CN109627314A - 具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽及其活性优化修饰物 - Google Patents

具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽及其活性优化修饰物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽及其活性优化修饰物，抗菌肽是具有选择性抑制大肠杆菌活性的人源天然蛋白，从人体足跟角质层脚屑中提取、分离、纯化得到；通过对抗菌肽的氨基酸序列修饰得到的SPINK9‑RV，能够提高SPINK9的抗菌活性，提高杀菌效率，即使是蛋白量很小的情况下，也能够具有优秀的抗菌活性，可以应用于抗生素、消毒剂、防腐剂或包装材料中，具有优秀的市场前景。

Description

具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽及其活性优化修饰物
技术领域
本发明涉及抗菌肽领域，特别是一种具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽及其活性优化修饰物。
背景技术
作为现代医学的一大支柱，抗生素在处理感染起到了巨大的作用。然而，近三十多年来，各种各样的感染仍然是人类健康的最大敌人之一。2017年9月，世卫组织正式发布了“全球濒临抗生素枯竭”的报告。由于对抗生素的使用不当或过度使用，许多细菌产生耐药性或快速进化成致命性的超级细菌，如在德国引发重大疫情的出血性大肠杆菌素、在美国被称为杀手的耐碳青霉烯的肠杆菌。当前，由于抗生素耐药性的产生，细菌感染发生的死亡总人数已经超过癌症和艾滋病的总和。更为重要的是，一旦发生细菌恐怖袭击，将是对国家、民族甚至全人类最可怕的灾难。澳大利亚首席科学家伊恩·查布曾指出,抗生素耐药性很可能会成为全球面临的最严重公共卫生挑战之一,这需要科学界、企业界和公众共同应对。
近年来，抗菌肽的开发与应用成为研究的热点。具有广谱抗微生物活性的抗菌肽，不仅对细菌毒素有中和作用，还能抗真菌、抗病毒、抑制或杀伤肿瘤细胞、杀灭寄生虫和原虫等。其作用机制独特，不易产生耐药性，抗菌肽只对原核生物细胞和真核生物病变细胞有抗菌作用，对正常的真核生物细胞不起作用。
在饲料中添加抗菌肽代替传统抗生素。抗菌肽不仅能够耐受饲料加工过程中高温高压的剧烈条件，并且可以在饲料保存过程中持续发挥其功能，保持饲料品质，延长贮存期限。比如，利用抗菌肽的抑菌活性，可以抑制产品在加工及销售中滋生的有害菌，延长产品货架期；在饲料中添加可以起到天然防霉防腐剂的作用，能抑制致病菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等，以及引起饲料霉变的多种霉菌。抗菌肽杀菌机理独特，病原菌不易对抗菌肽产生耐药性。再者，抗菌肽产品具广谱抗菌作用，对畜禽具有促生长、保健和治疗疾病的功能，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型制剂。据美国学者报道，抗菌肽可以作为饲料防霉剂。
在医药方面抗菌肽就成为其中最有前途的选择之一。新型抗菌药物抗菌肽由于其作用机理不同于传统抗生素，不会使细菌产生耐药性。而且除抗菌作用之外，还有促进伤口的快速愈合，消炎，抗感染的功能。抗菌肽可谓抗菌药物中的新秀。
抗菌肽还可作为新型的天然防腐剂，因为抗菌肽表现出的良好的热稳定性,可以用于热加工食品。其强大的抗菌活性可以防止食品生产，发酵过程中的杂菌污染。因此，把抗菌肽用作食品防腐剂是广阔的。
学界公认，抗菌肽是当前替代化学抗生素的最佳替代品。然而，到目前为止，全球极少有抗菌肽药物达到临床使用的要求。市场需要开发人源天然抗菌肽成药，本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽及其活性优化修饰物，本发明从人体足跟角质层脚屑中提取、分离并纯化得到选择性抑制大肠杆菌的抗菌肽，并对氨基酸序列进行修饰，实现提高SPINK9的灭菌活性的效果，提高杀菌效率。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽，抗菌肽是具有选择性抑制大肠杆菌活性的人源天然蛋白，抗菌肽的氨基酸序列由63个氨基酸残基组成，其氨基酸序列为SEQ IDNO.1；
SEQ ID NO.1:
KQTKQMVDCSHYKKLPPGQQRFCHHMYDPICGSDGKTYKNDCFFCSKVKKTDGTLKFVH FGKC。
前述的具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽，抗菌肽从人体足跟角质层脚屑中提取、分离、纯化得到。
前述的具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽，
提取的过程为：
收集人体足跟角质层脚屑，采用酸性乙酰乙酸缓冲液提取总蛋白；
分离、纯化的过程为：
提取的总蛋白经超滤管以三羟甲基氨基甲烷柠檬酸盐缓冲液膜渗滤后,用肝素琼脂糖凝胶柱进行亲和层析；
附着肝素的蛋白先通过含氯化钠的三羟甲基氨基甲烷柠檬酸盐缓冲液洗脱，再用三氟乙酸进行膜渗滤；
渗出液通过制备柱以反向高效液相色谱方式进行分离纯化,富集的蛋白经冷冻干燥后溶解于乙酸水溶液中保存；
富集的蛋白通过制备柱以反向高效液相色谱方式进行再一次分离纯化,分别收集各个峰值区的蛋白并用质谱仪进行分子量鉴定和氮末端蛋白测序；蛋白分子量为7314.5，7186.4，7168.3，7058.2，6957.1，6828.9，6810.9，6700.8或6569.6道尔顿的，都是抗菌肽或其衍生物。
前述的具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽，抗菌肽抑制ATCC 11303、ATCC10536、ATCC 11229大肠杆菌株系的抑菌圈直径大于等于10.5mm。
前述的具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽，环境的PH值对杀菌效率具有影响。
前述的具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽，酸性环境条件下杀菌效率高，PH值越低效率越高。
具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽的活性优化修饰物，抗菌肽的活性优化修饰物为SPINK9-RV，SPINK9-RV的氨基酸序列为SEQ ID NO.2；
SEQ ID NO.2:
KQTKQMVDCSHYKKLPPGQQRFCHRVYDPICGSDGKTYKNDCFFCSKVKKTDGTLKFVHF GKC。
前述的具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽的活性优化修饰物，SPINK9-RV的修饰过程为：
突变方案为His25Met26定点突变为Arg25Val26，设计合成覆盖突变位点的双向引物，通过DNA聚合酶链式反应，以搭桥法方式向目的DNA片段中引入点突变Arg25Val26。
前述的具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽的活性优化修饰物，当大肠杆菌菌悬液的蛋白用量小于等于12.5μg/ml时，SPINK9不具有抗菌活性，修饰物SPINK9-RV具有抗菌活性。
本发明的有益之处在于：
本发明从人体足跟角质层脚屑中提取、分离并纯化得到选择性抑制大肠杆菌的抗菌肽，实现对大肠杆菌具有选择性的抑制活性；
本发明对抗菌肽的氨基酸序列进行修饰得到SPINK9-RV，即使菌悬液是低蛋白也具有较高的抗菌活性，实现提高SPINK9的灭菌活性的效果，提高杀菌效率；
抗菌肽及其活性优化修饰物应用范围广，可以应用于抗生素、消毒剂、防腐剂或包装材料中；
抗菌肽与传统抗生素联合用药会产生协同作用，可以实现更好的抗菌效果，同时可以有效降低抗生素的使用剂量。
附图说明
图1是本发明的SPINK9对多种代表性大肠杆菌的杀菌效率示意图；InhibitionZone[mm]：抑菌圈直径(E.coli-killing activity：杀死大肠杆菌的活性)；
图2是pH值对本发明的SPINK9杀菌效率的影响示意图(Killing[％]：杀菌效率百分比)；
图3为SPINK9及其活性优化修饰物的杀菌效率的比较效果图(Killing[％]：杀菌效率百分比；protein concentration：蛋白浓度)。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
△具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽，抗菌肽是具有选择性抑制大肠杆菌活性的人源天然蛋白，抗菌肽的氨基酸序列由63个氨基酸残基组成，其氨基酸序列为SEQ IDNO.1；
SEQ ID NO.1:
KQTKQMVDCSHYKKLPPGQQRFCHHMYDPICGSDGKTYKNDCFFCSKVKKTDGTLKFVH FGKC。
抗菌肽从人体足跟角质层脚屑中提取、分离、纯化得到。
提取过程为：
收集80～120克人体足跟角质层脚屑，采用酸性乙酰乙酸缓冲液按照参考方法(Schroeder，1997)提取总蛋白；
分离、纯化的过程为：
提取的总蛋白经Amicon公司超滤管(3000道尔顿)以10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷柠檬酸盐缓冲液(pH 8.0)膜渗滤后,采用Pharmacia公司肝素琼脂糖凝胶柱进行亲和层析；
附着肝素的蛋白先通过含2摩尔氯化钠的100毫摩尔三羟甲基氨基甲烷柠檬酸盐缓冲液(pH 8.0)洗脱，再用0.1％三氟乙酸进行膜渗滤；
渗出液通过Macherey&Nagel公司的C8制备柱(300x7mm,C8Nucleosil,250x12.6mm)以反向高效液相色谱(RP-HPLC)方式进行分离纯化,富集的蛋白经冷冻干燥后溶解于5毫升0.01％(v/v)乙酸水溶液中保存；
富集的蛋白通过Macherey&Nagel公司的C2-C18制备柱以反向高效液相色谱(RP-HPLC)方式进行再一次分离纯化,分别收集各个峰值区的蛋白并采用Micromass公司的质谱仪进行分子量鉴定和氮末端蛋白测序；蛋白分子量为7314.5，7186.4，7168.3，7058.2，6957.1，6828.9，6810.9，6700.8或6569.6道尔顿的，都是丝氨酸蛋白酶抑制剂9(SPINK9)或其衍生物。
SPINK9抗菌肽验证实验部分：
实验一：SPINK9对多种代表性大肠杆菌的杀菌效率实验
实验过程:
首先吸取经过活化的大肠杆菌液接入营养肉汤培养基中，置于恒温振荡培养箱中振荡培养至对数期作为原菌液；吸取1mL原菌液用无菌生理盐水倍比稀释成105cfu/mL的菌悬液待用。然后用包含1％(v/v)胰蛋白酶大豆汤(TSB，Thermo Fisher Science公司)的10毫摩尔磷酸钠缓冲液(pH 5.5)配备的底层琼脂糖制备琼脂糖固体培养基；在无菌条件下，向无菌培养皿中倾倒约25mL的灭菌固体培养基，静置待其冷却，制备低电渗固体平板；吸取100μL稀释好的菌悬液，按照无菌操作步骤，接入固体平板培养基中均匀涂布。菌液扩散15min后用灭菌的3mm木塞钻孔器切进培养基为加样孔，向每孔滴加5μL SPINK9蛋白液(含有SPINK9蛋白1μg)，另设三组平行实验组，设溶菌酶为阳性对照组，0.01％乙酰乙酸为阴性对照组。将实验组和对照组平板放入恒温恒湿培养箱中，37℃下倒置培养16小时。然后，覆盖包含1％(w/v)琼脂糖，3.4％(w/v)酪蛋白胨，0.6％(w/v)大豆胨，0.5％D(+)-单水葡萄糖，1％(w/v)氯化钠和0.5％(w/v)磷酸二氢钾的琼脂糖培养基(pH 7.2-7.4)，在37℃培养3小时后，测定抑菌圈澄清区的直径。
实验结果如下表一所示：
表一 抗菌肽SPINK9抑制各类大肠杆菌的抑菌圈直径
注：a、原始数据为三次重复实验；
b、抑菌圈直径包括在测量数据内，如果抑菌圈直径小于3mm，定义为无抑菌圈，记为0；
c、该表格图形表示为图1。
结果分析：本发明的抗菌肽对大肠杆菌普遍具有抑制作用，特别是对ATCC 11303、ATCC10536、ATCC 11229这三种大肠杆菌株系的抑菌效果明显，抑菌圈直径大于等于10.5mm。
实验二：pH值对SPINK9杀菌效率的影响；
实验过程：首先吸取经过活化的大肠杆菌ATCC11303菌液接入营养肉汤培养基中，置于恒温振荡培养箱中振荡培养至对数期作为原菌液；吸取1mL原菌液离心富集后用含有1％胰蛋白酶大豆汤(TSB)的10毫摩尔磷酸钠缓冲液(pH值分别为5.5，6.2，和7.2)清洗并倍比稀释成105cfu/mL的菌悬液,同时配备倍比稀释成104cfu/mL、103cfu/mL、102cfu/mL稀释菌悬液待用。每100μL菌悬液滴加10μL SPINK9蛋白液(含有SPINK9蛋白浓度初始为19ng/ml，依次2倍叠加，直到100μg/ml)，另设2组平行实验组，设溶菌酶为阳性对照组，0.01％乙酰乙酸为阴性对照组。每个菌悬处理液在恒温恒湿培养箱中，37℃培养2小时后均匀涂布于营养肉汤培养基固体平板上，后倒置于恒温恒湿培养箱中，37℃培养16小时。采用日本BioKobe公司的菌落计数仪统计菌落数。
实验结果如表二所示：
表二 pH值对SPINK9杀菌效率的影响
注：a、SPINK9用量单位μg/ml；
b、原始数据为三次重复实验；数据结果表示为菌落统计上的杀菌百分比数值；
c、该表格图形表示为图2.
结果分析：
若抗菌肽的用量在0.78-12.5μg/ml，缓冲液的PH对杀菌效率具有影响，若抗菌肽的用量大于等于25μg/ml，缓冲液的PH对杀菌效率无影响。
若抗菌肽的用量在0.78-12.5μg/ml，缓冲液PH优选5.5。
△具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽的活性优化修饰物，抗菌肽的活性优化修饰物为SPINK9-RV，SPINK9-RV的氨基酸序列为SEQ ID NO.2；
SEQ ID NO.2:
KQTKQMVDCSHYKKLPPGQQRFCHRVYDPICGSDGKTYKNDCFFCSKVKKTDGTLKFVHF GKC。
SPINK9-RV的修饰过程为：
根据突变方案(His25Met26定点突变为Arg25Val26)，设计合成覆盖该突变位点的双向引物，通过DNA聚合酶链式反应(PCR)，以搭桥法方式向目的DNA片段中引入点突变Arg25Val26(即简写RV)。
SPINK9-RV抗菌肽验证实验部分：
实验三：SPINK9及其活性优化修饰物的杀菌效率的比较；
实验将SPINK9-GG作为阴性对照组；
SPINK9-GG的氨基酸序列表为：
KQTKQMVDCSHYKKLPPGQQRFCHGGYDPICGSDGKTYKNDCFFCSKVKKTDGTLK FVHFGKC。修饰过程为：根据突变方案(His25Met26定点突变为Gly25Gly26)，设计合成覆盖该突变位点的双向引物，通过DNA聚合酶链式反应(PCR)，以搭桥法方式向目的DNA片段中引入点突变Gly25Gly26(即简写GG)。
实验过程：首先吸取经过活化的大肠杆菌ATCC11303菌液接入营养肉汤培养基中，置于恒温振荡培养箱中振荡培养至对数期作为原菌液；吸取1mL原菌液离心富集后用含有1％胰蛋白酶大豆汤(TSB)的10毫摩尔磷酸钠缓冲液(pH值5.5)清洗并倍比稀释成105cfu/mL的菌悬液,同时配备倍比稀释成104cfu/mL、103cfu/mL、102cfu/mL稀释菌悬液待用。每100μL菌悬液滴加10μL SPINK9-v1或其修饰物SPINK9-RV蛋白液(含有蛋白浓度初始为19μg/ml，依次2倍叠加，直到100μg/ml)，另设2组平行实验组，设溶菌酶为阳性对照组，0.01％乙酰乙酸或另一个SPINK9-v1修饰物SPINK9-GG为阴性对照组。每个菌悬处理液在恒温恒湿培养箱中，37℃培养2小时后均匀涂布于营养肉汤培养基固体平板上，后倒置于恒温恒湿培养箱中，37℃培养16小时。采用日本BioKobe公司的菌落计数仪统计菌落数。
实验结果：
表二 SPINK9及其活性优化修饰物的杀菌效率的比较
注：a、SPINK9用量单位μg/ml；SPINK9-v1指正常的SPINK9；
b、原始数据为三次重复实验；数据结果表示为菌落统计上的杀菌百分比数值；
c、该表格图形表示为图3.
结果分析：
SPINK9-RV，能够提高抗菌肽的活性，提高杀菌效率；
当大肠杆菌菌悬液的蛋白用量大于等于25μg/ml时，SPINK9和修饰物SPINK9-RV的杀菌效率相差不大。
当大肠杆菌菌悬液的蛋白用量小于等于12.5μg/ml时，SPINK9不具有抗菌活性，修饰物SPINK9-RV具有抗菌活性，说明SPINK9-RV在低蛋白的情况下，仍然具有高灵敏性，活性明显高于正常的SPINK9，可以应用于医疗检测。
本发明从人体足跟角质层脚屑中提取、分离并纯化得到选择性抑制大肠杆菌的抗菌肽，实现对大肠杆菌具有选择性的抑制活性；通过对抗菌肽的氨基酸序列修饰得到的SPINK9-RV，能够提高SPINK9的抗菌活性，提高杀菌效率，即使是蛋白量很小的情况下，也能够具有优秀的抗菌活性，可以应用于抗生素、消毒剂、防腐剂或包装材料中；抗菌肽与传统抗生素联合用药会产生协同作用，可以实现更好的抗菌效果，同时可以有效降低抗生素的使用剂量，具有优秀的市场价值。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 浙江亮肽生物技术有限公司
<120> 具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽及其活性优化修饰物
<140> 2019100016040
<141> 2018-11-19
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63
<212> PRT
<213> native proteins
<400> 1
Lys Gln Thr Lys Gln Met Val Asp Cys Ser His Tyr Lys Lys Leu Pro
1 5 10 15
Pro Gly Gln Gln Arg Phe Cys His His Met Tyr Asp Pro Ile Cys Gly
20 25 30
Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Lys Asn Asp Cys Phe Phe Cys Ser Lys Val
35 40 45
Lys Lys Thr Asp Gly Thr Leu Lys Phe Val His Phe Gly Lys Cys
50 55 60
<210> 2
<211> 63
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Lys Gln Thr Lys Gln Met Val Asp Cys Ser His Tyr Lys Lys Leu Pro
1 5 10 15
Pro Gly Gln Gln Arg Phe Cys His Arg Val Tyr Asp Pro Ile Cys Gly
20 25 30
Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Lys Asn Asp Cys Phe Phe Cys Ser Lys Val
35 40 45
Lys Lys Thr Asp Gly Thr Leu Lys Phe Val His Phe Gly Lys Cys
50 55 60

Claims (9)

1.具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽，其特征在于，抗菌肽是具有选择性抑制大肠杆菌活性的人源天然蛋白，所述抗菌肽的氨基酸序列由63个氨基酸残基组成，其氨基酸序列为
SEQ ID NO.1；
SEQ ID NO.1:
KQTKQMVDCSHYKKLPPGQQRFCHHMYDPICGSDGKTYKNDCFFCSKVKKTDGTLKFVHFGKC。
2.根据权利要求1所述的具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽从人体足跟角质层脚屑中提取、分离、纯化得到。
3.根据权利要求2所述的具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽，其特征在于，
所述提取的过程为：
收集人体足跟角质层脚屑，采用酸性乙酰乙酸缓冲液提取总蛋白；
所述分离、纯化的过程为：
提取的总蛋白经超滤管以三羟甲基氨基甲烷柠檬酸盐缓冲液膜渗滤后,用肝素琼脂糖凝胶柱进行亲和层析；
附着肝素的蛋白先通过含氯化钠的三羟甲基氨基甲烷柠檬酸盐缓冲液洗脱，再用三氟乙酸进行膜渗滤；
渗出液通过制备柱以反向高效液相色谱方式进行分离纯化,富集的蛋白经冷冻干燥后溶解于乙酸水溶液中保存；
富集的蛋白通过制备柱以反向高效液相色谱方式进行再一次分离纯化,分别收集各个峰值区的蛋白并用质谱仪进行分子量鉴定和氮末端蛋白测序；蛋白分子量为7314.5，7186.4，7168.3，7058.2，6957.1，6828.9，6810.9，6700.8或6569.6道尔顿的，都是抗菌肽或其衍生物。
4.根据权利要求1所述的具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽抑制ATCC 11303、ATCC 10536、ATCC 11229大肠杆菌株系的抑菌圈直径大于等于10.5mm。
5.根据权利要求1所述的具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽，其特征在于，环境的PH值对杀菌效率具有影响。
6.根据权利要求5所述的具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽，其特征在于，酸性环境条件下杀菌效率高，PH值越低效率越高。
7.具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽的活性优化修饰物，其特征在于，所述抗菌肽的活性优化修饰物为SPINK9-RV，SPINK9-RV的氨基酸序列为SEQ ID NO.2；
SEQ ID NO.2:
KQTKQMVDCSHYKKLPPGQQRFCHRVYDPICGSDGKTYKNDCFFCSKVKKTDGTLKFVHFGKC。
8.根据权利要求7所述的具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽的活性优化修饰物，其特征在于，所述SPINK9-RV的修饰过程为：
突变方案为：His25Met26定点突变为Arg25Val26，设计合成覆盖突变位点的双向引物，通过DNA聚合酶链式反应，以搭桥法方式向目的DNA片段中引入点突变Arg25Val26。
9.根据权利要求7所述的具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽的活性优化修饰物，其特征在于，当大肠杆菌菌悬液的蛋白用量小于等于12.5μg/ml时，SPINK9不具有抗菌活性，修饰物SPINK9-RV具有抗菌活性。
CN201910001604.0A 2019-01-02 2019-01-02 具有选择性抗大肠杆菌活性的抗菌肽及其活性优化修饰物 Pending CN109627314A (zh)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WU Z 等: "Skin-Derived SPINK9 Kills Escherichia coli", 《J INVEST DERMATO》 *

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