CN118005739B - 一种抗耐药菌株的多肽aph229及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗耐药菌株的多肽APH229及其制备方法和应用,属于生物医药领域,多肽APH229其序列为:Val‑Lys‑Val‑Arg‑Lys‑Leu‑Ile‑Arg‑Arg‑Leu‑Arg‑Arg‑Ile‑Ala‑Ile‑Ala‑Arg‑Leu‑Ile。本发明制备的抗菌多肽APH229不仅可以对各种致病菌具有显著的活性,同时还显著增强对肺炎克雷伯耐药菌株、铜绿假单胞耐药菌株的抗菌活性。本发明的抗菌多肽APH229在具有广谱抗菌活性的同时对于正常的细胞毒副作用小,对红细胞有极低的裂解效果,并且稳定性好,有望成为治疗细菌感染的新型药物。
Description
技术领域
本发明属于生物多肽药物领域,具体涉及具体涉及一种抗耐药菌株的多肽APH229及其制备方法和应用。
背景技术
抗生素的发现和使用在全球范围内对人类健康产生了深远的影响。然而,随着抗生素的过度和不当使用,耐药性问题日益严峻。抗生素耐药性的增加导致了常用抗生素治疗感染的有效性下降,进而增加了疾病传播、严重病情和死亡率的风险。
抗菌肽(AMPs)是一类广泛存在于自然界的小分子蛋白质,它们在宿主的天然免疫系统中扮演着重要角色。这些分子由于其广谱的抗菌活性,成为了抗生素耐药性日益严峻的现代医疗中潜在的救星。它们的抗菌特性通常与其正电性、两亲性和分子大小有关。这些结构特点使得抗菌肽能够与细菌的负电荷细胞膜相互作用,导致细胞死亡。抗菌肽的作用机制多样,但主要包括破坏微生物的细胞膜、干扰细胞内代谢过程和靶向细胞内分子。其中,破坏细胞膜是最普遍的作用机制之一,这通常通过孔穿透或磷脂双层扰动实现。
目前从水蛭转录组中发现的一些多肽,但是现有的多肽其抗菌效果较差,尤其是对于耐药菌抗菌效果更差,所以需要对抗菌肽进行改造获得高活性以及低红细胞裂解能力的多肽。
发明内容
发明目的:针对现有技术存在的问题,本发明旨通过结构改造及优化获得抗菌效果好且毒性低的新型抗菌肽。具体的讲,本发明提供了一种抗耐药菌株的多肽APH229,该多肽APH229显著提高对于病原菌的抗菌活性,维持低红细胞裂解能力,可以成为治疗细菌感染的新型药物。
本发明还提供多肽APH229的制备方法和应用。
技术方案:为了实现上述目的,本发明所述一种抗耐药菌株的多肽APH229,其序列为:Val-Lys-Val-Arg-Lys-Leu-Ile-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg-Ile-Ala-Ile-Ala-Arg-Leu-Ile。
其中,所述多肽APH229以多肽VKVRKLIRRLRRIRIDRLI为模板,将14位的Arg以及16位的Asp替换成Ala得到APH229。
本发明所述的抗耐药菌株的多肽APH229的制备方法,以多肽VKVRKLIRRLRRIRIDRLI为模板,将14位的Arg以及16位的Asp替换成Ala,使用固相肽合成的方法合成APH229。
本发明所述的抗耐药菌株的多肽APH229在制备抗病原菌感染药物中的应用。
其中,所述抗病原菌感染药物为抗病原性细菌感染药物和抗病原性耐药细菌感染药物。
其中,所述病原性细菌为铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌中的一种或者多种。
其中,所述病原性耐药细菌为铜绿假单胞菌耐药株、肺炎克雷伯菌耐药株、鲍曼不动杆菌耐药株、金黄色葡萄球菌耐药株、大肠杆菌耐药株中的一种或者多种。
本发明所述的抗病原菌感染药物组合物,包含所述的多肽APH229及其药学上所接受的载体。
其中,所述药物组合物是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂。
本发明所述的抗病原菌感染药物组合物在制备对红细胞有低裂解效果的抗病原菌感染药物中的应用,所述病原性细菌为铜绿假单胞菌及其耐药株、肺炎克雷伯菌及其耐药株、鲍曼不动杆菌及其耐药株、金黄色葡萄球菌及其耐药株、大肠杆菌及其耐药株中的一种或者多种。
本发明设计特定的多肽APH229,将模板肽(VKVRKLIRRLRRIRIDRLI)第14位的Arg、16位的Asp替换成Ala得到APH229,显著提高多肽抗菌活性,尤其是对于耐药菌株的抗菌活性,并保持低溶血性。此外,前期实验时也尝试分别将模板肽第14位的Arg替换成Ala、16位的Asp替换成Arg得到APH297,与模板肽相比,APH297对于标准菌株的抗菌活性并没有提高,对于耐药菌株的活性略微提升,但其抗菌效果明显不如APH229。
本发明设计的APH229不仅显著提高了抗菌活性,对耐药菌株抗菌活性较差的问题,同时维持低红细胞裂解能力,可以有效用于制备抗病原菌感染药物。
有益效果:与现有技术相比,本发明具有如下优点:
1、本发明制备的抗菌多肽APH229具有更好的广谱抗菌活性,不仅可以对各种致病菌具有显著的活性,同时还显著增强对肺炎克雷伯耐药菌株、铜绿假单胞耐药菌株的抗菌活性。
2、本发明的抗菌多肽APH229在具有广谱抗菌活性的同时对于正常的细胞毒副作用小,对红细胞有极低的裂解效果,并且稳定性好,有望成为治疗细菌感染的新型药物。
3、本发明抗菌多肽APH229的设计制备方法简单方便,设计新颖,原料来源易得,可以工业化生产应用。
附图说明
图1为多肽APH229螺旋投影图:
图2为alphafold2预测的多肽APH229二级结构;
图3为多肽APH229反相液相色谱图;
图4为多肽APH229质谱图;
图5为多肽APH229对鼠源红细胞溶血率;
图6为多肽APH229浓度为血清稳定性结果图;
图7为模板多肽血清稳定性结果图;
图8为多肽APH229小鼠肺泡灌洗液稳定性结果图;
图9为模板多肽小鼠肺泡灌洗液稳定性结果图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
本发明中设计的多肽由生物公司直接进行合成,也可以按现有多肽合成方法进行合成。
本发明中的模式菌株均从菌种库购买获得,临床耐药菌株中铜绿假单胞菌耐药菌为耐碳青霉烯类均可,肺炎克雷伯菌为耐碳青霉烯类、耐头孢类或者产超广谱B-内酰胺酶耐药菌株。
实施例1
以从水蛭转录组中的多肽(SEQ ID NO.2:VKVRKLIRRLRRIRIDRLI)为模板,将序列上的第14位的Arg、 16位的Asp替换成Ala得到APH229,使用固相肽合成的方法合成APH22。
多肽APH229,其序列为:Val-Lys-Val-Arg-Lys-Leu-Ile-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg-Ile-Ala-Ile-Ala-Arg-Leu-Ile(SEQ ID NO.1)。
固相合成法合成多肽APH22
多肽的合成:多肽APH229的合成从C端到N端逐个进行。将 Fmoc-Phe-Rink Resin用二氯甲烷浸泡15 min,待树脂膨胀,抽去二氯甲烷;加入体积比为1:4的六氢吡啶/DMF溶液(每克树脂10 mL),通入氮气,反应 2 次,时间为5 min和 15 min,反应结束后用 DMF 洗涤树脂 6次。取少量颗洗涤后树脂加入验色剂ABC各2-3滴 (A液: 茚三酮/无水乙醇溶液;B液:吡啶; C液:苯酚/无水乙醇溶液)在 100℃下共热 3 min,溶液及树脂颜色变为蓝色,说明氨基保护完全脱除。加入过量反应两倍摩尔数的Fmoc-Lys-Phe-OH和HOBT, 用每克树脂10 ml的DMF溶解,加入两倍摩尔数的DIC和Collidine,氮气鼓动,反应1 h。反应结束后用DMF洗涤树脂6次,重复进行缩合反应,依次连接各Fmoc保护氨基酸,完成直链序列的合成,将树脂用二氯甲烷和乙醚浸泡后抽干。加入 TFA,在恒温摇床中反应2 h,摇床转速 110 r/min,温度 25℃。滤去树脂,向滤液中加入无水乙醚,离心后获得固体,加入无水乙醚洗涤,再离心,重复数次后烘干即可获得APH229粗品多肽。
多肽的纯化:称取一定量粗品,加入适量乙腈,超声至澄清用过滤器除去大颗粒杂质,然后过制备型液相色谱仪,分段收取样品。用分析色谱仪做梯度分析,将达到所需纯度样品进行保留。然后进行冷冻干燥处理。
多肽的纯度测定(HPLC法)及质谱分析结果:多肽合成后经纯化得到成品,成品经高效液相色谱和质谱进行鉴定。
液相色谱分析条件:C18色谱柱(4.6×250 mm, 5 µm);流动相A为含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液,流动相B为含0.1%TFA的纯净水。检测波长为220 nm;流速为1.0 ml/min;进样量20 µl,进行梯度洗脱。
本发明多肽氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,纯度大于95%。APH229的分子量为:2342.61;抗菌多肽APH229螺旋投影图和AlphaFold2预测二级结构分别如图1和2所示:其HPLC和 MS分别如图3和4所示,与理论值相吻合。
实施例2
本发明多肽APH229体外抗菌活性的测定
本实验中涉及到的菌株有铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及肺炎克雷伯耐药菌株和铜绿假单胞耐药菌株。
实验方法:
1.培养基的配置
取MHB培养基24g,加入1000ml蒸馏水中,加热煮沸溶解,分装。
2、实验器具的准备及灭菌
将MHB培养基、配套枪头、排枪槽、试管一同放入高压灭菌锅中灭菌,121℃杀菌20min。实验前超净工作台及操作室使用前需用紫外灯杀菌30min以上。
3.抗菌肽母液制备
称取适量的多肽,用生理盐水溶解,配制成 1024 μg/ml 的母液,0.22 μm 的水相滤头过滤除菌,分装,置于4℃保存(一周内使用完),备用。对于不溶或难溶于生理盐水的样品,根据其特性,可采用适当浓度的DMSO去溶解。
4、菌悬液的制备
从-80℃冰箱取出用甘油保存的菌种,吸取200μL的菌液加入到4mL 的MHB培养基中,在37℃摇床中培养16h活化,取活化后的菌悬液吸取500μL转培至2.5mlMHB中,继续培养4-6h(此步目的是为了取细菌的对数生长期,是依据细菌的生长曲线来选择),然后取菌悬液用MHB稀释至OD600=0.3(菌落数约为108CFU/mL)备用。
5.样品稀释及加菌
在96孔板的每个孔加入MHB肉汤培养基100μL,然后对样品进行二倍稀释,即在A/B/C三排的第一孔加入样品100μL,用排枪充分吹打(至少三次以上)使样品与肉汤充分混匀,然后吸取100μL加入第二孔再次充分吹打与肉汤混匀,照此重复直至最后一孔,接着再在每一孔加入稀释好的菌液100μL,使得最终体系菌落数为5×105CFU,重复做三次(A/B/C三排样品)。
同时,做空白对照(只加培养基)、阴性对照(只加细菌)、模板多肽对照、阳性对照(APH297)。
6.观察结果
将96孔板放入37℃恒温培养箱培养16-20h,观察结果,以肉眼可见不生长菌的最低样品浓度定为MIC,结果如表1-3所示。
从表1-3可以看出,APH229具有较好的抗菌活性,对铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌具有显著的活性,同时更为重要的是,可以显著增强对铜绿假单胞耐药菌株抗菌活性,具有较好的杀灭作用。
实施例3
本发明多肽APH229溶血活性实验
实验方法:
从ICR小鼠身上收集新鲜的红细胞(RBCs)。用0.01mM PBS缓冲液洗RBC至少3次(经过三次离心,体积大约在3ml),直到悬浮液中看不到颜色。然后将RBC用PBS稀释,以获得体积分数2.0%的RBCs溶液。将100μl RBCs与等体积的抗菌肽APH229混合,使多肽终浓度分别为: 256、128、64、32、16μg/ml,37℃孵育1小时。之后将与样品孵育1小时后RBCs离心(1500×g, 5 min)取上清液,然后将0.1ml上清液转移到96孔平底板上,2%Triton X-100(Sigma-Aldrich)溶液和等体积2.0%红细胞溶液的混合做为阳性对照,PBS与等体积2.0%红细胞溶液的混合做为阴性对照。用酶标仪在540nm处测血红蛋白定吸光度(OD540)。公式如下:
溶血率(%)=[(A-A0)/(A100-A0)]×100。
A表示多肽APH229组的吸光值。A0表示 PBS 组的吸光值,A100 表示 ,Triton X-100组的吸光值。
进行三次独立重复实验。评价了多肽APH229对小鼠红细胞(RBC)的溶血活性,实验结果如图5所示。在浓度为256μg/mL时,多肽APH229溶血毒性较低且低于10%,在药物有效剂量范围内无溶血毒性。
实施例4
1、血清稳定性实验
将多肽APH229和模板肽分别溶解在缓冲液(生理盐水含10%牛胚胎血清)中配置成1.024mg/mL,将溶液放置在37°C水浴锅中进行孵育,分别在0、1、2、3、4小时使用反相高效液相色谱检测,通过峰面积计算多肽剩余量,评估了APH229对胎牛血清的敏感性,结果如图6和7所示。
图6和7结果显示,APH229与10%牛胚胎血清中孵育2小时后肽剩余量87.4%,而模板肽剩余77.9%;说明本发明的APH229在血清中有好的稳定性。
2、pH稳定性实验
实验方法:
将实施例2中配制的多肽APH229溶液分别在不同的pH条件下(pH=2、5、7和9)放置2h,然后再按上述实施例2的MIC测定方法进行实验(用HCl 和NaOH来调节样品溶液pH值),实验结果,如表4所示。
表4结果显示,多肽APH229在测试的四种pH条件下,活性均没有影响,对肺炎克雷伯菌的活性依然为1μg/ml,说明本发明的多肽APH229具有优异的pH稳定性。
3、盐敏感性实验
在96孔板中,调节盐溶液/样品溶液/细菌溶液的体积为50μL/50μL/100μL,使得氯化钠、氯化铵、氯化锌、三氯化铁的最终浓度为150 mM、6μM、8μM和4μM,然后再按上述实施例2的MIC测定方法以菌株肺炎克雷伯菌ATCC10031进行实验,结果如表5所示。
表5结果显示,多肽APH229在生理浓度Na1+、NH4 1+、Zn2+、Fe3+存在时,本发明的多肽APH229仍保持原有活性,具有优异的盐稳定性。
4、小鼠肺泡灌洗液稳定性实验
实验方法:
从小鼠支气管肺泡中获取一定灌洗液(BAL),BCA测得其蛋白总浓度,根据BCA测定的蛋白浓度,将多肽APH229以及模板肽稀释在BAL中,使得多肽:BAL中总蛋白的比例为1:1(wt:wt)。然后在37℃恒温箱中孵育样品,并在不同时间(0h、0.5h、1h、2h)取少许样品,放在-20℃下冷冻,最后用HPLC法测定不同时间点样品降解情况, 液相色谱分析条件:C18色谱柱4.6×250 mm, 5 µm);流动相A为含0.1%三氟乙酸的和5%纯净水的乙腈溶液,流动相B为含0.1%三氟乙酸和5%乙腈的纯净水溶液;检测波长为214 nm;流速为1 mL/min;进样量100 µl;进行梯度洗脱,洗脱条件为在0-25 min内按0-80% B相梯度递增。
结果如图8和9所示,APH229与小鼠肺泡灌洗液孵育1小时后肽剩余量达到78.1%,而模板肽仅有6.4%;说明本发明的APH229在小鼠肺泡灌洗液中有好的稳定性。
Claims (6)
1.一种抗耐药菌株的多肽APH229,其特征在于,其序列为:Val-Lys-Val-Arg-Lys-Leu-Ile-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg-Ile-Ala-Ile-Ala-Arg-Leu-Ile。
2.一种权利要求1所述的抗耐药菌株的多肽APH229的制备方法,其特征在于,以多肽VKVRKLIRRLRRIRIDRLI为模板,将14位的Arg以及16位的Asp替换成Ala,使用固相肽合成的方法合成APH229。
3.一种权利要求1所述的抗耐药菌株的多肽APH229在制备抗病原菌感染药物中的应用,所述病原菌为铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌耐药株、肺炎克雷伯菌耐药株中的一种或者多种。
4.一种抗病原菌感染药物组合物,其特征在于,包含权利要求1所述的多肽APH229及其药学上所接受的载体。
5.根据权利要求4所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂。
6.一种权利要求4所述的抗病原菌感染药物组合物在制备对红细胞有低裂解效果的抗病原菌感染药物中的应用,所述病原菌为铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌耐药株、肺炎克雷伯菌耐药株中的一种或者多种。
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