CN104394953B - 用于结合有机靶的没有重复片段的蜘蛛丝融合蛋白结构 - Google Patents

用于结合有机靶的没有重复片段的蜘蛛丝融合蛋白结构 Download PDF

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Abstract

提供了包括部分B和CT的重组融合蛋白。B是非拖丝蛋白部分，其提供与有机靶选择性相互作用的能力。CT是70至120个氨基酸残基的部分，并衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段。融合蛋白不包括任何衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的部分。

Description

用于结合有机靶的没有重复片段的蜘蛛丝融合蛋白结构
发明的技术领域
本发明涉及重组融合蛋白的领域，且更具体地涉及包括衍生自蜘蛛丝蛋白(拖丝蛋白)的部分的新颖融合蛋白。本发明提供了用于提供为包括重组融合蛋白的聚合物的蛋白结构的方法，所述重组融合蛋白包括衍生自拖丝蛋白的部分。还提供了用于结合有机靶的新颖蛋白结构。
发明背景
在应用蛋白化学中，一个常见的问题是如何向相关的活性位点配制或呈现生物活性肽或蛋白，所述活性位点通常是有机靶，诸如核酸、蛋白、蛋白复合体、蛋白和/或脂质和/或碳水化合物和/或核酸的复合体。最简单的解决方案是仅仅提供生物活性肽或蛋白的水溶液。然而，许多应用的确要求一些进一步的手段来实现期望的目标。例如，可将肽/蛋白缔合于脂质混合物或化学地固定于支持结构。
用于固定于支持结构的肽/蛋白的应用包括制备和分析性分离程序诸如生物工艺、层析法、细胞捕获和培养、主动过滤器(active filters)和诊断学。基于胞外基质蛋白例如胶原的结构公开在EP 704 532和EP 985 732中。
还已经建议在支持结构中使用蜘蛛丝蛋白。蜘蛛丝是天然的高性能聚合物，由于强度和弹性的组合而获得了非同寻常的韧性和延伸性。蜘蛛具有多达七个不同的腺，这些腺产生具有不同机械性质和功能的多种丝类型。由大壶状腺产生的拖丝(dragline silk)是最坚韧的纤维。它由两种主要的多肽组成，大多被称为大壶状腺拖丝蛋白(spidroin)(MaSp)1和2，但在例如，在十字园蛛(Araneus diadematus)中被称为ADF-3和ADF-4。这些蛋白质具有200-720 kDa范围内的分子量。蜘蛛拖丝蛋白质或MaSp具有分成三部分的组成：无重复的N-端结构域、由许多重复的聚Ala/Gly区段构成的中心重复区域和无重复的C-端结构域。通常认为重复区域在丝纤维中形成分子间接触，但不太清楚末端结构域的准确功能。还认为与纤维形成相联系地，重复区域经历从无规卷曲和α-螺旋构象到β-折叠结构的结构转化。拖丝蛋白的C端区域在蜘蛛种类和丝类型之间通常是保守的。
WO 07/078239和Stark,M.等人,Biomacromolecules 8:1695-1701,(2007)公开了由具有高的Ala和Gly含量的重复片段和蛋白质的C端片段组成的微型蜘蛛丝蛋白，以及包含蜘蛛丝蛋白的可溶性融合蛋白。在蜘蛛丝蛋白从其融合配体释放后，自然地获得蜘蛛丝蛋白的纤维。
Rising,A.等人,CMLS 68(2):169-184(2010)综述了在产生蜘蛛丝蛋白方面的进展。纤维产生自微型化的拖丝蛋白构建体，所述微型化的拖丝蛋白构建体由衍生自蜘蛛丝蛋白的重复区的区段的4个重复和非重复C端结构域构成。
US 2009/0263430公开了酶β-半乳糖苷酶与微型蜘蛛丝蛋白的膜的化学偶联。然而，化学偶联可能要求对蛋白稳定性和/或功能不利的条件。包含衍生自蜘蛛丝蛋白的重复区的区段的多个重复的蛋白已经被设计以包括RGD细胞结合区段(Bini,E等人,Biomacromolecules 7:3139-3145(2006)；Morgan等人，Biomaterials 29(16):2556-2563(2008))和/或R5肽(Wong Po Foo,C等人,Proc Natl Acad Sci 103(25):9428-9433(2006))或参与矿化作用(mineralization)的其它蛋白区段(Huang,J等人,Biomaterials28:2358-2367(2007)；WO 2006/076711)。在这些现有技术文献中，通过在变性的有机溶剂六氟异丙醇(HFIP)中增溶融合蛋白和干燥来形成膜。
US 2005/261479 A1公开了用于纯化由重复片段和亲和性标签组成的重组丝蛋白的方法，包括从复杂混合物中磁亲和性分离单独的丝蛋白，而不形成丝蛋白纤维或其它聚合物结构。
已知的支持结构和相关的技术在以下方面具有某些缺陷，例如经济性、效率、稳定性、再生能力、生物活性和生物相容性。
发明概要
本发明的一个目的是提供新颖的重组融合蛋白。特别是，本发明的一个目的是提供能够与有机靶选择性相互作用的新颖的重组融合蛋白。
本发明的一个目的是提供能够与有机靶选择性相互作用的新颖蛋白结构。
本发明的另一个目的是提供能够与有机靶选择性相互作用的蛋白结构，其中所述结构的形成不使用可能对蛋白的二级结构或活性具有不可预测的作用和/或保持在蛋白结构中的强溶剂。
本发明的一个目的是提供能够与有机靶选择性相互作用的稳定蛋白结构，该蛋白结构在使用后可容易地再生，例如通过化学处理再生。
本发明的另一个目的是提供是生物相容的并适于细胞培养和作为植入物的稳定蛋白结构。
本发明的又另一个目的是提供具有高密度的能够与有机靶选择性相互作用的均匀间隔的官能团的蛋白结构。
本发明的另一个目的是提供在+4℃或在室温储存数月后保持其选择性结合能力的蛋白结构。
本发明的又一个目的是提供可高压灭菌，即，在灭菌热处理后保持其选择性结合能力的蛋白结构。
为了这些和其它目的，将从以下公开内容明显的是，根据第一方面，本发明提供融合蛋白和由包含该融合蛋白作为重复结构单元的聚合物组成的蛋白结构，如权利要求书中所列出的。
根据一个相关的方面，本发明提供编码融合蛋白的分离的核酸和产生融合蛋白的方法，如权利要求书中所列出的。
根据另一个方面，本发明提供用于提供蛋白结构的方法，如权利要求书中所列出的。
根据另一个方面，本发明提供亲和性介质，如权利要求书中所列出的。
根据一个方面，本发明提供细胞支架材料，如权利要求书中所列出的。根据一个相关的方面，本发明还提供根据权利要求书的细胞和细胞支架材料的组合。
根据一个方面，本发明提供蛋白结构和融合蛋白的新颖用途，如权利要求书中所列出的。
根据另一个方面，本发明提供用于从样品分离有机靶的方法，如权利要求书中所列出的。
根据另一个方面，本发明提供用于固定和任选地培养细胞的方法，如权利要求书中所列出的。
附图简述
图1显示拖丝蛋白C端结构域的序列比对。
图2显示拖丝蛋白N端结构域的序列比对。
图3显示纤维格式中丝融合的ABD的显微照片。
图4显示从ABD-NTCT和ABD-CT膜洗脱的人血浆的级分的SDS-PAGE凝胶。
图5显示在纤维和泡沫格式中丝融合的M4片段的显微照片。
图6显示Atto-565-生物素结合到M4-NTCT和M4-CT膜的荧光显微镜照片。
图7显示在泡沫格式中丝融合的抗体片段的显微照片。
图8显示纯的和丝融合的抗体片段的抗原结合分析。
图9显示丝融合的木聚糖酶的宏观泡沫。
所附序列的列表
SEQ ID NO
1 4Rep
2 4RepCT
3 NT4Rep
4 NT4Rep
5 NT4RepCTHis
6 NT
7 CT
8 共有NT序列
9 共有CT序列
10 来自Euprosthenops australis MaSp1的重复序列
11 共有G区段序列1
12 共有G区段序列2
13 共有G区段序列3
14 CT Euprosthenops sp MaSpl
15 CT Euprosthenops australis MaSpl
16 CT三带金蛛(Argiope trifasciata)MaSpl
17 CT泉字云斑蛛(Cyrtophora moluccensis)Sp1
18 CT几何寇蛛(Latrodectus geometricus)MaSpl
19 CT黑寡妇蜘蛛(Latrodectus hesperus)MaSpl
20 CT赫氏粒突蛛(Macrothele holsti)Sp1
21 CT络新妇蛛(Nephila clavipes)MaSpl
22 CT斑络新妇(Nephila pilipes)MaSpl
23 CT马达加斯加金色球蜘蛛(Nephila madagascariensis)MaSpl
24 CT带状褪金色圆网蜘蛛(Nephila senegalensis)MaSpl
25 CT变异涡蛛(Octonoba varians)Sp1
26 CT中华缕网蛛(Psechrus sinensis)Sp1
27 CT长爪绿色荧光蜘蛛(Tetragnatha kauaiensis)MaSpl
28 CT多色肖蛸(Tetragnatha versicolor)MaSpl
29 CT巨头地衣圆蛛(Araneus bicentenarius)Sp2
30 CT悦目金蛛(Argiope amoena)MaSp2
31 CT阿吉普奥兰提亚金蛛(Argiope aurantia)MaSp232 CT三带金蛛MaSp2
33 CT多型棘腹蛛(Gasteracantha mammosa)MaSp2
34 CT几何寇蛛MaSp2
35 CT黑寡妇蜘蛛MaSp2
36 CT络新妇蛛MaSp2
37 CT马达加斯加金色球蜘蛛MaSp2
38 CT带状褪金色圆网蜘蛛MaSp2
39 CT褐灰色捕鱼蜘蛛(Dolomedes tenebrosus)Fb1
40 CT褐灰色捕鱼蜘蛛Fb2
41 CT十字园蛛ADF-1
42 CT十字园蛛ADF-2
43 CT十字园蛛ADF-3
44 CT十字园蛛ADF-4
45 NT Euprosthenops australis MaSpl
46 NT几何寇蛛MaSpl
47 NT黑寡妇蜘蛛MaSpl
48 NT络新妇蛛MaSpl
49 NT三带金蛛MaSp2
50 NT几何寇蛛MaSp2
51 NT黑寡妇蜘蛛MaSp2
52 NT Nephila inaurata madagascanensis MaSp2
53 NT络新妇蛛MaSp2
54 NT横纹金蛛(Argiope bruennichi)圆柱状拖丝蛋白155 NT Nephila clavata圆柱状拖丝蛋白1
56 NT黑寡妇蜘蛛管状拖丝蛋白
57 NT络新妇蛛鞭毛状丝蛋白
58 NT Nephila inaurata madagascanensis鞭毛状丝蛋白
59 His6NT-CT
60 HiS6NTNT-CT
61 His6Z-CT
62 His6CT-Z
63 His6Z-NTCT
64 His6NTCT-Z
65 His6Z-NTNTCT
66 His6NTNTCT-Z
67 His6-ABD-NTCT(DNA)
68 His6-ABD-NTCT
69 His6-ABD-CT(DNA)
70 His6-ABD-CT
71 His6-M4-NTCT(DNA)
72 His6-M4-NTCT
73 His6-M4-CT(DNA)
74 His6-M4-CT
75 His6-scFv1-NTCT(DNA)
76 His6-scFv1-NTCT
77 His6-scFv1-CT(DNA)
78 His6-scFv1-CT
79 His6Xyl-NTCT(DNA)
80 His6Xyl-NTCT
81 His6Xyl-CT(DNA)
82 His6Xyl-CT
83 His6EGF-NTCT(DNA)
84 His6EGF-NTCT
85 His6EGF-CT(DNA)
86 His6EGF-CT
发明详述
本发明总体是基于如下洞见：能够与有机靶选择性相互作用的固态蛋白结构可制备为以重组融合蛋白作为重复结构单元的聚合物形式。融合蛋白包括至少一个能够与该有机靶选择性相互作用的优选地多于30个氨基酸残基的非拖丝蛋白部分、和对应于蜘蛛丝蛋白的至少C端片段的部分，条件是融合蛋白不包括任何衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的部分。
意外地，衍生自蜘蛛丝蛋白的部分可被诱导以在结构上重排并因而形成聚合、固体结构，而非拖丝蛋白部分不在结构上重排，但保持其期望的结构和功能，即，与该有机靶选择性相互作用的能力。可获得蛋白结构而无化学偶联步骤或变性方法步骤，这使得程序容易并改进获得具有保持其部分的功能性的融合蛋白的机会，尤其是当功能依赖于部分的二级结构时。这些融合蛋白聚合物的形成可被紧密地控制，且这一洞见已被开发为进一步的新颖蛋白结构、产生该蛋白结构的方法、和该蛋白结构在多种应用和方法中的用途。
因此，根据本发明的融合蛋白具备期望的选择性相互作用活性和蛋白结构中在生理条件下采用的内部的固态支持活性二者。当拖丝蛋白部分在结构上重排以形成聚合、固体结构时，融合蛋白的结合活性被保持，而非拖丝蛋白部分与拖丝蛋白部分共价连接，一定是被认为令人惊讶的。事实上，提供选择性相互作用活性的部分当被整合在根据本发明的融合蛋白结构中时，可增加其热和/或化学稳定性和/或结合活性。该蛋白结构还提供对有机靶的选择性相互作用活性的高和可预测的密度。具有选择性相互作用活性的有价值的蛋白部分的丢失被减到最小，因为所有表达的蛋白部分与固体支持物缔合。
从根据本发明的融合蛋白形成的聚合物是固体结构，由于其物理特征而是有用的，尤其是高强度、弹性和轻的重量的有用的组合。特别有用的特征是，融合蛋白的拖丝蛋白衍生部分是生化牢固的，适于用例如酸、碱或离液剂再生，并适于加热灭菌，例如在120℃高压灭菌20min。该聚合物还因为其支持细胞粘附和生长的能力而是有用的。衍生自拖丝的性质在开发为了医学或技术目的的新材料方面是有吸引力的。尤其是，根据本发明的蛋白结构可用在制备和分析性分离程序中，诸如层析法、细胞捕获、筛选和培养、主动过滤器(active filters)和诊断学。根据本发明的蛋白结构还可用在医疗装置中，诸如植入物和医学产品，诸如伤口闭合系统、创可贴、缝线、伤口敷料、和用于细胞固定、细胞培养、组织工程和引导细胞再生的支架。
本发明提供能够与有机靶选择性相互作用的重组融合蛋白，该融合蛋白包括部分B和CT、和任选的NT。本发明还提供能够与有机靶选择性相互作用的蛋白结构，其中所述蛋白结构是包括根据本发明的重组融合蛋白、和任选地由根据本发明的重组融合蛋白组成的聚合物，即，包括部分B和CT、和任选的NT，和任选地由部分B和CT、和任选的NT组成。根据本发明的融合蛋白不包括衍生自蜘蛛丝蛋白的重复(REP)片段的任何部分。
尽管在实施例中融合蛋白的CT和任选的NT部分不得已地涉及具体蛋白，例如衍生自来自Euprosthenops australis的大拖丝蛋白1(MaSp1)的蛋白，为了产生根据本发明的融合蛋白结构的目的，考虑本公开内容可适用于任何结构上相似的部分。而且，尽管在实施例中提供融合蛋白的选择性相互作用活性的B部分不得已地涉及具体蛋白部分，例如衍生自蛋白A、蛋白G和链霉亲和素的部分，为了产生根据本发明的融合蛋白结构的目的，考虑本公开内容可适用于能够与有机靶选择性相互作用的任何结构上和/或功能上相似的B部分。
根据本发明的具体融合蛋白以式BX-CT-BZ定义，其中x和z是从0至5的整数；且x+z≥1，任选地在融合蛋白的任一端或融合蛋白中任何两个蛋白部分之间还包含一个或更多个例如1-2个NT的NT部分，例如NT-BX-CT-BZ、BX-NT-CT-BZ、BX-CT-NT-BZ、BX-CT-BZ-NT、NT-NT-BX-CT-BZ或BX-CT-BZ-NT-NT。如果x+z>1，即，如果存在两个或更多个B部分，它们可以是相同或不同的。两个或更多个B部分可具有与相同有机靶或与不同有机靶选择性相互作用的能力。优选地，两个或更多个B部分是大致上相同的，各具有与相同有机靶选择性相互作用的能力。可替代地，优选两个或更多个B部分是不相同的，且它们一起提供与有机靶选择性相互作用的能力。
在根据本发明的优选融合蛋白中，x和z是0至2、优选地0至1的整数。在根据本发明的某些优选融合蛋白中，x或z是0，即，融合蛋白以式BX-CT、和CT-BZ定义，其中x或z是从1至5的整数，且任选地包含1-2个NT部分。在根据本发明的优选融合蛋白中，x和z是0至1的整数；且x+z＝1。因此，根据本发明的某些优选融合蛋白以式B-CT、和CT-B定义，任选地包含1-2个NT部分。在根据本发明的优选融合蛋白中，任选的NT部分不存在。
术语“融合蛋白”此处指通过由重组核酸，即通过组合正常情况下不会一起出现的两个或更多个核酸序列而人工创造的DNA或RNA表达而制备的蛋白质(遗传工程)。根据本发明的融合蛋白是重组蛋白，且因此其不同于天然存在的蛋白质。特别地，因为野生型拖丝蛋白不是由以上列出的重组核酸表达的，所以其不是根据本发明的融合蛋白。组合的核酸序列编码具有特定功能特性的不同蛋白质、部分蛋白质或多肽。所得的融合蛋白或重组融合蛋白是具有衍生自原始蛋白质、部分蛋白质或多肽中的每一种的功能特性的单一蛋白质。而且，根据本发明的融合蛋白和相应的基因是嵌合的，即，该蛋白/基因部分衍生自至少两种不同的物种。CT部分和任选的NT部分衍生自蜘蛛丝蛋白。为了避免疑问，根据本发明的B部分是非拖丝蛋白的蛋白或多肽，即，其不是衍生自蜘蛛丝蛋白。具体地，根据本发明的B部分不是衍生自蜘蛛丝蛋白的C端、重复或N端片段。
融合蛋白通常由从170至2000个氨基酸残基、诸如从170至1000个氨基酸残基、诸如从170至600个氨基酸残基、优选地从170至500个氨基酸残基、诸如从170至400个氨基酸残基组成。小的尺寸是有利的，因为包含蜘蛛丝蛋白片段的较长蛋白可能形成无定形的聚集物，这需要使用强力的溶剂来增溶和聚合。重组融合蛋白可包含多于2000个残基，尤其是在蜘蛛丝蛋白包含多于一个B部分和/或当其包含NT部分，例如1-2个NT部分的情形时。
术语"拖丝蛋白(spidroin)"和"蜘蛛丝蛋白(spider silk protein)"遍及本说明书可互换地使用，并涵盖所有已知的蜘蛛丝蛋白，包括大壶状腺蜘蛛丝蛋白，其通常缩写为"MaSp"，或在十字园蛛的情形缩写为"ADF"。这些大壶状腺蜘蛛丝蛋白一般为两种类型，1和2。这些术语还包括与已知蜘蛛丝蛋白具有高程度的同一性和/或相似性的非天然蛋白。
所以，术语"非拖丝蛋白"意指不是衍生自蜘蛛丝蛋白的蛋白，即，与蜘蛛丝蛋白具有低(或无)程度的同一性和/或相似性。
根据本发明的蛋白结构能够与有机靶选择性相互作用。这一能力存在于根据本发明的融合蛋白中，更具体地存在于融合蛋白的B部分中。CT部分和任选的NT部分与有机分子的任何相互作用不被术语"能够与有机靶选择性相互作用"涵盖。为了避免疑问，术语"能够与有机靶选择性相互作用"不涵盖根据本发明的融合蛋白的依赖于包括CT部分和/或任选的NT部分的相互作用的二聚、寡聚或聚合。
术语"有机靶"涵盖含碳原子的所有化学分子，例外是通常本领域技术人员认为是无机分子的那些，例如碳酸盐、碳的简单氧化物、氰化物、金刚石和石墨。为了避免疑问，无机分子、盐和离子，诸如硅石和氯化钙，不是有机的。有机靶可以是包含有机分子或由有机分子组成的复合体，例如，细胞表面上的受体复合体。有机靶可以是一种或更多种有机分子类型的单体、二聚体、寡聚体或聚合物，可以由共价键或其它类型的缔合保持在一起。当然，它还可以简单地是单个有机分子。根据本发明的优选的有机靶包括但不限于，核酸、蛋白和多肽、脂质和碳水化合物、以及其组合。根据本发明的另外的优选的有机靶包括但不限于，免疫球蛋白、包括免疫球蛋白或其衍生物的分子(molecules comprising immunoglobulinor derivatives thereof)、白蛋白、包括白蛋白或其衍生物的分子(moleculescomprising albumin or derivatives thereof)、生物素、包括生物素或其衍生物或类似物的分子(molecules comprising biotin or derivatives or analogues thereof)、及生物疾病标志物，例如来自血液、血清、尿、唾液或来自身体组织的其它样品。
在本发明的上下文中，配体例如根据本发明的融合蛋白的B部分与其靶的"特异"或"选择性"相互作用是指，该相互作用使得特异性与非特异性、或选择性或非选择性的相互作用之间的差别变得有意义。两种蛋白之间的相互作用有时以解离常数测量。解离常数描述两种分子之间的结合强度(或亲和性)。通常抗体与其抗原之间的解离常数是从10-7至10-11M。然而，高特异性不必要求高亲和性。对其对应物具有低亲和性(在摩尔范围中)的分子已经显示为与具有高的多的亲和性的分子同样特异性。在本发明的情形中，特异或选择性相互作用是指在指定条件下，在天然存在的或经加工的生物或生化流体的样品中其它蛋白的存在下，特定方法可用于确定特定蛋白、靶蛋白或其片段的存在和/或量的程度。换言之，特异性或选择性是区分相关蛋白的能力。特异和选择性在本说明书中有时可互换地使用。
根据本发明的融合蛋白还可包含一个或更多个接头肽。接头肽可布置在融合蛋白的任何部分之间，例如，CT和NT部分之间、两个B部分之间、和B和CT部分之间，或可布置在融合蛋白的任一末端。如果融合蛋白包含两个或更多个B部分，接头肽还可布置在两个B部分之间。接头可在融合蛋白的功能单元之间提供间隔区，而且还可构成用于鉴定和纯化该融合蛋白的工具，例如，His和/或Trx标签。如果融合蛋白包含用于鉴定和纯化融合蛋白的两个或更多个接头肽，优选它们被间隔序列隔开，例如His6-间隔区-His6-。接头还可构成将融合蛋白导向膜和/或致使融合蛋白从宿主细胞分泌到周围介质中的信号肽，例如信号识别颗粒。融合蛋白还可在其氨基酸序列中包括允许裂解并去除接头和/或其它相关部分，通常是一个或更多个B部分的裂解位点。多种裂解位点是本领域技术人员已知的，例如，针对化学剂的裂解位点，例如Met残基之后的CNBr裂解位点和Asn-Gly残基之间的羟胺裂解位点，针对蛋白酶例如凝血酶或蛋白酶3C的裂解位点，和自我剪接序列，例如内蛋白(intein)自我剪接序列。
CT和B部分彼此直接或间接连接。直接连接指部分之间的直接共价结合而无间插序列例如接头。间接连接也是指部分通过共价键连接，但是存在间插序列，例如接头和/或一个或更多个另外的部分，例如1-2个NT部分。
一个或更多个B部分可布置在融合蛋白的内部或任何一端，即，布置在C端或布置在N端。优选一个或更多个B部分布置在融合蛋白的N末端。如果融合蛋白包含用于鉴定和纯化融合蛋白的一个或更多个接头肽，例如，His或Trx标签，优选地其被布置在融合蛋白的N末端。
优选的融合蛋白具有布置在N端的B部分通过1-30个氨基酸残基，经由例如1-10个氨基酸残基的接头肽偶联到布置在C端的CT部分的形式。接头肽可包含裂解位点。任选地，融合蛋白具有可包含纯化标签例如His标签和裂解位点的N端或C端接头肽。
另一种优选的融合蛋白具有布置在N端的B部分直接偶联到布置在C端的CT部分的形式。任选地，融合蛋白具有可包含纯化标签例如His标签和裂解位点的N端或C端接头肽。
根据本发明的蛋白结构是包含根据本发明的重组融合蛋白作为重复结构单元的聚合物，这是意指，其包含有序的多个根据本发明的融合蛋白，通常远多于100个融合蛋白单元、例如，1000个融合蛋白单元或更多。任选地，聚合物可包含无B部分的互补蛋白、优选地衍生自蜘蛛丝的蛋白作为另外的重复结构单元。如果融合蛋白的B部分是大和/或庞大的，这可以是有益的。这些互补蛋白通常包括，且甚至由CT部分构成，且任选地还包括，且甚至由NT部分构成，例如1-2个NT部分。根据本发明的优选的互补蛋白可具有本文列出的结构的任一种，并缺失B部分。优选地，互补融合蛋白与缺失B部分的融合蛋白基本上相同。然而优选地，根据本发明的蛋白结构是由根据本发明的重组融合蛋白作为重复结构单元组成的聚合物，即，根据本发明的蛋白结构是根据本发明的重组融合蛋白的聚合物。
聚合物中融合单元的量值意指该蛋白结构获得显著的尺寸。在优选的实施方案中，蛋白结构在至少两个维度上具有至少0.1μm的尺寸。因此，本文使用的术语"蛋白结构"涉及具有至少0.1μm的厚度的融合蛋白聚合物，优选地人眼可见的宏观聚合物，即，具有至少1μm的厚度。术语"蛋白结构"不涵盖无结构的聚集物或沉淀物。尽管融合蛋白的单体是水溶性的，应理解的是，根据本发明的蛋白结构是固体结构，即，不溶于水。该蛋白结构是包含根据本发明的重组融合蛋白作为重复结构单元单体的聚合物。
优选地，根据本发明的蛋白结构是以选自由纤维(fiber)、膜(film)、泡沫(foam)、网状物(net)、网(mesh)、球(sphere)和胶囊(capsule)组成的组的物理形态。
优选地，根据本发明的蛋白结构是厚度为至少1nm或至少0.1μm、优选地至少1μm的纤维或膜。优选地，纤维或膜具有范围在1nm-400m，例如1-400μm、且优选地60-120μm中的厚度。优选地，纤维具有范围在0.5-300cm、优选地1-100cm中的长度。其它优选的范围是0.5-30cm和1-20cm。纤维具有在物理操作期间保持完整的能力，即，可用于旋转、编织、扭转、钩编和类似程序。膜是有利的，因为其是一致的并粘附于固体结构，例如，微量滴定板中的塑料制品。膜的这一特征有助于洗涤和再生程序，对于分离目的是非常有用的。特别有用的蛋白结构是膜或纤维，其中B部分是衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域或与其具有至少70％同一性的蛋白片段。
还优选地，根据本发明的蛋白结构具有高于1MPa、优选地高于2MPa、更优选地10MPa或更高的抗张强度。优选地，根据本发明的蛋白结构具有高于100MPa、更优选地200MPa或更高的抗张强度。
如下计算遍及本说明书和所附权利要求书使用的术语“％同一性”。使用CLUSTALW算法(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.和Gibson,T.J.,Nucleic Acids Research,22:4673-4680(1994))比对查询序列与靶序列。在对应所比对的序列中的最短序列的窗口上进行对比。对比每个位置的氨基酸残基，并将在靶序列中具有相同对应物的查询序列中的位置的百分比报告为％同一性。
如对“％同一性”所描述的计算遍及本说明书和所附权利要求书使用的术语“％相似性”，但以下除外：疏水残基Ala、Val、Phe、Pro、Leu、Ile、Trp、Met和Cys是相似的；碱性残基Lys、Arg和His是相似的；酸性残基Glu和Asp是相似的；且亲水性的、不带电荷的残基Gln、Asn、Ser、Thr和Tyr是相似的。在该上下文中剩余的天然氨基酸Gly不与任何其它氨基酸相似。
遍及本说明书，根据本发明的替代实施方案满足相应百分比的相似性，而不是指定百分比的同一性。其它替代实施方案满足指定百分比的同一性以及另一个较高百分比的相似性，选自对于每个序列的优选百分比的同一性的组。例如，某序列可以与另一序列70％相似；或其可以与另一序列70％相同；或其可以与另一序列70％相同且90％相似。
CT部分是包含70至120个氨基酸残基的蛋白片段，并衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段。表述"衍生自"意指在根据本发明的CT部分的上下文中，它与蜘蛛丝蛋白的C端氨基酸序列具有高度的相似性。如图1中所示，该氨基酸序列在各个物种和蜘蛛丝蛋白，包括MaSp1和MaSp2之间相当保守。以SEQ ID NO:9提供了MaSp1和MaSp2的C端区域的共有序列。在图1中，比对了以GenBank登记条目(如果可用)表示的下列MaSp蛋白质(SEQ ID NO:14-44)：
表1–拖丝蛋白CT部分
哪种特定的CT部分存在于根据本发明的蜘蛛丝蛋白中不是关键的，只要该CT部分没有完全缺失。因此，根据本发明的CT部分可选自图1和表1(SEQ ID NO:14-44)中示出的氨基酸序列或具有高度相似性的序列中的任何一种。多种多样的C端序列可用在根据本发明的蜘蛛丝蛋白中。
根据本发明的CT部分的序列与基于图1(SEQ ID NO:14-44)的氨基酸序列的共有氨基酸序列SEQ ID NO:9具有至少50％的同一性，优选地至少60％，更优选地至少65％的同一性，或甚至至少70％的同一性。。
根据本发明的代表性的CT部分是Euprosthenops australis序列SEQ ID NO:7。因此，根据本发明的一个优选方面，CT部分与SEQ ID NO:7或图1和表1(SEQ ID NO:14-44)中的任何单独的氨基酸序列具有至少80％、优选地至少90％、例如至少95％的同一性。在本发明的优选方面中，CT部分与SEQ ID NO:7或图1和表1中的任何单独的氨基酸序列相同。
CT部分通常由70至120个氨基酸残基组成。优选CT部分包含至少70、或多于80、优选地多于90个氨基酸残基。还优选CT部分包含至多120、或少于110个氨基酸残基。典型的CT部分包含约100个氨基酸残基。
任选的NT部分是包含100至160个氨基酸残基的蛋白片段，并衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段。表述"衍生自"意指在根据本发明的NT部分的上下文中，它与蜘蛛丝蛋白的N端氨基酸序列具有高度的相似性。如图2中所示，该氨基酸序列在各个物种和蜘蛛丝蛋白，包括MaSp1和MaSp2之间相当保守。在图2中，比对了以GenBank登记条目(如果可用)表示的以下拖丝蛋白NT部分(SEQ ID NO:45-58)：
表2–拖丝蛋白NT部分
对每个序列显示仅对应N端部分的部分，省略了信号肽。Nc标志和NIm标志根据Rising A.等人.Biomacromolecules 7,3120-3124(2006)翻译和编辑。
哪种特定的NT部分存在于根据本发明的蜘蛛丝蛋白中不是关键的。因此，根据本发明的NT部分可选自图2和表2(SEQ ID NO:45-58)中示出的氨基酸序列或具有高度相似性的序列中的任何一种。多种多样的N端序列可用在根据本发明的蜘蛛丝蛋白中。基于图2的同源序列，以下序列构成共有NT氨基酸序列：
QANTPWSSPNLADAFINSF(M/L)SA(A/I)SSSGAFSADQLDDMSTIG(D/N/Q)TLMSAMD(N/S/K)MGRSG(K/R)STKSKLQALNMAFASSMAEIAAAESGG(G/Q)SVGVKTNAISDALSSAFYQTTGSVNPQFV(N/S)EIRSLI(G/N)M(F/L)(A/S)QASANEV(SEQ ID NO:8).
根据本发明的NT部分的序列与共有氨基酸序列SEQ ID NO:8(其基于图2的氨基酸序列)具有至少50％的同一性、优选至少60％的同一性。在优选的实施方案中，根据本发明的NT部分的序列与共有氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少65％的同一性、优选至少70％的同一性。在优选的实施方案中，根据本发明的NT部分进一步地与共有氨基酸序列SEQ IDNO:8具有70％、优选80％的相似性。
根据本发明的代表性的NT部分是Euprosthenops australis序列SEQ ID NO:6。根据本发明的优选实施方案，NT部分与SEQ ID NO:6或图2(SEQ ID NO:45-48)中的任何单独的氨基酸序列具有至少80％同一性。在本发明的优选实施方案中，NT部分与SEQ ID NO:6或图2中的任何单独的氨基酸序列具有至少90％、诸如至少95％的同一性。在本发明的优选实施方案中，NT部分与SEQ ID NO:6或图2中的任何单独的氨基酸序列、尤其是与Ea MaSp1(SEQ ID NO:45)相同。
NT部分包含100至160个氨基酸残基。优选NT部分包含至少100、或多于110、优选地多于120个氨基酸残基。还优选NT部分包含至多160、或少于140个氨基酸残基。典型的NT部分包含大约130-140个氨基酸残基。
融合蛋白不包括任何衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的部分。衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的典型的部分，及因此在本融合蛋白中缺少的是REP部分，即衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的含有从70至300个氨基酸残基的蛋白片段。在缺乏REP部分的融合蛋白中，B部分对其它分子相比对其抗原靶的非特异性结合的甚至进一步降低已有利地观察到。从缺乏REP部分的融合蛋白自发形成固体结构也特别令人惊讶。
REP部分具有在富含丙氨酸的区段和富含甘氨酸的区段之间交替的重复性特征。如以下将更详细地解释的，REP部分通常包含多于70，例如多于140且少于300，优选地少于240，例如少于200个氨基酸残基，且自身可分成几个L(接头)区段、A(富含丙氨酸)区段和G(富含甘氨酸)区段。通常，所述接头区段是任选的，位于REP部分末端，而剩余的区段依次是富含丙氨酸和富含甘氨酸的。因此，REP部分通常可具有以下结构中的任何一种，其中n是整数：
L(AG)nL，例如LA1G1A2G2A3G3A4G4A5G5L；
L(AG)nAL，例如LA1G1A2G2A3G3A4G4A5G5A6L；
L(GA)nL，例如LG1A1G2A2G3A3G4A4G5A5L；或
L(GA)nGL，例如LG1A1G2A2G3A3G4A4G5A5G6L。
其遵循：富含丙氨酸或富含甘氨酸的区段是否与N端或C端接头区段相邻不是关键的。优选n是从2至10，优选地从2至8，优选地从4至8，更优选地从4至6的整数，即n＝4、n＝5或n＝6。
REP部分的丙氨酸含量通常高于20％，优选地高于25％，更优选地高于30％且低于50％，优选地低于40％，更优选地低于35％。
现在转向构成REP部分的区段，应强调的是每个区段是单独的，即，特定REP部分的任何两个A区段、任何两个G区段或任何两个L区段可以是相同的或可以是不相同的。因此，每种类型的区段在特定REP部分内是相同的不是一般特征。而是，以下公开内容为技术人员提供了如何鉴定从而认为是衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的REP部分的指南，且该REP部分不构成根据本发明的功能性融合蛋白的一部分。
每个单独的A区段是具有8至18个氨基酸残基的氨基酸序列。这些氨基酸残基中的绝大多数是丙氨酸残基。更特别地，这些氨基酸残基中的从0至3个不是丙氨酸残基，且剩余的氨基酸残基是丙氨酸残基。因此，每个单独的A区段中的所有氨基酸残基毫无例外地或除了一、二或三个氨基酸残基可以是任何氨基酸以外，都是丙氨酸残基。取代丙氨酸的氨基酸是天然氨基酸，优选地单独选自丝氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸的组，更优选地是丝氨酸。当然，A区段中的一个或更多个是全丙氨酸区段，而剩余的A区段包含1-3个非丙氨酸的残基，例如丝氨酸、谷氨酸、半胱氨酸或甘氨酸是可能的。
通常每个单独的A区段与选自SEQ ID NO:10的氨基酸残基7-19、43-56、71-83、107-120、135-147、171-183、198-211、235-248、266-279、294-306、330-342、357-370、394-406、421-434、458-470、489-502、517-529、553-566、581-594、618-630、648-661、676-688、712-725、740-752、776-789、804-816、840-853、868-880、904-917、932-945、969-981、999-1013、1028-1042和1060-1073的组的氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％，更优选地95％，最优选地100％的同一性。该组的每个序列对应于Euprosthenops australis MaSp1蛋白质的天然存在的序列的区段，该天然存在的序列从克隆相应的cDNA推断得来，参见WO2007/078239。可选择地，每个单独的A区段与选自SEQ ID NO:3的氨基酸残基143-152、174-186、204-218、233-247和265-278的组的氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％，更优选地95％，最优选地100％的同一性。
此外，已从实验数据推断出，每个单独的G区段是从12至30个氨基酸残基的氨基酸序列。优选每个单独的G区段由14至23个氨基酸残基组成。每个G区段的至少40％的氨基酸残基是甘氨酸残基。通常，每个单独的G区段的甘氨酸含量在40-60％的范围内。
通常每个单独的G区段与选自SEQ ID NO:10的氨基酸残基20-42、57-70、84-106、121-134、148-170、184-197、212-234、249-265、280-293、307-329、343-356、371-393、407-420、435-457、471-488、503-516、530-552、567-580、595-617、631-647、662-675、689-711、726-739、753-775、790-803、817-839、854-867、881-903、918-931、946-968、982-998、1014-1027、1043-1059和1074-1092的组的氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％，更优选地95％，最优选地100％的同一性。该组的每个序列对应于Euprosthenops australis MaSp1蛋白质的天然存在的序列的区段，该天然存在的序列从克隆相应的cDNA推断得来，参见WO2007/078239。可选择地，每个单独的G区段与选自SEQ ID NO:3的氨基酸残基153-173、187-203、219-232、248-264和279-296的组的氨基酸序列具有至少80％，优选地至少90％，更优选地95％，最优选地100％的同一性。该组的每个序列对应于表达的、非天然蜘蛛丝蛋白的区段，所述蛋白具有在合适的条件下形成丝结构的能力。因此，每个单独的G区段可与选自上述氨基酸区段的氨基酸序列相同。
G区段存在三种亚型。该分类是基于对Euprosthenops australis MaSp1蛋白质序列的仔细分析(WO 2007/078239)，并已在构建新颖、非天然蜘蛛丝蛋白中使用并验证了该信息。
G区段的第一种亚型由单字母氨基酸共有序列GQG(G/S)QGG(Q/Y)GG(L/Q)GQGGYGQGAGSS(SEQ ID NO:11)代表。该第一种且通常是最长的G区段亚型通常包含23个氨基酸残基，但是可包含少至17个氨基酸残基，且缺少带电荷的残基或包含一个带电荷的残基。因此，该第一种G区段亚型通常包含17-23个氨基酸残基，但设想其可包含少至12个或多至30个氨基酸残基。该第一种亚型的代表性G区段是SEQ ID NO:10的氨基酸残基20-42、84-106、148-170、212-234、307-329、371-393、435-457、530-552、595-617、689-711、753-775、817-839、881-903、946-968、1043-1059和1074-1092。在某些实施方案中，该第一种亚型的每个G区段的前两个氨基酸残基不是-Gln-Gln-。
G区段的第二种亚型由单字母氨基酸共有序列：GQGGQGQG(G/R)Y GQG(A/S)G(S/G)S(SEQ ID NO:12)代表。该第二种通常是中间尺寸的G区段亚型通常包含17个氨基酸残基且缺少带电荷的残基或包含一个带电荷的残基。该第二种G区段亚型通常包含14-20个氨基酸残基，但设想其可包含少至12个或更多至30个氨基酸残基。该第二种亚型的代表性G区段是SEQ ID NO:10的氨基酸残基249-265、471-488、631-647和982-998；及SEQ ID NO:3的氨基酸残基187-203。
G区段的第三种亚型由单字母氨基酸共有序列：G(R/Q)GQG(G/R)YGQG(A/S/V)GGN(SEQ ID NO:13)代表。该第三种G区段亚型通常包含14个氨基酸残基，且通常是G区段亚型中最短的。该第三种G区段亚型通常包含12-17个氨基酸残基，但设想其可包含多至23个氨基酸残基。该第三种亚型的代表性G区段是SEQ ID NO:10的氨基酸残基57-70、121-134、184-197、280-293、343-356、407-420、503-516、567-580、662-675、726-739、790-803、854-867、918-931、1014-1027；及SEQ ID NO:3的氨基酸残基219-232。
因此，在优选的实施方案中，每个单独的G区段与选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少80％，优选地90％，更优选95％的同一性。
在REP部分的A和G区段的交替序列的优选实施方案中，每隔一个G区段为第一种亚型，而剩余的G区段为第三种亚型，例如...A1G短A2G长A3G短A4G长A5G短...。在REP部分的另一个优选实施方案中，第二种亚型的一个G区段通过插入而中断G区段的规律性，例如...A1G短A2G长A3G中A4G短A5G长...。
每个单独的L区段代表可包含0至20个氨基酸残基，例如从0至10个氨基酸残基的任选的接头氨基酸序列。在从Euprosthenops australis的MaSp1蛋白质推断的氨基酸序列的重复部分(SEQ ID NO:10)中也存在接头氨基酸序列。特别地，接头区段的氨基酸序列可能与所描述的A或G区段的任何一种相似，但是通常不足以满足本文对其定义的标准。
代表性L区段是SEQ ID NO:10的氨基酸残基1-6和1093-1110；及SEQ ID NO:3的氨基酸残基138-142，但是本领域技术人员将易于认识到存在这些区段的许多合适的替代氨基酸序列。在REP部分的一个实施方案中，L区段中的一个包含0个氨基酸，即缺少L区段中的一个。在REP部分的另一个实施方案中，两个L区段都包含0个氨基酸，即不含这两个L区段。因此，REP部分的这些实施方案可示意性地表示如下：(AG)nL、(AG)nAL、(GA)nL、(GA)nGL；L(AG)n、L(AG)nA、L(GA)n、L(GA)nG；和(AG)n、(AG)nA、(GA)n、(GA)nG。
融合蛋白不包括任何衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的部分，即其与重复的蜘蛛丝蛋白片段具有低程度的(或没有)同一性和/或相似性。根据本发明的融合蛋白的序列优选地与本文公开的重复的拖丝蛋白氨基酸序列的任一种，且具体地与SEQ ID NO:10-13的任一种，具有小于30％的同一性、诸如小于20％的同一性、优选小于10％的同一性。
B部分是包含多于30个氨基酸残基的蛋白或多肽片段。B部分优选地包含多于50个氨基酸残基，诸如多于100个氨基酸残基。B部分优选地包含少于1000个氨基酸残基，诸如少于400个氨基酸残基、更优选地少于300个氨基酸残基。其能够与有机靶选择性相互作用，且融合蛋白中是B部分提供与有机靶选择性相互作用的能力。
B部分是非拖丝蛋白部分。这是意指，其不是衍生自蜘蛛丝蛋白，即，其与蜘蛛丝蛋白具有低(或无)程度的同一性和/或相似性。根据本发明的B部分的序列优选地与本文公开的拖丝蛋白氨基酸序列的任一种、具体地与SEQ ID NO:6-10的任一种具有少于30％同一性、诸如少于20％同一性、优选地少于10％同一性。
选择B部分被认为是在本领域普通技术人员能力范围内的。然而，以下为了示例起见，提供了可证明用作B部分的亲和配体的实例、以及用于检测和/或定量的形式和条件的实例。
选择亲和配体所需的生物分子多样性可通过组合改造多个可能的支架分子之一来产生，然后利用适当的选择平台选择特异性和/或选择性亲和配体。可用于针对有机靶产生亲和配体的此类结构的非限制性实例是葡萄球菌蛋白A和其结构域、和这些结构域的衍生物，诸如Z结构域(Nord K等人.(1997)Nat.Biotechnol.15:772-777)；脂笼蛋白(Beste G等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:1898-1903)；锚蛋白重复结构域(Binz HK等人(2003)J.Mol.Biol.332:489-503)；纤维素结合结构域(CBD)(Smith GP等人(1998)J.Mol.Biol.277:317-332；Lehtio J等人(2000)Proteins 41:316-322)；γ晶体蛋白(crystallines)(Fiedler U和Rudolph R,WO01/04144)；绿色荧光蛋白(GFP)(Peelle B等人.(2001)Chem.Biol.8:521-534)；人类细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)(HuftonSE等人.(2000)FEBS Lett.475:225-231；Irving RA等人.(2001)J.Immunol.Meth.248:31-45)；蛋白酶抑制剂，诸如Knottin蛋白(Wentzel A等人.(2001)J.Bacteriol.183:7273-7284；Baggio R等人.(2002)J.Mol.Recognit.15:126-134)和Kunitz结构域(Roberts BL等人.(1992)Gene 121:9-15；Dennis MS和Lazarus RA(1994)J.Biol.Chem.269:22137-22144)；PDZ结构域(Schneider S等人.(1999)Nat.Biotechnol.17:170-175)；肽适体，诸如硫氧还蛋白(Lu Z等人.(1995)Biotechnology 13:366-372；Klevenz B等人.(2002)Cell.Mol.Life Sci.59:1993-1998)；葡萄球菌核酸酶(Norman TC等人.(1999)Science285:591-595)；淀粉酶抑肽(McConell SJ和Hoess RH(1995)J.Mol.Biol.250:460-479；LiR等人.(2003)Protein Eng.16:65-72)；基于纤连蛋白III型结构域的trinectins(Koide A等人.(1998)J.Mol.Biol.284:1141-1151；Xu L等人.(2002)Chem.Biol.Biol.9:933-942)；锌指(Bianchi E等人.(1995)J.Mol.Biol.247:154-160；Klug A(1999)J.Mol.Biol.293:215-218；Segal DJ等人.(2003)Biochemistry 42:2137-2148)；adnectin；anticalin；DARPin；affilin和avimer。
上述实例包括展现用于产生新的结合特异性的单个随机化环的支架蛋白，具有其中从蛋白表面突出的侧链被随机化以产生新的结合特异性的刚性二级结构的蛋白支架，和展现用于产生新的结合特异性的非连续高变性环区的支架。
寡核苷酸也可用作亲和配体。称为适体或诱饵(decoy)的单链核酸，折叠为充分确定的三维结构并以高的亲和性和特异性结合其靶。(Ellington AD和Szostak JW(1990)Nature 346:818-822；Brody EN和Gold L(2000)J.Biotechnol.74:5-13；Mayer G和JenneA(2004)BioDrugs 18:351-359)。寡核苷酸配体可以是RNA或DNA，并可结合宽范围的靶分子种类。
对于从上述支架结构的任一种的变体池选择期望的亲和配体，大量选择平台可用于分离针对所选靶蛋白的特定新配体。筛选平台包括但不限于，噬菌体展示(Smith GP(1985)Science 228:1315-1317)、核糖体展示(Hanes J和Pltickthun A(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:4937-4942)、酵母双杂交系统(Fields S和Song 0(1989)Nature 340:245-246)、酵母展示(Gai SA和Wittrup KD(2007)Curr Opin Struct Biol17:467-473)、mRNA展示(Roberts RW和Szostak JW(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:12297-12302)、细菌展示(Daugherty PS(2007)Curr Opin Struct Biol 17:474-480，Kronqvist N等人.(2008)Protein Eng Des Sel 1-9，Harvey BR等人.(2004)PNAS 101(25):913-9198)、微珠展示(Nord O等人.(2003)J Biotechnol 106:1-13，WO01/05808)、SELEX(配体指数富集的系统进化(System Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment))(Tuerk C和Gold L(1990)Science 249:505-510)和蛋白片段互补检验(PCA)(Remy I和Michnick SW(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:5394-5399)。对免疫球蛋白、白蛋白或其它有机靶具有亲和性的B部分的优选的组是细菌receptin结构域或其衍生物。
优选的B部分的组能够与免疫球蛋白和包含免疫球蛋白或其衍生物，例如IgG的可结晶片段(fragment crystallisable，Fc)区域的分子，选择性相互作用。免疫球蛋白亚类的优选的组是被衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域识别的亚类，即，来自人类的IgG1、IgG2、IgG4、IgA和IgM、来自兔和牛的所有Ig亚类、来自豚鼠的IgG1和IgG2、和来自小鼠的IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM(参见Hober,S.等人,J.Chromatogr B.848:40-47(2007))、更优选地来自人类的免疫球蛋白亚类IgG1、IgG2、IgG4、IgA和IgM。Z结构域是葡萄球菌蛋白A的免疫球蛋白G(IgG)的结合结构域B的工程化的形式，且是58个氨基酸长的结合IgG的Fc区域的三-螺旋基序。免疫球蛋白亚类的另一优选的组是被C2结构域链球菌蛋白G识别的亚类；即，IgG的所有人类亚类，包括IgG3、和来自多种动物，包括小鼠、兔和绵羊的IgG。
优选的B部分的一个组选自以下组成的组：衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域、葡萄球菌蛋白A和其结构域，优选地E、D、A、B或C结构域、链球菌蛋白G和其结构域，优选地C1、C2和C3结构域；和与这些氨基酸序列的任一种具有至少70％同一性、诸如至少80％同一性、或至少90％同一性的蛋白片段。优选地，B部分选自以下组成的组：衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域、葡萄球菌蛋白A的B结构域、和链球菌蛋白G的C2结构域；和与这些氨基酸序列的任一种具有至少70％同一性、诸如至少80％同一性、或至少90％同一性的蛋白片段。优选地，B部分选自以下组成的组：衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域、和与这一氨基酸序列具有至少70％同一性、诸如至少80％同一性、或至少90％同一性的蛋白片段。优选地，B部分选自以下组成的组：衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域和链球菌蛋白G的C2结构域。对免疫球蛋白具有亲和性的B部分的优选的组是细菌receptin结构域或其衍生物。
优选的B部分的另一组能够与白蛋白和包含白蛋白的分子或其衍生物选择性相互作用。对白蛋白具有亲和性的B部分的优选的组是细菌receptin结构域或其衍生物。优选的B部分选自链球菌蛋白G、链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域、来自大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)的GA模块；和与这些氨基酸序列的任一种具有至少70％同一性、诸如至少80％同一性、或至少90％同一性的蛋白片段。优选地，B部分选自链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域、和与其具有至少70％同一性、诸如至少80％同一性、或至少90％同一性的蛋白片段。优选地，B部分是链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域。
优选的B部分的另一组能够与生物素和包含生物素的分子或其衍生物或类似物选择性相互作用。优选的B部分选自以下组成的组：链霉亲和素、单体链霉亲和素(M4)；和与这些氨基酸序列的任一种具有至少70％同一性、诸如至少80％同一性、或至少90％同一性的蛋白片段。优选地，B部分是单体链霉亲和素(M4)。
优选的B部分的另一组是酶，能够与底物选择性相互作用以进行酶催化的反应。优选的酶的B部分包括木聚糖酶和溶菌酶。
优选的B部分的另一组是生长因子，能够刺激细胞生长。优选的生长因子的B部分包括表皮生长因子(EGF)，特别是人EGF，成纤维细胞生长因子2(FGF2)，神经生长因子1(NGF1)和间质细胞衍生的因子1(SDF1)。根据本发明的具体融合蛋白和蛋白结构在实施例中提供。这些优选的融合蛋白形成由SEQ ID NO 61-66、68、70、72、74、76、80、82、84和86组成的组。另外优选的融合蛋白与这些序列的任一种具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％的同一性。
本发明还提供编码根据本发明的融合蛋白的分离的核酸。具体地，具体的核酸在实施例和所附的序列表中提供。另外优选的核酸编码与SEQ ID NO 61-66、68、70、72、74、76、80、82、84和86的任一种具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％的同一性的融合蛋白。
根据本发明的核酸可用于产生根据本发明的融合蛋白。本发明提供了制备融合蛋白的方法。第一步骤包括在合适的宿主中表达根据本发明的融合蛋白。合适的宿主是本领域技术人员熟知的且包括，例如细菌和真核细胞，例如酵母、昆虫细胞系和哺乳动物细胞系。通常，该步骤包括在大肠杆菌中表达编码该融合蛋白的核酸分子。
方法的第二步骤包括获得包含该融合蛋白的混合物。混合物可例如通过裂解或机械破坏宿主细胞获得。如果宿主细胞分泌融合蛋白，还可通过收集细胞培养基获得混合物。可使用标准方法分离由此获得的蛋白质。如需要的话，该混合物可进行离心，并收集合适的部分(沉淀或上清液)。包含融合蛋白的混合物还可进行凝胶过滤、层析例如阴离子交换层析、透析、相分离或过滤以导致分离。任选地，脂多糖和其它热原在该阶段被有效地去除。如需要的话，可在该步骤中通过裂解去除接头肽。
根据本发明的蛋白结构、或格式在适当的条件下从根据本发明的融合蛋白自发地组装，并且组装为聚合物由剪切力和/或两个不同相之间的界面的存在而促进，所述界面例如，固相与液相之间、气相与液相之间、或在疏水/亲水界面，例如，矿物油-水界面。所得的界面的存在刺激在界面或在界面周围区域中聚合，该区域延伸进入液体介质，从而所述聚合在所述界面或在所述界面区域中开始。通过修改组装期间的条件，可产生多种蛋白结构。例如，如果允许组装在从一侧向一侧轻微摆动的容器中发生，则在空气-水界面形成纤维。如果允许混合物静置，则在空气-水界面形成膜。如果蒸发混合物，则在容器底部形成膜。如果向含水混合物的顶部加入油，则在油-水界面形成膜，无论允许静置或摆动。如果混合物起泡沫，例如，通过鼓入空气或甩动，如果允许干燥，则泡沫是稳定的并固化。
如此，本发明提供用于提供展示对有机靶的结合活性的蛋白结构的方法。在第一方法步骤中，提供了根据本发明的重组融合蛋白。融合蛋白可例如，通过在适当的宿主中从根据本发明的核酸表达来提供。在第二方法步骤中，对融合蛋白进行实现形成包含重组融合蛋白的聚合物的条件。注意，尽管自发地组装的蛋白结构可在六氟异丙醇中溶解，溶解的融合蛋白随后不能够自发地再次组装为例如，纤维。
蛋白结构可用作固定有机靶的亲和性介质的部分，其中B部分能够与该有机靶选择性相互作用。样品，例如，生物样品可施加到能够结合该生物样品中存在的有机靶的根据本发明的融合蛋白或蛋白结构，然后融合蛋白或蛋白结构可用于从样品分离有机靶。可对已经从受治疗者取出的生物样品，诸如血液、血清或血浆进行有机靶的检测、分离和/或定量。
如此，本发明提供从样品分离有机靶的方法。提供了包含有机靶的样品，例如，生物样品，诸如血液、血清或血浆。生物样品可以是较早获得的样品。如果在方法中使用较早获得的样品，方法的步骤都不是对人类或动物体进行的。
提供了根据本发明的亲和性介质，其包含根据本发明的融合蛋白或蛋白结构。在某些实施方案中，亲和性介质由根据本发明的融合蛋白或蛋白结构组成。亲和性介质能够借助根据本发明的融合蛋白中的B部分与有机靶选择性相互作用。在实现亲和性介质与有机靶之间结合的适当条件下将亲和性介质与样品接触。在保持亲和性介质与有机靶之间选择性结合的适当条件下除去未结合的样品。这一方法导致有机靶被固定于根据本发明的亲和性介质，具体地被固定于融合蛋白。
在根据本发明的优选的方法中，当亲和性介质与样品接触以实现亲和性介质与有机靶之间的结合时，亲和性介质中的融合蛋白作为根据本发明的蛋白结构存在。
在这一方面，特别有用的蛋白结构是膜或纤维，其中B部分是衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域或与其具有至少70％同一性，诸如至少80％同一性、或至少90％同一性的蛋白片段。膜是有利的，因为其粘附于固体支持物，例如，微量滴定板中的塑料制品。膜的这一特征有助于洗涤和再生程序，对于分离目的是非常有用的。
已经令人惊讶地观察到，当作为根据本发明的蛋白结构中的根据本发明的融合蛋白的部分时，Z结构域的碱稳定性可甚至被增强。这一特征对于洗涤和再生目的可以是非常有用的，例如，允许高浓度的NaOH，诸如0.1M、0.5M、1M或甚至高于1M，例如，2M，和/或允许高浓度的脲，例如，6-8M。化学稳定性还可用于允许为了亲和纯化反复周期地使用Z结构域。这一碱稳定性可通过利用Z结构域的稳定的突变体来进一步增加。另外，已经有利地显示，包括Z结构域的根据本发明的融合蛋白是热稳定的。这允许加热灭菌并保持固体蛋白格式/结构以及结合能力。
具有Z结构域的传统亲和性基质的一个已知问题是Z结构域从亲和性基质的泄漏。由于Z结构域被肽键稳定地掺入本发明的融合蛋白中，预计Z结构域从根据本发明的蛋白结构的不期望的泄露是低的或不存在。根据本发明的融合蛋白的另一优点是，所得的蛋白结构具有高密度的Z结构域(或其它B部分)。预计这一高密度提供高结合能力。总之，融合蛋白的这些特征对于多种B部分是非常有吸引力的，尤其是对于以良好的生产经济使用蛋白Z的亲和纯化。这些特征在以传统凝胶珠亲和柱以外的形式也是有用的，例如，以滤器样的形式。
固定的有机靶能够与第二有机靶选择性相互作用。然后该方法还包括在实现第一和第二有机靶之间的结合的适当条件下，将所述亲和性介质和固定的有机靶与第二有机靶接触的步骤，第二有机靶能够与第一有机靶选择性相互作用。
固定的有机靶是可检测和/或可定量的。有机靶的检测和/或定量可以以本领域技术人员已知用于检测和/或定量结合试剂的任何方式、以基于多种生物或非生物相互作用的检验实现。有机靶本身可以用多种标志物标记，或可转而由第二、标记的亲和配体检测以允许检测、可视化和/或定量。这可使用许多标记的任何一种或更多种实现，所述标记可与有机靶或任何第二亲和配体轭合，使用本领域技术人员已知的许多技术的任何一种或更多种实现，如此不牵涉任何过度的实验。可与有机靶和/或第二亲和配体轭合的标记的非限制性实例包括，荧光染料或金属(例如，荧光素、罗丹明、藻红蛋白、荧光胺)、发色染料(例如，视紫质)、化学发光化合物(例如，鲁米那、咪唑)和生物发光蛋白(例如，萤光素、萤光素酶)、半抗原(例如，生物素)。多种其它可用的荧光团和发色团描述在Stryer L(1968)Science162:526-533，Brand L和Gohlke JR(1972)Annu.Rev.Biochem.41:843-868。有机靶和/或第二亲和配体还可用酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-内酰胺酶)、放射性同位素(例如，3H、14C、32P、35S或125I)和颗粒(例如，金)标记。在本公开内容的上下文中，"颗粒"是指适于标记分子的颗粒，诸如金属颗粒。另外，亲和配体还可用荧光半导体纳米晶体(量子点)标记。量子点具有极佳的量子产量，比有机荧光团更耐光，因此更容易检测(Chan等人.(2002)Curr Opi Biotech.13:40-46)。不同类型的标记可使用多种化学反应轭合于有机靶或第二亲和配体，例如，胺反应或硫醇反应。然而，可使用胺和硫醇以外的其它反应基团，例如，醛、羧酸和谷氨酰胺。
如果检测和/或定量包括暴露于第二有机靶或第二亲和配体，再次用缓冲液洗涤亲和性介质以除去未结合的第二亲和配体。举例来说，第二亲和配体可以是抗体或其片段或衍生物。之后，可以用常规方法检测和/或定量有机靶。对第二亲和配体的结合特征可以变化，但本领域技术人员将能够通过常规实验确定对每种确定有效和最佳的检验条件。
标记的分子的检测、定位和/或定量可包括可视化技术，诸如光显微术或免疫荧光显微术。其它方法可包括经由流式细胞术或发光测定法检测。标记可视化的方法可包括但不限于，荧光测定、发光测定和/或酶促技术。荧光通过如下检测和/或定量：将荧光标记暴露于特定波长的光，之后检测和/或定量特定波长区域中的发射光。发光标记的分子的存在可由在化学反应期间发生的发光检测和/或定量。酶反应的检测是由于化学反应导致的样品的色移。本领域技术人员知晓，为了适当的检测和/或定量，可修改多种不同的实验方案。
用于检测和/或定量有机靶的一种可得的方法是通过将其或第二亲和配体与酶连接，随后可在酶免疫测定(诸如EIA或ELISA)中检测和/或定量该酶。此类技术是充分建立的，其实现对本领域技术人员不产生任何过度的困难。在此类方法中，将生物样品与结合有机靶的根据本发明的蛋白结构接触，然后用酶促标记的第二亲和配体检测和/或定量。之后，在适当的缓冲液中，将适当的底物与酶促标记反应产生化学部分，例如使用分光光度计、荧光计、光度计或通过可见手段检测和/或定量。
有机靶或第二亲和配体可用放射性同位素标记以使得能够检测和/或定量。本公开内容中适当的放射性标记的非限制性实例是3H、14C、32P、35S或125I。标记的亲和配体的比活性依赖于放射性标记的半衰期、同位素纯度，和标记如何被掺入亲和配体。亲和配体优选地使用公知技术标记(Wensel TG和Meares CF(1983)于:Radioimmunoimaging andRadioimmunotherapy(Burchiel SW和Rhodes BA编著)Elsevier,New York,pp 185-196中)。如此放射性标记的亲和配体可用于通过检测放射性显现有机靶。放射性核素扫描可用以下进行，例如，γ射线照相机、磁共振光谱学、发射断层照相术、γ射线/β射线计数器、闪烁计数器和放射照相术。
如此，可向蛋白结构施加样品以检测、分离和/或定量有机靶。这一程序使得能够不仅检测有机靶，而且另外可显示其分布和相对水平。任选地，可从亲和性介质释放有机靶并收集。如此，用途可包括在其上已经固定有机靶的亲和性介质上亲和纯化。蛋白结构可例如布置在柱中或多孔板(诸如96孔板)中、或在磁珠、琼脂糖珠或sepharose珠上。另外，用途可包括蛋白结构在可溶基质上的用途，例如使用葡聚糖基质，或在表面等离子共振仪器诸如BiacoreTM仪器中的用途，其中分析可例如包括监测对固定的有机靶或多种可能的亲和配体的亲和性。
根据本发明的蛋白结构可被洗涤并用多种清洁剂，包括酸、碱和离液剂再生。尤其有用的清洁剂包括NaOH，诸如0.1、0.5或1M NaOH，和脲，诸如6-8M脲。由于根据本发明的蛋白结构令人惊讶地耐受化学处理和/或灭菌性热处理，包括使用蛋白结构的根据本发明的方法可包括再生蛋白结构的最终步骤。方法优选地包括通过化学处理和/或灭菌性热处理再生亲和性介质的最终步骤。优选地，化学处理包括用NaOH，诸如0.1、0.5或1M NaOH、和/或脲，诸如6-8M脲处理。
根据本发明的融合蛋白还可被允许在溶液中结合有机靶，即，在允许融合蛋白聚合并形成蛋白结构诸如膜、泡沫或纤维之前。拖丝蛋白衍生部分(例如，CT)本身和掺入B部分的相应的融合蛋白二者聚合为固体结构，即使在污染蛋白存在时，而没有明显地将污染物掺入材料中，且功能(B)部分保留其预期的结合特征。因此，预计B部分的结合特征可用于从周围溶液捕获化合物或细胞，并将捕获的化合物或细胞掺入根据本发明的蛋白结构之中或之上。
如此，在根据本发明的另一优选的方法中，当将亲和性介质与样品接触以实现亲和性介质与有机靶之间的结合时，亲和性介质中的融合蛋白在溶液中存在。然后允许融合蛋白结合有机靶的复合体形成根据本发明的融合蛋白结构。
当目的是从溶液"捞出"特定分子或细胞时，这一方法可以是尤其有用的，例如，在分泌了靶蛋白时从大规模真核细胞生产系统的培养基获得靶分子。由于由拖丝蛋白衍生部分结合靶分子和形成固体结构可以在生理条件发生且由于拖丝蛋白衍生部分是细胞相容的，该方法可重复地应用于进行中的生产过程。
根据本发明的蛋白结构还可用于细胞的分离、固定和/或培养。在这方面尤其有用的蛋白结构是膜、纤维或泡沫。膜是有利的，因为其粘附于固体结构，例如，微量滴定板中的塑料制品。膜的这一特征有助于洗涤和再生程序，对于选择性检测和分离目的是非常有用的。
如此，本发明提供用于培养具有存在于细胞表面的有机靶的细胞的细胞支架材料。细胞支架材料包括根据本发明的蛋白结构。在某些实施方案中，细胞支架材料由根据本发明的蛋白结构构成。
本发明人已经发现，包括包含根据本发明的融合蛋白、和任选地由根据本发明的融合蛋白构成的聚合物的细胞支架材料提供在多种不同情况中培养细胞、优选地真核细胞的有益环境。此外，该环境使得能够建立以其他方式建立非常困难、非常昂贵或甚至不可能在实验室中培养的细胞培养物，并且用于建立对组织工程和/或移植有用的包含细胞的材料。
本发明还提供细胞、优选地真核细胞与根据本发明的细胞支架材料的组合。根据本发明的该组合可以各种不同的形式呈现，并被调整为适合特定情况的需要。应设想，例如，本发明的组合作为用于替代受损或患病组织中的细胞的含细胞植入物可以是有用的。
细胞支架材料可用于直接或间接地捕获细胞。在直接捕获中，B部分能够与存在于细胞表面上的有机靶选择性相互作用。可选地，B部分能够与中间有机靶(intermediateorganic target)选择性相互作用并结合，且中间有机靶能够与存在于细胞表面上的有机靶选择性相互作用。如此，在间接捕获中，细胞支架材料还包含中间有机靶，且B部分能够与所述中间有机靶选择性相互作用并结合。反过来，中间有机靶能够与存在于细胞表面上的有机靶选择性相互作用。
在本文公开的细胞支架材料的一个实施方案中，所述融合蛋白还包含寡肽细胞结合基序。结合某些情况中某些细胞的培养，已发现寡肽细胞结合基序的存在提高或维持细胞存活，且认为将该基序作为蜘蛛丝蛋白的一部分纳入到细胞支架材料中提供另外的益处。细胞结合基序是通过至少一个肽键偶联到融合蛋白的剩余部分的寡肽。例如，其可被偶联到融合蛋白的剩余部分的N端或C端，或蜘蛛丝蛋白的剩余部分的氨基酸序列内的任何位置。关于寡肽细胞结合基序的选择，技术人员知晓几种替代方案。可由技术人员使用标准的基因工程或化学偶联技术容易地实现寡肽细胞结合基序与蜘蛛丝蛋白的剩余部分的偶联。因此，在某些实施方案中，细胞结合基序通过基因工程引入，即，在编码融合蛋白和细胞结合基序的核酸之间形成部分基因融合。作为这些实施方案的一个额外的有益特征，细胞结合基序将与组成细胞支架材料的聚合物中的融合蛋白单体以1:1的比例存在。
用于本文描述的方法或组合中的细胞支架材料中的聚合物可采取多种物理形态，且特定物理形态的使用可在不同的具体情况中提供另外的优点。例如，在这些方法或组合的实施方案中，所述细胞支架材料处于选自由膜、泡沫、胶囊、纤维和纤维网(fiber-mesh)组成的组的物理形态。
因此，本发明提供用于固定细胞的方法。提供包含目标细胞的样品例如，生物样品，诸如血液。生物样品可以是较早获得的样品。如果在方法中使用较早获得的样品，方法的步骤都不是对人类或动物体进行的。
在允许细胞支架材料与存在于目标细胞表面上的有机靶之间选择性相互作用的适当条件下，将样品施加于根据本发明的细胞支架材料。允许细胞通过细胞表面上的有机靶与所述细胞支架材料之间的结合固定于所述细胞支架材料。在适当条件下去除未结合的样品以维持细胞支架材料与有机靶之间的选择性结合。这一方法产生展示被固定于细胞支架材料、具体地固定于根据本发明的蛋白结构的有机靶的细胞。
如上所述，细胞支架材料可用于直接或间接地捕获细胞。在直接捕获中，B部分能够与存在于细胞表面上的有机靶选择性相互作用。可选地，B部分能够与中间有机靶选择性相互作用并结合，且中间有机靶能够与存在于细胞表面上的有机靶选择性相互作用。如此，在间接捕获中，细胞支架材料还包含中间有机靶，且B部分能够与所述中间有机靶选择性相互作用并结合。反过来，中间有机靶能够与存在于细胞表面上的有机靶选择性相互作用。
无论捕获方法，可通过裂解融合蛋白以从细胞支架材料释放参与细胞捕获的部分，从融合蛋白释放捕获的细胞。如上所述，融合蛋白可在其氨基酸序列中包括允许裂解并去除相关部分，通常是B部分或细胞结合基序的裂解位点。多种裂解位点是本领域技术人员已知的，例如，针对化学剂的裂解位点，例如Met残基之后的CNBr裂解位点和Asn-Gly残基之间的羟胺裂解位点，针对蛋白酶例如凝血酶或蛋白酶3C的裂解位点，和自我剪接序列，例如内蛋白(intein)自我剪接序列。
本发明还提供用于培养细胞的方法。使用上文公开的方法将目标细胞固定于细胞支架材料。在适于细胞培养的条件下保持细胞支架材料与固定的细胞的组合。
在本发明的上下文中，术语细胞的“培养”、“细胞培养”等应被广义地理解，使得它们包括例如细胞分裂和/或增殖的情况，细胞被保持在保留了该细胞类型当存在于其天然环境时所显示出的至少一种功能特征的分化状态的情况以及干细胞被保持在未分化状态的情况。
根据另一个方面，本发明提供了包括CT部分和至少一个NT部分的新颖的重组蛋白，条件是该蛋白不包括任何衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的部分。在一个优选的实施方案中，蛋白包括1-2个NT部分。
在一个优选的实施方案中，重组蛋白由CT部分和至少一个NT部分，如1-2个NT部分构成。蛋白可被示意地书写成NT-CT、CT-NT、NTNT-CT、CT-NTNT或NT-CT-NT，且优选NT-CT或NTNT-CT。
根据本发明的优选的重组蛋白选自SEQ ID NO:59-60；和与这些序列的任一种具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％的同一性的蛋白组成的组。本发明还提供编码根据本发明的重组蛋白的分离的核酸。
这种蛋白缺少蜘蛛丝蛋白的重复片段，且因此令人惊讶的，它仍然能够形成固体蛋白结构，例如纤维和膜。本重组蛋白的优点在于，相比CT单独或含有REP但缺乏NT的相应的蛋白，其可以以较高的产量来制备，参见例如实施例1-2。
本发明提供了一种蛋白质结构，其是包括根据此方面的重组蛋白作为重复结构单元的聚合物。蛋白结构优选地在至少两个维度上具有至少0.1μm的尺寸。蛋白结构优选地是以选自由纤维、膜、泡沫、网状物、网、球和胶囊组成的组的物理形态。
因为此重组蛋白不包括任何衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的部分，其与重复的蜘蛛丝蛋白片段具有低程度的(或没有)同一性和/或相似性。根据本发明的蛋白的序列优选地与本文公开的重复的拖丝蛋白氨基酸序列的任一种，且具体地与SEQ ID NO:10-13的任一种，具有小于30％的同一性、诸如小于20％的同一性、优选小于10％的同一性。
以下将通过下列非限制性实例进一步说明本发明。
实施例
实施例1-NT-CT的克隆、表达和纤维形成
为了研究CT共价地连接到NT是否可以形成纤维，产生和纯化了NT-CT融合蛋白(NT部分和CT部分)。
克隆
构建了编码His6NT-CT融合蛋白(SEQ ID NO:59)的基因。将载体转化到化学感受态的大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)BL21(DE3)细胞中，允许该细胞在补充有卡那霉素(70μg/ml)的琼脂板上生长。之后挑取菌落，PCR筛选正确的插入物，且随后还测序证实了DNA序列。
产生
将具备pT7His6NTCT载体的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在30℃在补充有卡那霉素(70μg/ml)的Luria-Bertani培养基(共6升)中生长至OD600值为1-1.5，随后用300μΜIPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)诱导表达，且在20℃另外培养大约2h。然后，通过在4700rpm离心20min来收获细胞，且将所得的细胞团溶解在20mM Tris(pH 8.0)中。
纯化
对20mM Tris(pH 8.0)中溶解的细胞团补充溶菌酶和DNA酶I以裂解细菌细胞，从而在15000rpm离心30min后回收细胞溶解产物。然后，将回收的细胞溶解产物分开并上样到共四种Chelating Sepharose Fast Flow Zn2+柱，经由His6标签保持蛋白结合于柱基质。洗涤后，用20mM Tris/300mM咪唑(pH 8.0)洗脱结合的蛋白。NTCT的产量通常高于CT或Rep4CT的产量。然后，将合并的洗脱液在5升的20mM Tris(pH 8.0)中透析过夜，浓缩至1mg/ml，并最终使得形成纤维或膜。如果pH降低至低于pH 6.4，纤维形成更快。
可以得到His6NTCT的宏观纤维的事实表明，当融合至NT时，CT保持其纤维形成特征。
实施例2-NTNT-CT的克隆、表达和纤维形成
为了研究尽管共价地连接到NTNT的CT是否可以形成纤维，产生和纯化了NTNT-CT融合蛋白(NTNT部分和CT部分)。
克隆
构建了编码His6NTNT-CT融合蛋白(SEQ ID NO:60)的基因。将载体转化到化学感受态的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，允许该细胞在补充有卡那霉素(70μg/ml)的琼脂板上生长。之后挑取菌落，PCR筛选正确的插入物，且随后还测序证实了DNA序列。
产生
将具备pT7His6NTNTCT载体的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在30℃在补充有卡那霉素(70μg/ml)的Luria-Bertani培养基(共6升)中生长至OD600值为1-1.5，随后用300μΜIPTG诱导表达，且在20℃另外培养大约2h。然后，通过在4700rpm离心20min来收获细胞，且将所得的细胞团溶解在20mM Tris(pH 8.0)中。
纯化
对20mM Tris(pH 8.0)中溶解的细胞团补充溶菌酶和DNA酶I以裂解细菌细胞，从而在15000rpm离心30min后回收细胞溶解产物。然后，将回收的细胞溶解产物分开并上样到共四种Chelating Sepharose Fast Flow Zn2+柱，经由His6标签保持蛋白结合于柱基质。洗涤后，用20mM Tris/300 mM咪唑(pH 8.0)洗脱结合的蛋白。NTNTCT的产量通常高于CT或Rep4CT的产量。然后，将合并的洗脱液在5升的20mM Tris(pH 8.0)中透析过夜，浓缩至1mg/ml，并最终使得形成纤维或膜。如果pH降低至低于pH 6.4，纤维形成更快。
可以得到His6NTNTCT的宏观纤维的事实表明，当融合至NTNT时，CT保持其纤维形成特征。
实施例3-IgG-结合CT融合蛋白的克隆、表达和纤维形成
为了证明融合蛋白概念，产生了与Z蛋白结构域(B部分)融合的CT蛋白(CT部分)。Z结构域是葡萄球菌蛋白A的免疫球蛋白G(IgG)结合结构域B的工程化的形式，且是结合IgG的可结晶片段(Fc)区域的58个氨基酸长的三螺旋基序。目的是研究是否可能从Z结构域与CT融合组成的融合蛋白产生结构，诸如纤维、膜和薄膜，并仍保持结构域Z的IgG-结合能力、以及CT的结构形成特征。为了如此，克隆了由Z结构域N端地或C端地融合于CT组成的融合蛋白。
克隆
构建了编码His6ZCT和His6CTZ融合蛋白(SEQ ID NO:61-62)的基因，并转化到化学感受态的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，允许该细胞在补充有卡那霉素(70μg/ml)的琼脂板上生长。之后挑取菌落，PCR筛选正确的插入物，且随后还测序证实了正确的DNA序列。
产生
将具备pT7His6ZCT或pT7His6CTZ载体的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在30℃在补充有卡那霉素(70μg/ml)的Luria-Bertani培养基(共6升)中生长至OD600值为1-1.5，随后用300μΜIPTG诱导His6ZCT或His6CTZ的表达，且在20℃另外培养大约2h。然后，通过在4700rpm离心20min来收获细胞，且将所得的细胞团溶解在20mM Tris(pH 8.0)中。
纯化
对20mM Tris(pH 8.0)中溶解的细胞团补充溶菌酶和DNA酶I以裂解细菌细胞，从而在15000rpm离心30min后回收细胞溶解产物。然后，将回收的细胞溶解产物分开并上样到共四种Chelating Sepharose Fast Flow Zn2+柱，经由His6标签保持His6ZCT蛋白结合于柱基质。洗涤后，用20mM Tris/300mM咪唑(pH 8.0)洗脱结合的蛋白。然后，将合并的洗脱级分在5升的20mM Tris(pH 8.0)中透析过夜，浓缩至1mg/ml，并最终使得形成纤维。
分析
为了探索融合蛋白结构中B部分与有机靶选择性相互作用的能力，研究了融合蛋白中的结构域Z结合IgG的能力。该融合蛋白的纤维和膜用于结合纯化的IgG和来自血清的IgG，伴随洗脱和随后的在SDS-PAGE上的分析，其中在非还原条件下的IgG显示为～146kDa的条带。
实施例4-IgG-结合NTCT融合蛋白的克隆、表达和纤维形成
为了证明融合蛋白概念，产生了与Z蛋白结构域(B部分)融合的NT-CT蛋白(NT和CT部分)。目的是研究是否可能从Z结构域与NTCT融合组成的融合蛋白产生结构，诸如纤维、膜和薄膜，并仍保持结构域Z的IgG-结合能力、以及CT的结构形成特征。为了如此，克隆了由Z结构域N端地或C端地融合于NTCT组成的融合蛋白。
克隆
构建了编码His6ZNTCT和His6NTCTZ融合蛋白(SEQ ID NO:63-64)的基因，并转化到化学感受态的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，允许该细胞在补充有卡那霉素(70μg/ml)的琼脂板上生长。之后挑取菌落，PCR筛选正确的插入物，且随后还测序证实了正确的DNA序列。
产生
将具备pT7His6ZNTCT和pT7His6NTCTZ载体的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在30℃在补充有卡那霉素(70μg/ml)的Luria-Bertani培养基(共6升)中生长至OD600值为1-1.5，随后用300μΜIPTG诱导表达，且在20℃另外培养大约2h。然后，通过在4700rpm离心20min来收获细胞，且将所得的细胞团溶解在20mM Tris(pH 8.0)中。
纯化
对20mM Tris(pH 8.0)中溶解的细胞团补充溶菌酶和DNA酶I以裂解细菌细胞，从而在15000rpm离心30min后回收细胞溶解产物。然后，将回收的细胞溶解产物分开并上样到共四种Chelating Sepharose Fast Flow Zn2+柱，经由His6标签保持His6ZNTCT或His6NTCTZ蛋白结合于柱基质。洗涤后，用20mM Tris/300mM咪唑(pH 8.0)洗脱结合的蛋白。将合并的洗脱级分在5升的20mM Tris(pH 8.0)中透析过夜，浓缩至1mg/ml，并最终使得形成纤维。
分析
为了探索融合蛋白结构中B部分与有机靶选择性相互作用的能力，研究了融合蛋白中的结构域Z结合IgG的能力。该融合蛋白的纤维和膜用于结合纯化的IgG和来自血清的IgG，伴随洗脱和随后的在SDS-PAGE上的分析，其中在非还原条件下的IgG显示为～146kDa的条带。
实施例5-IgG-结合NTNTCT融合蛋白的克隆、表达和纤维形成
为了证明融合蛋白概念，产生了与Z蛋白结构域(B部分)融合的NTNT-CT蛋白(NTNT和CT部分)。目的是研究是否可能从Z结构域与NTNTCT融合组成的融合蛋白产生结构，诸如纤维、膜和薄膜，并仍保持结构域Z的IgG-结合能力、以及CT的结构形成特征。为了如此，克隆了由Z结构域N端地或C端地融合于NTNTCT组成的融合蛋白。
克隆
构建了编码His6ZNTNTCT和His6NTNTCTZ融合蛋白(SEQ ID NO:65-66)的基因，并转化到化学感受态的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，允许该细胞在补充有卡那霉素(70μg/ml)的琼脂板上生长。之后挑取菌落，PCR筛选正确的插入物，且随后还测序证实了正确的DNA序列。
产生
将具备pT7His6ZNTNTCT和pT7His6NTNTCTZ载体的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在30℃在补充有卡那霉素(70μg/ml)的Luria-Bertani培养基(共6升)中生长至OD600值为1-1.5，随后用300μΜIPTG诱导表达，且在20℃另外培养大约2h。然后，通过在4700rpm离心20min来收获细胞，且将所得的细胞团溶解在20mM Tris(pH 8.0)中。
纯化
对20mM Tris(pH 8.0)中溶解的细胞团补充溶菌酶和DNA酶I以裂解细菌细胞，从而在15000rpm离心30min后回收细胞溶解产物。然后，将回收的细胞溶解产物分开并上样到共四种Chelating Sepharose Fast Flow Zn2+柱，经由His6标签保持His6ZNTNTCT或His6NTNTCTZ蛋白结合于柱基质。洗涤后，用20mM Tris/300mM咪唑(pH 8.0)洗脱结合的蛋白。然后，将合并的洗脱级分在5升的20mM Tris(pH 8.0)中透析过夜，浓缩至1mg/ml，并最终使得形成纤维。
分析
为了探索融合蛋白结构中B部分与有机靶选择性相互作用的能力，研究了融合蛋白中的结构域Z结合IgG的能力。该融合蛋白的纤维和膜用于结合纯化的IgG和来自血清的IgG，伴随洗脱和随后的在SDS-PAGE上的分析，其中在非还原条件下的IgG显示为～146kDa的条带。
实施例6-ABD-NTCT和ABD-CT融合蛋白的固体结构的克隆、表达和形成
产生了与衍生自链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域(ABD)融合的NTCT和CT。ABD是结合到白蛋白的5kDa的三螺旋基序。目的是研究从由分别融合至NTCT(表示为His6-ABD-NTCT，SEQ ID NO:68)和CT(表示为His6-ABD-CT，SEQ ID NO:70)的ABD结构域组成的融合蛋白，是否有可能产生如纤维和膜的结构，并仍保持ABD结构域的白蛋白结合能力，以及NTCT和CT的结构形成特征。为了如此，克隆了ABD结构域N端地融合至NTCT和CT组成的两种融合蛋白。
克隆
如下构建了编码His6-ABD-CT融合蛋白(SEQ ID NO:70)的基因(SEQ ID NO:69)。设计引物，以从含有这种ABD序列的载体中产生结构域ABD的PCR片段。此外，引物包含用于限制性内切酶NdeI和EcoRI的识别位点。然后将得到的PCR产物以及靶载体(表示为pAff8His6TrxHis6CT，包含卡那霉素抗性基因)用限制性内切酶NdeI和EcoRI处理。在限制性裂解靶载体后，His6TrxHis6部分被切掉。裂解的PCR片段和靶载体在T4DNA连接酶的辅助下被连接在一起，随后将得到的正确连接的载体(pT7His6-ABD-CT)转化到化学感受态的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，允许该细胞在补充有卡那霉素(50μg/ml)的琼脂板上生长。之后挑取菌落，并筛选正确的插入物，且随后测序证实了进入靶载体的插入的ABD的DNA序列。
以对His6-ABD-CT描述的相同的方式构建了编码His6ABD-NTCT融合蛋白(SEQ IDNO:68)的基因(SEQ ID NO:67)的克隆，但靶载体在此表示为pT7His6scFv1-NTCT，其中以NdeI和EcoRI处理后，pT7His6scFv1部分被切掉。正确连接的载体被表示为pT7His6ABD-NTCT。
产生
将具备pT7His6-ABD-CT载体的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在30℃在补充有卡那霉素(50μg/ml)的Luria-Bertani培养基(共3升)中生长至OD600值为1-1.5，随后用300μΜIPTG诱导pT7His6-ABD-CT的表达，且在14℃另外培养大约17h。然后，通过在4700rpm离心20min来收获细胞，且将所得的细胞团溶解在20mM Tris(pH 8.0)中。
以如对His6ABD-CT描述的相同的方式进行His6ABD-NTCT的生产。
纯化
对20mM Tris(pH 8.0)中溶解的细胞团补充溶菌酶和DNA酶I以裂解细菌细胞，随后添加终浓度分别为200mM和10mM的NaCl和咪唑。离心30min(15000rpm)后回收细胞溶解产物。然后，将回收的细胞溶解产物上样到Chelating Sepharose Fast Flow Zn2+柱，经由His6标签保持His6-ABD-CT蛋白结合于柱基质。洗涤后，用20mM Tris/200mM咪唑(pH8.0)/300mM NaCl洗脱结合的蛋白。按照A280测量，洗脱液包含28.8mg的His6-ABD-CT蛋白。然后，将洗脱的蛋白对3升20mM Tris(pH 8.0)透析过夜，且其后浓缩到1.48mg/ml，产生最终数量为6.216mg的His6-ABD-CT融合蛋白。
对His6-ABD-NTCT进行相同的纯化步骤。His6-ABD-NTCT的洗脱浓度为1.76mg/ml，且获得了最终数量为35.2mg的融合蛋白。
膜和纤维形成
以每膜15μl 1mg/ml可溶融合蛋白在96孔板(组织培养板，悬浮细胞，83.1835.500,Sarstedt)中浇铸His6-ABD-CT的膜。然后使膜固化过夜(20℃，35％相对湿度)。进行相同的步骤，用于以15μl 1mg/ml蛋白溶液浇铸His6-ABD-NTCT的膜。
还分别从His6ABD-CT和His6ABD-NTCT两者从1.76和1.06mg/ml的可溶融合蛋白制备了纤维。图3a显示了His6-ABD-NTCT融合蛋白(SEQ ID NO：68)的显微纤维照片，而图3b显示了His6-ABD-CT融合蛋白(SEQ ID NO：70)的显微纤维照片。虽然CT或NTCT已被融合于另一种蛋白，即46个氨基酸长的ABD结构域，可获得His6ABD-CT和His6ABD-NTCT两者的宏观纤维的事实，表明尽管被融合到ABD结构域，CT和NTCT保留其结构形成特征。
分析
为了评估ABD-NTCT膜结合白蛋白的能力，人血血浆用作白蛋白的来源。ABD-NTCT和ABD-CT的四种膜以150μl 1xPBS进行了预润湿，随后在室温下以100μl人血血浆(1：5稀释)温育30分钟。以200μl 1xPBS洗涤三次后，用洗脱缓冲液(即0.5M乙酸、1M脲、100mMNaCl)通过降低pH至约2.7在50μl中洗脱结合的白蛋白，其后洗脱级分通过非还原性SDS-PAGE分析。NTCT和CT的膜作为对照材料，并以相同的方式处理。
图4显示了来自人血血浆的白蛋白与ABD-NTCT和ABD-CT膜结合后洗脱的级分的非还原性SDS-PAGE凝胶。凝胶按照以下上样：
(1-4)ABD-NTCT膜一式四份，上样14μl；
(5-8)ABD-CT膜一式四份，上样14μl；
(9)蛋白分子量标志；
(10-13)NTCT(对照)膜一式四份；
(14-16)CT(对照)膜一式三份；
(17)人血血清(1:50)，上样8μl。
ABD-NTCT和ABD-CT的所有膜与来自人血血浆白蛋白结合(图4，泳道1-8)。由于仅一个单一的白蛋白条带(～65kDa)出现在ABD-NTCT和ABD-CT膜的洗脱级分中，它们表现为没有非特异性结合来自人血血浆的其它任何。NTCT和CT的对照膜在洗脱级分中不显示任何白蛋白(图4，泳道10-16)。推断，ABD结构域在与NTCT和CT的融合蛋白的宏观固体结构中是功能性的。
实施例7-M4-NTCT和M4-CT融合蛋白的固体结构的克隆、表达和形成
产生了分别与NTCT和CT蛋白融合的单体链霉亲和素(M4)结构域。M4结构域是四聚体链霉亲和素的突变形式，且是与生物素非共价地结合的159个氨基酸长的蛋白结构域。我们的目的是研究从由分别融合至NTCT(表示为His6-M4-NTCT，SEQ ID NO:72)和CT(表示为His6-M4-CT，SEQ ID NO:74)的M4结构域组成的融合蛋白，是否有可能产生如膜、泡沫和纤维的结构，并仍保持M4结构域的生物素结合能力，以及NTCT和CT的结构形成特征。为了如此，克隆了M4结构域N端地融合于NTCT和CT组成的两种融合蛋白。
克隆
如实施例6中阐述的构建了编码His6-M4-CT融合蛋白(SEQ ID NO:74)的基因(SEQID NO:73)，但设计了引物，以便从含有这样的M4序列的载体产生结构域M4的PCR片段。靶载体被表示为pAff8His6TrxHis6CT，其中在用NdeI和EcoRI处理后His6TrxHis6部分被切掉。正确连接的载体被表示为pT7His6M4-CT。
以对His6-M4-CT描述的相同的方式构建了编码His6-M4-NTCT融合蛋白(SEQ IDNO:72)的基因(SEQ ID NO:71)的克隆，但靶载体在此表示为pT7His6scFv1-NTCT，其中以NdeI和EcoRI处理后，pT7His6scFv1部分被切掉。正确连接的载体被表示为pT7His6M4-NTCT。
产生
如实施例6中描述的相同的方式进行了His6M4-CT和His6M4-NTCT的产生。
纯化
如实施例6中描述的相同的方式进行了His6M4-CT和His6M4-NTCT的纯化。
洗脱液含有3.6mg的His6M4-CT蛋白。蛋白浓缩至1.39mg/ml后，获得了最终数量为0.834mg的His6M4-CT融合蛋白。
His6M4-NTCT蛋白的洗脱液含量为3.2mg。蛋白浓缩至1.14mg/ml后，获得了最终数量为1.368mg的His6M4-NTCT融合蛋白。
膜、泡沫和纤维形成
如在实施例6中描述的浇铸His6M4-CT和His6M4-NTCT的膜。从1.14mg/ml可溶融合蛋白制备His6-M4-NTCT的纤维(图5a)。从30μl的1.39mg/ml可溶融合蛋白制备His6-M4-CT的泡沫(图5b)。虽然NTCT或CT已被融合至另一个蛋白，即159个氨基酸长的M4结构域，但可获得His6-M4-NTCT和His6-M4-CT的膜、纤维和泡沫的事实，表明尽管被融合到M4结构域，NTCT和CT保留其结构形成特征。
分析
His6-M4-NTCT和His6-M4-CT的布点膜分别含有0.34nmole和0.50nmole的靶蛋白分子。为了评价两个丝融合M4构建体的生物素结合能力，选择了每个构建体的两个膜，并通过与相等数量的Atto-565-生物素温育，相比存在于膜中的靶蛋白分子的量被分析。然后除去标记的生物素，并且将膜用100μl 1xPBS洗涤三次。最后，向膜中加入100μl 1xPBS后，使用倒置的Nikon Eclipse Ti设备(在563nm激发，在592nm发射)荧光显微镜分析。NTCT(0.55nmole)和CT(10.28nmole)的膜用作对照材料，并以相同的方式进行处理。
M4-NTCT和M4-CT膜含有单体链霉亲和素(M4)，其具有结合至生物素的固有亲和力。因为在分析中使用了标记的生物素，生物素对膜的结合可以在上面所指出的波长通过荧光显微镜检测。图6显示了在2x放大的Atto-565-生物素结合到M4-NTCT和M4-CT膜的荧光显微镜照片。A：M4-NTCT；B：NTCT；C：M4-CT和D：CT。只能从图6(A、C)中M4-NTCT和M4-CT膜观察到荧光，但不能从对照膜中观察到(B、D)。这证实，尽管被融合至NTCT和CT，M4保留了生物素结合能力。
实施例8-scFv1-NTCT和scFv1-CT融合蛋白的固体结构的克隆、表达和形成
生产了与命名为单链片段可变(scFv1)的工程化抗体片段融合的NTCT和CT。scFv1是27-kDa的单价、工程化的抗体片段，其识别特异于自身免疫疾病，全身性红斑狼疮(SLE)的抗原。我们的目的是研究从由分别融合至NTCT(表示为His6-scFv1-NTCT，SEQ ID NO:76)和CT(表示为His6-scFv1-CT，SEQ ID NO:78)的scFv1蛋白组成的融合蛋白，是否有可能产生如纤维、泡沫和膜的结构，并仍保持scFv1结构域的抗原检测能力，以及NTCT和CT的结构形成特征。为了如此，克隆了由scFv1结构域N端地融合于NTCT和CT组成的两种融合蛋白。
克隆
如实施例6中阐述的构建了编码His6-scFv1-CT融合蛋白(SEQ IDNO:78)的基因(SEQ ID NO:77)，但设计了引物，以便从含有这样的scFv1序列的载体产生结构域scFv1的PCR片段。靶载体被表示为pAff8His6TrxHis6CT，其中在用NdeI和EcoRI处理后His6TrxHis6部分被切掉。正确连接的载体被表示为pT7His6scFv1-CT。
以对His6-scFv1-CT描述的相同的方式构建了编码His6-scFv1-NTCT融合蛋白(SEQID NO:76)的基因(SEQ ID NO:75)的克隆，但用于NTCT扩增的引物包含用于限制性内切酶EcoRI和HindIII的位点，且靶载体在此表示为T7His6ScFv1-RepCT，其中以EcoRI和HindIII处理后，RepCT部分被切掉。正确连接的载体被表示为pT7His6scFv1-NTCT。
产生
如实施例6中描述的相同的方式进行了His6-scFv1-CT和His6-scFv1-NTCT的产生，除了pT7His6-scFv1-NTCT在总体积6升的培养基中进行产生。
纯化
如实施例6中描述的相同的方式进行了His6-scFv1-CT和pHis6-scFv1-NTCT的纯化。
洗脱液含有0.93mg的His6-scFv1-CT蛋白。蛋白浓缩至0.87mg/ml后，获得了最终数量为0.348mg的His6-scFv1-CT融合蛋白。
His6-scFv1-NTCT蛋白的洗脱液含量为4.86mg。蛋白浓缩至2.14mg/ml后，获得了最终数量为2.57mg的His6-scFv1-NTCT融合蛋白。
膜、泡沫和纤维形成
将来自每膜1μl的5μM可溶融合蛋白的His6-scFv1-CT的膜布点到微阵列载玻片(plastic MaxiSorp,Nunc)上。然后使膜在气候控制室固化过夜。进行相同的步骤，用于以1μl的5μM蛋白溶液浇铸His6-scFv1-NTCT的膜。
从0.49mg/ml可溶融合蛋白制备His6-scFv1-NTCT的纤维(数据未显示)，并分别从30μl的0.22和0.38mg/ml的可溶融合蛋白制备His6-scFv1-NTCT和His6-scFv1-CT两者的泡沫(图7a和7b)。虽然NTCT或CT已被融合至另一个蛋白，即263个氨基酸长的scFv1结构域，但可分别获得His6-scFv1-NTCT和His6-scFv1-CT的宏观纤维和泡沫的事实，表明尽管被融合到scFv1结构域，NTCT和CT仍保留其结构形成特征。
分析
通过将1μl 5μM蛋白质溶液添加到干净、黑色的聚合物Maxisorp微阵列载玻片(NUNC，25x76mm)上，将纯抗体(scFvl，对照)和丝融合抗体(scFv1-NTCT)手动地布点在微阵列格式中，在布点膜中分别得到135pmole纯抗体(scFv1)和274pmole丝融合抗体(scFv1-NTCT)。将蛋白布点在膜的格式中后，将膜在气候受控室中干燥过夜。然后通过应用200μl样品缓冲液(在PBS中的1％(w/v)无脂奶粉和1％(v/v)吐温20)90min封闭阵列，且然后通过应用200-300μl洗涤缓冲液(在PBS中0.05％(v/v)吐温20)洗涤三次。所有温育在室温下以温和搅拌进行。接着，应用100-200μl稀释于样品缓冲液的生物素化的抗原样品(10nM)并温育1h。然后通过应用200-300μl洗涤缓冲液洗涤阵列三次，及为了检测结合的抗原，将100-200μl Alexa-647标记的链霉亲和素(1μg/ml)稀释于样品缓冲液中，应用于阵列上并温育1h。最后，以200-300μl洗涤缓冲液将阵列洗涤三次，并在氮气流中干燥。然后使用共焦微阵列荧光扫描仪(ScanArray Express,Perkin-Elmer Life&Analytical Sciences)扫描阵列。使用ScanArray Express软件V2.0(Perkin-Elmer Life&Analytical Sciences)以定量每个斑点的强度。对于分析His6-scFv1-CT融合蛋白，进行相同的分析程序。
为了检测可以是潜在的生物标志物的低丰度血清蛋白，将scFv1N端地融合到NTCT或CT，分别得到His6-scFv1-NTCT和His6-scFv1-CT。将纯抗体(对照)和丝融合抗体片段布点到微阵列载玻片上，且使用生物素化的抗原样品分析其抗原结合能力。然后使用Alexa-647标记的链霉亲和素检测结合的抗原。图8显示了纯的(对照)和丝融合抗体片段的抗原结合分析。在5090检测强度测量斑点的强度。分析表明，相比单独scFv1对照，丝融合抗体片段(His6-scFv1-NTCT)的抗原识别增加了25倍，且没有观察到His6-scFv1-NTCT与其它抗原交叉反应的迹象。
实施例9-木聚糖酶-NTCT和木聚糖酶-CT融合蛋白的固体结构的克隆、表达和形成
为了证明与NTCT和CT融合的蛋白具有酶活性的概念，制备来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的酶木聚糖酶A分别与NTCT和CT融合。木聚糖酶A(内-1,4-β-木聚糖酶A)是185个氨基酸长(无信号肽)，且属于糖基水解酶11(纤维素G)家族。木聚糖酶A的酶功能是裂解木聚糖的β-1,4糖苷键，木聚糖是植物细胞壁中半纤维素的主要成分。我们的目的是研究从由分别融合至NTCT(表示为Xyl-NTCT，SEQ ID NO:80)和CT(表示为Xyl-CT，SEQ IDNO:82)的木聚糖酶A组成的融合蛋白，是否有可能产生如纤维、泡沫和膜的结构，并仍保持木聚糖酶的酶活性，以及CT的结构形成特征。为了如此，克隆了由木聚糖酶N端地融合至1)NTCT和2)CT的两种融合蛋白。
克隆
如实施例6中阐述的构建了编码His6Xyl-CT融合蛋白(SEQ ID NO:82)的基因(SEQID NO:81)，但设计了引物，以便从含有这样的木聚糖酶序列的载体产生木聚糖酶结构域的PCR片段。靶载体被表示为pAff8His6TrxHis6CT，其中在用NdeI和EcoRI处理后His6TrxHis6部分被切掉。正确连接的载体被表示为pT7His6Xyl-CT。
以对His6Xyl-CT描述的相同的方式构建了编码His6-Xyl-NTCT融合蛋白(SEQ IDNO:80)的基因(SEQ ID NO:79)的克隆，但靶载体在此表示为pT7His6ScFv1-NTCT，其中以NdeI和EcoRI处理后，pT7His6scFv1部分被切掉。正确连接的载体被表示为pT7His6Xyl-NTCT。
产生
如实施例6中描述的相同的方式进行了His6Xyl-CT和His6Xyl-NTCT的产生。
纯化
如实施例6中描述的相同的方式进行了His6Xyl-CT和His6Xyl-NTCT的纯化。
洗脱液含有3.6mg的His6Xyl-CT蛋白。蛋白浓缩至2.1mg/ml后，获得了最终数量为2mg的His6Xyl-CT融合蛋白。
His6Xyl-NTCT蛋白的洗脱液含量为4.3mg。蛋白浓缩至0.65mg/ml后，获得了最终数量为0.3mg的His6Xyl-NTCT融合蛋白。
膜、泡沫和纤维形成
将His6Xyl-CT的膜浇铸在96孔板(组织培养板，悬浮细胞，83.1835.500,Sarstedt)中。每个膜由15μl 1.0mg/ml可溶His6Xyl-CT在pH 8和pH 6两者制成。然后使膜固化过夜(20℃，35％相对湿度)。进行相同的步骤，用于浇铸His6Xyl-NTCT的膜，每个膜从15μl 0.41mg/ml可溶His6Xyl-NTCT浇铸(pH 8和pH 6两者)。
从可溶的His6Xyl-CT(1-2mg/ml)通过将空气引入(通过吹打)40μl蛋白溶液制备泡沫，随后在室温下过夜干燥。His6Xyl-CT形成的泡沫的外观(图9)，表明尽管被融合到Xyl结构域，CT保留其结构形成特征。
图9显示了融合蛋白His6Xyl-CT(SEQ ID NO:82)的宏观泡沫，由可溶融合蛋白制备。泡沫的外观表明，尽管与酶木聚糖酶(Xyl)融合产生，蜘蛛丝CT结构域保留其结构形成特征。
融合至NTCT或CT的木聚糖酶的酶活性的分析
木聚糖酶是裂解两个木糖残基之间的β-1,4-糖苷键的酶。为了测试融合至NTCT或CT的木聚糖酶(Xyl)的膜中的酶促能力，His6Xyl-CT和His6Xyl-NTCT的每个膜与90μlMcllvaine缓冲液(pH 6.0)一起温育。在50℃下所有膜预温育10min后，加入10μl 40mM PNX(对-硝基苯基-吡喃木糖苷)底物，接着在50℃再温育至少10min。然后，向每个膜加入100μl终止溶液(0.5M Na2CO3)，接着在410nm吸光度测量以鉴定来自酶反应的产物。NTCT和CT的膜，按照前述相同的方法浇铸，被包括作为对照。
实施例10-木聚糖酶-NTCT和木聚糖酶-CT融合蛋白的固体结构的克隆、表达和形 成
为了证明与NTCT和CT融合的肽具有细胞刺激作用的概念，制备人表皮生长因子(EGF)分别与NTCT和CT融合。EGF是53个氨基酸残基长的生长因子，对许多细胞类型的细胞例如角质形成细胞表面上发现的表皮生长因子受体(EGFR)具有高亲合性。结合EGFR后，蛋白-酪氨酸激酶活性被刺激，导致细胞中各种生物化学变化，引发细胞的生长和增殖。我们的目的是研究从由分别融合至NTCT(表示为EGF-NTCT，SEQ ID NO:84)和CT(表示为EGF-CT，SEQ ID NO:86)的EGF组成的融合蛋白，是否有可能产生如纤维和膜的结构，并仍保持EGF的细胞刺激作用，以及CT的结构形成特征。为了如此，克隆了由EGF N端地融合至1)NTCT和2)CT的两种融合蛋白。
克隆
如实施例6中阐述的构建了编码His6EGF-CT融合蛋白(SEQ ID NO:86)的基因(SEQID NO:85)，但设计了引物，以便从含有这样的EGF序列的载体产生EGF的PCR片段。靶载体被表示为pAff8His6TrxHis6CT，其中在用NdeI和EcoRI处理后His6TrxHis6部分被切掉。正确连接的载体被表示为pT7His6EGF-CT。
以对His6EGF-CT描述的相同的方式构建了编码His6EGF-NTCT融合蛋白(SEQ IDNO:84)的基因(SEQ ID NO:83)的克隆，但靶载体在此表示为pT7His6ScFv1-NTCT，其中以NdeI和EcoRI处理后，pT7His6ScFv1部分被切掉。正确连接的载体被表示为pT7His6EGF-NTCT。
产生
如实施例6中描述的相同的方式进行了His6EGF-CT和His6EGF-NTCT的产生。
纯化
如实施例6中描述的相同的方式进行了His6EGF-CT和His6EGF-NTCT的纯化。
膜和纤维形成
如实施例6中所述的，制备His6EGF-CT和His6EGF-NTCT两者的膜和纤维。
融合至NTCT或CT的EGF的细胞刺激能力的分析
研究了当与CT(标记为His6EGF-CT)或NTCT(标记为His6EGF-NTCT)融合时，EGF对角质形成细胞的细胞刺激能力。为了这个目的，分别使用了融合蛋白His6EGF-CT和His6EGF-NTCT的膜。将正常人表皮角质形成细胞(原代细胞)以3500或7000细胞/cm2的密度接种到基质上，在含有或没有重组人EGF的细胞培养基(KGM-GOLD，Lonza)中。培养基每隔一天更换。24、48、72和96小时后，将生活的和死细胞以活/死测定(Molecular probes)染色。在10x放大的倒置荧光显微镜(Nikon Eclipse Ti)中拍摄显微照片。

Claims (47)

1.一种重组融合蛋白，所述重组融合蛋白包括B部分和CT部分，其中：
B是非拖丝蛋白部分，其提供与有机靶选择性相互作用的能力，其中所述B部分选自由以下组成的组：衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域、和葡萄球菌蛋白A的E、D、A、B和C结构域、链球菌蛋白G、和链球菌蛋白G的C1、C2和C3结构域；链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域、来自大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)的GA模块；链霉亲和素、单体链霉亲和素；和与这些氨基酸序列的任一种具有至少70％同一性的蛋白片段；以及酶；并且所述B部分与SEQ ID NO 6-10的任一种具有少于30％的同一性；且
CT是从70至120个氨基酸残基的部分，并衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段，所述CT部分与SEQ ID NO:9具有至少50％的同一性或与SEQ ID NO:7具有至少80％的同一性，且提供形成聚合物的能力；
条件是所述重组融合蛋白不包括任何衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段的部分。
2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述有机靶选自免疫球蛋白和包含免疫球蛋白或其衍生物的分子组成的组。
3.根据权利要求2所述的重组融合蛋白，其中所述免疫球蛋白选自来自人类的免疫球蛋白亚类IgG1、IgG2、IgG4、IgA和IGM。
4.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述B部分选自衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域、和葡萄球菌蛋白A的E、D、A、B和C结构域、链球菌蛋白G、和链球菌蛋白G的C1、C2和C3结构域；和与这些氨基酸序列的任一种具有至少70％同一性的蛋白片段组成的组。
5.根据权利要求4所述的重组融合蛋白，其中所述B部分选自衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域、葡萄球菌蛋白A的B结构域、和链球菌蛋白G的C2结构域；和与这些氨基酸序列的任一种具有至少70％同一性的蛋白片段组成的组。
6.根据权利要求5所述的重组融合蛋白，其中所述B部分选自衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域和链球菌蛋白G的C2结构域组成的组。
7.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述有机靶选自白蛋白和包含白蛋白或其衍生物的分子组成的组。
8.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述B部分选自链球菌蛋白G、链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域、来自大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)的GA模块；和与这些氨基酸序列的任一种具有至少70％同一性的蛋白片段。
9.根据权利要求8所述的重组融合蛋白，其中所述B部分包括链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域、和与其具有至少70％同一性的蛋白片段。
10.根据权利要求9所述的重组融合蛋白，其中所述B部分是链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域。
11.根据权利要求1的重组融合蛋白，其中所述有机靶选自生物素和包含生物素或其衍生物或类似物的分子组成的组。
12.根据权利要求11所述的重组融合蛋白，其中所述B部分选自链霉亲和素、单体链霉亲和素；和与这些氨基酸序列的任一种具有至少70％同一性的蛋白片段组成的组。
13.根据权利要求12所述的重组融合蛋白，其中所述B部分是单体链霉亲和素。
14.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，所述重组融合蛋白选自由式BX-CT-BZ所定义的蛋白的组，
其中x和z是从0到5的整数；
且x+z≥1。
15.根据权利要求14所述的重组融合蛋白，所述重组融合蛋白选自由式BX-CT和CT-BZ所定义的蛋白的组，其中x和z是从1到5的整数。
16.根据权利要求15所述的重组融合蛋白，所述重组融合蛋白选自由式B-CT和CT-B所定义的蛋白的组。
17.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，所述重组融合蛋白选自由SEQ ID NO:61-66；和与这些序列的任一种具有至少80％同一性的蛋白组成的组。
18.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码根据权利要求1-17中任一项所述的重组融合蛋白。
19.根据权利要求18所述的分离的核酸，所述分离的核酸选自由编码根据权利要求17所述的重组融合蛋白的核酸组成的组。
20.一种能够与有机靶选择性相互作用的蛋白结构，其中所述蛋白结构是包含根据权利要求1-17中任一项所述的重组融合蛋白作为重复结构单元的聚合物，其中所述B部分提供与所述有机靶选择性相互作用的能力。
21.根据权利要求20所述的蛋白结构，其中所述蛋白结构在至少两个维度上具有至少0.1μm的尺寸。
22.根据权利要求20-21中任一项所述的蛋白结构，其中所述蛋白结构是以选自由纤维、膜、泡沫、网状物、球和胶囊组成的组的物理形态。
23.根据权利要求1-17中任一项所述的重组融合蛋白用于产生能够与有机靶选择性相互作用的蛋白结构的用途，其中所述蛋白结构是包含所述重组融合蛋白作为重复结构单元的聚合物，且其中所述B部分提供与所述有机靶选择性相互作用的能力。
24.根据权利要求20-22中任一项所述的蛋白结构在从样品分离有机靶中的用途。
25.根据权利要求20-22中任一项所述的蛋白结构在细胞培养中的用途。
26.一种产生重组融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在适当的宿主中表达根据权利要求1-17任一项所述的重组融合蛋白；及
b)获得包含所述重组融合蛋白的混合物。
27.根据权利要求26所述的方法，所述方法还包括分离所述重组融合蛋白。
28.一种提供根据权利要求20-22中任一项所述的蛋白结构的方法，所述蛋白结构展示对有机靶的结合活性，所述方法包括以下步骤：
(a)提供根据权利要求1-17中任一项所述的重组融合蛋白；
(b)将所述重组融合蛋白经受实现包含所述重组融合蛋白的聚合物的形成的条件。
29.一种用于固定有机靶的亲和性介质，所述亲和性介质包含根据权利要求1-17中任一项所述的重组融合蛋白，其中所述B部分能够与所述有机靶选择性相互作用。
30.根据权利要求29所述的亲和性介质，所述亲和性介质包含根据权利要求20-22中任一项所述的蛋白结构，所述蛋白结构是包含所述重组融合蛋白的聚合物。
31.根据权利要求29-30中任一项所述的亲和性介质，所述亲和性介质还包含所述有机靶，其中所述B部分能够与所述有机靶选择性相互作用并结合。
32.根据权利要求31所述的亲和性介质，其中所述有机靶能够与第二有机靶选择性相互作用。
33.一种用于培养细胞的细胞支架材料，所述细胞具有存在于细胞表面上的有机靶，所述细胞支架材料包含根据权利要求20-22中任一项所述的蛋白结构。
34.根据权利要求33所述的细胞支架材料，其中所述B部分能够与存在于所述细胞表面上的所述有机靶选择性相互作用。
35.根据权利要求33所述的细胞支架材料，其中所述细胞支架材料还包含中间有机靶，其中所述B部分能够与所述中间有机靶选择性相互作用并结合，且其中所述中间有机靶能够与存在于所述细胞表面上的所述有机靶选择性相互作用。
36.细胞与根据权利要求33-35中任一项所述的细胞支架材料的组合。
37.一种从样品分离有机靶的方法，所述方法包括以下步骤：
提供包含所述有机靶的样品；
提供根据权利要求29-32中任一项所述的亲和性介质，其中所述亲和性介质能够与所述有机靶选择性相互作用；
在实现所述亲和性介质与所述有机靶之间的结合的适当条件下将所述亲和性介质与所述样品接触；和
除去未结合的样品。
38.根据权利要求37所述的方法，所述方法还包括在实现固定的有机靶与第二有机靶之间的结合的适当条件下将所述亲和性介质和固定的有机靶与所述第二有机靶接触的步骤，所述第二有机靶能够与所述固定的有机靶选择性相互作用。
39.根据权利要求37-38中任一项所述的方法，其中当将所述亲和性介质与所述样品接触以实现所述亲和性介质与所述有机靶之间的结合时，所述亲和性介质中的所述重组融合蛋白以如根据权利要求20-22中任一项所述的蛋白结构存在。
40.根据权利要求37-38中任一项所述的方法，其中当将所述亲和性介质与所述样品接触以实现所述亲和性介质与所述有机靶之间的结合时，所述亲和性介质中的所述重组融合蛋白在溶液中存在，且其中允许所述重组融合蛋白与所述有机靶结合的复合体形成根据权利要求20-22中任一项所述的蛋白结构。
41.根据权利要求37所述的方法，所述方法还包括检测所述亲和性介质上的固定的靶的存在的步骤。
42.根据权利要求41所述的方法，所述方法还包括定量所述亲和性介质上的固定的靶的存在的步骤。
43.根据权利要求37所述的方法，所述方法还包括从所述亲和性介质释放和收集所述有机靶的步骤。
44.根据权利要求37所述的方法，所述方法还包括通过化学处理和/或灭菌热处理再生所述亲和性介质的最后步骤。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述化学处理包括用NaOH和/或脲处理。
46.一种固定细胞的方法，所述方法包括
提供包含目标细胞的样品；
将所述样品应用到根据权利要求33-35中任一项所述的细胞支架材料，其中所述细胞支架材料能够与存在于细胞表面上的有机靶选择性相互作用；和
通过所述细胞表面上的所述有机靶与所述细胞支架材料之间的结合，允许所述细胞固定于所述细胞支架材料。
47.一种用于培养细胞的方法，所述方法包括
根据权利要求39所述的方法固定目标细胞到细胞支架材料；和
在适合细胞培养的条件下保持已对其应用细胞的所述细胞支架材料。
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