CN111094326A

CN111094326A - 用于产生丝融合蛋白的浓缩粘合相的方法

Info

Publication number: CN111094326A
Application number: CN201880045931.XA
Authority: CN
Inventors: M.林德; P.穆罕默迪; S.阿朗科
Original assignee: Aalto Korkeakoulusaatio sr
Current assignee: Aalto Korkeakoulusaatio sr
Priority date: 2017-06-13
Filing date: 2018-06-13
Publication date: 2020-05-01
Also published as: US20200325188A1; WO2018229341A1; EP3638689A1; US11597750B2

Abstract

本发明涉及生产丝融合蛋白的浓缩相的方法，该方法包括以下步骤：在水性介质中制备丝融合蛋白的溶液，并在所述水性介质中浓缩所述丝融合蛋白，其中所述融合蛋白是从重组生产宿主中分离得到的并且包含丝状蛋白序列和位于所述丝状蛋白序列的侧翼的两个单独的非丝末端模块序列，如纤维素结合模块、SpyCatcher结构域、纤连蛋白的第十个III型模块、γ‑晶体蛋白D；其中进行该方法以使所述丝融合蛋白不被沉淀并随后溶解于所述水性介质中。本发明还涉及使用这种融合蛋白作为粘合剂。

Description

用于产生丝融合蛋白的浓缩粘合相的方法

发明领域

本发明涉及重组蜘蛛丝蛋白的产生以及该蛋白质在材料、生物技术和医学领域中的用途。本发明特别涉及这样的应用，其涉及复合材料(composite material)、纺织品、过滤器、生物医学涂层(coating)、伤口敷料(wound dressing)、药物释放材料、细胞支架、粘合剂等的制备。

发明背景

丝和丝状蛋白(silk-like protein)是在许多不同生物中发现的一大类蛋白质，它们在其中扮演着各种不同的角色。一个非常著名的实例是家养的蚕蛾(silk moth)家蚕(Bombyx mori)，其在工业规模上用于生产丝纤维。当制作网(webs)时¹，相关的丝蛋白由例如蜘蛛产生。另外，其他生物，例如贻贝在其壳中产生丝状蛋白作为珍珠结构(nacreousstructures)的一部分²。由于非常期望天然材料中的丝状蛋白的结构性质，因此对于制备丝状蛋白存在很大的工业兴趣。一种预想是·在特定应用中或大规模生产上工业生产的丝状蛋白可以替代当前的合成或其他天然聚合物。尽管家蚕丝被广泛使用，但其使用和工业规模扩大(scale-up)仍存在局限性。出于可扩展性和工艺(process)方面的考虑，期望使用可在生物反应器中生长的重组生物或细胞以产生丝状蛋白。还期望生产非天然发现形式的丝状蛋白，以制备新型的丝状聚合物材料³。

在文献中，通过重组产生的丝蛋白形成纤维的问题已得到充分地记载。本发明涉及将重组产生的丝蛋白加工成这样状态的一般问题，例如可以从所述状态中制造纤维并且其处于被发现是天然产生的丝蛋白，如蜘蛛网的状态。第一步，将细菌或真核细胞用来产生丝状蛋白。为此，使用了重组DNA技术的标准方法⁴。继续进行的典型方法是在水性溶液中收集由所述生物产生的重组蛋白，该水性溶液可以是该生物已经在其中生长的培养基。然后通常从溶液中沉淀丝蛋白。沉淀后，收集丝蛋白，并经常冻干⁵。然后，使用一些溶解化学物质(solubilization chemical)(如1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)^6-10、溴化锂(LiBr)¹¹或硫氰酸胍(guanidinium thiocyanate)(GdmSCN))将收集并沉淀的蛋白质溶解¹²。在下一步中，通过例如透析或其他形式的缓冲液交换来去除过量的溶解化学物质。通常将丝蛋白溶液浓缩或脱盐，然后挤出到含有抗溶剂(antisolvent)(如甲醇或异丙醇)的凝固浴(coagulation bath)中^10,12,13。有时，使用微流控(microfluidic)设备执行此过程^14,15。还描述了备选方式。例如，丝蛋白溶液也可以通过静电纺丝(electrospinning)进行加工以产生纤维^16,17。

有时，蛋白质不是通过沉淀，而是使用色谱技术进行纯化的。在这些情况下，多肽标签在遗传上与丝蛋白融合。这些标签例如是组氨酸残基(His标签)、硫氧还蛋白(Trx)¹⁸或SUMO标签¹⁹的序列。当去除标签(如Trx或SUMO)时，蛋白质的溶解度降低并且会发生纤维形成。在这些情况下，原纤维(fibril)在溶液中或在空气-水界面处形成并且纤维可以从水性溶液中拉出⁶。

本发明解决了这样的问题，即如何能够以不需要沉淀丝蛋白或随后溶解该蛋白质的方式生产和加工丝蛋白以组装成纤维或其他结构，如膜(film)或涂层。本发明不需要使用融合标签，其必须通过用蛋白酶处理或切割融合蛋白标签的其他方式去除²⁰。本发明允许产生重组丝蛋白的纤维而无需使用凝固浴，如异丙醇或甲醇。因为不需要溶解、融合蛋白去除和使用凝固浴的步骤，所以本发明在制备纤维方面具有显著的益处。

沉淀的丝蛋白的溶解需要使用刺激性化学物质，特别是HFIP、锂盐和GdmSCN是有毒性的或者会增加工艺的实质成本。溶解也可引起对丝蛋白的物理损伤。在组装之前使用蛋白酶切割蛋白质结构域需要昂贵的蛋白酶，并且增加了限制可扩展性(scalability)的加工(processing)步骤，如色谱法。

本发明公开了这样的方式，其中重组丝蛋白可以进入浓缩相，其然后可以用于形成纤维、粘合剂、涂层、膜或其他材料结构。

发明概述

本发明的目的是提供使用重组丝蛋白通过容易的(facile)加工来生产材料的方法。本发明减少了丝状蛋白纯化所需的加工步骤，因为仅需要浓缩步骤用于形成浓缩的丝状蛋白溶液。浓缩的丝状溶液通过相分离事件形成，并且不涉及蛋白质的沉淀或蛋白质的随后溶解。本发明还能够省略其他替代加工方法，如色谱分离和通过肽键切割对标签蛋白的可能去除。本发明具有这样的优势，其使得能够通过在空气或气体环境中拉伸(stretching)或拉长(elongating)蛋白质浓缩溶液直接形成纤维。可以直接从浓缩物中拉出纤维，而无需在液浴(liquid bath)中挤出丝状蛋白以使蛋白质凝固(coagulate)。因此，可以省略该加工步骤。优势还包括制备很长的单纤维细丝(single fiber filament)的可能性。另外，本发明提供了将浓缩的丝状溶液用作为胶合(gluing)多种材料和表面的水基粘合剂的用途。

因此，一方面，本发明提供了生产丝融合蛋白的浓缩相的方法，该方法包括以下步骤：

a)在水性介质(aqueous medium)中制备丝融合蛋白的溶液，其中所述融合蛋白从重组生产宿主中分离并且包含丝状蛋白序列和位于所述丝状蛋白序列侧翼的两个单独的非丝末端模块(module)序列；

b)在所述水性介质中浓缩所述融合蛋白，直到发生液相分离；

c)收集步骤b)中获得的所述水性介质的富含蛋白质的相

d)用步骤c)中获得的富含蛋白质的相重复步骤b)和c)直到达到约20-45％w/v的蛋白质浓度；

e)任选地将融合蛋白的聚集体与步骤d)中获得的可溶性融合蛋白分离并从溶液中除去所述聚集体；

f)将步骤d)或e)中获得的溶液浓缩至约60-80％w/v的最终蛋白质浓度，

其中进行步骤a)至f)以使所述丝融合蛋白不被沉淀并随后溶解于所述水性介质中。

在另一方面，本发明提供了通过上述方法生产的蜘蛛丝融合蛋白的浓缩物。

在另一方面，本发明提供了重组蜘蛛丝融合蛋白，其包含丝聚合物重复和位于所述丝聚合物重复侧翼的来自热纤梭菌(Clostridium thermocellum)的两个纤维素结合模块(CBM)，其中该重复序列由与SEQ ID NO:2的重复Q序列组合的SEQ ID NO：1的重复A序列组成，所述纤维素结合模块由SEQ ID NO：7的序列组成，每个模块通过SEQ ID NO：6的C-末端接头或SEQ ID NO：5的N-末端接头与所述重复连接。

在另一方面，本发明提供了重组蜘蛛丝融合蛋白，其包含SEQ ID NO:3的蜘蛛丝蛋白重复序列十字园蛛(Araneus diadematus)ADF3，或SEQ ID NO:4的黑寡妇蜘蛛(Latrodectus hesperus)AcSp1序列；和位于所述丝蛋白重复侧翼的来自热纤梭菌的两个纤维素结合模块(CBM)，所述纤维素结合模块由SEQ ID NO：7的序列组成，每个模块通过SEQID NO：6的C-末端接头或SEQ ID NO：5的N-末端接头与所述重复序列ADF3或黑寡妇蜘蛛AcSp1序列连接。

在另一方面，本发明提供了重组蜘蛛丝融合蛋白，其包含SEQ ID NO：3的蜘蛛丝蛋白重复序列十字园蛛ADF3，和位于所述丝蛋白重复序列侧翼的从酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的纤连蛋白结合蛋白FbaB工程化改造的两个SpyCatcher结构域，所述SpyCatcher结构域由SEQ ID NO：14的序列组成，每个结构域通过SEQ ID NO：6的C-末端接头或SEQ ID NO：17的N-末端接头与所述重复序列ADF3连接。

在另一方面，本发明提供了重组蜘蛛丝融合蛋白，其包含SEQ ID NO：3的蜘蛛丝蛋白重复序列十字园蛛ADF3，和位于所述丝蛋白重复序列侧翼的来自智人(Homo sapiens)的纤连蛋白的第十个III型模块，所述纤连蛋白的第十个III型模块由SEQ ID NO：18的序列组成，每个结构域通过SEQ ID NO：6的C-末端接头或SEQ ID NO：17的N-末端接头与所述重复序列ADF3连接。

在另一方面，本发明提供了重组蜘蛛丝融合蛋白，其包含SEQ ID NO：3的蜘蛛丝蛋白重复序列十字园蛛ADF3，和位于所述丝蛋白重复序列侧翼的来自智人的两个γ-晶体蛋白D结构域，所述γ-晶体蛋白D结构域由SEQ ID NO：20的序列组成，每个结构域通过SEQ IDNO：6的C-末端接头或SEQ ID NO：17的N-末端接头与所述重复序列ADF3连接。

在另一方面，本发明提供了表达如上所定义的重组蜘蛛丝融合蛋白的重组核酸。

在另一方面，本发明提供了表达重组核酸的宿主细胞，所述重组核酸表达如上所定义的重组蜘蛛丝融合蛋白。

在另一方面，本发明提供了粘合剂，其包含作为活性成分的丝融合蛋白，其中所述丝融合蛋白包含丝状蛋白序列和位于所述丝状蛋白序列侧翼的两个单独的非丝末端模块序列。

在另一方面，本发明涉及丝融合蛋白作为粘合剂的用途，其中所述丝融合蛋白包含丝状蛋白序列和位于所述丝状蛋白序列侧翼的两个单独的非丝末端模块序列。

在另一方面，本发明涉及制备复合物的方法，其包括以下步骤：a)提供第一基质(substrate)，b)将权利要求15-28中任一项的粘合剂应用到所述基质上，和c)使由步骤b)获得的基质接触第二基质或表面以形成复合物，其中所述第一基质与所述第二基质或表面的粘附通过所述粘合剂增强。

附图简述

图1.丝状蛋白相分离成浓缩相。底部的较深色液体是由浓度诱导的相分离形成的丝状蛋白相。

图2.从相分离的蛋白浓缩物中收集的样品显示出浓缩的丝蛋白的液滴(光学显微镜)。

图3.相分离的致密蛋白质浓缩物液滴的冷冻电子显微照片(Cryo-electronmicrograph)。

图4.从相分离的致密蛋白质浓缩物液滴中拉出纤维。

图5.从相分离的致密蛋白质液滴中拉出并干燥的细丝的扫描电子显微照片。

图6.丝状蛋白浓缩物在拉力作用下变形时形成纤维状集合体(fibrousassembly)。

图7.含有丝状序列的质粒(A)pPMA51、(B)pSA42、(C)pSA60、(D)pSA16(E)pEEEt20和(F)pSAEt210的示意图。

图8.从相分离的蛋白浓缩物中收集的样品显示出浓缩的丝蛋白的液滴(光学显微镜)。

图9.从相分离的致密蛋白质液滴中拉出并干燥的细丝的扫描电子显微照片。

图10.丝状蛋白浓缩物在拉力作用下变形时形成纤维状集合体。

图11.由丝状分子形成的纤维状集合体中分子排列的扫描电子显微照片。

图12.末端结构域的三维结构。左图；来自热纤梭菌的家族性三纤维素结合模块(CBM)(PDB：1NBC)的结构。右图；来自酿脓链球菌(PDB：4MLI)的SpyCatcher域的结构。

图13.使用蛋白质浓缩物进行的不同类型材料的黏附。

图14.对于不同类型材料,蛋白质浓缩粘合剂的搭接剪切强度(lap-shearstrength)。

图15.通过用其悬挂4.5kg的重量来显示用蛋白质浓缩粘合剂制成的这种连接(joint)的强度。

实施方案描述

本发明涉及在重组生产宿主中生产丝状蛋白之后，由丝状蛋白的溶液形成蛋白质浓缩物。浓缩物是通过浓缩丝状蛋白质的溶液而形成的，不需要纯化步骤，如蛋白质沉淀或色谱纯化。浓缩物的特征在于是可检测的和分离的液相，其不同于从中形成所述浓缩物的水相。

因此，本发明提供用于生产丝融合蛋白的浓缩相的方法，该方法包括以下步骤：

a)在水性介质(aqueous medium)中制备丝融合蛋白的溶液，其中所述融合蛋白从重组生产宿主中分离并且包含丝状蛋白序列和位于所述丝状蛋白序列侧翼的两个单独的非丝末端模块序列；

c)收集步骤b)中获得的所述水性介质的富含蛋白质的相

d)用步骤c)中获得的富含蛋白质的相重复步骤b)和c)，直到达到约20-45％w/v的蛋白质浓度；

表述“非丝末端模块序列”在本文中是指位于所述丝状蛋白序列侧翼的两个蛋白质结构域，所述两个结构域具有相同或几乎相同(即，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性或序列同一性)的氨基酸序列。在备选实施方案中，位于丝状蛋白序列侧翼的所述非丝末端模块序列具有相似的三维结构。所述非丝末端模块序列在自然界中不与丝蛋白序列组合存在。用于本发明的丝融合蛋白的合适的末端模块序列优选具有如图12所述的三维结构。所述三维结构包含形成β-折叠的连续β链，优选至少四个连续的β链。末端模块的氨基酸序列长度优选在90-250个氨基酸范围内，更优选在98-239个氨基酸范围内(参见表1)。优选地，所述蛋白质结构域选自下组：碳水化合物结合模块(CBM)，如来自热纤梭菌的纤维素结合模块，其包含SEQ ID NO：7的序列。我们还公开了基于由酿脓链球菌的纤连蛋白结合蛋白FbaB工程化改造的SpyCatcher结构域的末端模块序列，其包含SEQ ID NO：14的序列，来自智人的γ-晶体蛋白D，其包含SEQ ID NO：20的序列，以及来自智人的纤连蛋白的第十个III型模块，其包含SEQ ID NO：18的序列。对于其他优选的实施方案，表1中列出了用于丝融合蛋白的合适的末端模块肽。在优选的实施方案中，可以将非丝末端模块序列与具有相应三维结构的另一个非丝末端模块序列配对。例如，当丝融合蛋白中的侧翼末端模块序列之一是CBM时，另一个可以是SpyCatcher结构域。

术语“水性介质”在本文中是指液体介质，其优选可以是蒸馏水或由水和弱酸及其共轭碱(conjugate base)的混合物组成的缓冲液。

术语“丝状蛋白序列”在本文中是指包含能够形成丝纤维状(fibrillar)结构或丝纤维的重复序列的氨基酸序列。优选地，丝状蛋白序列是来自蜘蛛目(order Araneae)蜘蛛的蜘蛛丝蛋白序列或其变体。

如本文所用，术语“变体”是指与亲本序列具有高度同源性的氨基酸或核酸序列。优选地，变体与亲本序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性(即序列同一性)序列。适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是BLASTp和BLASTn 2.0算法，其描述于Altschul等人(1997)NucleicAcids Res25(17):3389-3402中。

优选地，上述方法还包括以下步骤：

g)从步骤f)获得的浓缩物中制备丝融合蛋白细丝。更优选地，在步骤g)中通过利用剪切力从浓缩物中拉出细丝来制备细丝。在图4中显示了实例。

在优选的实施方案中，该方法包括从表达所述融合蛋白的宿主细胞分离重组融合蛋白的进一步的初始步骤。在某些实施方案中，本发明需要以这样的形式生产重组丝状蛋白(例如SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：19；SEQ IDNO：21)，其中丝蛋白的氨基和羧基末端两者均添加了其他非丝末端模块序列(图7)。如上所讨论，这些非丝末端模块序列可以是例如纤维素结合模块(CBM)(例如SEQ ID NO：7)、由酿脓链球菌的纤连蛋白结合蛋白FbaB工程化改造的SpyCatcher结构域(例如SEQ ID NO：14)、来自智人的γ-晶体蛋白D(其包含SEQ ID NO：20的序列)和来自智人的纤连蛋白的第十个III型模块(其包含SEQ ID NO：18的序列)，其变体或其混合对(对于其他选择，参见表1)。另外的蛋白质序列也可以在非丝末端模块序列和丝序列之间掺入，以用作接头的氨基酸序列(SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6)。丝状部分可以是A(SEQ ID NO：1)和Q(SEQ ID NO：2)序列的重复，或者可以是天然发现的序列，如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4。优选地，所述蜘蛛丝蛋白质重复序列包含10-50个丝聚合物重复，其中该重复序列由与SEQ ID NO:2的重复Q序列或其变体组合的SEQ ID NO：1的重复A序列或其变体组成。更优选地，所述蜘蛛丝蛋白重复序列是(AQ)12。在另一个优选的实施方案中，所述蜘蛛丝蛋白重复序列发现于来自包含SEQID NO：3的十字园蛛的ADF3；SEQ ID NO:4的黑寡妇蜘蛛AcSp1序列或其变体。所述接头可优选地选自下组：SEQ ID NO：6的C-末端接头和SEQ ID NO：5的N-末端接头。

在优选的实施方案中，本方法的浓缩步骤b)和f)通过离心力、透析如超滤技术，和/或蒸发来进行。在下面的实施例中，离心力和蒸发在该方法的不同阶段使用。

本发明还提供通过本发明的方法生产的丝形细丝。优选地，所述丝形细丝由如上定义的蜘蛛丝融合蛋白构成。更优选地，所述丝形细丝由包含12个丝聚合物重复和位于所述丝聚合物重复侧翼的来自热纤梭菌的两个纤维素结合模块(CBM)的蜘蛛丝融合蛋白构成，其中所述重复序列由与SEQ ID NO：2的重复Q序列组合的SEQ ID NO：1的重复A序列组成，所述纤维素结合模块由SEQ ID NO：7的序列组成，每个模块通过SEQ ID NO：6的C-末端接头或SEQ ID NO：5的N-末端接头与所述重复连接。在备选实施方案中，所述丝形细丝由SEQ ID NO：3的蜘蛛丝蛋白重复序列ADF3，或SEQ ID NO：4的黑寡妇蜘蛛AcSp1序列；和位于所述丝蛋白重复侧翼的来自热纤梭菌的两个纤维素结合模块(CBM)构成，所述纤维素结合模块由SEQ ID NO：7的序列组成，每个模块通过SEQ ID NO：6的C-末端接头或SEQ ID NO：5的N-末端接头与所述重复序列ADF3或所述黑寡妇蜘蛛AcSp1序列连接。

本发明还提供了由上文和权利要求书中定义的方法的步骤a)-f)生产的蜘蛛丝融合蛋白的浓缩物。

本发明进一步涉及包含丝聚合物重复和位于所述丝聚合物重复侧翼的来自热纤梭菌的两个纤维素结合模块(CBM)的重组蜘蛛丝融合蛋白，其中所述重复序列由与SEQ IDNO：2的重复Q序列组合的SEQ ID NO：1的重复A序列组成，所述纤维素结合模块由SEQ IDNO：7的序列组成，每个模块通过SEQ ID NO：6的C-末端接头或SEQ ID NO：5的N-末端接头与所述重复连接。优选地，丝聚合物重复序列是(AQ)12。更优选地，所述重组蜘蛛丝融合蛋白包含SEQ ID NO：8的序列。

在备选实施方案中，所述重组蜘蛛丝融合蛋白包含SEQ ID NO：3的蜘蛛丝蛋白重复序列ADF3，或SEQ ID NO：4的黑寡妇蜘蛛AcSp1序列；和位于所述丝蛋白重复侧翼的来自热纤梭菌的两个纤维素结合模块(CBM)，所述纤维素结合模块由SEQ ID NO：7的序列组成，每个模块通过SEQ ID NO：6的C-末端接头或SEQ ID NO：5的N-末端接头与所述重复序列ADF3或所述黑寡妇蜘蛛AcSp1序列连接。

在其他备选实施方案中，所述重组蜘蛛丝融合蛋白包含SEQ ID NO：3的蜘蛛丝蛋白重复序列十字园蛛ADF3，和位于所述丝蛋白重复序列侧翼的从酿脓链球菌的纤连蛋白结合蛋白FbaB工程化改造的两个SpyCatcher结构域，所述SpyCatcher结构域由SEQ ID NO：14的序列组成，每个结构域通过SEQ ID NO：6的C-末端接头或SEQ ID NO：17的N-末端接头与所述重复序列ADF3连接。

在其他备选实施方案中，所述重组蜘蛛丝融合蛋白包含SEQ ID NO：3的蜘蛛丝蛋白重复序列十字园蛛ADF3，和位于所述丝蛋白重复序列侧翼的来自智人的纤连蛋白的两个第十个III型模块，所述纤连蛋白的第十个III型模块由SEQ ID NO：18的序列组成，每个结构域通过SEQ ID NO：6的C-末端接头或SEQ ID NO：17的N-末端接头与所述重复序列ADF3连接。

在其他备选实施方案中，所述重组蜘蛛丝融合蛋白包含SEQ ID NO：3的蜘蛛丝蛋白重复序列十字园蛛ADF3，和位于所述丝蛋白重复序列侧翼的来自智人的两个γ-晶体蛋白D结构域，所述γ-晶体蛋白D结构域由SEQ ID NO：20的序列组成，每个结构域通过SEQ IDNO：6的C-末端接头或SEQ ID NO：17的N-末端接头与所述重复序列ADF3连接。

表达如上定义的融合蛋白的重组核酸和包含所述核酸的宿主细胞在本发明的范围内(例如，SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23)。

如以上作为任选步骤e)所定义的：在浓缩物形成之前，可以通过过滤或通过离心沉降使溶液从细胞碎片和颗粒物质中澄清。通过事先将溶液加热到70摄氏度以上，可以进一步增强该步骤。本发明的显著优势是不进行丝状蛋白的沉淀。缺少沉淀步骤也使得没有必要涉及溶解沉淀的步骤。溶解液的使用可导致对丝蛋白的损坏，因此本发明在避免使用这些方面显示出优势。省略丝状蛋白的沉淀和随后的溶解也促进了该方法的加工和扩大。缺少色谱纯化步骤可降低成本，并使该方法更容易扩大。浓缩物的形成是作为相分离事件发生的，其中丝状蛋白质的浓缩物明显形成了富含蛋白质的液相(fluid phase)(见图1)。该浓缩物可以描述为相分离的蛋白质溶液、浓液(dope)，或者也可以描述为蛋白质凝聚层(coacervate)。通过在显微镜下成像，很明显有时蛋白质浓缩物在溶液中以液滴可见(图2和3)。本发明的显著优点是，除了澄清和浓缩步骤，无需其他处理步骤即可形成浓缩相中的高浓度蛋白质。浓缩物中蛋白质的浓度可以通过例如蒸发进一步提高。蛋白质浓缩物具有一些明显的有利特性。从这种浓缩物中有可能制备丝状蛋白的纤维。纤维是通过在浓缩物中应用拉伸力(extensional force)而制造的。如图4所证实的，浓缩物的拉伸导致丝状蛋白质纤维的形成。直接拉伸蛋白质浓缩物形成纤维是有利的，因为可以形成纤维而无需凝固浴。纤维可以在周围介质为空气的情况下形成，因此不必挤出为液体。蛋白质浓缩物的另一个明显的优势是它可以应用于各种表面，并且可以用作水基粘合剂。

本发明的粘合剂可以通过应用到优选选自下组的基质上来使用：塑料、玻璃、金属、木材、纸、纺织品和组织基质。即，它可以用于黏附或固定基质。使用方式遵循粘合剂使用的一般方式，并且典型方式是涂布。

本发明粘合剂的医学或生物学应用的实例如下，但不限于此：(1)整形外科治疗，如骨、韧带、腱、半月板和肌肉的治疗，以及人造材料的植入；(2)穿孔、撕裂和割伤的治疗，以及眼科附件(attachment)，如角膜植入物和人造角膜植入物；(3)牙科附件如将固位体、牙桥(bridge)或牙冠(crown)固定在适当位置、固定松动的牙齿、修复折断的牙齿以及将填充物固定在适当位置；(4)外科手术治疗，如血管附着、细胞组织附着、人造材料植入物和伤口闭合；(5)植物附件(plant attachment)，如移植部分的粘合和伤口愈合。

工业适用性

丝状蛋白通常可用于形成材料，如涂层、纤维、过滤器、复合材料、汽车零部件(automotive part)、医学材料(伤口敷料、药物输送材料、涂层、细胞生长基质)。优点是它们的生物相容性、生物可降解性、设计和修改特性的可能性、它们的机械特性、水基加工、强度、韧性和弹性。该材料还可用于纺织和服装应用。

粘合剂在工业中具有非常广泛的应用性，例如在制造复合材料或将材料的成分固定在一起时。在复合材料中，粘合剂与其他成分结合，并且粘合剂也可以包含组合物的一小部分。在复合材料中，粘合剂用作将材料的成分粘合在一起的基质。粘合剂的其他应用是将设备的组件固定在一起。

胶合应用包括生物医学或医药工业。粘合剂可用于胶合组织、皮肤、牙科应用、伤口、骨骼、植入物、传感器。

现在已经一般性地描述了本发明，通过参考以下实施例将更容易理解本发明，这些实施例是通过举例说明的方式提供的，并不旨在限制本发明。

尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是下面描述了合适的方法和材料。

实施例

实施例1：

蛋白质生产。将含有丝状蛋白序列(SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13；或SEQ ID NO：16)的质粒(见图7)转化到大肠杆菌中并在Luria Bertani(LB)培养基(或其他细菌生长培养基)中培养(grown)，直到在600nm处达到约0.5AU的光密度。通过添加异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(thiogalactopyranoside)(IPTG)诱导蛋白质产生并允许细胞生长12小时。当使用自动诱导培养基如MagicMediaTM(Thermo Fisher Scientific)时，未添加IPTG。通过超声破碎细胞。或者，使用匀浆器(homogenizer)，如Avestin Emulsiflex-C3。同样，可以使用其他细胞裂解技术。通过离心除去细胞碎片。

蛋白质溶液的制备。将澄清的上清液加热至例如75摄氏度以从上清液中沉淀出材料，而丝状蛋白保留在溶液中。

在随后的步骤中，使用脱盐色谱柱或使用超滤对含有蛋白质的溶液进行脱盐。可以在脱盐过程中将蛋白质的溶剂更改为例如水或含有0-100mM NaCl的5-50mM Tris缓冲液。丝状蛋白的浓度由其在280nm处的吸光度确定。

形成浓缩的蛋白质相。使用25℃时的离心浓缩器浓缩来自先前步骤的融合蛋白溶液。在蛋白质浓度增加的过程中，发生相分离并形成富含蛋白质的浓缩相。收集富含蛋白质的相并进一步处理。一旦蛋白质溶液的总浓度达到约1％w/v，就会发生相分离。然后在第二个浓缩步骤中进一步浓缩蛋白质。使用离心浓缩器在25摄氏度和845-1500相对离心力的作用下，将从先前步骤收集的富含蛋白质的，相分离的溶液进一步逐渐浓缩至大约10-15％w/v。为了确定在这些浓度下的蛋白质浓度，进行了更准确的干重测量。

浓度的增加还可以通过不同类型的超滤技术、透析或蒸发来实现。

使用富含蛋白质相的第三个浓缩步骤。通过蒸发进一步浓缩浓度为10-15％w/v的丝蛋白，以达到约20-45％w/v的浓度。

在浓缩步骤中，可能需要清洗步骤：为了获得均质且不絮凝(non-flocculating)的溶液，从溶液中去除(通过离心)聚集体和短丝(直径通常为纳米，长度为几微米，其通常会形成网状)，以及凝胶颗粒(尺寸约为几微米)。去除聚集体有助于随后的纤维拉出或其他处理。

储存步骤：20-45％w/v是浓液(dope solution)的储存浓度。在第三个浓缩步骤后，使用液氮将样品快速冷冻。

实施例2：

由蛋白质浓缩物制造纤维。将实施例1中制备的一滴蛋白质溶液(约30％，或20-45％)通过蒸发进一步浓缩至60-80％，并放置在两个尖端形状的物体(如镊子的尖端)之间。

蛋白质含量约为60-80％w/v时，可以从蛋白质溶液中拉出细丝。纤维拉出的实例如图4所示。

实施例3：

由蛋白质浓缩物制造粘合剂。将实施例1中制备的一滴蛋白质溶液(约30％或20-50％)放置在两种材料(例如标准的纸)之间，并干燥5分钟，直到蛋白质浓缩物固化并使纸彼此粘合。可以在图13中看见用作粘合剂的蛋白质浓缩物的实例。

表1.在本发明的丝融合蛋白中用作非丝末端模块序列的其他合适的肽。

参考文献

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20.US8173772B2.

序列表

<110> 阿尔托大学基金会(Aalto University Foundation sr.)

<120> 用于产生丝融合蛋白的浓缩粘合相的方法

<130> AALTO18PCT

<150> FI 20175544

<151> 2017-06-13

<150> FI 20176165

<151> 2017-12-22

<160> 23

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 区块A

<400> 1

Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly

1 5 10 15

Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln

20

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 区块Q

<400> 2

Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly

1 5 10 15

Pro Gly Gln Gln

20

<210> 3

<211> 499

<212> PRT

<213> 十字园蛛(Araneus diadematus)

<220>

<223> ADF3

<400> 3

Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly

1 5 10 15

Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr

20 25 30

Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gln Gln Gly Pro Gly Gln

35 40 45

Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala

50 55 60

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65 70 75 80

Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala

85 90 95

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100 105 110

Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala

115 120 125

Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly

130 135 140

Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala

145 150 155 160

Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gly Pro Gly Gln Gln

165 170 175

Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala

180 185 190

Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly

195 200 205

Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly

210 215 220

Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly

225 230 235 240

Tyr Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro

245 250 255

Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ser Gly Gly Tyr Gly

260 265 270

Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln

275 280 285

Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly

290 295 300

Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly

305 310 315 320

Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly

325 330 335

Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly

340 345 350

Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro

355 360 365

Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly

370 375 380

Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly

385 390 395 400

Gln Gly Ala Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly

405 410 415

Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro

420 425 430

Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly

435 440 445

Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly

450 455 460

Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly

465 470 475 480

Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro

485 490 495

Gly Gly Gln

<210> 4

<211> 396

<212> PRT

<213> 黑寡妇蜘蛛(Latrodectus hesperus)

<220>

<223> AcSp1

<400> 4

Phe Gly Gly Pro Ser Ala Gly Gly Asp Val Ala Ala Lys Leu Ala Arg

1 5 10 15

Ser Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Ser Gly Val Phe Arg Ala Ala Phe

20 25 30

Asn Ser Arg Val Ser Thr Pro Val Ala Val Gln Leu Thr Asp Ala Leu

35 40 45

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50 55 60

Lys Leu Arg Lys Ala Ser Gln Ala Val Ser Lys Val Arg Met Gly Ser

65 70 75 80

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85 90 95

Leu Ser Ser Ser Gly Lys Val Ala Asp Ala Asn Ile Asn Gln Ile Ala

100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

Asn Val Ala Arg Asn Met Gln Ala Ser Ile Gln Gly Gly Pro Ala Pro

145 150 155 160

Ile Thr Ala Glu Gly Pro Asp Phe Gly Ala Gly Tyr Pro Gly Gly Ala

165 170 175

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180 185 190

Arg Gly Gly Asp Ala Thr Ala Lys Leu Leu Gln Ala Leu Val Pro Ala

195 200 205

Leu Leu Lys Ser Asp Val Phe Arg Ala Ile Tyr Lys Arg Gly Thr Arg

210 215 220

Lys Gln Val Val Gln Tyr Val Thr Asn Ser Ala Leu Gln Gln Ala Ala

225 230 235 240

Ser Ser Leu Gly Leu Asp Ala Ser Thr Ile Ser Gln Leu Gln Thr Lys

245 250 255

Ala Thr Gln Ala Leu Ser Ser Val Ser Ala Asp Ser Asp Ser Thr Ala

260 265 270

Tyr Ala Lys Ala Phe Gly Leu Ala Ile Ala Gln Val Leu Gly Thr Ser

275 280 285

Gly Gln Val Asn Asp Ala Asn Val Asn Gln Ile Gly Ala Lys Leu Ala

290 295 300

Thr Gly Ile Leu Arg Gly Ser Ser Ala Val Ala Pro Arg Leu Gly Ile

305 310 315 320

Asp Leu Ser Gly Ile Asn Val Asp Ser Asp Ile Gly Ser Val Thr Ser

325 330 335

Leu Ile Leu Ser Gly Ser Thr Leu Gln Met Thr Ile Pro Ala Gly Gly

340 345 350

Asp Asp Leu Ser Gly Gly Tyr Pro Gly Gly Phe Pro Ala Gly Ala Gln

355 360 365

Pro Ser Gly Gly Ala Pro Val Asp Ser Asn Ile Gly Leu Val Gly Thr

370 375 380

Gln Asp Val Ala Ile Gly Val Ser Gln Pro Val Asp

385 390 395

<210> 5

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头N

<400> 5

Pro Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ser

1 5 10 15

Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala

20

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头C

<400> 6

Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr Val Ala

1 5 10 15

Asn Ser Ser Ser

20

<210> 7

<211> 154

<212> PRT

<213> 热纤梭菌(Clostridium thermocellum)

<220>

<223> CBM

<400> 7

Asn Leu Lys Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Pro Ser Asp Thr Thr Asn

1 5 10 15

Ser Ile Asn Pro Gln Phe Lys Val Thr Asn Thr Gly Ser Ser Ala Ile

20 25 30

Asp Leu Ser Lys Leu Thr Leu Arg Tyr Tyr Tyr Thr Val Asp Gly Gln

35 40 45

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50 55 60

Gly Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Ser Asn Val Lys Gly Thr Phe Val Lys

65 70 75 80

Met Ser Ser Ser Thr Asn Asn Ala Asp Thr Tyr Leu Glu Ile Ser Phe

85 90 95

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100 105 110

Phe Ala Lys Asn Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gln Ser Asn Asp Tyr Ser

115 120 125

Phe Lys Ser Ala Ser Gln Phe Val Glu Trp Asp Gln Val Thr Ala Tyr

130 135 140

Leu Asn Gly Val Leu Val Trp Gly Lys Glu

145 150

<210> 8

<211> 860

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CBM-L_N-AQ12-L_C-CBM-H6融合蛋白

<400> 8

Met Gly Asn Leu Lys Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Pro Ser Asp Thr

1 5 10 15

Thr Asn Ser Ile Asn Pro Gln Phe Lys Val Thr Asn Thr Gly Ser Ser

20 25 30

Ala Ile Asp Leu Ser Lys Leu Thr Leu Arg Tyr Tyr Tyr Thr Val Asp

35 40 45

Gly Gln Lys Asp Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Ala Ile Ile Gly

50 55 60

Ser Asn Gly Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Ser Asn Val Lys Gly Thr Phe

65 70 75 80

Val Lys Met Ser Ser Ser Thr Asn Asn Ala Asp Thr Tyr Leu Glu Ile

85 90 95

Ser Phe Thr Gly Gly Thr Leu Glu Pro Gly Ala His Val Gln Ile Gln

100 105 110

Gly Arg Phe Ala Lys Asn Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gln Ser Asn Asp

115 120 125

Tyr Ser Phe Lys Ser Ala Ser Gln Phe Val Glu Trp Asp Gln Val Thr

130 135 140

Ala Tyr Leu Asn Gly Val Leu Val Trp Gly Lys Glu Pro Ser Ala Ser

145 150 155 160

Ala Ser Ala Ser Ala Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Gly

165 170 175

Ala Gly Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly

180 185 190

Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala

195 200 205

Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gln Gln Gly

210 215 220

Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala

225 230 235 240

Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln

245 250 255

Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala

260 265 270

Ala Ala Ala Ala Gly Gly Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Ala

275 280 285

Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Ser Ala Ala Ala

290 295 300

Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly

305 310 315 320

Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala

325 330 335

Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gly Pro

340 345 350

Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser

355 360 365

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln

370 375 380

Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly

385 390 395 400

Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr

405 410 415

Gly Pro Gly Tyr Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly

420 425 430

Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ser Gly

435 440 445

Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro

450 455 460

Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala

465 470 475 480

Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln

485 490 495

Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly

500 505 510

Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr

515 520 525

Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln

530 535 540

Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln

545 550 555 560

Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly

565 570 575

Pro Gly Gly Gln Gly Ala Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Gly

580 585 590

Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln

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Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln

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Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly

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Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr

645 650 655

Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln

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Gln Gly Pro Gly Gly Gln Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser

675 680 685

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705 710 715 720

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755 760 765

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835 840 845

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<210> 9

<211> 860

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CBM-L_N-Nat.AQ12-L_C-CBM-H6融合蛋白

<400> 9

Met Gly Asn Leu Lys Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Pro Ser Asp Thr

1 5 10 15

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Gly Arg Phe Ala Lys Asn Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gln Ser Asn Asp

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Ala Ser Ala Ser Ala Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Gly

165 170 175

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Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala

195 200 205

Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gln Gln Gly

210 215 220

Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala

225 230 235 240

Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln

245 250 255

Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala

260 265 270

Ala Ala Ala Ala Gly Gly Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Ala

275 280 285

Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Ser Ala Ala Ala

290 295 300

Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly

305 310 315 320

Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala

325 330 335

Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gly Pro

340 345 350

Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser

355 360 365

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln

370 375 380

Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly

385 390 395 400

Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr

405 410 415

Gly Pro Gly Tyr Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly

420 425 430

Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ser Gly

435 440 445

Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro

450 455 460

Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala

465 470 475 480

Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln

485 490 495

Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly

500 505 510

Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr

515 520 525

Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln

530 535 540

Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln

545 550 555 560

Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly

565 570 575

Pro Gly Gly Gln Gly Ala Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Gly

580 585 590

Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln

595 600 605

Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln

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Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly

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Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr

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Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln

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Gln Gly Pro Gly Gly Gln Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser

675 680 685

Ala Ala Ser Thr Val Ala Asn Ser Ser Ser Asn Leu Lys Val Glu Phe

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Lys Val Thr Asn Thr Gly Ser Ser Ala Ile Asp Leu Ser Lys Leu Thr

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Pro Gly Ala His Val Gln Ile Gln Gly Arg Phe Ala Lys Asn Asp Trp

805 810 815

Ser Asn Tyr Thr Gln Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Lys Ser Ala Ser Gln

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Phe Val Glu Trp Asp Gln Val Thr Ala Tyr Leu Asn Gly Val Leu Val

835 840 845

Trp Gly Lys Glu Leu Glu His His His His His His

850 855 860

<210> 10

<211> 757

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CBM-L_N-L.hes.AcSp1-L_C-CBM-H6融合蛋白

<400> 10

Met Gly Asn Leu Lys Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Pro Ser Asp Thr

1 5 10 15

Thr Asn Ser Ile Asn Pro Gln Phe Lys Val Thr Asn Thr Gly Ser Ser

20 25 30

Ala Ile Asp Leu Ser Lys Leu Thr Leu Arg Tyr Tyr Tyr Thr Val Asp

35 40 45

Gly Gln Lys Asp Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Ala Ile Ile Gly

50 55 60

Ser Asn Gly Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Ser Asn Val Lys Gly Thr Phe

65 70 75 80

Val Lys Met Ser Ser Ser Thr Asn Asn Ala Asp Thr Tyr Leu Glu Ile

85 90 95

Ser Phe Thr Gly Gly Thr Leu Glu Pro Gly Ala His Val Gln Ile Gln

100 105 110

Gly Arg Phe Ala Lys Asn Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gln Ser Asn Asp

115 120 125

Tyr Ser Phe Lys Ser Ala Ser Gln Phe Val Glu Trp Asp Gln Val Thr

130 135 140

Ala Tyr Leu Asn Gly Val Leu Val Trp Gly Lys Glu Pro Ser Ala Ser

145 150 155 160

Ala Ser Ala Ser Ala Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Gly

165 170 175

Ala Gly Ala Phe Gly Gly Pro Ser Ala Gly Gly Asp Val Ala Ala Lys

180 185 190

Leu Ala Arg Ser Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Ser Gly Val Phe Arg

195 200 205

Ala Ala Phe Asn Ser Arg Val Ser Thr Pro Val Ala Val Gln Leu Thr

210 215 220

Asp Ala Leu Val Gln Lys Ile Ala Ser Asn Leu Gly Leu Asp Tyr Ala

225 230 235 240

Thr Ala Ser Lys Leu Arg Lys Ala Ser Gln Ala Val Ser Lys Val Arg

245 250 255

Met Gly Ser Asp Thr Asn Ala Tyr Ala Leu Ala Ile Ser Ser Ala Leu

260 265 270

Ala Glu Val Leu Ser Ser Ser Gly Lys Val Ala Asp Ala Asn Ile Asn

275 280 285

Gln Ile Ala Pro Gln Leu Ala Ser Gly Ile Val Leu Gly Val Ser Thr

290 295 300

Thr Ala Pro Gln Phe Gly Val Asp Leu Ser Ser Ile Asn Val Asn Leu

305 310 315 320

Asp Ile Ser Asn Val Ala Arg Asn Met Gln Ala Ser Ile Gln Gly Gly

325 330 335

Pro Ala Pro Ile Thr Ala Glu Gly Pro Asp Phe Gly Ala Gly Tyr Pro

340 345 350

Gly Gly Ala Pro Thr Asp Leu Ser Gly Leu Asp Met Gly Ala Pro Ser

355 360 365

Asp Gly Ser Arg Gly Gly Asp Ala Thr Ala Lys Leu Leu Gln Ala Leu

370 375 380

Val Pro Ala Leu Leu Lys Ser Asp Val Phe Arg Ala Ile Tyr Lys Arg

385 390 395 400

Gly Thr Arg Lys Gln Val Val Gln Tyr Val Thr Asn Ser Ala Leu Gln

405 410 415

Gln Ala Ala Ser Ser Leu Gly Leu Asp Ala Ser Thr Ile Ser Gln Leu

420 425 430

Gln Thr Lys Ala Thr Gln Ala Leu Ser Ser Val Ser Ala Asp Ser Asp

435 440 445

Ser Thr Ala Tyr Ala Lys Ala Phe Gly Leu Ala Ile Ala Gln Val Leu

450 455 460

Gly Thr Ser Gly Gln Val Asn Asp Ala Asn Val Asn Gln Ile Gly Ala

465 470 475 480

Lys Leu Ala Thr Gly Ile Leu Arg Gly Ser Ser Ala Val Ala Pro Arg

485 490 495

Leu Gly Ile Asp Leu Ser Gly Ile Asn Val Asp Ser Asp Ile Gly Ser

500 505 510

Val Thr Ser Leu Ile Leu Ser Gly Ser Thr Leu Gln Met Thr Ile Pro

515 520 525

Ala Gly Gly Asp Asp Leu Ser Gly Gly Tyr Pro Gly Gly Phe Pro Ala

530 535 540

Gly Ala Gln Pro Ser Gly Gly Ala Pro Val Asp Ser Asn Ile Gly Leu

545 550 555 560

Val Gly Thr Gln Asp Val Ala Ile Gly Val Ser Gln Pro Val Asp Ala

565 570 575

Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr Val Ala Asn

580 585 590

Ser Ser Ser Asn Leu Lys Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Pro Ser Asp

595 600 605

Thr Thr Asn Ser Ile Asn Pro Gln Phe Lys Val Thr Asn Thr Gly Ser

610 615 620

Ser Ala Ile Asp Leu Ser Lys Leu Thr Leu Arg Tyr Tyr Tyr Thr Val

625 630 635 640

Asp Gly Gln Lys Asp Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Ala Ile Ile

645 650 655

Gly Ser Asn Gly Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Ser Asn Val Lys Gly Thr

660 665 670

Phe Val Lys Met Ser Ser Ser Thr Asn Asn Ala Asp Thr Tyr Leu Glu

675 680 685

Ile Ser Phe Thr Gly Gly Thr Leu Glu Pro Gly Ala His Val Gln Ile

690 695 700

Gln Gly Arg Phe Ala Lys Asn Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gln Ser Asn

705 710 715 720

Asp Tyr Ser Phe Lys Ser Ala Ser Gln Phe Val Glu Trp Asp Gln Val

725 730 735

Thr Ala Tyr Leu Asn Gly Val Leu Val Trp Gly Lys Glu Leu Glu His

740 745 750

His His His His His

755

<210> 11

<211> 2580

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码融合蛋白CBM-L_N-AQ12-L_C-CBM-H6的核酸序列

<400> 11

atgggcaatc tgaaagtgga gttctataat agcaatccga gcgataccac caatagcatt 60

aatccgcagt ttaaagttac caataccggt agcagcgcaa ttgatctgag caaactgacc 120

ctgcgttatt actataccgt tgatggtcag aaagatcaga cattttggtg tgatcatgca 180

gccattattg gtagcaatgg tagctataat ggcattacca gcaatgtgaa aggcaccttt 240

gttaaaatga gcagcagcac caataatgcc gatacctatc tggaaattag ctttaccggt 300

ggcaccctgg aaccgggtgc acatgttcag attcagggtc gttttgcaaa aaatgattgg 360

agcaattata cccagagcaa cgactatagc tttaaaagcg caagccagtt tgttgaatgg 420

gatcaggtta ccgcatatct gaatggtgtt ctggtttggg gtaaagaacc gagcgctagc 480

gcaagcgcat cagccggtgc aagtgctgca gcaagtgccg gtgctggtgc gggtgcaggt 540

cctggtcagc agggtccggg tcaacaagga cctggacagc aaggaccgta tggtccaggt 600

gcatcagctg cagccgcagc agcgggtggt tatggtccgg gaagcggtca gcaaggccct 660

tcacaacagg gaccaggcca acagggtcct ggcggtcaag gtccttatgg acctggtgct 720

tctgctgcgg cagcggctgc cggtggctat ggccctggta gtggccagca agggcctggt 780

ggccagggtc catatggccc aggttctagt gccgcagctg ctgctgcagg cggtaatgga 840

ccgggttcag gacaacaagg tgcagggcag caaggtcccg gacaacaggg tccaggtggt 900

agtgcagcag cggcagcagc tggcggatat ggaccaggta gtgggcaaca aggcccaggt 960

caacaagggc cagggggtca aggcccatac ggtccgggtg cttccgcagc cgcagctgca 1020

gcaggcggtt acggtcctgg tagtggtcaa ggtccaggcc agcaaggacc aggtggacaa 1080

gggccttacg gaccaggcgc atctgcggca gcagcagccg cagggggata tggtcctggt 1140

tcagggcagc agggaccagg tcagcaaggt ccaggtcagc agggacctgg gggtcaggga 1200

ccttacggtc ctggcgcaag tgcagctgca gcggcagcgg gtggctacgg accgggttat 1260

ggccagcagg gaccgggaca gcagggaccc ggtggacagg gtccgtatgg accgggtgca 1320

agtgcagcat cagcagcaag tggtggttac ggacctggct caggacagca aggccctggc 1380

caacaaggcc ctggcggaca gggaccctat gggccaggtg ccagcgctgc agcagccgca 1440

gccggtggat acggtccagg ctctggtcaa caaggtcctg ggcaacaagg tcctggccag 1500

cagggtccag gacagcaagg gcctggcggt caaggaccgt acggaccggg tgccagcgca 1560

gcggctgcag cggcaggcgg ttatggtcca ggatcaggcc agcaaggtcc gggtcagcaa 1620

ggcccagggc agcaaggacc gggtcaacag ggaccgggtc agcagggtcc tgggcaacag 1680

ggtccgggac aacagggacc aggtcaacaa ggaccgggtc aacaaggtcc aggtggtcag 1740

ggtgcatatg gtcctggcgc ttcagcagca gcaggggctg cagggggtta tggcccaggt 1800

agcggtcagc agggacccgg acaacaaggc cctggacaac agggtcccgg tcagcaaggg 1860

ccaggccaac aaggtccagg acaacaagga ccagggcagc agggtccagg ccaacaaggc 1920

ccttatggtc cgggtgccag tgctgcggca gcggcagctg ggggttatgg tccaggctct 1980

ggacagcagg gacctggcca gcaaggacct gggcagcaag ggccaggcgg tcaggcaagt 2040

gcatcagcaa gcgcagcagc gagtgcagca agcaccgttg cgaattctag ctccaacctg 2100

aaagttgagt tttataactc caatccgtca gatacgacga acagtattaa ccctcagttc 2160

aaagtgacaa acaccggttc aagcgccatc gatctgtcaa aactgacatt acgttactat 2220

tatacagtgg acggccagaa agaccaaacc ttctggtgcg accatgccgc aattatcggt 2280

tcaaatggtt catataacgg tatcacgagc aacgtcaaag gtacattcgt gaaaatgagt 2340

agctcaacca acaacgcaga tacctactta gaaatttcat ttacgggtgg tacgttagaa 2400

ccaggtgcgc acgtgcagat ccaaggtcgc ttcgccaaaa acgactggtc aaattataca 2460

cagtcgaatg actacagctt caaatcagca tcacagttcg tagagtggga tcaagtgaca 2520

gcctacctga acggcgtgct ggtgtggggc aaagaactcg agcaccacca ccaccaccac 2580

<210> 12

<211> 2580

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码融合蛋白CBM-L_N-Nat.AQ12-L_C-CBM-H6的核酸序列

<400> 12

atgggcaatc tgaaagtgga gttctataat agcaatccga gcgataccac caatagcatt 60

aatccgcagt ttaaagttac caataccggt agcagcgcaa ttgatctgag caaactgacc 120

ctgcgttatt actataccgt tgatggtcag aaagatcaga cattttggtg tgatcatgca 180

gccattattg gtagcaatgg tagctataat ggcattacca gcaatgtgaa aggcaccttt 240

gttaaaatga gcagcagcac caataatgcc gatacctatc tggaaattag ctttaccggt 300

ggcaccctgg aaccgggtgc acatgttcag attcagggtc gttttgcaaa aaatgattgg 360

agcaattata cccagagcaa cgactatagc tttaaaagcg caagccagtt tgttgaatgg 420

gatcaggtta ccgcatatct gaatggtgtt ctggtttggg gtaaagaacc gagcgctagc 480

gcaagcgcat cagccggtgc aagtgctgca gcaagtgccg gtgctggtgc gggtgcaggt 540

cctggtcagc agggtccggg tcaacaagga cctggacagc aaggaccgta tggtccaggt 600

gcatcagctg cagccgcagc agcgggtggt tatggtccgg gaagcggtca gcaaggccct 660

tcacaacagg gaccaggcca acagggtcct ggcggtcaag gtccttatgg acctggtgct 720

tctgctgcgg cagcggctgc cggtggctat ggccctggta gtggccagca agggcctggt 780

ggccagggtc catatggccc aggttctagt gccgcagctg ctgctgcagg cggtaatgga 840

ccgggttcag gacaacaagg tgcagggcag caaggtcccg gacaacaggg tccaggtggt 900

agtgcagcag cggcagcagc tggcggatat ggaccaggta gtgggcaaca aggcccaggt 960

caacaagggc cagggggtca aggcccatac ggtccgggtg cttccgcagc cgcagctgca 1020

gcaggcggtt acggtcctgg tagtggtcaa ggtccaggcc agcaaggacc aggtggacaa 1080

gggccttacg gaccaggcgc atctgcggca gcagcagccg cagggggata tggtcctggt 1140

tcagggcagc agggaccagg tcagcaaggt ccaggtcagc agggacctgg gggtcaggga 1200

ccttacggtc ctggcgcaag tgcagctgca gcggcagcgg gtggctacgg accgggttat 1260

ggccagcagg gaccgggaca gcagggaccc ggtggacagg gtccgtatgg accgggtgca 1320

agtgcagcat cagcagcaag tggtggttac ggacctggct caggacagca aggccctggc 1380

caacaaggcc ctggcggaca gggaccctat gggccaggtg ccagcgctgc agcagccgca 1440

gccggtggat acggtccagg ctctggtcaa caaggtcctg ggcaacaagg tcctggccag 1500

cagggtccag gacagcaagg gcctggcggt caaggaccgt acggaccggg tgccagcgca 1560

gcggctgcag cggcaggcgg ttatggtcca ggatcaggcc agcaaggtcc gggtcagcaa 1620

ggcccagggc agcaaggacc gggtcaacag ggaccgggtc agcagggtcc tgggcaacag 1680

ggtccgggac aacagggacc aggtcaacaa ggaccgggtc aacaaggtcc aggtggtcag 1740

ggtgcatatg gtcctggcgc ttcagcagca gcaggggctg cagggggtta tggcccaggt 1800

agcggtcagc agggacccgg acaacaaggc cctggacaac agggtcccgg tcagcaaggg 1860

ccaggccaac aaggtccagg acaacaagga ccagggcagc agggtccagg ccaacaaggc 1920

ccttatggtc cgggtgccag tgctgcggca gcggcagctg ggggttatgg tccaggctct 1980

ggacagcagg gacctggcca gcaaggacct gggcagcaag ggccaggcgg tcaggcaagt 2040

gcatcagcaa gcgcagcagc gagtgcagca agcaccgttg cgaattctag ctccaacctg 2100

aaagttgagt tttataactc caatccgtca gatacgacga acagtattaa ccctcagttc 2160

aaagtgacaa acaccggttc aagcgccatc gatctgtcaa aactgacatt acgttactat 2220

tatacagtgg acggccagaa agaccaaacc ttctggtgcg accatgccgc aattatcggt 2280

tcaaatggtt catataacgg tatcacgagc aacgtcaaag gtacattcgt gaaaatgagt 2340

agctcaacca acaacgcaga tacctactta gaaatttcat ttacgggtgg tacgttagaa 2400

ccaggtgcgc acgtgcagat ccaaggtcgc ttcgccaaaa acgactggtc aaattataca 2460

cagtcgaatg actacagctt caaatcagca tcacagttcg tagagtggga tcaagtgaca 2520

gcctacctga acggcgtgct ggtgtggggc aaagaactcg agcaccacca ccaccaccac 2580

<210> 13

<211> 2271

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码融合蛋白CBM-L_N-L.hes.AcSp1-L_C-CBM-H6的核酸序列

<400> 13

atgggcaatc tgaaagtcga attttacaac agcaatccga gcgataccac gaacagcatc 60

aatccgcagt ttaaggttac gaacacgggc agctccgcaa ttgatctgtc aaaactgacc 120

ctgcgttatt actatacggt ggatggccag aaggaccaaa ccttttggtg cgaccatgcg 180

gccattatcg gctcgaacgg tagctacaat ggcatcacct cgaacgtcaa aggcacgttc 240

gtgaagatga gctctagtac caacaatgcc gatacgtatc tggaaattag ttttaccggc 300

ggtacgctgg aaccgggtgc acacgttcag atccaaggtc gcttcgctaa aaacgattgg 360

tctaattaca cccagtctaa cgactatagt tttaagtccg cgtcacagtt cgttgaatgg 420

gatcaagtca cggcctacct gaatggcgtg ctggtttggg gtaaagaacc gagcgcgagc 480

gcaagcgcaa gtgccggtgc aagcgcagca gcatcagccg gtgctggtgc aggcgccttt 540

ggtggtccga gtgccggtgg tgatgttgca gcaaaactgg cacgtagcct ggcaagcacc 600

ctggcaagca gcggtgtttt tcgtgcagca tttaatagcc gtgttagcac accggttgca 660

gttcagctga ccgatgcact ggttcagaaa attgcaagca atctgggtct ggattatgca 720

accgcaagca aactgcgtaa agcaagccag gcagttagca aagttcgtat gggtagcgat 780

accaatgcat atgcactggc aattagcagc gcactggcag aagttctgag cagcagcggt 840

aaagttgcag atgcaaacat taatcagatt gcaccgcagc tggcaagcgg tattgttctg 900

ggtgttagca ccaccgcacc gcagtttggt gttgatctga gcagcattaa tgtgaacctg 960

gatattagca atgtggcacg taatatgcag gcaagcattc agggtggtcc ggcaccgatt 1020

acagccgaag gtccggattt tggtgcaggt tatccgggtg gtgcaccgac cgatctgagc 1080

ggtctggata tgggtgcacc gagtgatggt agccgtggtg gtgatgcaac cgccaaactg 1140

ctgcaggcac tggttccggc actgctgaaa agtgatgtgt ttcgtgcaat ctataaacgt 1200

ggcacccgta aacaggttgt tcagtatgtt accaatagcg cactgcagca ggcagcaagc 1260

agcctgggcc tggatgcaag caccattagc cagctgcaga ccaaagcaac ccaggcactg 1320

agcagcgtta gcgcagatag cgatagcacc gcatatgcaa aagcatttgg tctggcaatt 1380

gcacaggttc tgggcaccag cggtcaggtt aatgatgcaa atgtgaatca gattggtgca 1440

aaactggcca ccggtattct gcgtggtagc agcgcagttg caccgcgtct gggtattgat 1500

ctgagtggta ttaatgtgga tagcgatatt ggtagcgtta ccagcctgat tctgagcggt 1560

agcaccctgc agatgaccat tccggcaggc ggtgatgatc tgtcaggtgg ctatccgggt 1620

ggctttcctg ccggtgcaca gccgagtggt ggcgcaccgg ttgatagcaa tattggtctg 1680

gttggcaccc aggatgttgc aattggtgtt agccagccgg ttgatgccag cgcaagcgca 1740

agtgcagcag caagcgcagc cagcaccgtt gcaaatagct ctagcaatct gaaagtcgaa 1800

ttttacaaca gcaatccgag cgataccacg aacagcatca atccgcagtt taaggttacg 1860

aacacgggca gctccgcaat tgatctgtca aaactgaccc tgcgttatta ctatacggtg 1920

gatggccaga aggaccaaac cttttggtgc gaccatgcgg ccattatcgg ctcgaacggt 1980

agctacaatg gcatcacctc gaacgtcaaa ggcacgttcg tgaagatgag ctctagtacc 2040

aacaatgccg atacgtatct ggaaattagt tttaccggcg gtacgctgga accgggtgca 2100

cacgttcaga tccaaggtcg cttcgctaaa aacgattggt ctaattacac ccagtctaac 2160

gactatagtt ttaagtccgc gtcacagttc gttgaatggg atcaagtcac ggcctacctg 2220

aatggcgtgc tggtttgggg taaagaactc gagcaccacc accaccacca c 2271

<210> 14

<211> 116

<212> PRT

<213> 酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)

<220>

<223> SpyCatcher

<400> 14

Gly Ala Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln

1 5 10 15

Ser Gly Asp Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe

20 25 30

Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Lys

35 40 45

Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly

50 55 60

Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu

65 70 75 80

Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr

85 90 95

Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly

100 105 110

Asp Ala His Ile

115

<210> 15

<211> 781

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SpyCatcher-L_ N-Nat.AQ12-L_C- SpyCatcher-H6

<400> 15

Met Gly Ala Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly

1 5 10 15

Gln Ser Gly Asp Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys

20 25 30

Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met

35 40 45

Lys Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp

50 55 60

Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val

65 70 75 80

Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe

85 90 95

Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys

100 105 110

Gly Asp Ala His Ile Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Gly Ala Ser

115 120 125

Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Pro Gly Gln Gln

130 135 140

Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly

145 150 155 160

Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly

165 170 175

Gln Gln Gly Pro Ser Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly

180 185 190

Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly

195 200 205

Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro

210 215 220

Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Asn Gly

225 230 235 240

Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Ala Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln

245 250 255

Gly Pro Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro

260 265 270

Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly

275 280 285

Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr

290 295 300

Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln

305 310 315 320

Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly

325 330 335

Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly

340 345 350

Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala

355 360 365

Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Tyr Gly Gln Gln Gly

370 375 380

Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala

385 390 395 400

Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ser Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln

405 410 415

Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro

420 425 430

Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser

435 440 445

Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly

450 455 460

Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala

465 470 475 480

Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly

485 490 495

Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro

500 505 510

Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly

515 520 525

Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Tyr Gly

530 535 540

Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly

545 550 555 560

Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro

565 570 575

Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly

580 585 590

Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala

595 600 605

Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly

610 615 620

Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Ala Ser

625 630 635 640

Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr Val Ala Asn Ser

645 650 655

Ser Ser Ala Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly

660 665 670

Gln Ser Gly Asp Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys

675 680 685

Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met

690 695 700

Lys Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp

705 710 715 720

Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val

725 730 735

Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe

740 745 750

Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys

755 760 765

Gly Asp Ala His Ile Leu Glu His His His His His His

770 775 780

<210> 16

<211> 2346

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SpyCatcher-L_ N-Nat.AQ12-L_C- SpyCatcher-H6

<400> 16

atgggcgcaa tggttgatac cctgagcggt ctgagcagcg aacagggtca gagcggtgat 60

atgaccattg aagaagatag cgcaacccac atcaaattca gcaaacgtga tgaagatggt 120

aaagaactgg caggcgcaac catgaaactg cgtgatagca gcggtaaaac cattagcacc 180

tggattagtg atggtcaggt gaaagatttt tatctgtacc ctggcaaata cacctttgtt 240

gaaaccgcag caccggatgg ttatgaagtt gcaaccgcaa ttacctttac cgttaatgaa 300

cagggccagg ttaccgtgaa tggtaaagca accaaaggtg atgcacatat tagtgctagc 360

gcaagcgcat cagccggtgc aagtgctgca gcaagtgccg gtgctggtgc gggtgcaggt 420

cctggtcagc agggtccggg tcaacaagga cctggacagc aaggaccgta tggtccaggt 480

gcatcagctg cagccgcagc agcgggtggt tatggtccgg gaagcggtca gcaaggccct 540

tcacaacagg gaccaggcca acagggtcct ggcggtcaag gtccttatgg acctggtgct 600

tctgctgcgg cagcggctgc cggtggctat ggccctggta gtggccagca agggcctggt 660

ggccagggtc catatggccc aggttctagt gccgcagctg ctgctgcagg cggtaatgga 720

ccgggttcag gacaacaagg tgcagggcag caaggtcccg gacaacaggg tccaggtggt 780

agtgcagcag cggcagcagc tggcggatat ggaccaggta gtgggcaaca aggcccaggt 840

caacaagggc cagggggtca aggcccatac ggtccgggtg cttccgcagc cgcagctgca 900

gcaggcggtt acggtcctgg tagtggtcaa ggtccaggcc agcaaggacc aggtggacaa 960

gggccttacg gaccaggcgc atctgcggca gcagcagccg cagggggata tggtcctggt 1020

tcagggcagc agggaccagg tcagcaaggt ccaggtcagc agggacctgg gggtcaggga 1080

ccttacggtc ctggcgcaag tgcagctgca gcggcagcgg gtggctacgg accgggttat 1140

ggccagcagg gaccgggaca gcagggaccc ggtggacagg gtccgtatgg accgggtgca 1200

agtgcagcat cagcagcaag tggtggttac ggacctggct caggacagca aggccctggc 1260

caacaaggcc ctggcggaca gggaccctat gggccaggtg ccagcgctgc agcagccgca 1320

gccggtggat acggtccagg ctctggtcaa caaggtcctg ggcaacaagg tcctggccag 1380

cagggtccag gacagcaagg gcctggcggt caaggaccgt acggaccggg tgccagcgca 1440

gcggctgcag cggcaggcgg ttatggtcca ggatcaggcc agcaaggtcc gggtcagcaa 1500

ggcccagggc agcaaggacc gggtcaacag ggaccgggtc agcagggtcc tgggcaacag 1560

ggtccgggac aacagggacc aggtcaacaa ggaccgggtc aacaaggtcc aggtggtcag 1620

ggtgcatatg gtcctggcgc ttcagcagca gcaggggctg cagggggtta tggcccaggt 1680

agcggtcagc agggacccgg acaacaaggc cctggacaac agggtcccgg tcagcaaggg 1740

ccaggccaac aaggtccagg acaacaagga ccagggcagc agggtccagg ccaacaaggc 1800

ccttatggtc cgggtgccag tgctgcggca gcggcagctg ggggttatgg tccaggctct 1860

ggacagcagg gacctggcca gcaaggacct gggcagcaag ggccaggcgg tcaggcaagt 1920

gcatcagcaa gcgcagcagc gagtgcagca agcaccgttg cgaattctag ctccgcaatg 1980

gttgataccc tgagcggtct gagcagcgaa cagggtcaga gcggtgatat gaccattgaa 2040

gaagatagcg caacccacat caaattcagc aaacgtgatg aagatggtaa agaactggca 2100

ggcgcaacca tgaaactgcg tgatagcagc ggtaaaacca ttagcacctg gattagtgat 2160

ggtcaggtga aagattttta tctgtaccct ggcaaataca cctttgttga aaccgcagca 2220

ccggatggtt atgaagttgc aaccgcaatt acctttaccg ttaatgaaca gggccaggtt 2280

accgtgaatg gtaaagcaac caaaggtgat gcacatattc tcgagcacca ccaccaccac 2340

cactga 2346

<210> 17

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头N

<400> 17

Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala

1 5 10 15

Gly Ala Gly Ala Gly Ala

20

<210> 18

<211> 100

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 纤连蛋白的第十个III型模块

<400> 18

Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr

1 5 10 15

Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg

20 25 30

Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln

35 40 45

Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu

50 55 60

Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg

65 70 75 80

Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr

85 90 95

Glu Ile Pro Ser

100

<210> 19

<211> 744

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FB10-L_N-ADF3-L_N-FB10-H6融合蛋白

<400> 19

Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr

1 5 10 15

Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg

20 25 30

Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln

35 40 45

Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu

50 55 60

Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg

65 70 75 80

Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr

85 90 95

Glu Ile Pro Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Gly Ala Ser Ala Ala

100 105 110

Ala Ser Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro

115 120 125

Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser

130 135 140

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln

145 150 155 160

Gly Pro Ser Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly

165 170 175

Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr

180 185 190

Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly

195 200 205

Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Asn Gly Pro Gly

210 215 220

Ser Gly Gln Gln Gly Ala Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro

225 230 235 240

Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser

245 250 255

Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr

260 265 270

Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro

275 280 285

Gly Ser Gly Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro

290 295 300

Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly

305 310 315 320

Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln

325 330 335

Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala

340 345 350

Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Tyr Gly Gln Gln Gly Pro Gly

355 360 365

Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala

370 375 380

Ala Ser Ala Ala Ser Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly

385 390 395 400

Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala

405 410 415

Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln

420 425 430

Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln

435 440 445

Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala

450 455 460

Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly

465 470 475 480

Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln

485 490 495

Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln

500 505 510

Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Tyr Gly Pro Gly

515 520 525

Ala Ser Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly

530 535 540

Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln

545 550 555 560

Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln

565 570 575

Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala

580 585 590

Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly

595 600 605

Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Ala Ser Ala Ser

610 615 620

Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr Val Ala Asn Ser Ser Ser

625 630 635 640

Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr

645 650 655

Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr

660 665 670

Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe

675 680 685

Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro

690 695 700

Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp

705 710 715 720

Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Ile

725 730 735

Leu Glu His His His His His His

740

<210> 20

<211> 175

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> γ-晶体蛋白D

<400> 20

Met Gly Lys Ile Thr Leu Tyr Glu Asp Arg Gly Phe Gln Gly Arg His

1 5 10 15

Tyr Glu Cys Ser Ser Asp His Pro Asn Leu Gln Pro Tyr Leu Ser Arg

20 25 30

Cys Asn Ser Ala Arg Val Asp Ser Gly Cys Trp Met Leu Tyr Glu Gln

35 40 45

Pro Asn Tyr Ser Gly Leu Gln Tyr Phe Leu Arg Arg Gly Asp Tyr Ala

50 55 60

Asp His Gln Gln Trp Met Gly Leu Ser Asp Ser Val Arg Ser Cys Arg

65 70 75 80

Leu Ile Pro His Ser Gly Ser His Arg Ile Arg Leu Tyr Glu Arg Glu

85 90 95

Asp Tyr Arg Gly Gln Met Ile Glu Phe Thr Glu Asp Cys Ser Cys Leu

100 105 110

Gln Asp Arg Phe Arg Phe Asn Glu Ile His Ser Leu Asn Val Leu Glu

115 120 125

Gly Ser Trp Val Leu Tyr Glu Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Arg Gln Tyr

130 135 140

Leu Leu Met Pro Gly Asp Tyr Arg Arg Tyr Gln Asp Trp Gly Ala Thr

145 150 155 160

Asn Ala Arg Val Gly Ser Leu Arg Arg Val Ile Asp Phe Ser Pro

165 170 175

<210> 21

<211> 897

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRYS-L_N-ADF3-L_c-CRYS-H6融合蛋白

<400> 21

Met Gly Lys Ile Thr Leu Tyr Glu Asp Arg Gly Phe Gln Gly Arg His

1 5 10 15

Tyr Glu Cys Ser Ser Asp His Pro Asn Leu Gln Pro Tyr Leu Ser Arg

20 25 30

Cys Asn Ser Ala Arg Val Asp Ser Gly Cys Trp Met Leu Tyr Glu Gln

35 40 45

Pro Asn Tyr Ser Gly Leu Gln Tyr Phe Leu Arg Arg Gly Asp Tyr Ala

50 55 60

Asp His Gln Gln Trp Met Gly Leu Ser Asp Ser Val Arg Ser Cys Arg

65 70 75 80

Leu Ile Pro His Ser Gly Ser His Arg Ile Arg Leu Tyr Glu Arg Glu

85 90 95

Asp Tyr Arg Gly Gln Met Ile Glu Phe Thr Glu Asp Cys Ser Cys Leu

100 105 110

Gln Asp Arg Phe Arg Phe Asn Glu Ile His Ser Leu Asn Val Leu Glu

115 120 125

Gly Ser Trp Val Leu Tyr Glu Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Arg Gln Tyr

130 135 140

Leu Leu Met Pro Gly Asp Tyr Arg Arg Tyr Gln Asp Trp Gly Ala Thr

145 150 155 160

Asn Ala Arg Val Gly Ser Leu Arg Arg Val Ile Asp Phe Ser Pro Ser

165 170 175

Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Gly

180 185 190

Ala Gly Ala Gly Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly

195 200 205

Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala

210 215 220

Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gln

225 230 235 240

Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro

245 250 255

Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser

260 265 270

Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser

275 280 285

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln

290 295 300

Gly Ala Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Ser Ala

305 310 315 320

Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly

325 330 335

Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala

340 345 350

Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln

355 360 365

Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly

370 375 380

Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly

385 390 395 400

Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly

405 410 415

Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly

420 425 430

Gly Tyr Gly Pro Gly Tyr Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro

435 440 445

Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala

450 455 460

Ser Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln

465 470 475 480

Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala

485 490 495

Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly

500 505 510

Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly

515 520 525

Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly

530 535 540

Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro

545 550 555 560

Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly

565 570 575

Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln

580 585 590

Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Ala Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala

595 600 605

Ala Gly Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro

610 615 620

Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly

625 630 635 640

Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln

645 650 655

Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly

660 665 670

Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro

675 680 685

Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala

690 695 700

Ala Ser Ala Ala Ser Thr Val Ala Asn Ser Ser Ser Gly Lys Ile Thr

705 710 715 720

Leu Tyr Glu Asp Arg Gly Phe Gln Gly Arg His Tyr Glu Cys Ser Ser

725 730 735

Asp His Pro Asn Leu Gln Pro Tyr Leu Ser Arg Cys Asn Ser Ala Arg

740 745 750

Val Asp Ser Gly Cys Trp Met Leu Tyr Glu Gln Pro Asn Tyr Ser Gly

755 760 765

Leu Gln Tyr Phe Leu Arg Arg Gly Asp Tyr Ala Asp His Gln Gln Trp

770 775 780

Met Gly Leu Ser Asp Ser Val Arg Ser Cys Arg Leu Ile Pro His Ser

785 790 795 800

Gly Ser His Arg Ile Arg Leu Tyr Glu Arg Glu Asp Tyr Arg Gly Gln

805 810 815

Met Ile Glu Phe Thr Glu Asp Cys Ser Cys Leu Gln Asp Arg Phe Arg

820 825 830

Phe Asn Glu Ile His Ser Leu Asn Val Leu Glu Gly Ser Trp Val Leu

835 840 845

Tyr Glu Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Arg Gln Tyr Leu Leu Met Pro Gly

850 855 860

Asp Tyr Arg Arg Tyr Gln Asp Trp Gly Ala Thr Asn Ala Arg Val Gly

865 870 875 880

Ser Leu Arg Arg Val Ile Asp Phe Ser Leu Glu His His His His His

885 890 895

His

<210> 22

<211> 2228

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码融合蛋白FB10-L_N-ADF3-L_N-FB10-H6的核酸序列

<400> 22

tgttagtgat gttccgcgtg atctggaagt tgttgcagca accccgacca gcctgctgat 60

tagctgggat gcaccggcag ttaccgttcg ttattatcgt attacctatg gtgaaaccgg 120

tggtaatagt ccggttcaag aatttaccgt tccgggtagc aaaagcaccg caaccattag 180

cggtctgaaa ccgggtgttg attacaccat taccgtttat gccgttaccg gtcgtggtga 240

ttcaccggca agcagcaaac cgattagcat taactatcgt accgaaattc cgagcgctag 300

cgcaagcgca agtgccggtg caagcgcagc agcatcagcc ggtgctggtg caggcgccgg 360

cccgggtcag caaggcccag gacagcaagg cccgggtcag cagggaccgt acggccctgg 420

tgcctcggcc gcagcagctg cagcaggagg atatggacct ggatctggtc agcagggccc 480

gtcgcagcag ggcccgggtc aacaaggccc aggcggccag ggcccgtatg gaccgggggc 540

gagtgccgct gccgctgccg ctggcggtta tgggcctggg tcaggtcagc aaggtcctgg 600

gggtcaggga ccatatgggc ctgggagttc ggccgcagcc gctgcggcgg gcggtaatgg 660

gcctggctcc gggcaacaag gcgctggtca acaaggacct gggcagcagg ggccgggcgg 720

tagcgctgcg gcagcagctg caggtgggta cggtccagga tcgggacaac aaggaccagg 780

tcaacagggg cctggcgggc aaggacctta tgggccggga gcctccgcgg cggcggctgc 840

agctggtggt tacggaccgg ggtcaggcca aggaccgggc cagcagggac cgggggggca 900

gggtccatac ggcccagggg cttcagcagc tgcagcagcg gcgggcggct atggtcctgg 960

ttcgggccag caagggccag ggcaacaagg tccagggcaa caagggcctg gcgggcaagg 1020

accttacggc ccaggagcgt cagcggcggc tgcggctgcc gggggctacg gcccgggcta 1080

tggtcagcag gggccgggtc agcagggacc gggtggtcag gggccatatg gtccaggggc 1140

ctctgccgca agcgcggcga gtgggggcta tgggccgggc tcgggacagc agggccctgg 1200

ccagcagggg ccagggggcc aaggaccgta tggaccaggc gcatcggcgg cagccgccgc 1260

ggcgggagga tatggtcctg ggagcggtca gcagggaccg ggccagcaag gacctggtca 1320

gcaagggcca ggtcaacaag ggccgggtgg gcaagggcca tacgggccag gagcctcagc 1380

agcggctgcc gcggctggtg ggtacggtcc gggttcgggc cagcaaggac ctggacaaca 1440

gggtccaggt cagcaaggcc caggccaaca gggtccgggg cagcaagggc caggtcagca 1500

aggtcctggt caacaaggtc cagggcagca gggaccgggc cagcaagggc caggcggtca 1560

aggtgcgtat ggaccggggg catctgccgc tgcaggggcc gccggtggtt atggcccggg 1620

ctccgggcag caagggcctg ggcaacaggg gcctggccaa caaggcccag gacagcaagg 1680

tccaggccaa caggggcctg ggcaacaagg gcctggccag caagggcctg gccaacaagg 1740

tccgtatggt cctggcgcaa gcgcggcagc ggcggcagcc ggtggatacg gcccaggaag 1800

cgggcaacaa ggtcctgggc agcaggggcc tggtcaacaa ggaccgggcg gtcaggccag 1860

cgcaagcgca agtgcagcag caagcgcagc cagcaccgtt gcgaattctt ctagcgttag 1920

tgatgttccg cgtgatctgg aagttgttgc agcaaccccg accagcctgc tgattagctg 1980

ggatgcaccg gcagttaccg ttcgttatta tcgtattacc tatggtgaaa ccggtggtaa 2040

tagtccggtt caagaattta ccgttccggg tagcaaaagc accgcaacca ttagcggtct 2100

gaaaccgggt gttgattaca ccattaccgt ttatgccgtt accggtcgtg gtgattcacc 2160

ggcaagcagc aaaccgatta gcattaacta tcgtaccgaa attctcgagc accaccacca 2220

ccaccact 2228

<210> 23

<211> 2689

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码融合蛋白CRYS-L_N-ADF3-L_c-CRYS-H6的核酸序列

<400> 23

tgggtaaaat taccctgtat gaagatcgtg gttttcaggg tcgtcattat gaatgtagca 60

gcgatcatcc gaatctgcag ccgtatctga gccgttgtaa tagcgcacgt gttgatagcg 120

gttgttggat gctgtatgaa cagccgaatt atagtggtct gcagtatttt ctgcgtcgcg 180

gtgattatgc agatcatcag cagtggatgg gtctgagcga tagcgttcgt agctgtcgtc 240

tgattccgca tagcggtagc catcgtattc gtctgtatga gcgtgaagat tatcgtggtc 300

agatgattga atttacggaa gattgtagct gtctgcagga tcgttttcgc tttaatgaaa 360

ttcatagcct gaatgtgctg gaaggtagct gggttctgta cgaactgagc aattatcgcg 420

gtcgtcagta tctgctgatg cctggtgatt atcgtcgtta tcaggattgg ggtgcaacca 480

atgcgcgtgt tggtagcctg cgtcgtgtta ttgattttag cccgagcgct agcgcaagcg 540

catcagccgg tgcaagtgct gcagcaagtg ccggtgctgg tgcgggtgca ggtcctggtc 600

agcagggtcc gggtcaacaa ggacctggac agcaaggacc gtatggtcca ggtgcatcag 660

ctgcagccgc agcagcgggt ggttatggtc cgggaagcgg tcagcaaggc ccttcacaac 720

agggaccagg ccaacagggt cctggcggtc aaggtcctta tggacctggt gcttctgctg 780

cggcagcggc tgccggtggc tatggccctg gtagtggcca gcaagggcct ggtggccagg 840

gtccatatgg cccaggttct agtgccgcag ctgctgctgc aggcggtaat ggaccgggtt 900

caggacaaca aggtgcaggg cagcaaggtc ccggacaaca gggtccaggt ggtagtgcag 960

cagcggcagc agctggcgga tatggaccag gtagtgggca acaaggccca ggtcaacaag 1020

ggccaggggg tcaaggccca tacggtccgg gtgcttccgc agccgcagct gcagcaggcg 1080

gttacggtcc tggtagtggt caaggtccag gccagcaagg accaggtgga caagggcctt 1140

acggaccagg cgcatctgcg gcagcagcag ccgcaggggg atatggtcct ggttcagggc 1200

agcagggacc aggtcagcaa ggtccaggtc agcagggacc tgggggtcag ggaccttacg 1260

gtcctggcgc aagtgcagct gcagcggcag cgggtggcta cggaccgggt tatggccagc 1320

agggaccggg acagcaggga cccggtggac agggtccgta tggaccgggt gcaagtgcag 1380

catcagcagc aagtggtggt tacggacctg gctcaggaca gcaaggccct ggccaacaag 1440

gccctggcgg acagggaccc tatgggccag gtgccagcgc tgcagcagcc gcagccggtg 1500

gatacggtcc aggctctggt caacaaggtc ctgggcaaca aggtcctggc cagcagggtc 1560

caggacagca agggcctggc ggtcaaggac cgtacggacc gggtgccagc gcagcggctg 1620

cagcggcagg cggttatggt ccaggatcag gccagcaagg tccgggtcag caaggcccag 1680

ggcagcaagg accgggtcaa cagggaccgg gtcagcaggg tcctgggcaa cagggtccgg 1740

gacaacaggg accaggtcaa caaggaccgg gtcaacaagg tccaggtggt cagggtgcat 1800

atggtcctgg cgcttcagca gcagcagggg ctgcaggggg ttatggccca ggtagcggtc 1860

agcagggacc cggacaacaa ggccctggac aacagggtcc cggtcagcaa gggccaggcc 1920

aacaaggtcc aggacaacaa ggaccagggc agcagggtcc aggccaacaa ggcccttatg 1980

gtccgggtgc cagtgctgcg gcagcggcag ctgggggtta tggtccaggc tctggacagc 2040

agggacctgg ccagcaagga cctgggcagc aagggccagg cggtcaggca agtgcatcag 2100

caagcgcagc agcgagtgca gcaagcaccg ttgcgaattc tagctccggt aaaattaccc 2160

tgtatgaaga tcgtggtttt cagggtcgtc attatgaatg tagcagcgat catccgaatc 2220

tgcagccgta tctgagccgt tgtaatagcg cacgtgttga tagcggttgt tggatgctgt 2280

atgaacagcc gaattatagt ggtctgcagt attttctgcg tcgcggtgat tatgcagatc 2340

atcagcagtg gatgggtctg agcgatagcg ttcgtagctg tcgtctgatt ccgcatagcg 2400

gtagccatcg tattcgtctg tatgagcgtg aagattatcg tggtcagatg attgaattta 2460

cggaagattg tagctgtctg caggatcgtt ttcgctttaa tgaaattcat agcctgaatg 2520

tgctggaagg tagctgggtt ctgtacgaac tgagcaatta tcgcggtcgt cagtatctgc 2580

tgatgcctgg tgattatcgt cgttatcagg attggggtgc aaccaatgcg cgtgttggta 2640

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Claims

1.丝融合蛋白(silk fusion protein)作为粘合剂(adhesive)的用途，其中所述丝融合蛋白包含丝状蛋白(silk-like protein)序列和位于所述丝状蛋白序列侧翼的两个单独的非丝末端模块(module)序列。

2.根据权利要求1的用途，其中所述丝融合蛋白包含蜘蛛丝蛋白序列。

3.根据权利要求2的用途，其中所述蜘蛛丝蛋白重复序列包含10-50个丝聚合物重复，并且其中所述重复序列包含与SEQ ID NO：2的重复Q序列或其变体组合的SEQ ID NO：1的重复A序列或其变体，或由与SEQ ID NO：2的重复Q序列或其变体组合的SEQ ID NO：1的重复A序列或其变体组成。

4.根据权利要求3的用途，其中所述蜘蛛丝蛋白重复序列是(AQ)12。

5.根据权利要求3的用途，其中所述蜘蛛丝蛋白重复序列是包含SEQ ID NO：3的序列的十字园蛛(Araneus diadematus)ADF3，包含SEQ ID NO：4的序列的黑寡妇蜘蛛(Latrodectus hesperus)AcSp1序列或其变体。

6.根据前述权利要求中任一项的用途，其中在所述丝状蛋白序列侧翼的所述非丝末端模块序列包含纤维素结合模块(CBM)、SpyCatcher(SpyC)、纤连蛋白(fibronectin)、γ-晶体蛋白(crystallin)结构域或其混合对。

7.根据权利要求6的用途，其中所述纤维素结合模块(CBM)来自热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)，包含SEQ ID NO：7的序列或其变体，所述SpyCatcher结构域是酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的纤连蛋白(fibronectin)结合蛋白FbaB的工程化变体，包含SEQ ID NO：14的序列或其变体，所述纤连蛋白来自智人(Homo sapiens)，包含SEQ ID NO：18的序列或其变体，并且所述γ-晶体蛋白D结构域来自智人，包含SEQ ID NO：20的序列或其变体。

8.根据权利要求6或7的用途，其中位于所述丝状蛋白序列侧翼的所述纤维素结合模块、所述SpyCatcher结构域、纤连蛋白的第十个III型模块或γ-晶体蛋白D序列通过接头序列与所述丝状蛋白序列连接。

9.根据权利要求8的用途，其中所述接头序列选自下组：SEQ ID NO：6的C-末端接头和SEQ ID NO：5的N-末端接头。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的用途，其中所述非丝末端模块序列包含形成β-折叠的连续β链。

11.根据权利要求10的用途，其中所述非丝末端模块序列的长度在90-250个氨基酸的范围内。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的用途，其中所述非丝末端模块序列包含位于所述丝状蛋白序列侧翼的一对肽或混合对肽，其中所述肽选自下组：纤维素结合模块(CBM)、SpyCatcher结构域、纤连蛋白的第十个III型模块、γ-晶体蛋白D、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、泛素(ubiquitin)样蛋白SMT3、硫氧还蛋白1(thioredoxin 1)、SnoopCatcher结构域、黏连蛋白(cohesin)、R2蛋白、肿瘤坏死因子细胞因子CD40配体、肿瘤坏死因子、B细胞活化因子(BAFF)，及其变体或同系物(homolog)。

13.根据权利要求1-12中任一项的用途，其中所述非丝末端模块序列是人类来源的肽。

14.根据权利要求1-13中任一项的用途，其中所述丝融合蛋白与选自下组的一种或多种处于组合物中：表面活性剂、氧化剂、交联剂和填充剂(filler)。

15.包含丝融合蛋白作为活性成分的粘合剂，其中所述丝融合蛋白包含丝状蛋白序列和位于所述丝状蛋白序列侧翼的两个单独的非丝末端模块序列。

16.根据权利要求15的粘合剂，其中所述丝融合蛋白包含蜘蛛丝蛋白序列。

17.根据权利要求16的粘合剂，其中所述蜘蛛丝蛋白重复序列包含10-50个丝聚合物重复，并且其中所述重复序列包含与SEQ ID NO：2的重复Q序列或其变体组合的SEQ ID NO：1的重复A序列或其变体，或由与SEQ ID NO：2的重复Q序列或其变体组合的SEQ ID NO：1的重复A序列或其变体组成。

18.根据权利要求17的粘合剂，其中所述蜘蛛丝蛋白重复序列是(AQ)12。

19.根据权利要求16的粘合剂，其中所述蜘蛛丝蛋白重复序列是包含SEQ ID NO：3的序列的十字园蛛ADF3，包含SEQ ID NO：4的序列的黑寡妇蜘蛛AcSp1序列或其变体。

20.根据权利要求15-19中任一项的粘合剂，其中在所述丝状蛋白序列侧翼的所述非丝末端模块序列包含纤维素结合模块(CBM)、SpyCatcher、纤连蛋白、γ-晶体蛋白结构域或其混合对。

21.根据权利要求20的粘合剂，其中所述纤维素结合模块(CBM)来自热纤梭菌，包含SEQID NO：7的序列或其变体，并且所述SpyCatcher结构域是酿脓链球菌的纤连蛋白结合蛋白FbaB的工程化变体，包含SEQ ID NO：14的序列或其变体，所述纤连蛋白是来自智人的纤连蛋白的第十个III型模块，包含SEQ ID NO：18的序列或其变体，并且所述γ-晶体蛋白D结构域来自智人，包含SEQ ID NO：20的序列或其变体。

22.根据权利要求20或21的粘合剂，其中位于所述丝状蛋白序列侧翼的所述纤维素结合模块或所述SpyCatcher结构域、纤连蛋白的第十个III型模块或γ-晶体蛋白D序列通过接头序列与所述丝状蛋白序列连接。

23.根据权利要求22的粘合剂，其中所述接头序列选自下组：SEQ ID NO：6的C-末端接头和SEQ ID NO：5的N-末端接头。

24.根据权利要求15-23中任一项的粘合剂，其中所述非丝末端模块序列包含形成β-折叠的连续β-链。

25.根据权利要求24的粘合剂，其中所述非丝末端模块序列的长度在90-250个氨基酸的范围内。

26.根据权利要求15-25中任一项的粘合剂，其中所述非丝末端模块序列包含在所述丝状蛋白序列侧翼的一对肽或混合对肽，其中所述肽选自下组：纤维素结合模块(CBM)、SpyCatcher结构域、纤连蛋白的第十个III型模块、γ-晶体蛋白D、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、泛素样蛋白SMT3、硫氧还蛋白1、SnoopCatcher结构域、黏连蛋白、R2蛋白、肿瘤坏死因子细胞因子CD40配体、肿瘤坏死因子、B细胞活化因子(BAFF)，及其变体或同系物。

27.根据权利要求15-26中任一项的粘合剂，其中所述非丝末端模块序列是人类来源的肽。

28.根据权利要求15-27中任一项的粘合剂，其中所述丝融合蛋白与选自下组的一种或多种处于组合物中：表面活性剂、氧化剂、交联剂和填充剂。

29.根据权利要求15-28中任一项的粘合剂，其用于医学应用。

30.根据权利要求29的粘合剂，其中所述医学应用是外科手术或牙科手术(dentaloperation)或伤口处理。

31.制备复合物的方法，其包括以下步骤：a)提供第一基质(substrate)，b)将权利要求15-28中任一项的粘合剂应用到所述基质上，和c)使由步骤b)获得的基质接触第二基质或表面以形成复合物，其中所述第一基质与所述第二基质或表面的粘附通过所述粘合剂增强。

32.生产丝融合蛋白的浓缩相的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在水性介质(aqueous medium)中制备丝融合蛋白的溶液，其中所述融合蛋白从重组生产宿主中分离，并且包含丝状蛋白序列和位于所述丝状蛋白序列侧翼的两个单独的非丝末端模块序列；

b)在所述水性介质中浓缩所述融合蛋白直到发生液相分离；

c)收集步骤b)中获得的所述水性介质的富含蛋白质的相

e)任选地将所述融合蛋白的聚集体与步骤d)中获得的可溶性融合蛋白分离并从溶液中除去所述聚集体；

f)将步骤d)或e)中获得的溶液浓缩至约60-80％w/v的最终蛋白质浓度，其中进行步骤a)至f)以使所述丝融合蛋白不被沉淀并随后溶解于所述水性介质中。

33.根据权利要求32的方法，其中所述方法包括进一步的步骤：

g)从步骤f)获得的浓缩物中制备丝融合蛋白纤维。

34.根据权利要求32或33的方法，其中步骤b)和f)通过离心力和/或蒸发进行。

35.根据权利要求32-34中任一项的方法，其中所述水性介质是水或水性缓冲液。

36.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述丝融合蛋白包含蜘蛛丝蛋白序列。

37.根据权利要求36的方法，其中所述蜘蛛丝蛋白重复序列包含10-50个丝聚合物重复，并且其中所述重复序列由与SEQ ID NO：2的重复Q序列或其变体组合的SEQ ID NO：1的重复A序列或其变体组成。

38.根据权利要求37的方法，其中所述蜘蛛丝蛋白重复序列是(AQ)12。

39.根据权利要求36的方法，其中所述蜘蛛丝蛋白序列是包含SEQ ID NO：3的序列的十字园蛛ADF3，SEQ ID NO：4的黑寡妇蜘蛛AcSp1序列或其变体。

40.根据权利要求32-39中任一项的方法，其中在所述丝状蛋白序列侧翼的所述非丝末端模块序列包含纤维素结合模块(CBM)、SpyCatcher结构域、γ-晶体蛋白D结构域、纤连蛋白的第十个III型模块或其混合对。

41.根据权利要求40的方法，其中所述纤维素结合模块(CBM)来自热纤梭菌，包含SEQID NO：7的序列或其变体，并且所述SpyCatcher结构域是酿脓链球菌的纤连蛋白结合蛋白FbaB的工程化变体，包含SEQ ID NO：14的序列或其变体。

42.根据权利要求40或41的方法，其中在所述丝状蛋白序列侧翼的所述纤维素结合模块或所述SpyCatcher结构域通过接头序列与所述丝状蛋白序列连接。

43.根据权利要求42的方法，其中所述接头序列选自下组：SEQ ID NO：6的C-末端接头和SEQ ID NO：5的N-末端接头。

44.根据权利要求33-43中任一项的方法，其中在步骤g)中通过用拉力从浓缩物中拉出纤维来制备所述纤维。

45.根据权利要求32-44中任一项的方法，其包含从表达所述融合蛋白的宿主细胞中分离重组融合蛋白的进一步初始步骤。

46.根据权利要求32-45中任一项的方法，其中所述非丝末端模块序列包含形成β-折叠的连续β-链。

47.根据权利要求46的方法，其中所述非丝末端模块序列的长度在90-250个氨基酸的范围内。

48.根据权利要求32-47中任一项的方法，其中所述非丝末端模块序列包含在所述丝状蛋白序列侧翼的一对肽或混合对肽，其中所述肽选自下组：纤维素结合模块(CBM)、SpyCatcher结构域、纤连蛋白的第十个III型模块、γ-晶体蛋白D、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、泛素样蛋白SMT3、硫氧还蛋白1、SnoopCatcher结构域、黏连蛋白、R2蛋白、肿瘤坏死因子细胞因子CD40配体、肿瘤坏死因子、B细胞活化因子(BAFF)，及其变体或同系物。

49.通过根据权利要求33-48中任一项的方法生产的丝纤维。

50.根据权利要求49的纤维，其中所述丝纤维由蜘蛛丝融合蛋白构成。

51.根据权利要求49的纤维，其中所述丝纤维由蜘蛛丝融合蛋白构成，所述蜘蛛丝融合蛋白包含12个丝聚合物重复和在所述丝聚合物重复侧翼的来自热纤梭菌的两个纤维素结合模块(CBM)，其中所述重复序列由与SEQ ID NO:2的重复Q序列组合的SEQ ID NO：1的重复A序列组成，所述纤维素结合模块由SEQ ID NO：7的序列组成，每个模块通过SEQ ID NO：6的C-末端接头或SEQ ID NO：5的N-末端接头与所述重复连接。

52.根据权利要求49的纤维，其中所述丝纤维由SEQ ID NO：3的蜘蛛丝蛋白重复序列ADF3或SEQ ID NO：4的黑寡妇蜘蛛AcSp1序列，和位于所述丝蛋白重复侧翼的来自热纤梭菌的两个纤维素结合模块(CBM)构成，所述纤维素结合模块由SEQ ID NO：7的序列组成，每个模块通过SEQ ID NO：6的C-末端接头或SEQ ID NO：5的N-末端接头与所述重复序列ADF3或黑寡妇蜘蛛AcSp1序列连接。

53.根据权利要求49的纤维，其中所述丝纤维由SEQ ID NO:3的蜘蛛丝蛋白重复序列十字园蛛ADF3和位于所述丝蛋白重复序列侧翼的来自酿脓链球菌的两个SpyCatcher结构域构成，所述SpyCatcher结构域由SEQ ID NO：14的序列组成，每个结构域通过SEQ ID NO：6的C-末端接头或SEQ ID NO：17的N-末端接头与所述重复序列ADF3连接。

54.通过根据权利要求36的方法的步骤a)-f)生产的蜘蛛丝融合蛋白的浓缩物。

55.根据权利要求54的浓缩物，其中所述浓缩物是包含蜘蛛丝融合蛋白的凝聚层(coacervate)，所述蜘蛛丝融合蛋白包含12个丝聚合物重复和在所述丝聚合物重复侧翼的来自热纤梭菌的两个纤维素结合模块(CBM)，其中所述重复序列由与SEQ ID NO:2的重复Q序列组合的SEQ ID NO：1的重复A序列组成，所述纤维素结合模块由SEQ ID NO：7的序列组成，每个模块通过SEQ ID NO：6的C-末端接头或SEQ ID NO：5的N-末端接头与所述重复连接。

56.根据权利要求54的浓缩物，其中所述浓缩物是凝聚层，其包含SEQ ID NO：3的蜘蛛丝蛋白重复序列ADF3或SEQ ID NO：4的黑寡妇蜘蛛AcSp1序列；和位于所述丝蛋白重复侧翼的来自热纤梭菌的两个纤维素结合模块(CBM)，所述纤维素结合模块由SEQ ID NO：7的序列组成，每个模块通过SEQ ID NO：6的C-末端接头或SEQ ID NO：5的N-末端接头与所述重复序列ADF3或黑寡妇蜘蛛AcSp1序列连接。

57.根据权利要求54的浓缩物，其中所述浓缩物是凝聚层，其包含SEQ ID NO：3的蜘蛛丝蛋白重复序列十字园蛛ADF3，和位于所述丝蛋白重复序列侧翼的来自酿脓链球菌的两个SpyCatcher结构域，所述SpyCatcher结构域由SEQ ID NO：14的序列组成，每个结构域通过SEQ ID NO：6的C-末端接头或SEQ ID NO：17的N-末端接头与所述重复序列ADF3连接。

58.重组蜘蛛丝融合蛋白，其包含丝聚合物重复和来自热纤梭菌的两个纤维素结合模块(CBM)，其中所述重复序列由与SEQ ID NO：2的重复Q序列组合的SEQ ID NO：1的重复A序列组成，所述纤维素结合模块由SEQ ID NO：7的序列组成，每个模块通过SEQ ID NO：6的C-末端接头或SEQ ID NO：5的N-末端接头与所述重复连接。

59.根据权利要求58的重组蜘蛛丝融合蛋白，其中所述丝聚合物重复序列是(AQ)12。

60.根据权利要求58或59的重组蜘蛛丝融合蛋白，其包含SEQ ID NO：8。

61.重组蜘蛛丝融合蛋白，其包含SEQ ID NO：3的蜘蛛丝蛋白重复序列ADF3，或SEQ IDNO：4的黑寡妇蜘蛛AcSp1序列；和来自热纤梭菌的两个纤维素结合模块(CBM)，所述纤维素结合模块由SEQ ID NO：7的序列组成，每个模块通过SEQ ID NO：6的C-末端接头或SEQ IDNO：5的N-末端接头与所述重复序列ADF3或所述黑寡妇蜘蛛AcSp1序列连接。

62.重组蜘蛛丝融合蛋白，其包含SEQ ID NO：3的蜘蛛丝蛋白重复序列十字园蛛ADF3，和位于所述丝蛋白重复序列侧翼的从酿脓链球菌的纤连蛋白结合蛋白FbaB工程化改造的两个SpyCatcher结构域，所述SpyCatcher结构域由SEQ ID NO：14的序列组成，每个结构域通过SEQ ID NO：6的C-末端接头或SEQ ID NO：17的N-末端接头与所述重复序列ADF3连接。

63.重组蜘蛛丝融合蛋白，其包含SEQ ID NO：3的蜘蛛丝蛋白重复序列十字园蛛ADF3，和位于所述丝蛋白重复序列侧翼的来自智人的两个纤连蛋白的第十个III型模块，所述纤连蛋白的第十个III型模块由SEQ ID NO：18的序列组成，每个结构域通过SEQ ID NO：6的C-末端接头或SEQ ID NO：17的N-末端接头与所述重复序列ADF3连接。

64.重组蜘蛛丝融合蛋白，其包含SEQ ID NO：3的蜘蛛丝蛋白重复序列十字园蛛ADF3，和位于所述丝蛋白重复序列侧翼的来自智人的两个γ-晶体蛋白D结构域，所述γ-晶体蛋白D结构域由SEQ ID NO：20的序列组成，每个结构域通过SEQ ID NO：6的C-末端接头或SEQID NO：17的N-末端接头与所述重复序列ADF3连接。

65.表达根据权利要求58-64中任一项的融合蛋白的重组核酸。

66.宿主细胞，其包含根据权利要求65的核酸并表达根据权利要求58-64中任一项的蛋白质。