts such as aluminum chloride, aluminum bromide, aluminum iodide, aluminum nitrate, aluminum perchlorate, and aluminum thiocyanate, potassium chloride, potassium bromide, potassium iodide, potassium nitrate, potassium perchlorate, and potassium thiocyanate.
  • Potassium salts such as sodium chloride, sodium bromide, sodium iodide, sodium nitrate, sodium perchlorate, and sodium salts such as sodium thiocyanate, zinc chloride, zinc bromide, zinc iodide, zinc nitrate, perchloric acid Zinc, zinc salts such as zinc thiocyanate, magnesium chloride, magnesium bromide, magnesium iodide, magnesium nitrate, magnesium perchlorate, and magnesium salts such as magnesium thiocyanate, barium chloride, barium bromide, barium iodide, Examples include barium salts such as barium nitrate, barium perchlorate, and barium thiocyanate, and strontium salts such as strontium chloride, strontium bromide, strontium iodide, strontium nitrate, strontium perchlorate, and strontium thiocyanate.
  • the content of the dissolution promoter is 1.0 parts by mass or more, 5.0 parts by mass or more, 9.0 parts by mass or more, 15 parts by mass or more, or 20.0 parts by mass, based on 100 parts by mass of the total amount of modified fibroin. It may be more than that.
  • the content of the solubility promoter may be 40 parts by mass or less, 35 parts by mass or less, or 30 parts by mass or less based on 100 parts by mass of the total modified fibroin.
  • the dope solution When producing the dope solution, it may be heated to 30 to 90°C.
  • the temperature at which it can be dissolved may be appropriately set depending on the solvent used, the type of modified fibroin, etc. Shaking and stirring may be used to promote dissolution.
  • the viscosity of the dope liquid may be set as appropriate.
  • a dope solution when used as a spinning solution, its viscosity may be set as appropriate depending on the spinning method. centipoise), etc.
  • the viscosity of the spinning solution can be measured using, for example, "EMS Viscometer” (trade name, manufactured by Kyoto Electronics Industry Co., Ltd.).
  • a film-like molded object (modified fibroin film) can be obtained, for example, by the method of forming a film of the dope solution described above and removing the solvent from the formed film.
  • the fibrous molded body (modified fibroin fiber) can be obtained, for example, by the method of spinning the above-mentioned dope and removing the solvent from the spun dope.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram schematically showing an example of a spinning device for producing modified fibroin fibers.
  • a spinning device 10 shown in FIG. 1 is an example of a spinning device for dry-wet spinning, and includes an extrusion device 1, an undrawn yarn manufacturing device 2 having a coagulating bath 20, and a drawing device having a washing bath (drawing bath) 21. 3 and a drying device 4 in order from the upstream side.
  • the extrusion device 1 has a storage tank 7 in which a spinning stock solution (dope solution) 6 is stored. Coagulation bath liquid 11 is stored in coagulation bath 20 .
  • the spinning dope 6 is forced out by a gear pump 8 attached to the lower end of the storage tank 7 through a nozzle 9 provided with an air gap 19 between it and the coagulating bath liquid 11 .
  • the extruded spinning dope 6 is supplied (introduced) into the coagulation bath liquid 11 of the coagulation bath 20 through the air gap 19 .
  • the solvent is removed from the spinning dope in the coagulation bath liquid 11, and the modified fibroin is coagulated.
  • the coagulated modified fibroin is led to the washing bath 21 and washed with the washing liquid 12 in the washing bath 21, and then transferred to the drying device 4 by the first nip roller 13 and the second nip roller 14 installed in the washing bath 21. Sent. At this time, for example, if the rotational speed of the second nip roller 14 is set higher than the rotational speed of the first nip roller 13, modified fibroin fibers 36 drawn at a magnification according to the rotational speed ratio can be obtained.
  • the modified fibroin fibers stretched in the cleaning liquid 12 leave the cleaning bath 21, are dried when passing through the drying device 4, and are then wound up in a winder.
  • modified fibroin fibers are obtained by the spinning device 10 as a roll 5 that is finally wound up on a winder.
  • 18a to 18g are thread guides.
  • a plurality of coagulation baths 20 may be provided in which the coagulation bath liquid 11 is stored.
  • the distance that the coagulated modified fibroin passes through the coagulation bath liquid 11 (substantially the distance from the thread guide 18a to the thread guide 18b) is sufficient as long as it can efficiently remove the solvent, and the spinning dope from the nozzle 9 It may be determined according to the extrusion speed (discharge speed), etc.
  • the residence time of the coagulated modified fibroin (or spinning stock solution) in the coagulation bath solution 11 depends on the distance that the coagulated modified fibroin passes through the coagulation bath solution 11, the extrusion speed of the spinning stock solution 6 from the nozzle 9, etc. For example, it may be 0.01 to 3 minutes, preferably 0.05 to 0.15 minutes. Further, stretching (pre-stretching) may be performed in the coagulation bath liquid 11.
  • the stretching performed in the washing bath 21 when obtaining the modified fibroin fibers may be so-called wet heat stretching, which is performed in hot water or in a solution prepared by adding an organic solvent or the like to warm water.
  • the temperature of this moist heat stretching may be, for example, 50 to 90°C, preferably 75 to 85°C.
  • the undrawn yarn (or pre-drawn yarn) can be stretched, for example, 1 to 10 times, preferably 2 to 8 times.
  • the lower limit of the final drawing ratio is preferably more than 1 time, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, or 6 times the undrawn yarn (or pre-drawn yarn). or more, 7 times or more, 8 times or more, or 9 times or more, and the upper limit is preferably 40 times or less, 30 times or less, 20 times or less, 15 times or less, 14 times or less, or 13 times or less. , 12 times or less, 11 times or less, and 10 times or less.
  • a porous molded body (modified fibroin porous body) can be obtained, for example, according to the method described in International Publication No. 2014/175178.
  • the molded body can be obtained, for example, according to the method described in International Publication No. 2017/047504.
  • the molded article according to this embodiment contains the modified fibroin according to the present invention, the degree of crystal orientation is improved. Therefore, according to the present invention, a molded article with excellent mechanical strength can be provided.
  • Example 1 [(1) Production of modified fibroin-expressing strain] (Preparation of plasmid type expression strain) Based on the base sequence and amino acid sequence of fibroin derived from Nephila clavipes (GenBank accession number: P46804.1, GI: 1174415), modified fibroin having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 was designed. .
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence in which substitutions, insertions, and deletions of amino acid residues have been made to the amino acid sequence of fibroin derived from Nephila clavipes in order to improve productivity. Furthermore, the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4 (tag sequence and hinge sequence) is added to the N-terminus. PRT410 has a GQ motif content of 12.52%, a PX 3 motif content of 28.62%, a PQ motif content of 0%, and a GP motif content of 28.62%.
  • PRT2949 The amino acid sequence (PRT2949) shown by SEQ ID NO: 2 is obtained by replacing all GQ in PRT410 with QG (100 positions in total).
  • PRT2949 has a GQ motif content of 0%, a PX 3 motif content of 28.62%, a PQ motif content of 5.01%, and a GP motif content of 28.62%.
  • PRT2955 The amino acid sequence (PRT2955) shown by SEQ ID NO: 3 is obtained by replacing all GQ in PRT410 with QG (total of 100 positions), and further substituting GPQ with GPA (total of 39 positions).
  • PRT2955 has a GQ motif content of 0%, a PX 3 motif content of 28.62%, a PQ motif content of 0%, and a GP motif content of 28.62%.
  • nucleic acids encoding each modified fibroin were synthesized.
  • An NdeI site and an EcoRI site downstream of the stop codon were added to the nucleic acid at the 5' end.
  • the nucleic acid was cloned into a cloning vector (pUC118). Thereafter, the same nucleic acid was excised by restriction enzyme treatment with NdeI and EcoRI, and then recombined with the protein expression vector pET-22b(+) to obtain an expression vector.
  • E. coli BLR (DE3) was transformed with the obtained pET22b(+) expression vector.
  • the transformed E. coli was cultured in 2 mL of LB medium containing ampicillin for 15 hours.
  • the culture solution was added to 100 mL of seed culture medium (Table 1) containing ampicillin so that the OD 600 was 0.005.
  • the culture solution temperature was maintained at 30° C., and flask culture was performed until OD 600 reached 5 (about 15 hours) to obtain a seed culture solution.
  • the seed culture solution was added to a jar fermenter supplemented with 500 ml of production medium (Table 2) so that the OD 600 was 0.05. Culture was carried out by keeping the culture solution temperature at 37° C. and controlling the pH to be constant at 6.9. Further, the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • feed solution glucose 455 g/1L, Yeast Extract 120 g/1L
  • feed solution glucose 455 g/1L, Yeast Extract 120 g/1L
  • 1M isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside IPTG
  • IPTG 1M isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • the washed precipitate was suspended in 8M guanidine buffer (8M guanidine hydrochloride, 10mM sodium dihydrogen phosphate, 20mM NaCl, 1mM Tris-HCl, pH 7.0) to a concentration of 100mg/mL and incubated at 60°C for 30 minutes. Stir with a stirrer for 1 minute to dissolve. After dissolution, dialysis was performed against water using a dialysis tube (cellulose tube 36/32 manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.). The white aggregated protein obtained after dialysis was collected by centrifugation, water was removed using a freeze dryer, and freeze-dried powder was collected.
  • 8M guanidine buffer 8M guanidine hydrochloride, 10mM sodium dihydrogen phosphate, 20mM NaCl, 1mM Tris-HCl, pH 7.0
  • the distance from the sample to the detector was 63 mm, and the obtained X-ray diffraction data were recorded with a two-dimensional semiconductor detector (PILATUS 300K).
  • the obtained two-dimensional diffraction pattern was converted into a one-dimensional profile using the software 2DP (XtaLAB-SP, Rigaku Corporation), and the degree of orientation of the ⁇ -sheet crystal was calculated.

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Abstract

本発明は、式１：［（Ａ）nモチーフ－ＲＥＰ］m、又は式２：［（Ａ）nモチーフ－ＲＥＰ］m－（Ａ）nモチーフで表されるドメイン配列を含み、ＧＱモチーフ含有率が１２．５％以下である、改変フィブロイン。 ［式１及び式２中、（Ａ）nモチーフは４～２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）nモチーフ中のアミノ酸残基総数に対するアラニン残基、セリン残基、スレオニン残基及びバリン残基の総数が８０％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは８～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）nモチーフ等は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。］

Description

改変フィブロイン
　本発明は、改変フィブロインに関する。
　フィブロインは、例えば、昆虫及びクモ類が産生する糸を構成する主要成分であり、繊維状のタンパク質の一種である。フィブロインは、例えば、強度及び伸度等の優れた特性を有しており、医療、航空、衣料等の様々な分野への応用が期待されている。
　フィブロインのアミノ酸配列を改変した改変フィブロインが知られている。例えば、特許文献１には、式１：［（Ａ）nモチーフ－ＲＥＰ］mで表されるドメイン配列を含む改変フィブロインであって、上記ドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列を有する、改変フィブロインが開示されている。
国際公開第２０１７／２２２０３４号
　特許文献１に開示される改変フィブロインは、モールド成形体にしたときの曲げ強度が向上している。一方、成形体の結晶の配向度を向上させ得る改変フィブロインは、これまで知られていない。
　そこで、本発明は、結晶の配向度が向上した成形体を得ることができる改変フィブロインを提供することを目的とする。
　本発明は、ＧＱモチーフ含有率と、成形体の結晶の配向度とが逆相関するという関係を見出したことに基づいている。すなわち、改変フィブロインのＧＱモチーフ含有率を低減することによって、当該改変フィブロインを含む成形体の結晶の配向度を向上し、安定して紡糸することができる。
　本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
　式１：［（Ａ）nモチーフ－ＲＥＰ］m、又は式２：［（Ａ）nモチーフ－ＲＥＰ］m－（Ａ）nモチーフで表されるドメイン配列を含み、
　ＧＱモチーフ含有率が１２．５％以下である、改変フィブロイン。
［式１及び式２中、（Ａ）nモチーフは４～２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）nモチーフ中のアミノ酸残基総数に対するアラニン残基、セリン残基、スレオニン残基及びバリン残基の総数が８０％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは８～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）nモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。］
［２］
　ＰＸ3モチーフ（但し、Ｘ3はプロリン残基以外のアミノ酸残基を示す。）を含有する、［１］に記載の改変フィブロイン。
［３］
　Ｘ3がアラニン残基である、［２］に記載の改変フィブロイン。
［４］
　ＰＸ3モチーフ含有率が１０％以上である、［３］に記載の改変フィブロイン。
［５］
　ＰＱモチーフ含有率が５％以下である、［１］～［４］のいずれかに記載の改変フィブロイン。
［６］
　ＧＰモチーフを含有する、［１］～［５］のいずれかに記載の改変フィブロイン。
［７］
　［１］～［６］のいずれかに記載の改変フィブロインをコードする核酸配列を有する核酸。
［８］
　［７］に記載の核酸と、前記核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列を有する核酸とを含む、発現ベクター。
［９］
　プラスミドベクター又はウイルスベクターである、［８］に記載の発現ベクター。
［１０］
　［８］又は［９］に記載の発現ベクターで形質転換された宿主。
［１１］
　［１］～［６］のいずれかに記載の改変フィブロインを含む、組成物。
［１２］
　成形体である、［１１］に記載の組成物。
［１３］
　繊維、フィルム、多孔質体、又はモールド成形体の形状である、［１２］に記載の組成物。
　本発明によれば、結晶の配向度が向上した成形体を得ることができ、安定して紡糸が行える改変フィブロインを提供することができる。
改変フィブロイン繊維を製造するための紡糸装置の一例を概略的に示す説明図である。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
〔改変フィブロイン〕
　本実施形態に係る改変フィブロインは、式１：［（Ａ）nモチーフ－ＲＥＰ］m、又は式２：［（Ａ）nモチーフ－ＲＥＰ］m－（Ａ）nモチーフで表されるドメイン配列を含み、ＧＱモチーフ含有率が１２．５％以下である。本実施形態に係る改変フィブロインは、ＧＱモチーフ含有率が低減されているため、当該改変フィブロインを含む成形体の結晶の配向度が向上する。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、そのドメイン配列が天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるフィブロインを意味する。本明細書でいう「天然由来のフィブロイン」もまた、式１：［（Ａ）nモチーフ－ＲＥＰ］m、又は式２：［（Ａ）nモチーフ－ＲＥＰ］m－（Ａ）nモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。
　本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）nモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式１：［（Ａ）nモチーフ－ＲＥＰ］m、又は式２：［（Ａ）nモチーフ－ＲＥＰ］m－（Ａ）nモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。
　一実施形態において、各［（Ａ）nモチーフ－ＲＥＰ］は、
　（ｉ）アミノ酸残基総数に対するアラニン残基数の割合が、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％又は５０％であってよく、
　（ｉｉ）アミノ酸残基総数に対するグリシン残基数の割合が、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％又は５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％又は６０％であってよく、
　（ｉｉｉ）アミノ酸残基総数に対するセリン残基数の割合が、０％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％又は３０％であってよく、
　（ｉｖ）アミノ酸残基総数に対するプロリン残基数の割合が、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％であってよく、
　（ｖ）アミノ酸残基総数に対するチロシン残基数の割合が、０％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％又は１０％であってよく、
　（ｖｉ）アミノ酸残基総数に対するグルタミン残基数の割合が、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％であってよく、
　（ｖｉｉ）アミノ酸残基総数に対するアルギニン残基数の割合が、０％、１％、２％、３％、４％又は５％であってよい。
　（Ａ）nモチーフは、４～２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。（Ａ）nモチーフは、好ましくは４～２０アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であり、より好ましくは４～１６アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であり、更により好ましくは４～１２アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列である。
　（Ａ）nモチーフは、（Ａ）nモチーフ中のアミノ酸残基総数に対する、アラニン残基、セリン残基、スレオニン残基及びバリン残基の総数が８０％以上であればよいが、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基、セリン残基、スレオニン残基及びバリン残基から選択される１種以上のアミノ酸残基のみで構成されることを意味する。）が更により好ましい。（Ａ）nモチーフは、（Ａ）nモチーフ中のアミノ酸残基総数に対するアラニン残基数が８０％以上であってもよく、８５％以上であってもよく、９０％以上であってもよく、９５％以上であってもよく、１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する）であってもよい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）nモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されることが好ましい。アラニン残基のみで構成されるとは、（Ａ）nモチーフが、（Ａ）n（Ａはアラニン残基を示し、ｎは４～２７の整数、好ましくは４～２０の整数、より好ましくは４～１６の整数を示す。）で表されるアミノ酸配列を有することを意味する。
　本実施形態に係る改変フィブロイン中に複数存在する（Ａ）nモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。
　ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。
　一実施形態において、ＲＥＰは、ＲＥＰ中のアミノ酸残基総数に対する、グリシン残基、セリン残基、グルタミン残基及びアラニン残基の総数が、４０％以上であってよく、４５％以上であってよく、５０％以上であってよく、５５％以上であってよく、６０％以上であってよく、６５％以上であってよく、７０％以上であってよい。
　一実施形態において、ＲＥＰは、ＲＥＰ中のアミノ酸残基総数に対する、グリシン残基、セリン残基、プロリン残基及びチロシン残基の総数が、５０％以上であってよく、５５％以上であってよく、６０％以上であってよく、６５％以上であってよく、７０％以上であってよく、７５％以上であってよく、８０％以上であってよく、８５％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよい。
　一実施形態において、ＲＥＰは、天然由来のフィブロイン特有の非晶領域と同一のアミノ酸配列であってもよく、異なるアミノ酸配列であってもよい。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、少なくとも２つのＲＥＰに下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選択される少なくとも１つのコンセンサス配列を含むことが好ましい。
　（ａ）ＧＰＺ1；ここで、Ｚ1は任意のアミノ酸残基であり、好ましくはアラニン残基、セリン残基、グリシン残基、チロシン残基、プロリン残基及びグルタミン残基からそれぞれ独立して選択される。
　（ｂ）ＧＧＺ2；ここで、Ｚ2は任意のアミノ酸残基であり、好ましくはチロシン残基、プロリン残基、アルギニン残基、セリン残基、アラニン残基、スレオニン残基、アスパラギン残基及びグルタミン残基からそれぞれ独立に選択される。
　（ｃ）ＧＱＱ。
　本実施形態に係る改変フィブロイン中に複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。
　式１及び式２中の「ｍ」は、［（Ａ）nモチーフ－ＲＥＰ］で示されるアミノ酸配列の繰り返し数を意味し、８～３００の整数を示す。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、遺伝子組換え技術を使用して異種宿主により生産されたタンパク質であってよい。本実施形態に係る改変フィブロインは、改変フィブロインと、宿主（異種宿主）由来の不可避的な夾雑物とを含む組成物であってもよい。夾雑物としては、例えば、宿主（異種宿主）由来のタンパク質（目的とする組換えタンパク質以外のタンパク質）、脂質及び核酸等が挙げられる。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、ＧＱモチーフ含有率が１２．５％以下である。ここで、本明細書において「ＧＱモチーフ」とは、Ｘ1ＧＱＸ2からなるアミノ酸配列（但し、Ｘ1はグリシン残基以外のアミノ酸残基を示し、Ｘ2はグルタミン残基以外のアミノ酸残基を示す。Ｘ1及びＸ2は同一であってもよく、異なっていてもよい。なお、Ｘ1ＧＱＸ2からなるアミノ酸配列は、ＧのＮ末端側にアミノ酸残基が存在しない場合はＧＱＸ2からなるアミノ酸配列とし、同様にＱのＣ末端側にアミノ酸残基が存在しない場合はＸ1ＧＱからなるアミノ酸配列とする。）に含まれるＧＱからなるアミノ酸配列を意味する。また、本明細書において「ＧＱモチーフ含有率」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）nモチーフ－ＲＥＰ］m、又は式２：［（Ａ）nモチーフ－ＲＥＰ］m－（Ａ）nモチーフで表されるドメイン配列を含む改変フィブロインにおいて、最もＣ末端側に位置する（Ａ）nモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰを対象領域とし、対象領域に含まれるＸ1ＧＱＸ2からなるアミノ酸配列を抽出する。抽出された個数にアミノ酸残基数２（ＧＱからなるアミノ酸配列のアミノ酸残基数に対応）を乗じた数がｗである。例えば、Ｘ1ＧＱＸ2からなるアミノ酸配列が５０個抽出された場合、ｗは５０×２＝１００である。また、例えば、Ｘ1ＧＱＸ2（＝Ｘ1）ＧＱＸ2からなるアミノ酸配列の場合のように２つのＸ1ＧＱＸ2に含まれるＸ2（＝Ｘ1）が存在してもよい。ｙは、対象領域に含まれるアミノ酸残基総数である。ＧＱモチーフ含有率は、ｗ／ｙ（％）として算出される。
　本実施形態に係る改変フィブロインのＧＱモチーフ含有率は、好ましくは、１０％以下、７．５％以下、５％以下、４％以下、２．５％以下又は０％である。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、ＰＸ3モチーフを含有するものであってよい。ここで、本明細書において「ＰＸ3モチーフ」とは、ＰＸ3からなるアミノ酸配列（但し、Ｘ3はプロリン残基以外のアミノ酸残基を示す。）を意味する。また、本明細書において「ＰＸ3モチーフ含有率」は、上述の「ＧＱモチーフ含有率」と同様の方法により算出される値である。ＰＸ3モチーフ中のＸ3はアラニン残基であってもよい。
　本実施形態に係る改変フィブロインのＰＸ3モチーフ含有率は、例えば、１０％以上、１２％以上、１５％以上、１８％以上、２０％以上又は２５％以上であってよい。本実施形態に係る改変フィブロインのＰＸ3モチーフ含有率は、特に上限を設けないが、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下又は３０％以下であってよい。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、ＰＱモチーフ含有率が５％以下であってもよい。ここで、本明細書において「ＰＱモチーフ」とは、Ｘ4ＰＱＸ5からなるアミノ酸配列（但し、Ｘ4はプロリン残基以外のアミノ酸残基を示し、Ｘ5はグルタミン残基以外のアミノ酸残基を示す。Ｘ4及びＸ5は同一であってもよく、異なっていてもよい。なお、Ｘ4ＰＱＸ5からなるアミノ酸配列は、ＰのＮ末端側にアミノ酸残基が存在しない場合はＰＱＸ5からなるアミノ酸配列とし、同様にＱのＣ末端側にアミノ酸残基が存在しない場合はＸ4ＰＱからなるアミノ酸配列とする。）を意味する。また、本明細書において「ＰＱモチーフ含有率」は、上述の「ＧＱモチーフ含有率」と同様の方法により算出される値である。
　本実施形態に係る改変フィブロインのＰＱモチーフ含有率は、好ましくは４％以下、３％以下、２％以下、１％以下又は０％である。ＰＱモチーフ含有率が低減することによって、当該改変フィブロインを含む成形体の結晶の配向度がより一層向上する。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、ＧＰモチーフを含有するものであってよい。ここで、本明細書において「ＧＰモチーフ」とは、ＧＰＸ6からなるアミノ酸配列（但し、Ｘ6はプロリン残基及以外のアミノ酸残基を示す。なお、ＧＰＸ6からなるアミノ酸配列は、ＰのＣ末端側にアミノ酸残基が存在しない場合はＧＰからなるアミノ酸配列とする。）を意味する。また、本明細書において「ＧＰモチーフ含有率」は、上述の「ＧＱモチーフ含有率」と同様の方法により算出される値である。
　本実施形態に係る改変フィブロインのＧＰモチーフ含有率は、２０％以上であることが好ましく、２５％以上であることがより好ましく、３０％以上であることが更に好ましい。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が５％以上であることが好ましく、８％以上であることがより好ましく、１０％以上であることが更に好ましい。本明細書において、「グルタミン残基含有率」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）nモチーフ－ＲＥＰ］m、又は式２：［（Ａ）nモチーフ－ＲＥＰ］m－（Ａ）nモチーフで表されるドメイン配列を含む改変フィブロインにおいて、最もＣ末端側に位置する（Ａ）nモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるグルタミン残基の総数をｕとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）nモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）nモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、グルタミン残基含有率はｕ／ｔとして算出される。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、アラニン残基含有率が１３～４２％、グリシン残基含有率が２５～５５％、プロリン残基含有率が１０～２０％、チロシン残基含有率が１～１０％、及びグルタミン残基含有率が５～２０％であってよい。ここで、「アラニン残基含有率」、「グリシン残基含有率」、「プロリン残基含有率」及び「チロシン残基含有率」は、上述の「グルタミン残基含有率」と同様の方法により算出される値である。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
　タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ｍｅｔａｌ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による改変フィブロインの単離に利用することができる。
　また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
　さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変フィブロインを精製することができる。
　さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着した改変フィブロインをプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変フィブロインを回収することもできる。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産された組換えタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　本実施形態に係る改変フィブロインの具体例として、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２９４９）又は配列番号３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２９５５）を有する改変フィブロインを挙げることができる。
（改変フィブロインの製造方法）
　本実施形態に係る改変フィブロインは、例えば、当該改変フィブロインをコードする核酸配列を有する核酸と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列を有する核酸とを含む発現ベクターで形質転換された宿主により、当該改変フィブロインを発現させることにより生産することができる。
　改変フィブロインをコードする核酸配列を有する核酸は、例えば、ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ　１０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）等で合成したオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して連結する方法によって合成することができる。
　調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、組換えタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
　発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、改変フィブロインをコードする核酸配列を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
　宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
　原核生物の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ等を挙げることができる。ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ等を挙げることができる。セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス等を挙げることができる。バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス等を挙げることができる。ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等を挙げることができる。ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム等を挙げることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス等を挙げることができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ等を挙げることができる。
　原核生物を宿主とする場合、改変フィブロインをコードする核酸配列を有する核酸を導入する発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
　真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
　真核生物を宿主とする場合、改変フィブロインをコードする核酸配列を有する核酸を導入する発現ベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，６９，２１１０　（１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。
　発現ベクターで形質転換された宿主による改変フィブロインの発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
　改変フィブロインは、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に改変フィブロインを生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
　宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、上記形質転換微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
　大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５～４０℃である。培養時間は、通常１６時間～７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０～９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
　また、培養中必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　発現させた改変フィブロインの単離、精製は、組換えタンパク質の単離、精製に通常用いられている方法で行うことができる。例えば、当該改変フィブロインが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、組換えタンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
　また、改変フィブロインが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として改変フィブロインの不溶体を回収する。回収した改変フィブロインの不溶体は蛋白質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法により改変フィブロインの精製標品を得ることができる。当該改変フィブロインが細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該改変フィブロインを回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
〔成形体〕
　本実施形態に係る成形体は、本発明に係る改変フィブロインを含む。成形体に含まれる改変フィブロインは、１種のみであってもよく、２種以上を組み合わせてもよい。
　本実施形態に係る成形体は、その形状及び用途等に応じて、更に他の添加剤を含むものであってもよい。添加剤としては、例えば、可塑剤、レベリング剤、架橋剤、結晶核剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、着色剤、フィラー、及び合成樹脂が挙げられる。添加剤の含有量は、改変フィブロイン１００質量部に対して、５０質量部以下であってよい。
　本実施形態に係る成形体の形状は特に限定されず、例えば、繊維、フィルム、多孔質体、モールド成形体等であってよい。本実施形態に係る成形体は、上記繊維を撚る、織る又は編む等した撚糸、織物（織生地を含む。）、編物（編生地を含む。）、組み物、不織布等であってもよい。上記繊維はまた、ロープ、手術用縫合糸、電気部品用の可撓性止め具、さらには移植用生理活性材料（例えば、人工靭帯及び大動脈バンド）等の高強度用途にも応用できる。
　本実施形態に係る成形体は、例えば、改変フィブロイン、及び必要に応じて他の添加剤を含む原料（例えば、ドープ液）を成形して成形体を得る工程を備える製造方法により製造することができる。
　ドープ液は、改変フィブロインと、必要に応じて他の添加剤と、溶媒とを少なくとも含む。ドープ液は、更に溶解促進剤を含むものであってもよい。
　溶媒としては、例えば、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ギ酸、並びに尿素、グアニジン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、臭化リチウム、塩化カルシウム及びチオシアン酸リチウム等を含む水溶液等を挙げることができる。これらの溶媒は、１種単独で使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。
　ドープ液における改変フィブロインの含有量は、ドープ液の全質量を基準として、１０質量％以上、１５質量％以上、又は２０質量％以上であってよい。改変フィブロインの含有量は、ドープ液の製造効率の観点から、ドープ液の全質量を基準として、５０質量％以下、４５質量％以下、又は４０質量％以下であってよい。
　溶解促進剤としては、例えば、以下に示すルイス酸とルイス塩基とからなる無機塩が挙げられる。ルイス塩基としては、例えば、オキソ酸イオン（硝酸イオン、過塩素酸イオン等）、金属オキソ酸イオン（過マンガン酸イオン等）、ハロゲン化物イオン、チオシアン酸イオン、シアン酸イオン等が挙げられる。ルイス酸としては、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン等の金属イオン、アンモニウムイオン等の多原子イオン、錯イオン等が挙げられる。ルイス酸とルイス塩基とからなる無機塩の具体例としては、塩化リチウム、臭化リチウム、ヨウ化リチウム、硝酸リチウム、過塩素酸リチウム、及びチオシアン酸リチウム等のリチウム塩、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硝酸カルシウム、過塩素酸カルシウム、及びチオシアン酸カルシウム等のカルシウム塩、塩化鉄、臭化鉄、ヨウ化鉄、硝酸鉄、過塩素酸鉄、及びチオシアン酸鉄等の鉄塩、塩化アルミニウム、臭化アルミニウム、ヨウ化アルミニウム、硝酸アルミニウム、過塩素酸アルミニウム、及びチオシアン酸アルミニウム等のアルミニウム塩、塩化カリウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、硝酸カリウム、過塩素酸カリウム、及びチオシアン酸カリウム等のカリウム塩、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びチオシアン酸ナトリウム等のナトリウム塩、塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、硝酸亜鉛、過塩素酸亜鉛、及びチオシアン酸亜鉛等の亜鉛塩、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、硝酸マグネシウム、過塩素酸マグネシウム、及びチオシアン酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化バリウム、臭化バリウム、ヨウ化バリウム、硝酸バリウム、過塩素酸バリウム、及びチオシアン酸バリウム等のバリウム塩、並びに塩化ストロンチウム、臭化ストロンチウム、ヨウ化ストロンチウム、硝酸ストロンチウム、過塩素酸ストロンチウム、及びチオシアン酸ストロンチウム等のストロンチウム塩が挙げられる。
　溶解促進剤の含有量は、改変フィブロインの全量１００質量部に対して、１．０質量部以上、５．０質量部以上、９．０質量部以上、１５質量部以上又は２０．０質量部以上であってよい。溶解促進剤の含有量は、改変フィブロインの全量１００質量部に対して、４０質量部以下、３５質量部以下又は３０質量部以下であってよい。
　ドープ液の製造時に、３０～９０℃に加温してもよい。使用する溶媒、及び改変フィブロインの種類等に応じて溶解可能な温度を適時設定すればよい。溶解を促進するために振盪、撹拌してもよい。
　ドープ液の粘度は、適宜設定してよい。例えば、ドープ液を紡糸液として使用する場合、その粘度は、紡糸方法に応じて適宜設定してよく、例えば、３５℃において１００～１５，０００ｃＰ（センチポイズ）、４０℃において１００～３０，０００ｃＰ（センチポイズ）等に設定すればよい。紡糸液の粘度は、例えば京都電子工業社製の商品名"ＥＭＳ粘度計"を使用して測定することができる。
　フィルム状の成形体（改変フィブロインフィルム）は、例えば、上述したドープ液の膜を形成し、形成された膜から溶媒を除去する方法により得ることができる。
　繊維状の成形体（改変フィブロイン繊維）は、例えば、上述したドープ液を紡糸し、紡糸されたドープ液から溶媒を除去する方法により得ることができる。
　図１は、改変フィブロイン繊維を製造するための紡糸装置の一例を概略的に示す説明図である。図１に示す紡糸装置１０は、乾湿式紡糸用の紡糸装置の一例であり、押出し装置１と、凝固浴槽２０を有する未延伸糸製造装置２と、洗浄浴槽（延伸浴槽）２１を有する延伸装置３と、乾燥装置４とを上流側から順に有している。
　押出し装置１は貯槽７を有しており、ここに紡糸原液（ドープ液）６が貯留される。凝固浴槽２０に凝固浴液１１が貯留される。紡糸原液６は、貯槽７の下端部に取り付けられたギアポンプ８により、凝固浴液１１との間にエアギャップ１９を開けて設けられたノズル９から押し出される。押し出された紡糸原液６は、エアギャップ１９を経て、凝固浴槽２０の凝固浴液１１内に供給（導入）される。凝固浴液１１内で紡糸原液から溶媒が除去されて改変フィブロインが凝固する。凝固した改変フィブロインは、洗浄浴槽２１に導かれ、洗浄浴槽２１内の洗浄液１２により洗浄された後、洗浄浴槽２１内に設置された第一ニップローラ１３と第二ニップローラ１４により、乾燥装置４へと送られる。このとき、例えば、第二ニップローラ１４の回転速度を第一ニップローラ１３の回転速度よりも速く設定すると、回転速度比に応じた倍率で延伸された改変フィブロイン繊維３６が得られる。洗浄液１２中で延伸された改変フィブロイン繊維は、洗浄浴槽２１内を離脱してから、乾燥装置４内を通過する際に乾燥され、その後、ワインダーにて巻き取られる。このようにして、改変フィブロイン繊維が、紡糸装置１０により、最終的にワインダーに巻き取られた巻回物５として得られる。なお、１８ａ～１８ｇは糸ガイドである。凝固浴液１１が貯留される凝固浴槽２０は複数設けられていてもよい。
　凝固した改変フィブロインが凝固浴液１１中を通過する距離（実質的には、糸ガイド１８ａから糸ガイド１８ｂまでの距離）は、脱溶媒が効率的に行えればよく、ノズル９からの紡糸原液の押出速度（吐出速度）等に応じて決定されるものであってよい。凝固した改変フィブロイン（又は紡糸原液）の凝固浴液１１中での滞留時間は、凝固した改変フィブロインが凝固浴液１１中を通過する距離、ノズル９からの紡糸原液６の押出速度等に応じて決定されるものであってよく、例えば、０．０１～３分であってよく、０．０５～０．１５分であることが好ましい。また、凝固浴液１１中で延伸（前延伸）をしてもよい。
　なお、改変フィブロイン繊維を得る際に洗浄浴槽２１内で実施される延伸は、温水中、温水に有機溶剤等を加えた溶液中等で行う、いわゆる湿熱延伸であってもよい。この湿熱延伸の温度としては、例えば、５０～９０℃であってよく、７５～８５℃が好ましい。湿熱延伸では、未延伸糸（又は前延伸糸）を、例えば、１倍～１０倍延伸することができ、２～８倍延伸することが好ましい。
　最終的な延伸倍率は、その下限値が、未延伸糸（又は前延伸糸）に対して、好ましくは、１倍超、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上のうちのいずれかであり、上限値が、好ましくは４０倍以下、３０倍以下、２０倍以下、１５倍以下、１４倍以下、１３倍以下、１２倍以下、１１倍以下、１０倍以下である。
　多孔質状の成形体（改変フィブロイン多孔質体）は、例えば、国際公開第２０１４／１７５１７８号に記載される方法に準じて得ることができる。
　モールド成形体は、例えば、国際公開第２０１７／０４７５０４号に記載される方法に準じて得ることができる。
　本実施形態に係る成形体は、本発明に係る改変フィブロインを含んでいるため、結晶の配向度が向上している。このため、本発明によれば、機械的強度に優れた成形体を提供することができる。
　以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
実施例1
〔（１）改変フィブロイン発現株の作製〕
（プラスミド型発現株の作製）
　ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号１～３で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロインを設計した。
　配列番号１で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ４１０）は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列を有し、さらにＮ末端に配列番号４で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されている。ＰＲＴ４１０は、ＧＱモチーフ含有率１２．５２％、ＰＸ3モチーフ含有率２８．６２％、ＰＱモチーフ含有率０％、ＧＰモチーフ含有率２８．６２％である。
　配列番号２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２９４９）は、ＰＲＴ４１０中のＧＱを全てＱＧに置換したものである（計１００箇所）。ＰＲＴ２９４９は、ＧＱモチーフ含有率０％、ＰＸ3モチーフ含有率２８．６２％、ＰＱモチーフ含有率５．０１％、ＧＰモチーフ含有率２８．６２％である。
　配列番号３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２９５５）は、ＰＲＴ４１０中のＧＱを全てＱＧに置換し（計１００箇所）、更にＧＰＱをＧＰＡに置換したものである（計３９箇所）。ＰＲＴ２９５５は、ＧＱモチーフ含有率０％、ＰＸ3モチーフ含有率２８．６２％、ＰＱモチーフ含有率０％、ＧＰモチーフ含有率２８．６２％である。
　次に、各改変フィブロインをコードする核酸を合成した。当該核酸には、５'末端にＮｄｅＩサイト及び終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
〔（２）タンパク質の発現〕
　得られたｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表１）にＯＤ600が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ600が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　当該シード培養液を５００ｍｌの生産培地（表２）を添加したジャーファーメンターにＯＤ600が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　１２０ｇ／１Ｌ）を１ｍｌ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のタンパク質を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするタンパク質サイズのバンドの出現により、目的とするタンパク質の発現を確認した。
〔（３）タンパク質の精製〕
　ＩＰＴＧを添加してから２０時間後に回収した菌体を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ　Ｎｉｒｏ　Ｓｏａｖｉ社）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ　グアニジン緩衝液（８Ｍグアニジン塩酸塩、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。
〔（４）紡糸原液の調製〕
　溶解溶媒であるギ酸に、上述の改変フィブロインの凍結乾燥粉末を濃度３６質量％となるよう添加した後、スターラーを使用して４０℃に保温して３時間振盪し、溶解させた。その後、ゴミと泡を取り除き、紡糸原液（ドープ液）とした。
〔（５）紡糸〕
　得られた紡糸原液を用いて、図１に示す紡糸装置に準じた紡糸装置を用いた紡糸によって、紡糸及び延伸された改変フィブロイン繊維を製造した。用いた紡糸装置は、図１に示す紡糸装置１０において、未延伸糸製造装置２（第１凝固浴槽）及び延伸装置３（洗浄浴槽）の間に、第２の未延伸糸製造装置（第２凝固浴槽）を備えるものである。第１凝固浴液には、メタノール（ＭｅＯＨ）を用いた。凝固浴液全量に対する、溶解溶媒と同種の溶媒の含有量を表３に示す。第２凝固浴槽としては、ＭｅＯＨを用いた。また、洗浄浴槽の洗浄液には、水を用いた。その他の湿式紡糸の条件は以下のとおりである。
　押出しノズル直径：０．２ｍｍ
　押出し速度（吐出量）：２．０ｍｌ／ｍｉｎ
　巻取り速度：５３ｍ／ｍｉｎ
　延伸倍率：表３参照
　乾燥温度：６０℃
〔（６）最大延伸倍率の評価〕
　まず延伸倍率を４倍に設定し、紡糸を行った。１０分間の巻き取りを最大として、５倍、６倍と延伸倍率を上げていき、巻き取りを行って巻き取り時間を計測した。５分以下の巻き取り時間だった場合、同じ延伸倍率で３回繰り返しを行い、全て５分以下で糸切れにより紡糸が中断した場合、その時点で使用していた倍率を最大延伸倍率とした。次に、最大延伸倍率から０．２５ずつ倍率を下げていき、５分間巻き取りが行えた倍率を、安定して巻き取りが行える最大延伸倍率とした。
（結果）
　結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ＰＲＴ４１０中のＧＱを全てＱＧに置換したＰＲＴ２９４９で製造した繊維は、最大延伸倍率（７倍）での巻き取り時間が延長しており（２０秒→１分）、紡糸安定性が向上していた。また、ＰＲＴ４１０中のＧＱを全てＱＧに置換し、かつＧＰＱをＧＰＡに置換したＰＲＴ２９５５で製造した繊維は、最大延伸倍率（７倍）での巻き取り時間が更に延長しており（２０秒→５分）、かつ５分間巻き取りできた延伸倍率（安定して巻き取りが行える最大延伸倍率）が高くなっており（６．７５倍→７倍）、紡糸安定性がより一層向上していた。
〔（７）結晶構造の評価〕
　上記で得られた延伸倍率が４倍、５倍、６倍の繊維について、広角X線回折 (Wide Angle X-ray Scattering、WAXS) を用いて結晶構造を解析した。結果を表４に示す。
結晶の配向度の測定方法： 広角X線回折測定は XtaLAB-SP (株式会社リガク製) を使用して行なわれた。定格出力1.2 kW、波長1.5418 Å、焦点サイズ70 μm のビームを用いた。測定に用いる繊維サンプルは厚さが0.5～1 mmになるよう束ねられ、繊維軸が縦になるように多サンプル試料ホルダーに配置された。サンプルから検出器までの距離(カメラ長)は63 mmとし、得られたX線回折データは2次元半導体検出器 (PILATUS 300K) で記録した。得られた二次元の回折パターンを、ソフトウェア 2DP (XtaLAB-SP、株式会社リガク) を使用して1次元プロファイルに変換し、βシート結晶の配向度を計算した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　GQモチーフを置換した結果、 a 、b、c軸方向の結晶の配向度は、置換前に比べてどの延伸倍率でも向上することが明らかになった。このことは、非結晶領域のアミノ酸配列の置換によって結晶領域が配向しやすくなったことを示唆している。
　１…押出し装置、２…未延伸糸製造装置、３…延伸装置、４…乾燥装置、６…紡糸原液、１０…紡糸装置、２０…凝固浴槽、２１…洗浄浴槽、３６…改変フィブロイン繊維。

Claims (13)

  1. 　式１：［（Ａ）nモチーフ－ＲＥＰ］m、又は式２：［（Ａ）nモチーフ－ＲＥＰ］m
    －（Ａ）nモチーフで表されるドメイン配列を含み、
    　ＧＱモチーフ含有率が１２．５％以下である、改変フィブロイン。
    ［式１及び式２中、（Ａ）nモチーフは４～２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）nモチーフ中のアミノ酸残基総数に対するアラニン残基、セリン残基、スレオニン残基及びバリン残基の総数が８０％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは８～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）nモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。］
  2. 　ＰＸ3モチーフ（但し、Ｘ3はプロリン残基以外のアミノ酸残基を示す。）を含有する、請求項１に記載の改変フィブロイン。
  3. 　Ｘ3がアラニン残基である、請求項２に記載の改変フィブロイン。
  4. 　ＰＸ3モチーフ含有率が１０％以上である、請求項３に記載の改変フィブロイン。
  5. 　ＰＱモチーフ含有率が５％以下である、請求項１に記載の改変フィブロイン。
  6. 　ＧＰモチーフを含有する、請求項１に記載の改変フィブロイン。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の改変フィブロインをコードする核酸配列を有する核酸。
  8. 　請求項７に記載の核酸と、前記核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列を有する核酸とを含む、発現ベクター。
  9. 　プラスミドベクター又はウイルスベクターである、請求項８に記載の発現ベクター。
  10. 　請求項９に記載の発現ベクターで形質転換された宿主。
  11. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の改変フィブロインを含む、組成物。
  12. 　成形体である、請求項１１に記載の組成物。
  13. 　繊維、フィルム、多孔質体、又はモールド成形体の形状である、請求項１２に記載の組成物。
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Non-Patent Citations (2)

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Title
HINMAN MICHAEL B, LEWIS RANDOLPH V: "Isolation of a Clone Encoding a Second Dragline Silk Fibroin - NEPHZLA CLAVZPES DRAGLINE SILK IS A TWO-PROTEIN FIBER", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 267, no. 27, 25 September 1992 (1992-09-25), pages 19320 - 19324, XP093138166 *
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