CN103193877B - 一种蛋白质及其在制备抗微生物产品中的应用 - Google Patents
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本发明公开了一种蛋白质及其在制备抗微生物产品中的应用。本发明提供的多肽，如序列表的序列1所示、序列表的序列2所示、序列表的序列3所示或序列表的序列4所示。本发明还保护具有所述多肽的蛋白质、所述多肽的衍生物或含有所述多肽的组合物。本发明对于微生物，特别是有害微生物的防治，微生物流行病的防治具有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白质及其在制备抗微生物产品中的应用。
背景技术
与简单的无机分子或是由微生物产生的抗生素类不同，抗菌肽是由基因编码的，因而高等生物可以根据其表面的微生物对这些肽类抗生素的敏感性的变化来灵活调节其自身的分子结构,有广谱、高效的杀菌活性。目前抗菌肽的潜在应用价值受到了国内外学者的广泛关注。迄今发现的抗菌肽中，主要是小分子抗微生物肽（一般小于100个氨基酸），这些内源性的短肽分子能够破坏微生物细胞膜的结构或功能。在过去的20年里，在植物以及软体动物和人等一系列多细胞动物的细胞和体液中发现了数百个这类抗微生物肽。大体上，可以粗略地将这些短肽分类为Cecropin样抗菌肽、富含脯氨酸残基的抗菌肽、含甘氨酸残基的抗菌肽和富含半胱氨酸残基的抗菌肽，其中富含半胱氨酸残基的碱性抗菌肽被命名为防御素(defensin)。
防御素具有广谱及强力的抗微生物（细菌、真菌、病毒、寄生虫等）特性，是人粘膜、皮肤以及上皮细胞的重要免疫作用分子。人防御素包括α、β和θ三个家族，分子大小为29-45个氨基酸，含有六个半胱氨酸残基，从而形成三对二硫键。其中，β-防御素家族在人基因组上约有40个成员，人β-防御素1（hBD-1）于1995年被发现，随后在2000年左右hBD-2、hBD-3和hBD-4也相继被发现。
β-防御素具有广谱的抗微生物活性。在体外，防御素在毫摩尔浓度下对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌均具有杀灭作用。其中，微克级水平的hBD-3对金黄色葡萄球菌和酿脓链球菌等革兰氏阳性致病菌，绿脓杆菌和大肠杆菌等革兰氏阴性菌，以及酵母，都具有强烈的杀伤作用，并且对多重抗药性的金黄色葡萄球菌和抗万古霉素的粪肠球菌也可在较低浓度下发挥杀伤作用。hBD-4可以抑制革兰氏阳性菌（如葡萄球菌）和革兰阴性菌（如大肠埃希菌）的生长，同时抗绿脓杆菌的活性也很强。此外，β-防御素对病毒、真菌（如酵母等）等微生物也有抑制作用。
β-防御素的直接杀菌作用是由于β-防御素分子呈阳性、带正电荷，能够与带负电荷、呈阴性的细菌表面结合，结合后其分子中的疏水区可插入到细菌的胞膜，而其带电区（带正点荷）则与细菌胞膜上带负电荷的磷脂头部和水分子相互作用。在细胞膜上多个β-防御素分子聚集形成孔隙或通道，使得正常情况下处于胞外的离子、多肽等流入胞内，而胞内重要的盐类、大分子等则泄漏到胞外，最终导致不可逆性的菌体死亡。β-防御素在细胞膜上的通道形成过程与膜的磷脂组成成分和所处的温度环境等因素有关。然而，一旦β-防御素在膜上形成了通道，上述因素便不会对其通道的活动构成本质的影响。
β-防御素的表达水平和活力受作用环境的盐浓度和离子种类的影响。过高的盐浓度（如100mM以上PBS缓冲液）会导致防御素活性水平急剧下降。一价离子对防御素活性影响较小，二价离子（如钙、镁离子）则可显著降低防御素的活性。分析认为较高的盐浓度（>50mM）可能会影响防御素的带电量，进而降低其抗菌效果，而人体生理环境盐浓度约为150mM，一定程度限制了防御素的临床应用。因此，提升防御素的活性和耐盐能力可推动防御素的实际应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种蛋白质及其在制备抗微生物产品中的应用。
本发明提供的多肽，如序列表的序列1所示、序列表的序列2所示、序列表的序列3所示或序列表的序列4所示。
本发明还保护具有所述多肽的蛋白质（包括将所述多肽进行一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白质，也包括将所述多肽与其他标签蛋白或功能蛋白进行融合得到的融合蛋白）、所述多肽的衍生物或含有所述多肽的组合物。
本发明还保护所述多肽、所述蛋白质、所述衍生物或所述组合物在制备抑制微生物生长和/或杀灭微生物的产品中的应用。
本发明还保护一种抑制微生物生长和/或杀灭微生物的产品，其活性成分为所述多肽、所述蛋白质、所述衍生物或所述组合物。
本发明提供的产品，除了所述有效成分外，可以添加药学上允许的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂、添加剂等。
本发明提供的产品，可为片剂、散剂、颗粒剂、液剂、乳剂或悬浊剂等，亦可为粉剂、水剂、油剂、软膏、硬膏、喷雾剂等。
本发明还保护所述多肽、所述蛋白质、所述衍生物或所述组合物在抑制微生物生长和/或杀灭微生物中的应用。
以上任一所述的微生物可为细菌，具体可为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌，更具体可为大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、福氏志贺菌、宋氏志贺菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌或表皮葡萄球菌。
本发明通过改变现有防御素的氨基酸组成和部分序列，设计新的抗菌肽，通过影响多肽或其部分区域的二级结构、带电荷量、疏水性等特性，从而保持或提高其抗微生物活性，并具有更好的耐盐能力。本发明对于微生物，特别是有害微生物的防治，微生物流行病的防治具有重大价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次独立重复实验，结果取平均值。
PBS缓冲液的制备方法：将8mmol Na2HPO4和2mol NaH2PO4溶于水并用水定容至1L。
LB培养基的制备方法：取胰化蛋白胨（OXOID，批号804054）10g、酵母提取物（OXOID，批号1173143）5g、NaCl(西陇化工股份有限公司，批号1207032)10g，用蒸馏水定容至1L，pH7.4。
MH培养基（水解酪蛋白培养基）：青岛海博生物技术有限公司，批号20121105。
实施例1、抗菌肽的设计
已报道的β-防御素3（hBD-3）和β-防御素4（hBD-4）的序列如下：
β防御素3、4的氨基酸序列为：
hBD-3：GIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCCSTRGRKCCRRKK
hBD-4：EFELDRICGYGTARCRKKCCPNTYACCLRKWDESLLNRTKP
根据已报道的β-防御素3和β-防御素4，设计新的抗菌肽如下：
H4（序列表的序列2）：GIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCCSTRGRKCCRRKK。
H4中，用hBD-4中的方框部分取代了hBD-3中的方框部分。
3N4I（序列表的序列1）：QKYYCRVRGGRCAVLSCRSQEYRIGRCSTRGRKCCRRKK。
3N4I中，删除了H4中的下划线部分。
MIX-M（序列表的序列3）：GIIAVLAKVVCRVRKKRCAVLSCPRRAKRIGKCSTRGRKCCRRKK。
MIX-M中，对H4中的若干氨基酸残基进行了突变，见粗体字母。
HBD3-M（序列表的序列4）：GIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEESISKCSTRGRKCCRRKK。
HBD3-M中，对H4中的若干氨基酸残基进行了突变，见粗体字母。
实施例2、抗菌肽的合成
委托上海波泰生物技术有限公司，采用9-芴甲氧羰基法（Fmoc固相合成法）分别合成hBD-3、hBD-4、H4、3N4I、MIX-M和HBD3-M。
合成工艺简述如下：
1、NovaSyn TGA树脂（0.25mmol/g）作为固相载体；将10份的首个氨基酸以N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）/4-二甲氨基吡啶（DMAP）法加入到树脂中（10份的Fmoc-氨基酸，5份的DIC，0.1份的DMAP）；后续的氨基酸，以四倍于固相载体的量，同时加入1份的Fmoc-氨基酸，1份的2-(1H-benzotriazole-1-yl)1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate，1份的N-hydroxybenzotriazole，以及2份的N,N-diisopropylethylamine。
2、Fmoc基团用30%的哌啶/NMP洗脱，合成后的多肽用含5%thioanisole，3%ethandithiol及2%anisole的三氟乙酸（TFA）去保护并从树脂上分离；洗脱下的多肽用冰冷的乙醚沉淀，过滤后溶于水中，冻干，并用DTT还原。
3、合成的多肽用反向高效液相层析（RP-HPLC）进行纯化，样品注入PhenomenexC18层析柱（25cm，内径5mm），用含0.1%TFA的蒸馏水（A液）和0.1%TFA的乙腈（B液）洗脱，收集下的组分冻干干燥并进行RP-HPLC分析。
实施例3、抗菌肽的对微生物的抑制活性
实验菌株如下：
大肠杆菌（Escherichia coli）：ATCC编号为25922；
肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）：ATCC编号为700603；
铜绿假单胞菌（Pseudomonas Aeruginosa）：ATCC编号为15442；
福氏志贺菌（Shigella flexneri）：CICC编号为21534；
宋氏志贺菌（Shigella sonnei）：CICC编号为21535；
鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）：CICC编号为21484；
金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）：ATCC编号为29213；
粪肠球菌（Enterococcus faecalis）：ATCC编号为29212；
屎肠球菌（Enterococcus faecium）：ATCC编号为6057；
表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）：ATCC编号为12228。
CICC即中国工业微生物菌种保藏管理中心，网址为：http://www.china-cicc.org/。
ATCC即美国模式培养物集存库，网址为：http://www.atcc.org/。
实验方法：（1）用液体培养基培养待测菌株至OD600nm约为0.6，然后用PBS缓冲液稀释，得到浓度为106CFU/ml的菌液；（2）在步骤（1）得到的菌液中加入待测多肽（即实施例2制备得到的hBD-3、hBD-4、H4、3N4I、MIX-M或HBD3-M；H4即序列表的序列2所示的多肽，3N4I即序列表的序列1所示的多肽，MIX-M即序列表的序列3所示的多肽，HBD3-M即序列表的序列4所示的多肽），37℃孵育3h；（3）将步骤（2）得到的混合液用PBS缓冲液稀释至1000倍体积后取100μl均匀涂布在固体培养基平板上，37℃培养12小时，观察细菌生长与存活状况，对活菌进行计数，采用Logit回归模型计算LD90数值（即90%细菌死亡时对应的多肽浓度）。
采用LB培养基（包括液体培养基和固体培养基）的实验菌株为：大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、福氏志贺菌、宋氏志贺菌和鼠伤寒沙门氏菌。
采用MH培养基（包括液体培养基和固体培养基）的实验菌株为：金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌和表皮葡萄球菌。
各个多肽对各个细菌的LD90数值见表1。
表1各个多肽对各个细菌的LD90数值（μg/ml）
结果表明：H4、3N4I、MIX-M和HBD3-M均具有显著的抗菌活性，针对多种G+菌和G-菌，其LD90范围为0.8-8.0μg/ml；已知防御素hBD-3和hBD-4的LD90范围为1.7-11.5μg/ml和8.0-125.2μg/ml。即本发明提供的多肽比现有防御素的抑菌浓度均有不同程度的下降，抗菌活性显著增强。
实施例4、多肽的耐盐活性
实验菌株如下：
大肠杆菌（Escherichia coli）：ATCC编号为25922；
金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）：ATCC编号为29213；
肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）：ATCC编号为700603；
铜绿假单胞菌（Pseudomonas Aeruginosa）：ATCC编号为15442；
福氏志贺菌（Shigella flexneri）：CICC编号为21534；
宋氏志贺菌（Shigella sonnei）：CICC编号为21535。
实验方法：（1）用液体培养基培养待测菌株至OD600nm约为0.6，然后用PBS缓冲液稀释，得到浓度为106CFU/ml的菌液；（2）在步骤（1）得到的菌液中加入剂量大于LD99数值的待测多肽（即实施例2制备得到的hBD-3、hBD-4、H4、3N4I、MIX-M或HBD3-M；H4即序列表的序列2所示的多肽，3N4I即序列表的序列1所示的多肽，MIX-M即序列表的序列3所示的多肽，HBD3-M即序列表的序列4所示的多肽），并加入NaCl，使NaCl浓度分别达到50、100、150或200mmol/L，37℃孵育3h；（3）将步骤（2）得到的混合液用PBS缓冲液稀释至1000倍体积后取100μl均匀涂布在固体培养基平板上，37℃培养12小时，观察细菌生长与存活状况，对活菌进行计数。设置不加入NaCl的对照组甲。设置不加入NaCl且不加入待测多肽的对照组乙。计算各个浓度的NaCl处理组与对照组相比的抑菌活性。抑菌活性=（对照组乙的活菌数-实验组或对照组甲的活菌数）÷对照组乙的活菌数×100%。
结果见表2至表7。
表2多肽在不同盐浓度条件下对大肠杆菌的抑菌活性
表3多肽在不同盐浓度条件下对金黄色葡萄球菌的抑菌活性
表4多肽在不同盐浓度条件下对肺炎克雷伯菌的抑菌活性
表5多肽在不同盐浓度条件下对铜绿假单胞菌的抑菌活性
表7多肽在不同盐浓度条件下对宋氏志贺的抑菌活性
针对多种细菌，本发明提供的4种多肽在有盐条件下（≥50mM NaCl）的抑菌活性高于已知防御素hBD-3和hBD-4，特别是在高盐条件下（≥150mM NaCl）具有更好的抑菌活性，耐盐能力显著增强。H4与MIX-M的耐盐优势表现的更为突出，在盐浓度高达200mM时，它们的抗菌活性没有明显改变，仍然保有79-98%的活性。
Claims (5)
1.多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。
2.权利要求1所述多肽在制备抑制微生物生长和/或杀灭微生物的产品中的应用；所述微生物为细菌。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述细菌为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。
4.一种抑制微生物生长和/或杀灭微生物的产品，其活性成分为权利要求1所述多肽；所述微生物为细菌。
5.如权利要求4所述的产品，其特征在于：所述细菌为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。
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