CN102603885B - 防御素及其在制备抗菌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明利用小球藻表达了改造的兔防御素NP-1(mNP-1)，在小球藻中表达的防御素对革兰氏阴性菌和阳性菌等具有很强的抑制或杀灭作用，也可杀灭耐药菌。本发明的结果可应用于制备抗革兰氏阴性菌和阳性菌药物，也可用于制备抗耐药的超级细菌的药物。
Description
技术领域
本发明涉及防御素及其在制备抗革兰氏阴性菌和阳性菌药物中的应用。具体地，涉及利用小球藻生产的防御素mNP-1，及其在制备抗革兰氏阴性菌和阳性菌药物中的应用。
背景技术
防御素的结构特点及分类
防御素是一类广泛存在于动物、植物和人类体内具有微生物抗性的阳离子小肽。防御素一般由29-54个氨基酸组成，分子量为3-6KD。在结构上具有以下共同特点：(1)带正电荷，(2)富含精氨酸，(3)具有一定数目的保守的半胱氨酸，(4)通过半胱氨酸分子形成分子内二硫键，使肽环合形成反向平行的β片层结构。自1985年美国加利福尼亚大学Lehrer教授对其命名以来(Selsted et al.，1985)，受到国内外科学家的广泛关注。根据分子大小、结构与功能的差异，可将防御素大致分为四类：α防御素、β防御素、昆虫防御素与植物防御素。基于半胱氨酸残基的间距和二硫键的形式，哺乳动物的防御素可分为三类：α防御素、β防御素和θ防御素。哺乳动物的防御素由18-42个氨基酸组成，其中6个保守的半胱氨酸形成了3对二硫键，使肽链折叠成β片层结构。α防御素由29-36个氨基酸组成，二硫键的连接方式为1-6、2-4、3-5；β防御素由38-42个氨基酸组成，二硫键的连接方式为1-5、2-4、3-6，β防御素中还有一个脯氨酸和甘氨酸；1999年从非人灵长类恒河猴中发现了新的一类防御素——由18个氨基酸残基组成的环状θ防御素，它们是由两个不同的截短的α防御素类肽连接而成。
防御素在人体中广泛分布，人体中α防御素有6种，其中4种即HNP1-4主要产生于粒细胞，2种HD5-6主要产生于潘氏细胞；人类基因组有28个β-防御素基因，在人类和鼠类已经鉴定出超过35个β-防御素基因。防御素的表达与病源微生物的入侵是紧密相关的，例如在透析病人的腹腔中同时发现有α防御素与β防御素，又如细菌性脑膜炎患儿的脑脊髓液中防御素的浓度比非细菌性脑膜炎高150倍。眼内防御素的表达研究表明，防御素在泪液中的含量与感染时的表达不同。研究表明防御素在人体防病抗病中起着非常重要的作用。
到目前为止，分离到的兔防御素有9个，其中7个为α防御素：NP-1，NP-2，NP-3a，NP-3b，NP-4，NP-5和Corticostatin VI，产生于粒细胞。另外2个兔防御素：RK-1和RK-2，来自于兔肾细胞。α-防御素NP-1比人防御素HNP-1的抗菌活性强5～10倍，两者间的这一明显差异被归结为它们的分子净电荷性质：在NP-1分子中含有9个净正电荷，而在HNP-1分子中仅含有3个净正电荷。目前，从生物体中分离到的防御素已达30多种，其中兔防御素(Netrophile Peptide-1，NP-1)的抗性谱最广。兔防御素NP-1由33个氨基酸组成，属于α-防御素，有6个半胱氨酸，它们形成3个二硫键，连接位置分别为1-6，2-4，3-5(Ganz，1989)。它对梅毒螺旋体、很多革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒有显著的抑制或毒杀效应。
防御素抗微生物机理
在动植物及人体内，防御素含量极其少，却执行着机体重要的防御功能。与传统抗生素相比，防御素有其独特的抑制机理。防御素的抗菌作用机理为：它依靠静电作用，通过本身所带的正电荷与带负电荷的微生物细胞膜相互吸附，即防御素与革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)、革兰氏阳性菌的脂磷壁酸等阴离子分子作用而附着在靶细胞表面，二聚或多聚的防御素穿膜形成瞬时的或稳定的跨膜离子通道(兔防御素NP-1形成瞬时的，人防御素HNP-1形成稳定的跨膜离子通道)，导致细胞内溶液外渗，从而扰乱了细胞膜的通透性及细胞能量状态，导致细胞膜去极化，呼吸作用受到抑制以及细胞内ATP含量下降，最终导致靶细胞死亡。防御素的抗病毒作用则是通过与病毒外壳蛋白结合而导致病毒失去生物活性。正是由于这种特殊的作用机理，目的微生物难以产生抗防御素的抗性突变，因此防御素被认为是一种新型低耐药性甚至无耐药性的抗感染肽类。
不同防御素的抗微生物活性
由于不同来源的防御素在结构上有一定的差异，因此它们的抑菌谱亦有很大差别。各种α-防御素对革兰氏阴性菌、阳性菌，分枝杆菌、真菌、被膜病毒、HIV病毒在不同程度上都有抑制作用，其作用剂量大部分在1-100μg/ml之间(Patterson Delafied et al.，1980，1981；Lehrer et al.，1983，1985a，1985b，1986，1989；Selsted et al.，1984，1985c，1987，1992；Ganz，1985a；Segal et al.，1985；Daher et al.，1986；Levitz et al.，1986；Shafer et al.，1988；Eisenhauer et al.，1989；Yamashita and Saito，1989；Cullor et al.，1990，1991；Miyasaki et al.，1990a，1990b，1990b；Borenstein et al.，1991a，1991b；Kohashi et al.，1992；Ogata et al.，1992；Nakashima，1993)。与其它抗微生物肽相比，防御素具有更广的抗性谱，尤其是兔防御素NP-1，NP-2，不但抗性谱广，抑菌活性也较强。
1984年，Selsted等发现从兔中性粒细胞分离获得的NP-1在浓度为50μg/ml时对3个家系的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，肺炎链球菌(Staphylococcuspneumoniae)，无乳链球菌(Staphylococcus agalactiae)，李斯特菌(Listeriamonocytogenes)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，大肠杆菌(Escherichia coli)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)和支气管炎博德氏杆菌(bordetella bronchiseptica)抑制生长或者杀灭作用(Selsted etal.1984)。
1985年，Lehrer等首次发现兔MCP-1和MCP-2(现名分别为，兔防御素NP-1和NP-2)在体外对1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type1，HSV-1)具有中和活性作用，而4个结构同源的肽NP-3a，NP-3b，NP-4和NP-5对HSV-1无效。兔防御素NP-1和NP-2对单纯疱疹病毒的灭活作用依赖于肽浓度以及肽与HSV-1孵育的时间，温度和pH。2型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 2，HSV-2)，水泡性口炎病毒(vesicularstomatitis virus)，流感病毒A/WSN(influenza virus A/WSN)也易被MCP-1和MCP-2直接中和，但MCP-1和MCP-2对巨细胞病毒(cytomegalovirus)，埃可病毒II型(echovirus type 11)，和呼肠孤病毒3型(reovirus type 3)无效。
1986年，Lehrer等也首次报道HNP1对包膜病毒单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2)、水泡性口炎病毒，人流感病毒有直接灭活作用，但对非被膜病毒埃可病毒和呼肠孤病毒没有作用。在包膜病毒的研究中，HNP1对HSV-1和HVS-2有很强的直接抑制作用，对水泡性口炎病毒和流感病毒(IAV)有温和的直接抑制作用，对巨细胞病毒，仅在高浓度时，才有轻微的作用。
对少数禽类的β防御素抗菌活性的研究显示其具有广泛地抗革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌和真菌作用。
在美国，每年由于感染造成的死亡人数超过250万例，因此感染已成为造成死亡的首要原因。而且在美国，每年有70％感染患者有抗药性，使耐药细菌迅速的增加，已成为世界所面临的最严重的医疗问题之一。感染耐甲氧西林的金黄色葡萄菌(MRSA)仅4年已增加了700％。在美国，2008年MRSA的住院费用超过了685,000美元，并预计到2013年增至240万美元。MRSA感染直接花费美国医疗系统的100亿美元和每年总花费达180亿美元。
抗生素耐药菌的出现，甚至多重耐药菌的发现，以及耐药菌感染的急剧上升，急需不会带来病原菌耐药性的新药物。由于防御素具有强大的抗菌和免疫调节作用，防御素对抗生素耐药菌及多重耐药菌也均具有抑杀作用。与传统的抗生素相比，细菌从防御素中获得耐药性极为困难。因此，广泛地认为防御素是最具有潜力的新一代抗感染生物肽。
防御素的杀伤效果可被血清抵消，可能是由于防御素结合到各种血浆蛋白如特异性补体成分，丝氨酸蛋白酶抑制剂和激活的a2-巨球蛋白(Lichtenstein et al.，1986 and 1988；Okrent et al.，1990；Panyutich et al.，1991，1994 and 1995)。当1％胎牛血清存在时，人防御素(HNPs)介导的肿瘤细胞裂解降低了30％，而当5％胎牛血清存在时，人防御素(HNPs)介导的肿瘤细胞裂解降低了75％(Lichtenstein et al.，1986)。
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌
自然界存在多种多样的病菌，通过革兰氏染色法，能够把细菌分成两大类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。这种染色方法是：先用龙胆紫(也称结晶紫)染色细菌，所有的细菌均被染成紫色，然后再用革兰氏碘液来加强染料与菌体的结合，再用95％的乙醇脱水短时脱水(20-30秒)，在这个过程中有些细菌染色很牢固，染色不被脱去，而仍保留着紫色，有些细菌染色不牢固，染色被脱去变成为无色，接着再用番红或沙黄复染1分钟，那么被脱色了的细菌可以染色，变成红色，未脱色的细菌不能再染色了，仍保持着原来的紫色；据此，凡是被染成紫色的细菌就成为革兰氏阳性菌(G+菌)，被染成红色的细菌称为革兰氏阴性菌(G-菌)。
大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，常见的革兰氏阳性菌有：葡萄球菌(Staphyloccocus)、链球菌(Streptococcus)、肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae)、炭疽杆菌(Bacillusanthraci)、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、破伤风杆菌(Clostridiumtetani)等，可以选择青霉素族，头孢曲松钠等；大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。常见的革兰氏阴性菌有：痢疾志贺氏杆菌(Shigella dysenteriae)、伤寒杆菌((Salmonella entericaserovar Typhi)、大肠杆菌(Escherichia coli)、变形杆菌(proteusbacillusvulgaris)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)、百日咳杆菌(Bordetellapertussis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)等革兰氏阴性菌则对青霉素不敏感，可以选择氟喹诺酮类药物如诺氟沙星，左氧氟沙星等，也可以选择大环内酯类比如克拉霉素、罗红霉素等。
革兰氏阳性菌细胞壁较厚，约20～80nm。肽聚糖含量丰富，有15～50层，每层厚度1nm，约占细胞干重的50～80％。此外，尚有大量特殊组分磷壁酸(teichoic acid)。磷壁酸是由核糖醇(ribitol)或甘油(glyocerol)残基经由磷酸二酯键互相连接而成的多聚物。磷壁酸分壁磷壁酸(wallteichoic acid)和膜磷壁酸(membrane teichoic acid)两种，前者和细胞壁中肽聚糖的N-乙酰胞壁酸连结，膜磷壁酸又称脂磷壁酸(lipteichoic acid)和细胞膜连结，另一端均游离于细胞壁外。磷壁酸抗原性很强，是革兰氏阳性菌的重要表面抗原；在调节离子通过粘肽层中起作用；也可能与某些酶的活性有关；某些细菌的磷壁酸，能粘附在人类细胞表面，其作用类似菌毛，可能与致病性有关。此外，某些革兰氏阳性菌细胞壁表面还有一些特殊的表面蛋白，如a蛋白等，都与致病有关。
临床上，常见的革兰氏阳性菌(G+菌)致病菌主要包括7大类：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、草绿色链球菌(Viridans streptococci)、肠球菌属(Enterococcus其中粪球菌(E.faecalis)更为常见)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、β-溶血链球菌(β-haemolytic streptococcus)。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，Sau)是目前床上最常见的致病菌之一，青霉素从20世纪40年代开始应用于临床，但很快出现了耐药菌株。自从1961年Jevons首次分离出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-reistant Staphylococcus aureus，MRSA)以来，MRSA在世界的感染率和分离率不断增加，已成为目前医院内感染的主要病原菌之一，由金黄色葡萄球菌引起的感染成为临床棘手的问题(Moran et al，2006)。MRSA自出现以来，强大的致病毒力因子以及耐药性便使其成为临床上的一个难题，导致MRSA的感染率不断上升，感染范围不断扩大，感染的程度愈来愈严重。MRSA感染的治疗目前还是以药物为主，但其对抗生素的多重耐药导致治疗上的困难。其临床感染率和危害性已经引起医学界震惊和高度重视，因此人们把MRSA这种菌株形象地称为“超级细菌”。自从1968年首次发现MRSA～I引起的感染，40年来，MRSA造成的院内与院外感染均成上升趋势，我国1989年全国部分城市调查MRSA平均检出率为42.7％，属MRSA感染的严重国家之一。20世纪90年代以后我国北京、上海、广州等地大型医院MRSA的分离率都已超过了50％，而其他地区的报道也大部分在25％-60％之间。上海2004年金黄色葡萄球菌(简称：金葡菌)中MRSA的分离率已达到63.9％，2006年上海各大医院MRSA的检出率最高达92.5％。2006年中国CHINET细菌耐药性监测显示MRSA在金葡菌感染中所占比例平均为76.3％，说明MRSA感染已经达到了很严重的程度(汪复，2008)。在国外，近年在南欧部分国家和英国MRS A在金葡菌感染中的检出率在大型医院达到了30％-50％。在德国，1996-2006年间MRSA的感染率不断增长达到了20％-22％，德国的一所大型教学医院(kath-arinen hospital)MRSA感染的病例在1994-2003年间上升了277％(Trautmann et al.，2007)。2004年美国大部分医院MRSA感染率都超过50％，MRSA在美国占院内感染金葡菌的比率从1975年的2.4％上升到1997年的39.9％。2005年，美国Uehnert等在全美475所医院的调查显示，MRSA感染的住院病人相比1995年增长了10倍，是2000年的3倍，比2004年增长了30％，而且由于检测及培养方面的差别与缺陷，实际的发生率可能更高(Jarvis et al.，2007)。近年来感染菌变迁的总趋势是革兰氏阴性杆菌占主要地位(张秀珍，1999)，临床上感染的革兰氏阴性菌菌群主要有：大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、不动杆菌属(Acinetobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、幽门螺旋杆菌(Heliobacterium chlorum)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)。季萍等(2002)的研究结果表明，这些致病的革兰氏阴性菌大部分产生了耐药性：肠杆菌科细菌对氨苄西林耐药率为80％～100％，除肺炎克雷伯菌外，对阿莫西林/棒酸耐药率为＞60％。除大肠杆菌外，对培氟沙星耐药率为＜50％。除肠杆菌属外对奈替米星、头孢西丁的耐药率为15％～30％，铜绿假单胞菌对亚胺培南、庆大霉素、头孢他啶、妥布霉素耐药率为10％～25％。不动杆菌属对亚胺培南、妥布霉素耐药率2％～29％。产ESBLs菌株高度耐三代头孢菌素，对氨基糖苷类、复方新诺明、喹诺酮类交叉耐药率高达78.9％～100％。
兔防御素的生产
目前文献报道获取兔防御素的途径大部分是从兔子中获得的(Judithet al.，1980；Selsted et al.，1983，1984，1985；Lehrer et al.，1981，1983，1985；Sinha et al.，2003)。
中国科学院遗传与发育生物学研究所以椭圆小球藻硝酸还原酶基因缺失突变体为受体，以NPTII和硝酸还原酶基因为筛选标记，以Ubiquitin启动子控制NP-1，获得了能够在硝酸盐培养基上培养而且具有较强NP-1活性的转基因小球藻(安洋等，2008)。
NP-1的离体抗菌活性已有较多报道(Patterson-Delafield et al.，1980，1981；Selsted et al.，1984，1985c；Lehrer et al，1983，1985a，986；Levitz et al.，1986；Miyasaki et al.，1990b，Borenstein et al.，1991a，1991b；Kohashi et al.，1992)，已报道的NP-1的抗菌谱有：白色念球菌(Candida albicans)，粪肠球菌(S.faecalis)，枯草杆菌(B.subtilis)，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)，肺炎链球菌(Staphylococcus pneumoniae)，无乳链球菌(Staphylococcus agalactiae)，李斯特菌(Listeria monocytogenes)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，大肠杆菌(Escherichia coli)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)和支气管炎博德氏杆菌(bordetellabronchiseptica)，曲霉(Aspergillus fumigatus)，米根霉(Rhizopus oryzae)，伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)，啮蚀艾肯菌Eikenella corrodens)，二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga spp.)，梅毒螺旋体(Treponema pallidum)。但其在抗耐药细菌方面还未见报道，在活体抗细菌方面也未见报道。抗病毒方面的报道较少(Nakashima et al.，1993；Lehrer et al，1985b；Sinha et al.，2003)。
发明内容
本发明提供了一种改造的NP-1(即mNP-1)及其在抗细菌方面的应用，所述的改造的NP-1(即mNP-1)具有34个氨基酸，第一个氨基酸为甲硫氨酸，是新加上的，其余的33个氨基酸来自兔防御素NP-1的序列，改造后的NP-1的核苷酸序列为SEQ ID NO：15所示，其氨基酸序列为SEQ ID NO：16(简称mNP-1)。mNP-1具有较强抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的能力，在离体水平mNP-1浓度为5μg/mL以上时，对部分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有杀灭作用。我们还在活体上证明了mNP-1对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有显著杀灭效果，尤其是对耐药菌杀灭的效果更为显著。而前人从兔中获得的防御素NP-1浓度为50μg/mL以上时，对金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌杆菌，大肠杆菌，肺炎链球菌，无乳链球菌，流感嗜血杆菌具有杀灭作用(Selsted et al.，1984)。我们比较了mNP-1与从兔子中分离获得的天然NP-1抗革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌)及革兰氏阴性菌(铜绿假单胞菌和大肠杆菌)的效果，结果表明mNP-1比从兔子中分离获得的天然NP-1的抗菌效果更好。至今未有报告从兔子中分离获得的防御素NP-1对耐药菌有杀灭作用，也未有报道在活体水平上对杀灭革兰氏阴性菌和阳性菌有效。1-10％(v/v)浓度的人血清对mNP1抑菌活性没有影响。
具体地，在本发明的一个方面，提供了一种短肽mNP-1，其氨基酸序列为SEQ ID NO：16所示的序列。
在本发明的另一个方面，提供了编码所述短肽mNP-1的核酸。优选地，所述核酸的序列为SEQ ID NO：15所示的序列。
在本发明的另一个方面，提供了一种表达载体，其包含上述之一的核酸。
在一个具体的实施方案中，所述表达载体是通过将Nos终止子(SEQID NO：6)，Ubiquitin基因启动子(SEQ ID NO：1)，含有编码上述mNP-1(SEQ ID NO：13)的基因以及NR基因表达框(SEQ ID NO：5)依次连接到载体的多克隆位点中，获得表达载体pGreen-NR-U-mNP1。
在本发明的另一个方面，提供了宿主细胞，其包含上述的核酸或上述的表达载体。
在本发明的又一个方面，提供了药物组合物，其包含上述的短肽mNP-1或上述的编码所述短肽mNP-1的核酸和任选地药用载体。优选地，所述的药物组合物为溶液、片剂、胶囊、雾剂、膏剂、粉剂或注射剂的形式。
在本发明的又一个方面，提供了上述的短肽mNP-1或上述的编码所述短肽mNP-1的核酸在制备抗革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌药物中的应用。在优选的实施方案中，所述细菌是奈瑟氏菌属(Neisseria)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，李斯特菌属(Listeria)，假单胞菌属(Psdeuomnoda)，埃希氏菌属(Escherichia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，沙雷氏菌属(Serratia)，嗜血杆菌属(Haemophilus)，博德特氏菌属(Bordetella)，螺旋杆菌属(Heliobacterium)，链球菌属(Streptococcus)，不动杆菌属(Acinetobacter)，沙门氏菌属(Salmonella)。更优选地，所述细菌为淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，耐甲氧西林的金黄色葡萄菌(MRSA)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)，泛耐药铜绿假单胞菌，大肠杆菌(Escherichia coli)，幽门螺旋杆菌(Heliobacterium chlorum)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，沙门氏菌(Salmonella)，大肠杆菌(Escherichiacoli)。
在一个具体的实施方案中，所述的革兰氏阴性菌为大肠杆菌(Escherichia coli)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)，淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)，幽门螺旋杆菌(Heliobacterium chlorum)和沙门氏杆菌(Salmonella)。
在一个具体的实施方案中，所述的革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。
附图说明
图1.PBI221质粒结构图。
图2.pbinUGUS质粒结构图。
图3.pGreen0029质粒结构图。
图4.pGreen0029nos质粒结构图。
图5.pGreen0029-U-nos质粒的结构图。
图6.pGreen0029-U-mNP1-nos质粒结构图。
图7pGreen-NR-U-mNP1质粒结构图。
图8.电击方法转化椭圆小球藻硝酸还原酶功能缺失突变体得到的抗G418的藻落。
图9.NPTII基因PCR检测结果。1泳道为阳性质粒，2泳道为未转化藻株nrm-4；3-11泳道为转化藻株1-9；
图10.Ubi-mNP-1-Nos基因PCR检测结果。1泳道为未转化藻株nrm-4；2泳道为阳性质粒；3-11泳道为转化藻株1-9。
图11.Sephadex G-50的紫外吸收峰图。
图12.Sephadex C-25的紫外吸收峰图。
图13.从转基因小球藻中纯化mNP-1的电泳图。1，4：蛋白质分子量标准；2，3：纯化的mNP-1(箭头所指)。
图14.mNP-1胰蛋白酶解肽段LC-MS分析结果。
图15.mNP-1对淋病奈瑟氏菌抑杀结果。
图16.mNP-1对金黄色葡萄球菌(药敏质控菌)，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑杀结果。图16A1为mNP-1对药敏质控菌的抑菌试验，图16A2为mNP-1对MRSA的抑菌试验，其中试管编号1为培养基对照(以NC表示，即阴性对照)；编号2-8为不同浓度(以μg/ml表示)mNP-1；编号9为细菌对照(以PC表示，阳性对照)。细菌生长以“+”表示，不生长以“-”表示。图16B头孢西丁对金黄色葡萄球菌(药敏质控菌)(上图)和MRSA(下图)的抑菌试验，其中试管编号1为培养基对照(以NC表示，即阴性对照)；编号2-8为不同浓度(以μg/ml表示)头孢西丁；编号9为细菌阳性对照，以PC表示。细菌生长以“+”表示，不生长以“-”表示。
图17.mNP-1对铜绿假单胞菌(药敏质控菌)和临床多重耐药铜绿假单胞菌的抑杀结果。图17A1为mNP-1对铜绿假单胞菌(药敏质控菌)的抑菌试验。图17A2为mNP-1对临床多重耐药铜绿假单胞菌株的抑菌试验。其中试管编号1为培养基对照(以NC表示，即阴性对照)；编号2-8为不同浓度(以μg/ml表示)NP-1；编号9为细菌阳性对照，以PC表示。细菌生长以“+”表示，不生长以“-”表示。图17B为头孢他啶对铜绿假单胞菌(药敏质控菌，上图)和铜绿假单胞菌临床多重耐药菌株的抑菌试验(下图)，其中试管编号1为培养基对照(以NC表示，即阴性对照)；编号2-8为不同浓度(以μg/ml表示)NP-1；编号9为细菌阳性对照，以PC表示。细菌生长以“+”表示，不生长以“-”表示。
图18.mNP-1对大肠杆菌的抑杀结果，其中80μg/ml-5μg/ml表示mNP-1的浓度，CK表示大肠杆菌对照。
图19.转mNP-1小球藻提取液对大肠杆菌的抑杀结果，其中含50μg/ml mNP-1的小球藻提取液以“TC”表示；非转基因小球藻(野生藻)提取液以“CK”表示。
图20.mNP-1对幽门螺旋杆菌的抑杀结果。
图21.mNP-1对肺炎链球菌的抑杀结果，CK表示细菌对照。
图22.1-10％的人血清对mNP-1的抑杀大肠杆菌生长的活性没有影响。
图23.mNP-1与从兔子中提取的天然NP-1对金黄色葡萄球菌抗菌效果比较结果。
图24.mNP-1与从兔子中提取的天然NP-1对肺炎链球菌抗菌效果比较结果。
图25.mNP-1与从兔子中提取的天然NP-1对铜绿假单胞菌抗菌效果比较结果。
图26.mNP-1与从兔子中提取的天然NP-1对大肠杆菌抗菌效果比较结果。
具体实施方式
下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解的是，下述实施例是举例说明的目的，其不应以任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。
各种限制性内切酶，DNA上样缓冲液(6×Loading Buffer)购自TaKaRa公司；普通Taq酶，plus 2000 Maker，DNA纯化回收试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司；T4DNA连接酶购自NEB公司；葡萄糖及其他无机试剂均购自北京经科宏达生物技术有限公司；鲑鱼精DNA购自Invitrogen公司；丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，购自鼎国公司；SephadexG-50，Sephadex C-25购自pharmacia公司。
实施例1.椭圆小球藻硝酸还原酶突变体的表达载体构建方法
根据Ubiquitin启动子序列(SEQ ID NO：1)设计引物，上游引物：5’CCGGAAGCTTGTGCAGCGTGACCCG3’(SEQ ID NO：2)；下游引物：5’GCCCGGATCCCTGCAGAAGT3’(SEQ ID NO：3)，其中在上游引物中加入Hind III酶切位点(下划线标出部分)，下游引物中加入BamH I酶切位点(下划线标出部分)，用PCR方法从玉米基因组中得到Ubiquitin启动子，测序结果显示为Ubiquitin启动子序列(SEQ ID NO：4，其在SEQ ID NO：1的5’端及3’端分别添加了Hind III酶切位点和BamH I酶切位点)。PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环结束后，72℃延伸10min。将PCR产物2007bp大小的片段，用HindIII和BamHI内切酶双酶切，质粒pBI221(Clontech)(图1)也经HindIII和BamHI内切酶双酶切，然后将两双酶切产物16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L氨苄霉素的LB培养基上37℃倒置培养过夜，对长出的抗性菌落提取质粒进行Hind III和BamH I内切酶双酶切鉴定，能够得到1987bp大小片段(即Ubiquitin启动子)的质粒即命名为pbinUGUS(图2)。
实施例2.利用pGreen0029框架来构建表达载体。
根据Nos终止子序列(SEQ ID NO：6)设计引物，上游引物：5’ATAAGAATGCGGCCGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAAC3’(SEQID NO：7)下游引物：5’CGAGCTCGCCCGATCTAGTAACATAGATGA3’(SEQ ID NO：8)其中在上游引物中加入Not I酶切位点(下划线标出部分)，在下游引物中加入Sac I酶切位点(下划线标出部分)，用PCR的方法从pBI221(Clontech)中获得了Nos终止子，PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环结束后，72℃延伸10min。将PCR产物268bp大小的片段，用Not I和Sac I内切酶双酶切，质粒pGreen0029(图3，来自BBSRC)也经Not I和Sac I内切酶双酶切，然后将两双酶切产物16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上37℃倒置培养过夜，对长出的抗性菌落提取质粒进行Not I和Sac I内切酶双酶切鉴定，能够得到270bp左右大小片段(即Nos终止子)的质粒即命名为pGreen0029nos(图4)。
实施例3.椭圆小球藻硝酸还原酶突变体的表达载体pGreen-NR-U-mNP1的构建.
按照常规技术，将Ubiquitin启动子(SEQ ID NO：1)从载体pbinUGUS(图2)中通过HindIII和BamHI双酶切回收后，连接到同样经过HindIII和BamHI双酶切的pGreen0029nos载体上(图4)获得pGreen0029-U-nos初级中间载体(图5)。通过化学合成方法合成带有目的基因mNP-1的序列(其序列如SEQ ID NO：13)，为提高NP-1的抗病毒活性，在合成的过程中，在NP-1的N端添加了一个甲硫氨酸，将NP-1改造成了mNP-1，因mNP-1基因太小，为方便构建载体，在该基因的C端添加了75bp辅助序列，同时在基因的5’和3’端分别添上两个酶切位点BamH I和NotI，最终得到合成的带有mNP-1基因的201bp序列(SEQ ID NO：13)，将合成的序列(SEQ ID NO：13)通过BamH I和NotI双酶酶切回收189bp的带有mNP-1基因的片段，然后与经同样经过BamH I和NotI双酶酶切的载体pGreen0029-U-NOS连接(图5)，获得载体pGreen0029-U-mNP1-nos(图6)。最后通过HindIII酶切pSK-NR质粒(含有硝酸还原酶表达框NR序列，小球藻NR基因序列已提交到GenBank，接收号为AY275834，NR表达框序列如SEQ ID NO：5所示，涉及pSK-NR质粒及NR表达框的专利公开号：CN1676597)，回收4518bp NR表达框片段，单酶切NR表达框和载体pGreen0029-U-mNP1-NOS，然后将它们相连，则构建成椭圆小球藻硝酸还原酶突变体的mNP-1植物表达载体pGreen-NR-U-mNP1(见图7)。
实施例4.小球藻电击转化
小球藻E4液体培养基见表4。
小球藻固体培养基：液体培养基+7％琼脂pH 5.4～7.0。
小球藻筛选培养基：小球藻固体培养基的Na2NO20.69g/L替换为10mmol/L NO3 -，并添加抗生素G418至终浓度为15mg/L。
取50ml对数生长期的硝酸还原酶突变体小球藻nrm-4(公开号：CN 1676597A)，50×g，离心10min离心收集藻细胞(RefrigeratedCentrifuge CR 20B2，HIACHI)；用高渗液(山梨醇0.2M，甘露醇0.2M)冰上处理1-3h；50g离心10min，去上清，沉淀用5ml电击缓冲液(山梨醇0.2M，甘露醇0.2M，KCL 0.08M，CaCL20.005M，HEPES 0.01M)悬浮，并用电击缓冲液调细胞密度到1×106个/mL；加入终浓度为10μg/mL的质粒pGreen-NR-Ubi-mNP1和25μg/mL的鲑精DNA，混匀，冰上放置5-10min后电击，取400μl混合好的小球藻细胞放入电击杯中，电击。脉冲电压为6-10.5KV，脉冲持续时间分别为0.001-0.2s，脉冲次数为210，脉冲距离为2mm，循环周期为100。电击后将小球藻转入筛选培养基中培养(图8)。
实施例5.转基因小球藻的分子检测
a.转基因小球藻总DNA的提取
挑取平板上的单藻落细胞接种于15mg/L G418液体培养基中培养，(25℃，光照2500lux，120rpm)。2周后(浓度达到约为1×108个/mL)，1600g离心10min收集藻细胞，在液氮中将细胞磨碎，参照文献Chen et al.，(2001)的方法提取小球藻总DNA，提取的DNA存于-20℃备用。
b.转基因小球藻的PCR检测
以转基因藻基因组DNA为模板，分别进行NPTII基因(载体质粒pGreen0029中的卡那抗性基因，序列为SEQ ID NO：14)和Ubiquitin启动子mNP-1-Nos终止子的PCR扩增。检测NPTII基因的PCR引物为：正向引物NPTII-f，5’GTCCTGATAGCGGTCCGCCAC3’(SEQ ID NO：9)；反向引物NPTII-r，5′TCCGGTGCCCTGAATGAACT3’(SEQ ID NO：10)。PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，57℃退火40s，72℃延伸1min 30s，30个循环结束后，72℃延伸10min。可以扩增出约501bp的片段。Ubiquitin-mNP1-Nos的基因序列的PCR扩增，扩增的引物分别为：Ubi-852-L：5’-GCTCCTTCGCTTTCCCTTCC-3’(SEQ ID NO：11)；Nos-2429-R：5’-GCGCTATATTTTGTTTTCTATCGCG-3’(SEQ ID NO：12)。PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环结束后，72℃延伸10min。可以扩增出约1578bp的DNA片段，即Ubiquitin-mNP1-Nos片段。
共对9个藻株进行了检测，检测结果见图9，10。转化藻株1-9，能够扩增出外源NPTII基因，在转化藻株1-4和6-9中能够扩增出外源Ubiquitin-mNP1-Nos片段，在转化藻株1-4和6-9中NPTII和Ubiquitin-mNP1-Nos片段都能够扩增出来。证明NPTII和Ubiquitin-mNP1-Nos片段PCR均为阳性的藻株为转基因藻株，选取这些藻株进行液体扩繁培养，用以进一步检测转基因藻株的mNP1活性。
实施例6.转基因小球藻可溶性蛋白的提取
用E4培养基(培养基成分见表4)培养转基因藻，离心收集对数生长期(浓度约为1×108个/mL)的细胞，约3g湿藻重，然后按湿藻重∶无菌水∶＝1∶1进行混合。超声破碎9s，间隔4s，破碎次数90次(JY92-II超声细胞粉碎机，宁波)，沸水煮10min使大分子量蛋白质变性沉淀。4℃过夜后7500g离心10min，取上清液。
表4培养基组成
| 组成成份 | E4液体培养基 |
| 葡萄糖(g) | 5 |
| KNO3(g) | / |
| Na2NO2(g) | 0.69 |
| KH2PO4(g) | 0.075 |
| MgSO4·7H2O(g) | 0.175 |
| CaCl2(mg) | 25 |
| FeCl3·6H2O(mg) | 5 |
| NaCl(mg) | 25 |
| FeCl3·6H2O(mg) | 0.81 |
| EDTA(mg) | 20 |
| 微量元素(mL) | 1 |
| 水(mL) | 1000 |
其中的微量元素溶液配方为：H3BO31.43g，ZnSO4·7H2O 0.11g，MnCl2·4H2O 0.905g，Na2MoO4·2H2O 0.0185g，CuSO4·5H2O 0.0395g，水1000mL。
实施例7.防御素mNP-1的纯化
通过Sephadex G-50初步纯化mNP-1
转基因小球藻表达的mNP-1是34个氨基酸小肽，分子量为4028.98Da。提取转mNP-1基因的小球藻总蛋白(方法见实施例6)，将该提取物冷冻干燥后，用0.2％乙酸溶解，然后用葡聚糖凝胶Sephadex G-50进行分离纯化(图11)，通过凝胶层析的方法进行组别分离除去大分子量的蛋白，收集分子量为1.5×103～30×103的小肽(即图11中的紫外线280nm吸收峰的第二个峰)，并进行低温冷冻干燥，待进一步分离纯化。
通过阳离子交换柱Sephadex C-25进一步纯化mNP-1
将经过了Sephadex G-50获得的活性部分冻干物进行阳离子交换柱Sephadex C-25纯化(见图12)。收集洗脱部分，然后透析，再进行低温冷冻干燥，进行电泳检测。
电泳检测纯化的mNP-1
将经过多级纯化后获得的mNP-1进行Tricine-SDS-PAGE电泳检测，电泳结果(见图13)表明获得了高纯度的mNP-1纯化产物。Tricine-SDS-PAGE的三明治胶浓度范围分别是6％，12％，16.5％。
LC-MS检测电泳获得的mNP-1
将电泳条带切胶回收，并进行胶内胰蛋白酶消化，将消化后的产物进行LC-MS分析。肽段AGFCRIRGR，MH+＝1093.26，当它带4个电荷时，对应的质荷比M/Z＝274.3(见图14)。提取274.3的离子流，含量较高，且此离子峰的MS2碎片匹配较好，因此认为此肽段是AGFCRIRGR，该肽段是mNP-1小肽的一小段。
实施例8.淋病奈瑟氏菌(革兰氏阴性菌)对防御素mNP-1的药物敏感试验
实验方法：药纸片琼脂平板扩散法
实验材料：
1.试剂：氨苄西林(剂量)药敏纸片(以下以AM表示)、mNP-1药敏纸片(10μg，以NP-20表示)、mNP-1药敏纸片(5μg，以NP-10表示)、空白对照纸片(BLANK)。
2.器械与用品：烛缸、酒精灯、蜡烛、接种环、镊子、37℃恒温培养箱、量尺、巧克力平板。菌种：淋病奈瑟菌巧克力培养基(牛肉浸出液1L，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，无菌脱纤维马血、羊血或兔血100ml，pH 7.2～7.4)培养物(购自中检所)。
实验步骤：
1.先于皿底注明纸片代号，用烧灼过后的接种环蘸取含菌培养物，于巧克力培养基平面均匀划线，用经烧灼的镊子将不同药物纸片等距离摆放在培养基表面，再放入37℃培养箱。
2.培养24小时后，观察结果。
3.用量尺量纪录抑菌环直径，对照药物敏感性参照表进行分析。
实验结果：见图15
表5.淋病奈瑟氏菌对防御素mNP-1的敏感试验
结论：防御素mNP-1对淋病奈瑟氏菌的生长有抑制作用，其效应与使用的剂量呈正比。
实施例9.防御素mNP-1体外对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)
实验目的：检测mNP-1在体外对金黄色葡萄球菌药敏质控菌和临床耐药菌株MRSA的最小抑菌浓度
实验方法：试管稀释法
实验材料：
抗生素：头孢西丁溶液(102.4mg/ml，北京医药公司)，根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)规定，使用头孢西丁筛选耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)表型，判断标准为试管法中头孢西丁药最小抑菌浓度≥8μg/ml，即为MRSA表型(耐药菌株)。
mNP-1溶液(1mg/ml)
菌种：
金黄色葡萄球菌药敏质控菌：ATCC29213
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)临床分离株(bmu-jst-1，北京大学医学部)：用法国梅里埃生物公司的葡萄球菌和微球菌鉴定系统API STAPH鉴定为金黄色葡萄球菌，应用头孢西丁药敏纸片琼脂平板扩散法确认为MRSA。
培养基：NCCLS推荐使用Mueller-Hinton(MH)肉汤，pH 7.2～7.4细菌比浊仪
实验原理：
甲氧西林的抗菌作用与青霉素相似，对革兰阳性菌和奈瑟菌属有良好抗菌活性，对耐青霉素的金黄色葡萄球菌也有良好抗菌作用。但近年MRSA临床呈上升趋势，目前NCCLS规定，使用头孢西丁来筛选检测MRSA表型，作为判断药物敏感性的指标，我国也采用此标准检测MRSA菌株。
实验步骤：
实验分别设培养液对照组、细菌对照组、抗生素对照组、mNP-1实验组。将待检物mNP-1连续依次对倍稀释成8个不同浓度，然后接种待检菌液(5×105cfu/ml)，与各对照组比较，确定待检物mNP-1的最低抑菌浓度(MIC)，实验重复三次。
实验结果：见图16A1，图16A2和图16B，表6。表6是重复三次实验的平均结果。
表6 mNP-1和头孢西丁对各菌株的最小抑菌浓度(MIC，μg/ml)
结论：
1.防御素mNP-1对金葡菌的最小抑菌浓度(MIC)为16μg/ml，对临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)临床多重耐药菌株的最小抑菌浓度(MIC)为8μg/ml。
2.本实验结果表明，防御素mNP-1对本实验检测的临床常见的耐药菌株有良好的抑菌作用，其效果均优于对相应药敏质控菌的抑菌作用。
实施例10.防御素mNP-1体外对铜绿假单胞菌(革兰氏阴性菌)的药物敏感试验
实验目的：检测mNP-1在体外对铜绿假单胞菌药敏质控菌和临床多重耐药菌株的最小抑菌浓度。
实验方法：试管稀释法
实验材料：
抗生素：头孢他啶溶液(102.4mg/ml，北京医药公司)，根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)规定。mNP-1溶液(1mg/ml)
菌种：
铜绿假单胞菌药敏质控菌：ATCC27853
铜绿假单胞菌临床多重耐药菌株临床多重耐药菌株PAPR(bmu-307-1，北京大学医学部)：采用法国梅里埃生物公司ATP1505 Expression全自动鉴定及药敏测试仪鉴定为多重耐药菌株，耐药谱包括丁胺卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素、左旋氧氟沙星、哌拉西林、头孢吡肟、头孢他啶、头孢西丁、头孢曲松等。
培养基：NCCLS推荐使用Mueller-Hinton(MH)肉汤，pH7.2～7.4
细菌比浊仪
实验步骤：
实验分别设培养液对照组、细菌对照组、抗生素对照组、mNP-1实验组。将待检物mNP-1连续依次对倍稀释成8个不同浓度，然后接种待检菌液(5×105cfu/ml)，与各对照组比较，确定待检物mNP-1的最低抑菌浓度(MIC)，实验进行三次重复。
实验结果：见图17A1、图17A2和图17B，表7。
表7 mNP-1和头孢西丁对各菌株的最小抑菌浓度(MIC，μg/ml)
结论：
(1)防御素mNP-1对铜绿假单胞菌药敏质控菌的最小抑菌浓度(MIC)为16μg/ml，对铜绿假单胞菌临床多重耐药菌株的最小抑菌浓度(MIC)为8μg/ml。
(2)本实验结果表明，防御素mNP-1对本实验检测的两株临床常见的耐药菌株有良好的抑菌作用，其效果均优于对相应药敏质控菌的抑菌作用。
实施例11.防御素mNP-1体外对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)的抑杀试验
试验方法：二倍稀释试管抑菌法
实验分别设细菌对照组、mNP-1实验组。将待检物mNP-1连续依次对倍稀释成5个不同浓度，然后接种待检菌液(1×106cfu/ml)，与各对照组比较，确定待检物mNP-1的最低抑菌浓度(MIC)，实验做了三次重复。
取5个管分别加入1ml的LB液体培养基，在第一管中加入1ml的mNP1储存液(浓度为160μg/ml)，用枪吸打混匀，然后吸取1ml加入到第二管中，用枪吸打混匀，然后吸取1ml加入到第三管中，以此法依次稀释，最后一管吸取1ml弃掉。然后通过10倍稀释法稀释过夜培养的大肠杆菌(ATCC25922)成103倍，将稀释103倍的大肠杆菌以1∶100的比例加入到各管中，即每管加入10μl。37度过夜培养，第二天观察抑菌结果
实验结果：见图18，结果表明浓度为5μg/ml的mNP1对大肠杆菌ATCC25922仍有抑杀作用，即mNP-1对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)为5μg/ml。
实验方法：药纸片琼脂平板扩散法
将过夜培养的大肠杆菌ATCC25922通过10倍稀释法稀释成103倍，然后吸取100μl涂布LB固体培养基，用圆形灭菌滤纸片蘸取转mNP1小球藻的粗提液(含50μg/ml mNP-1)，置于涂布LB固体培养基上，同时用一灭菌滤纸片蘸取非转基因小球藻(野生藻)提取液作为对照，将平板置37度恒温培养箱过夜培养，第二天观察结果。
实验结果：见图19，结果表明含50μg/ml mNP-1的小球藻提取液(以“TC”表示)对大肠杆菌ATCC25922有显著的抑杀作用，非转基因小球藻(野生藻)提取液(“以CK”表示)对大肠杆菌ATCC25922没有抑杀作用。
实施例12.防御素mNP-1体外对革兰氏阴性菌幽门螺旋杆菌的药效试验
取新鲜的11637幽门螺旋杆菌菌种(购自中检所)采用划线法接种于含10％新鲜羊血的布氏平板，将含有5μg的mNP1药敏纸片，置于上述平板上(放于平板左边)，同时用一灭菌滤纸片蘸取生理盐水作对照(放于平板右边)，将平板置37度微需氧环境中培养5天后观察结果。结果表明5μg的mNP1防御素对幽门螺旋感觉有明显的抑菌效应，结果见图20，其中平板左边的表示5μg的mNP1药敏纸片对幽门螺旋杆菌的抑杀作用，药敏纸片周围没有白色菌落生长，右边的表示生理盐水对幽门螺旋杆菌没有抑杀作用，生理盐水纸片周围有白色菌落生长。
实施例13.mNP-1对沙门氏杆菌(革兰氏阴性菌)小鼠体内抑菌试验材料：
试验用菌：沙门氏杆菌533(079)-13(购自中检所)
mNP-1：本实验室制备
试验用小鼠：巴比西(Balb/c)小鼠(购自北医动物中心)
方法：
A：沙门氏杆菌活化：37度过夜培养，菌液按10-1，10-2，10-3，10-4，10-5稀释，各取5只小鼠，腹腔注射0.5ml(菌液与酵母液比列为1∶9)各浓度菌液，24小时观察沙门氏杆菌最小致死剂量为10-2，OD＝0.189B：mNP-1在小鼠体内对沙门氏杆菌的最小保护剂量
十只小鼠为一组，四组处理，一组对照
处理一：1000μg/ml mNP-1
处理二：200μg/ml mNP-1
处理三：40μg/ml mNP-1
处理四：20μg/ml mNP-1
对照：0μg/ml mNP-1
每只小鼠分别按上述处理腹腔注射0.5ml mNP-1和0.5ml 10-2沙门氏杆菌，24小时和48小时后观察结果如下：
初步结论：≥100μg的mNP-1对小鼠的沙门氏菌致死量有保护作用。
实施例14.防御素mNP-1体外对革兰氏阳性菌肺炎链球菌的药效试验
采用MH(Mueller-Hinton，MH)肉汤，外加2.5％的裂解马血。配制方法参照李影淋等(1978)编写的《临床检验手册》。采用2倍液体稀释法测试mNP-1对链球菌生长的抑杀作用。
实验操作：取5支玻璃试管，在各管分别加MH肉汤培养基1ml，在第一管加1ml 100μg/ml的mNP-1储存液，混匀后，吸取1ml加到第2管中，依次类推，直至第5管，第5管吸取1ml弃去，使浓度分别为50μg/ml，25μg/ml，12.5μg/ml，6.25μg/ml，3.75μg/ml。将选取的肺炎链球菌(购自中检所)按常规法扩繁链球菌，调制菌液，每管加稀释好的菌液25μl(107CFU/ml)，35℃培养20～24h观察结果，结果见图21。从图21结果可知，mNP-1在浓度为12.5μg/ml对肺炎链球菌仍有抑杀作用，其中CK表示mNP-1的浓度为0。
实施例15.人血清对mNP-1抑杀大肠杆菌的活性没有影响。
分别在10个管中加入5μg的mNP-1及10-100μl的人血清，然后用LB液体培养基补足1ml，使得血清浓度为1％-10％，如图22所示。通过10倍稀释法稀释过夜培养的大肠杆菌ATCC25922成103倍，将稀释103倍的大肠杆菌以1∶100的比例加入到各管中，即每管加入10μl。37度过夜培养，第二天观察抑菌结果。实验结果见图22，结果表明浓度为1-10％的血清对5μg/ml的mNP-1的大肠杆菌ATCC25922的抑杀作用没有影响，其中CK表示用同样的LB液体培养基培养的大肠杆菌。
实施例16.mNP-1与从兔子中提取的天然NP-1对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌抗菌效果比较。
菌株：金黄色葡萄球菌(ATCC29213)，肺炎链球菌(ATCC49619)，铜绿假单胞菌(ATCC27853)，大肠杆菌(ATCC25922)
试剂：NP1，从家兔中分离获得，分离方法参照文献Patterson-Delafieldet al.，1980)；mNP1。
培养基：Mueller-Hinton(1000ml成分：牛肉粉2g，可溶性淀粉1.5g，酸水解酪蛋白17.5g，琼脂粉10g，pH7.2-7.4)固体培养基。
方法：药纸片琼脂平板扩散法
结果：mNP-1与从兔子中提取的天然NP-1对金黄色葡萄球菌抗菌效果比较见图23。mNP-1与从兔子中提取的天然NP-1对肺炎链球菌抗菌效果比较见图24。mNP-1与从兔子中提取的天然NP-1对铜绿假单胞菌抗菌效果比较见图25。mNP-1与从兔子中提取的天然NP-1对大肠杆菌抗菌效果比较见图26。
图23中的1表示50μg/mL的从兔子中分离获得的天然NP1，图中的2表示15μg/mL的mNP1，图中的3表示30μg/mL的mNP1，从图23可以看出，30μg/mL的mNP1的抑菌圈的直径大于50μg/mL的天然NP1。由此可得出mNP1在对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的杀灭作用较天然NP1好。
图24中1表示20μg/mL的mNP1，图24中2表示50μg/mL的天然NP1。从图24中可以看出20μg/mL的mNP1的抑菌圈直径大于50μg/mL的天然NP1，由此可得出改造的mNP1在对革兰氏阳性菌肺炎链球菌的杀灭作用较天然NP1好。
图25中mNP1的浓度均为30μg/mL，天然NP1的浓度均为50μg/mL，从图25可以看出，30μg/mL的mNP1抑杀铜绿假单胞菌的效果比50μg/mL的天然NP1好，由此可得出改造的mNP1在对革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌的杀灭作用较天然NP1好。
图26中1表示mNP1的浓度为20μg/mL，2表示天然NP1的浓度为50μg/mL，从图26可以看出，20μg/mL的mNP1抑杀革兰氏阴性菌大肠杆菌的效果比50μg/mL的天然NP1好，由此可得出改造的mNP1在对革兰氏阴性菌大肠杆菌的杀灭作用较天然NP1好。
参考文献：
Borenstein L A，Ganz T，Sell S，Lehrer R I，and Miller J N(1991a).
Contribution of rabbit leukocyte defensins to the host response inexperimental syphilis.Infect Immun，59：1368-1377
Borenstein L A，Selsted M E，Lehrer R I，and Miller J N(1991b).
Antimicrobial activity of rabbit leukocyte defensins against Treponemapallidum subsp.pallidum.Infect Immun，59：1359-1367.
Chen Y，Wang Y Q，Sun Y R，Zhang L M and Li W B(2001).Highly efficientexpression of rabbit neutrophil peptide-1 gene in Chlorella ellipsoidea cells(J).Curr Genet，39：365-370
Cullor J S，Mannis M J，Murphy C J，Smtth W L，Selsted M E，and Reid T W(1990).In vitro antimicrobial activity of defensins against ocular pathogens.Archives of Ophthalmology，108：861-864.
Cullor J S，Wood V，Smith W，Panico L，and Selsted M E(1991).Bactericidalpotency and mechanistic specificity of neutrophil defensins against bovinemastitis pathogens.Vet Microbiol，29：49-58
Daher K，Selsted M E and Lehrer R(1986).Direct inactivation of viruses byhuman granulocyte defensins.J Virol，60：1068-1074
Eisenhauer P B，Harwig S S，Szklarek D，Ganz T，Selsted M E，and Lehrer R I(1989).Purification and antimicrobial properties of three defensins from ratneutrophils.Infect Immun，57：2021-2027
Evans E W，Beach F G，Moore K M，Jackwood M W，Glisson J R，Harmon B G(1995).Antimicrobial activity of chicken and turkey heterophil peptidesCHP1，CHP2，THP1，and THP3.Vet Microbiol，47：295-303.
Evans E W，Beach G G，Wunderlich J，Harmon B G(1994).Isolation ofantimicrobial peptides from avian heterophils.J Leukoc Biol，56：661-665.
Ganz T，Rayner J R，Valore E V，Tumolo A，Talmadge K and Fuller F(1989).
The structure of the rabbit macrophage defensin genes and theirorgan-specific expression(J).Immunl，43：1358-1365
Ganz T，Selsted M E，Szklarek D，Harwig S S，Daher K，Bainton D F，andLehrer R I(1985a).Defensins.Natural peptide antibiotics of humanneutrophils.J Clin Invest，76，1427-1435.
Higgs R，Lynn D J，Gaines S，McMahon J，Tierney J，James T，Lloyd A T，Mulcahy，G，O’Farrelly C(2005).The synthetic form of a novel chickenβ-defensin identified in silico is predominantly active against intestinalpathogens.Immunogenetics 57：90-98.
Kohashi O，Ono T，Ohki K et al.(1992).Bactericidal activities of rat defensinsand synthetic rabbit defensins on Staphylococci，Klebsiella pneumoniae(Chedid，277，and 8N3)，Pseudomonas aeruginosa(mucoid and nonmucoidstrains)，Salmonella typhimurium(Ra，Rc，Rd，and Re of LPS mutants)andEscherichia coli.Microbiol Immunol，36：369-380.
Lehrer R I，Barton A，Daher K A，Harwig S S，Ganz T，and Selsted M E(1989).
Interaction of human defensins with Escherichia coli.Mechanism ofbactericidal activity.J Clin Invest，84：553-561
Lehrer R I，Ganz T，Szklarek D，and Selsted M E(1988).Modulation of the invitro candidacidal activity of human neutrophil defensins by target cellmetabolism and divalent cations.J Clin Invest，81：1829-1835
Lehrer R I，Kathleen D，Ganz T，and Selsted M E(1985b).Direct Inactivationof Viruses by MCP-1 and MCP-2，Natural Peptide Antibiotics from RabbitLeukocytes.Journal of Virology，54：467-472
Lehrer R I，Selsted M E，Szklarek D，and Fleischmann J(1983).Antibacterialactivity of microbicidal cationic proteins 1 and 2，natural peptideantibiotics of rabbit lung macrophages.Infect Immun，42：10-14.
Lehrer R I，Szklarek D，Ganz T，and Selsted M E(1985a).Correlation ofbinding of rabbit granulocyte peptides to Candida albicans withcandidacidal activity.Infect Immun，49：207-211
Lehrer R I，Szklarek D，Ganz T，and Selsted M E(1986).Synergistic activity ofrabbit granulocyte peptides against Candida albicans.Infect Immun.52：902-904
Levitz S M，Selsted M E，Ganz T，Lehrer R I，and Diamond R D(1986).Invitro killing of spores and hyphae of Aspergillus fumigatus and Rhizopusoryzae by rabbit neutrophil cationic peptides and bronchoalveolarmacrophages.J Infect Dis，154，483-489.
Li W，Li H，Lu R，Li F，Dus M，Atkinson P，Brydon E，Johnson K，Garcia-Sastre A，Ball L，et al.(2004).Interferon antagonist proteins ofinfluenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing.Proc NatlAcad Sci USA，101：1350-1355
Miyasaki K T，Bodeau A L，Ganz T，Selsted M E，and Lehrer R I(1990a).Invitro sensitivity of oral，gram-negative，facultative bacteria to thebactericidal activity of human neutrophil defensins.Infect Immun，58：3934-3940.
Miyasaki K T，Bodeau A L，Ganz T，Selsted M E，Lehrer R I(1990c).
Sensitivity of oral，Gram-negative，facultative bacteria to the bactericidalactivity of human neutrophil defensins.Infect Immun，58：3934-3940
Miyasaki K T，Bodeau A L，Selsted M E，Ganz T，and Lehrer R I(1990b).
Killing of oral，gram-negative，facultative bacteria by the rabbit defensin，NP-1.Oral Microbiol Immunol，5：315-319.
Nakashima H，Yamamoto N，Masuda M，Fujii N(1993).Defensins inhibit HIVreplication in vitro.AIDS，7：1129
Ogata K，Linzer B A，Zuberi R I，Ganz T，Lehrer R I，and Catanzaro A(1992).
Activity of defensins from human neutrophilic granulocytes againstMycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare.Infect Immun，60：4720-4725
Patterson-Delafield J，Martinez R J，and Lehrer R I(1980).Microbicidalcationic proteins in rabbit alveolar macrophages：a potential host defensemechanism.Infect Immun，30：180-192
Patterson-Delafield J，Szklarek D，Martinez R J，and Lehrer R I(1981).
Microbicidal cationic proteins of rabbit alveolar macrophages：amino acidcomposition and functional attributes.Infect Immun，31：723-731
Periathamby A R，Antonyraj K J，and Karunakaran T(2000).Large-scalesynthesis and functional elements for the antimicrobial activity of defensins.Biochem J，347：633-641
Segal G P，Lehrer R I，and Selsted M E(1985).In vitro effect of phagocytecationic peptides on Coccidioides immitis.J Infect Dis，151：890-894
Selsted M E，and Harwig S S(1987).Purification，primary structure，andantimicrobial activities of a guinea pig neutrophil defensin.Infect Immun，55：2281-2286
Selsted M E，Brown D M，Delange R J，Harwig S S L，and Lehrer R I.PrimaryStructures of Six Antimicrobial Peptides of Rabbit Peritoneal Neutrophils.JBiol Chem，1985c，260：4579-4584
Selsted M E，Brown D M，Delangel R J and Lehrer R I.(1983).Primarystructures of MCP-1 and MCP-2，natural peptide antibiotics of rabbit lungmacrophages.Journal of Biological Chemistry，258：14485-14489
Selsted M E，Miller S I，Henschen A H，and Ouellette A J(1992).Entericdefensins：antibiotic peptide components of intestinal host defense.J CellBiol，18：929-936
Selsted M E，Szklarek D，and Lehrer R I(1984).Purification and antibacterialactivity of antimicrobial peptides of rabbit granulocytes.Infect Immun，45：150-154
Shafer W M，Engle S A，Martin L E，and Spitznagel JK(1988).Killing ofProteus mirabilis by polymorphonuclear leukocyte granule proteins：
Evidence for species specificity by antimicrobial proteins.Infect Immun，56：51-53
Sinha S.，Cheshenko N，Lehrer R I，Herold B C.2003.NP-1，a Rabbitα-Defensin，Prevents the Entry and Intercellular Spread of Herpes SimplexVirus Type 2.ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY.494-500.
Sugiarto H，Yu P-L(2006).Identification of three novel ostricacins：an updateon the phylogenetic perspective of β-defensins.Int J Antimicrob Agents 27：229-235.
van Dijk A，Veldhuizen E J A，Kalkhove S I C，Tjeerdsma-van Bokhoven J LM，Romijn R A，Haagsman H P(2007).The bdefensin gallinacin-6 isexpressed in the chicken digestive tract and has antimicrobial activityagainst food-borne pathogens.Antimicrob Agents Chemother，51：912-922
Yamashita T，Saito K(1989).Purification，primary structure，and biologicalactivity of guinea pig neutrophil cationic peptides.Infect Immun，57：2405-2409
汪复.2006年中国CHINET菌耐药监测[J].中国抗感染化疗杂志，2008，8(1)：1
Trautmann M，Pollitt A，Loh U，et al.Implementation of an intensifiedinfection control program to reduce MRSA transmissions in a Germantertiary care hospital[J].Am J Infect Control，2007，35(10)：643
Jarvis WR，Schlosser J，Chinn R et al.National prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in inpatients at US health care f acilities，2006[J]Am J Infect Control，2007，35(10)：631
张秀珍.当代细菌检验与临床[M].北京：人民卫生出版社，1999.34.
李影林，卢淑文，刘雅琴.临床医学检验手册(M).长春：吉林科学出版社，1978，605～620.
Lichtenstein A，Ganz T，Selsted ME，and Lehrer RI.In vitro tumor cellcytolysis mediated by peptide defensins of human and rabbitgranulocytesBlood 1986 1407-1410
Okrent DG，Lichtenstein AK，and Ganz T.Direct cytotoxicity ofpolymorphonuclear leukocyte granule proteins to human lung-derivedcells and endothelial cells.Am.Rev.Respir.Dis.1990 141，179-185
Lichtenstein AK，Ganz T，Selsted ME.，and Lehrer RI.Synergistic cytolysismediated by hydrogen peroxide combined with peptide defensins.CellImmunol.1988114，104-116
Lichtenstein AK，Ganz T，Nguyen TM，Selsted ME，and Lehrer RI.Mechanism of target cytolysis by peptide defensins.Target cell metabolicactivities，possibly involving endocytosis，are crucial for expression ofcytotoxicity.J.Immunol.1988 140，2686-2694
Panyutich A，and Ganz T.Activated alpha2-macroglobulin is a principaldefensin-binding protein.1991.Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.5，101-106
Panyutich AV，Szold O，Poon PH.，Tseng Y，and Ganz T.Identification ofdefensin binding to C1 complement.FEBS Lett.1994.356，169-173
Panyutich AV，Hiemstra PS，van Wetering S，and Ganz T.Human neutrophildefensin and serpins form complexes and inactivate each other.Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.1995.12，351-357
Claims (4)
1.短肽mNP-1或编码所述短肽的核酸在制备抗细菌的药物中的应用，其中所述短肽mNP-1的氨基酸序列为SEQ ID NO：16所示，其中所述的细菌为奈瑟氏菌属(Neisseria)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，李斯特菌属(Listeria)，假单胞菌属(Psdeuomnoda)，埃希氏菌属(Escherichia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，沙雷氏菌属(Serratia)，嗜血杆菌属(Haemophilus)，博德特氏菌属(Bordetella)，螺旋杆菌属(Heliobacterium)，链球菌属(Streptococcus)，不动杆菌属(Acinetobacter)，沙门氏菌属(Salmonella)。
2.权利要求1的应用，其中编码所述短肽的核酸序列为SEQ ID NO：15所示。
3.权利要求1所述的应用，其中所述细菌为淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)，幽门螺旋杆菌(Heliobacterium chlorum)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，大肠杆菌(Escherichia coli)。
4.权利要求1的所述的应用，其中所述细菌为耐甲氧西林的金黄色葡萄菌(MRSA)或泛耐药铜绿假单胞菌。
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