JP2015515969A - 有機ターゲットに結合するための反復断片を持たないクモ糸融合タンパク質の構造 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は組換え融合タンパク質の分野、より具体的にはクモ糸タンパク質(スピドロイン)に由来する部分を含む新規融合タンパク質に関する。本発明は、スピドロインに由来する部分を含む組換え融合タンパク質を含むポリマーであるタンパク質構造を提供する方法を与える。また、有機ターゲットに結合するための新規なタンパク質構造を与える。
応用タンパク質化学において、活性、典型的には生物活性ペプチドを、活性に関連する部位、典型的には有機ターゲット、例えば、核酸、タンパク質、タンパク質の複合体、タンパク質及び/又は脂質及び/又は糖質及び/又は核酸などに対していかに調製又は提示するかは一般的な問題である。最も簡単な解決策は、生物活性ペプチド又はタンパク質の水溶液を提供することである。しかしながら、多くの適用が所望の目標を達成するために幾つかの更なる手段を要求する。例えば、ペプチド/タンパク質は、脂質混合物と会合するか又は支持構造体に化学的に固定化されてもよい。
本発明は、有機ターゲットとの選択的相互作用が可能な固体タンパク質構造が、反復構造単位として組換え融合タンパク質のポリマーの形態で調製できるとする見識に一般的に基づいている。融合タンパク質は、有機ターゲットと選択的に相互作用することが可能である、好ましくは30以上のアミノ酸残基の、少なくとも一の非スピドロイン部分と、及び融合タンパク質はクモ糸タンパク質の反復断片に由来する任意の部分を含んでいないという条件でクモ糸タンパク質の少なくともC末端断片に対応する部分とを含有している。
L(AG)nL、例えばLA1G1A2G2A3G3A4G4A5G5L;
L(AG)nAL、例えばLA1G1A2G2A3G3A4G4A5G5A6L;
L(GA)nL、例えばLG1A1G2A2G3A3G4A4G5A5L;又は
L(GA)nGL、例えばLG1A1G2A2G3A3G4A4G5A5G6L。
アラニンリッチセグメント又はグリシンリッチセグメントは、N末端又はC末端のリンカーセグメントに隣接しているかどうかは重要ではないということになる。nは2から10の整数、好ましくは2から8、好ましくは4から8、より好まれるのは4から6であり、即ち、n=4、n=5、又はn=6である。
オリゴヌクレオチドはまた親和性リガンドとして使用することができる。アプタマーもしくはデコイと呼ばれる一本鎖核酸は、明確に定義された三次元構造にフォールドし、高い親和性と特異性でそれらのターゲットに結合する(Ellington AD and Szostak JW (1990) Nature 346:818-822; Brody EN and Gold L (2000) J. Biotechnol. 74:5-13; Mayer G and Jenne A (2004) BioDrugs 18:351-359)。オリゴヌクレオチドリガンドは、RNA又はDNAの何れかとすることができ、ターゲット分子のクラスの広い範囲に結合することができる。
NTに共有結合したCTが繊維を形成することができるかを調べるため、NT−CT融合タンパク質(NT部分とCT部分)を生成し、精製した。
クローニング
His6NT−CT融合タンパク質(配列番号59)をコードする遺伝子を構築した。ベクターは、カナマイシン(70μg/ml)を補充した寒天プレート上で増殖させたケモコンピテント(chemocompetent)大腸菌(E. coli)BL21(DE3)細胞に形質転換した。コロニーをその後採取し、正しい挿入のためにPCR検査をし、その後またDNA配列を確認するために配列決定した。
pT7His6NTCTベクターを有する大腸菌BL21(DE3)細胞を、カナマイシン(70μg/ml)を補充したルリア−ベルターニ(Luria−Bertani)培地(全6リットル)で、30℃で1−1.5のOD600値まで増殖させ、次に、300μMのIPTG(イソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド)で発現を誘導し、約2時間、20℃でさらにインキュベートした。次に、細胞を4700rpmで20分間の遠心分離により回収し、得られた細胞ペレットを、20mMトリス(pH8.0)中に溶解した。
20mMトリス(pH8.0)中に溶解させた細胞ペレットは、細菌細胞を溶解するために、リゾチーム及びDNアーゼIが補充され、細胞溶解物を30分間15000回転の遠心後に回収した。次に、回収した細胞溶解物を分割し、合計4つのキレートセファロースファーストフローZn2+カラムにロードし、タンパク質がHis6タグを介してカラムマトリックスに結合するように保った。洗浄後、結合したタンパク質を20mMのトリス/300mMのイミダゾール(pH8.0)で溶出した。NTCTの収率は、CT又はRep4CTよりも典型的に高かった。次に、プールされた溶出液を一晩、20mMトリス(pH8.0)の5リットルに対して透析し、1mg/mlに濃縮し、最終的に繊維又は薄膜を形成させた。pHが6.4未満に減少した場合には、繊維はより速く形成された。
NTNTに共有結合されるものの、CTが繊維を形成することができるかを調べるため、NTNT−CT融合タンパク質(NTNT部分とCT部分)を生成し、精製した。
クローニング
His6NTNT−CT融合タンパク質(配列番号60)をコードする遺伝子を構築した。ベクターは、カナマイシン(70μg/ml)を補充した寒天プレート上で増殖させたケモコンピテント(chemocompetent)大腸菌(E. coli)BL21(DE3)細胞に形質転換した。コロニーをその後採取し、正しい挿入のためにPCR検査をし、その後またDNA配列を確認するために配列決定した。
pT7His6NTNTCTベクターを有する大腸菌BL21(DE3)細胞を、カナマイシン(70μg/ml)を補充したルリア−ベルターニ(Luria−Bertani)培地(全6リットル)で、30℃で1−1.5のOD600値まで増殖させ、次に、300μMのIPTGで発現を誘導し、約2時間、20℃でさらにインキュベートした。次に、細胞を4700rpmで20分間の遠心分離により回収し、得られた細胞ペレットを、20mMトリス(pH8.0)中に溶解した。
20mMトリス(pH8.0)中に溶解させた細胞ペレットは、細菌細胞を溶解するために、リゾチーム及びDNアーゼIが補充され、細胞溶解物を30分間15000回転の遠心後に回収した。次に、回収した細胞溶解物を分割し、合計4つのキレートセファロースファーストフローZn2+カラムにロードし、タンパク質がHis6タグを介してカラムマトリックスに結合するように保った。洗浄後、結合したタンパク質を20mMのトリス/300mMのイミダゾール(pH8.0)で溶出した。NTNTCTの収率は、CT又はRep4CTよりも典型的に高かった。次に、プールされた溶出液を一晩、20mMトリス(pH8.0)の5リットルに対して透析し、1mg/mlに濃縮し、最終的に繊維又は薄膜を形成させた。pHが6.4未満に減少した場合には、繊維はより速く形成された。
融合タンパク質の概念を証明するために、CTタンパク質(CT部分)はZタンパク質ドメイン(B部分)と融合して生成される。Zドメインは、ブドウ球菌タンパク質の免疫グロブリンG(IgG)結合ドメインBの改変版であり、IgGの結晶化(Fc)領域断片に結合する58アミノ酸長の三重らせんモチーフである。目標は、CTに融合したZドメインからなる融合タンパク質から、例えば、繊維、薄膜及び膜などの構造体を生成し、及びドメインZのIgG結合能力、並びにCTの構造形成特性をなお保持することが可能であるかどうかを探索することである。そのために、CTのN末端又はC末端のZドメインからなる融合タンパク質をクローニングする。
His6ZCT及びHis6CTZ融合タンパク質(配列番号61−62)をコードする遺伝子が構築され、カナマイシン(70μg/ml)を補充した寒天プレート上で増殖させたケモコンピテント(chemocompetent)大腸菌(E. coli)BL21(DE3)細胞に形質転換する。コロニーをその後採取し、正しい挿入のためにPCR検査をし、その後また正しいDNA配列を確認するために配列決定する。
pT7His6ZCT又はpT7His6CTZベクターを有する大腸菌BL21(DE3)細胞を、カナマイシン(70μg/ml)を補充したルリア−ベルターニ培地(全6リットル)で、30℃で1−1.5のOD600値まで増殖させ、次に、300μMのIPTGでHis6ZCT又はHis6CTZ発現を誘導し、約2時間、20℃でさらにインキュベートする。次に、細胞を4700rpmで20分間の遠心分離により回収し、得られた細胞ペレットを、20mMトリス(pH8.0)中に溶解する。
20mMトリス(pH8.0)中に溶解させた細胞ペレットは、細菌細胞を溶解するために、リゾチーム及びDNアーゼIが補充され、すぐに細胞溶解物を30分間15000回転の遠心後に回収する。次に、回収した細胞溶解物を分割し、合計4つのキレートセファロースファーストフローZn2+カラムにロードし、His6ZCTタンパク質がHis6タグを介してカラムマトリックスに結合するように保つ。洗浄後、結合したタンパク質を20mMのトリス/300mMのイミダゾール(pH8.0)で溶出した。プールされた溶出画分を一晩、20mMトリス(pH8.0)の5リットルに対して透析し、1mg/mlに濃縮し、最終的に繊維を形成させた。
融合タンパク質構造のB部分の、有機ターゲットとの選択的相互作用の能力を探索するために、融合タンパク質のZドメインのIgGに結合する能力を試験した。この融合タンパク質の繊維と薄膜を、精製したIgG及び血清からのIgGの結合のために用い、その後溶出し続いてSDS−PAGEで分析し、ここでIgGは非還元条件下で〜146kDaのバンドとして現れる。
融合タンパク質の概念を証明するために、NT−CTタンパク質(NT部分とCT部分)はZタンパク質ドメイン(B部分)と融合して生成される。目標は、NTCTに融合したZドメインからなる融合タンパク質から、例えば、繊維、薄膜及び膜などの構造体を生成し、及びドメインZのIgG結合能力、並びにCTの構造形成特性をなお保持することが可能であるかどうかを探索することである。そのために、NTCTのN末端及びC末端のZドメインからなる融合タンパク質をクローニングする。
His6ZNTCT及びHis6NTCTZ融合タンパク質(配列番号63−64)をコードする遺伝子が構築され、カナマイシン(70μg/ml)を補充した寒天プレート上で増殖させたケモコンピテント(chemocompetent)大腸菌(E. coli)BL21(DE3)細胞に形質転換する。コロニーをその後採取し、正しい挿入のためにPCR検査をし、その後またDNA配列を確認するために配列決定する。
pT7His6ZNTCT及びpT7His6NTCTZベクターを有する大腸菌BL21(DE3)細胞を、カナマイシン(70μg/ml)を補充したルリア−ベルターニ(Luria-Bertani)培地(全6リットル)で、30℃で1−1.5のOD600値まで増殖させ、次に、300μMのIPTGで発現を誘導し、約2時間、20℃でさらにインキュベートする。次に、細胞を4700rpmで20分間の遠心分離により回収し、得られた細胞ペレットを、20mMトリス(pH8.0)中に溶解する。
20mMトリス(pH8.0)中に溶解させた細胞ペレットは、細菌細胞を溶解するために、リゾチーム及びDNアーゼIが補充され、すぐに細胞溶解物を30分間15000回転の遠心後に回収する。次に、回収した細胞溶解物を分割し、合計4つのキレートセファロースファーストフローZn2+カラムにロードし、His6ZNTCT又はHis6NTCTZタンパク質がHis6タグを介してカラムマトリックスに結合するように保つ。洗浄後、結合したタンパク質を20mMのトリス/300mMのイミダゾール(pH8.0)で溶出した。プールされた溶出画分を一晩、20mMトリス(pH8.0)の5リットルに対して透析し、1mg/mlに濃縮し、最終的に繊維を形成させた。
融合タンパク質構造のB部分の、有機ターゲットとの選択的相互作用の能力を探索するために、融合タンパク質のZドメインのIgGに結合する能力を試験した。この融合タンパク質の繊維と薄膜を、精製したIgG及び血清からのIgGの結合のために用い、その後溶出し続いてSDS−PAGEで分析し、ここでIgGは非還元条件下で〜146kDaのバンドとして現れる。
融合タンパク質の概念を証明するために、NTNT−CTタンパク質(NTNT及びCT部分)はZタンパク質ドメイン(B部分)と融合して生成される。目標は、NTNTCTに融合したZドメインからなる融合タンパク質から、例えば、繊維、薄膜及び膜などの構造体を生成し、及びドメインZのIgG結合能力、並びにCTの構造形成特性をなお保持することが可能であるかどうかを探索することである。そのために、NTNTCTのN末端及びC末端のZドメインからなる融合タンパク質をクローニングする。
His6ZNTCT及びHis6NTCTZ融合タンパク質(配列番号65−66)をコードする遺伝子が構築され、カナマイシン(70μg/ml)を補充した寒天プレート上で増殖させたケモコンピテント(chemocompetent)大腸菌(E. coli)BL21(DE3)細胞に形質転換する。コロニーをその後採取し、正しい挿入のためにPCR検査をし、その後またDNA配列を確認するために配列決定する。
pT7His6ZNTNTCT及びpT7His6NTNTCTZベクターを有する大腸菌BL21(DE3)細胞を、カナマイシン(70μg/ml)を補充したルリア−ベルターニ(Luria-Bertani)培地(全6リットル)で、30℃で1−1.5のOD600値まで増殖させ、次に、300μMのIPTGで発現を誘導し、約2時間、20℃でさらにインキュベートする。次に、細胞を4700rpmで20分間の遠心分離により回収し、得られた細胞ペレットを、20mMトリス(pH8.0)中に溶解する。
20mMトリス(pH8.0)中に溶解させた細胞ペレットは、細菌細胞を溶解するために、リゾチーム及びDNアーゼIが補充され、すぐに細胞溶解物を30分間15000回転の遠心後に回収する。次に、回収した細胞溶解物を分割し、合計4つのキレートセファロースファーストフローZn2+カラムにロードし、His6ZNTNTCT又はHis6NTNTCTZタンパク質がHis6タグを介してカラムマトリックスに結合するように保つ。洗浄後、結合したタンパク質を20mMのトリス/300mMのイミダゾール(pH8.0)で溶出した。プールされた溶出画分を一晩、20mMトリス(pH8.0)の5リットルに対して透析し、1mg/mlに濃縮し、最終的に繊維を形成させた。
融合タンパク質構造のB部分の、有機ターゲットとの選択的相互作用の能力を探索するために、融合タンパク質のZドメインのIgGに結合する能力を試験した。この融合タンパク質の繊維と薄膜を、精製したIgG及び血清からのIgGの結合のために用い、その後溶出し続いてSDS−PAGEで分析し、ここでIgGは非還元条件下で〜146kDaのバンドとして現れる。
NTCT及びCTは、連鎖球菌プロテインG由来のアルブミン結合ドメイン(ABD)との融合で生成された。ABDはアルブミンと結合する5kDaの三重らせんモチーフである。目標は、NTCTに融合したABDドメイン(His6−ABD−NTCTと表記;配列番号68)及びCTに融合したABDドメイン(His6−ABD−CTと表記;配列番号70)からそれぞれなる融合タンパク質から、例えば、繊維及び薄膜などの構造体を生成し、及びABDドメインのアルブミン結合能力、並びにNTCT及びCTの構造形成特性をなお保持することが可能であるかどうかを探索することであった。そのために、NTCT及びCTのN末端に融合したABDドメインからなる2つの融合タンパク質がクローニングされた。
His6−ABD−CT融合タンパク質(配列番号70)をコードする遺伝子(配列番号69)は以下のように構築した。プライマーは、そのようなABD配列を含むベクターからドメインABDのPCR断片を生成するために設計された。また、プライマーは、制限エンドヌクレアーゼNdeI及びEcoRIの認識部位を含有していた。得られたPCR生成物は、その後、標的ベクター(カナマイシン耐性遺伝子を有するpAff8His6TrxHis6CTを示す)のように、制限エンドヌクレアーゼNdeI及びEcoRIで処理した。ターゲットベクターの制限切断に際し、His6TrxHis6部分が切断された。切断されたPCR断片と目標ベクターを、T4 DNAリガーゼを用いて互いに連結し、そして、得られた正しく連結されたベクター(pT7His6−ABD−CT)は、カナマイシン(50μg/ml)を補充した寒天プレート上に増殖させたケモコンピテント(chemocompetent)大腸菌(E. coli) BL21(DE3)細胞に形質転換された。コロニーをその後採取し、正しい挿入のためにスクリーニングし、続いて、標的ベクター中にABDが挿入されたDNA配列を確認するために配列決定した。
pT7His6−ABD−CTベクターを有する大腸菌BL21(DE3)細胞を、カナマイシン(50μg/ml)を補充したルリア−ベルターニ(Luria-Bertani)培地(全3リットル)で、30℃で1−1.5のOD600値まで増殖させ、次に、300μMのIPTGでpT7His6−ABD−CTの発現を誘導し、約17時間、14℃でさらにインキュベートした。次に、細胞を4700rpmで20分間の遠心分離により回収し、得られた細胞ペレットを、20mMトリス(pH8.0)中に溶解した。
20mMのトリス(pH8.0)中に溶解した細胞ペレットは、細菌細胞を溶解するために、リゾチーム及びDNアーゼIを補充され、その後、NaClとイミダゾールをそれぞれ200mM及び10mMの最終濃度まで添加した。30分間の遠心分離(15000rpm)後、細胞溶解物を回収した。次に、回収した細胞溶解物をキレートセファロースファストフローZN2+カラムにロードし、His6タグを介してHis6−ABD−CTタンパク質がマトリックスに結合するように保った。洗浄後、結合したタンパク質を20mMのトリス/200mMのイミダゾール(pH8.0)/300mMのNaClで溶出した。溶出物は、A280の測定によると28.8mgのHis6−ABD−CTタンパク質を含んでいた。次に、溶出したタンパク質を、一晩、20mMのトリス(pH8.0)を3リットルに対して透析し、その後、1.48mg/mlに濃縮し、6.216mgのHis6−ABD−CT融合タンパク質の最終量を得た。
His6−ABD−CTの薄膜は、薄膜あたり1mg/mlの可溶性融合タンパク質の15μlから、96ウェルプレート(組織培養プレート、浮遊細胞、83.1835.500、ザルスタット)中で成型された。次いで、薄膜を一晩凝固させた(20℃、35%相対湿度)。1mg/mlのタンパク質溶液の15μlからHis6−ABD−NTCTの薄膜を成型するために同じ手順が続けられた。
アルブミンに結合するABD−NTCTの薄膜の能力を評価するために、アルブミンの源としてヒト血漿を使用した。ABD−NTCT及びABD−CTの4つの薄膜は、1×PBSの150μlで予め湿らせ、続いて室温で30分間、ヒト血漿(1:5希釈)の100μlでのインキュベーションを行った。200μlの1×PBSで3回洗浄した後、結合したアルブミンを、溶出緩衝液(即ち、0.5M酢酸、1M尿素、100mMのNaCl)によりpHを約2.7まで下げることによって50μlで溶出し、その後溶出画分を非還元SDS−PAGEにより分析した。NTCT及びCTの薄膜がコントロール材料として使用され、同じ方法で処理された。
(1−4)ABD−NTCT薄膜の四連、14μlロードされた;
(5−8)ABD−CT薄膜の四連、14μlロードされた;
(9)タンパク質のラダー;
(10−13)NTCT(コントロール)薄膜の四連;
(14−16)CT(コントロール)薄膜の三連;
(17)ヒト血漿(1:50)、8μlロードされた。
単量体ストレプトアビジン(M4)ドメインは、NTCT及びCTタンパク質との融合でそれぞれ産生された。M4ドメインは、四量体ストレプトアビジンの変異型バージョンであり、ビオチンに非共有結合する159アミノ酸長のタンパク質ドメインである。我々の目標は、NTCTに融合したM4ドメイン(His6−M4−NTCTと表記;配列番号72)及びCTに融合したM4ドメイン(His6−M4−CTと表記;配列番号74)からそれぞれなる融合タンパク質から、例えば、薄膜、発泡体及び繊維などの構造体を生成し、及びM4ドメインのビオチン結合能力、並びにNTCT及びCTの構造形成特性をなお保持することが可能であるかどうかを探索することであった。そのために、NTCT及びCTのN末端に融合したM4ドメインからなる2つの融合タンパク質がクローニングされた。
His6−M4−CT融合タンパク質(配列番号74)をコードする遺伝子(配列番号73)が実施例6に記載されるように構築されたが、プライマーは、M4配列などを含むベクターからドメインM4のPCR断片を生成するために設計された。標的ベクターは、pAff8His6TrxHis6CTと記され、His6TrxHis6部分はNdeI及びEcoRIによる処理により切断された。正確に連結されたベクターは、pT7His6M4−CTと示される。
His6M4−CT及びHis6M4−NTCTの産生は、実施例6に記載したのと同様に行われた。
His6M4−CT及びHis6M4−NTCTの精製は、実施例6に記載したのと同様に行われた。
His6M4−CT及びHis6M4−NTCTの薄膜は、実施例6に記載したように成型された。繊維は、可溶性融合タンパク質の1.14mg/mlからHis6−M4−NTCTで作られた(図5a)。発泡体は、1.39mg/mlの可溶性融合タンパク質の30μlからHis6−M4−CTで作られた(図5b)。NTCT又はCTは別のタンパク質、即ち159アミノ酸長のM4ドメインに融合されているが、His6−M4−NTCT及びHis6−M4−CTの薄膜、繊維、及び発泡体を得ることができたという事実は、NTCT及びCTはM4ドメインに融合されているにもかかわらず、それらの構造形成特性を保持していることを示している。
スポットされたHis6−M4−NTCT及びHis6−M4−CTの薄膜は、標的タンパク質分子をそれぞれ0.34ナノモル及び0.5ナノモル含有する。2つの糸が融合したM4構築物のビオチン結合能を評価するために、各構築物において2つの薄膜を選択し、Atto−565ビオチンの等量でインキュベートすることにより、薄膜中に存在する標的タンパク質分子の量と比較して分析した。その後、標識されたビオチンを除去し、薄膜を1×PBS100μlで3回洗浄した。最終的に、100μlの1×PBSが薄膜に添加され、その後倒立ニコンエクリプスTi機器(563nmで励起、592nmで発光)を用いて蛍光顕微鏡分析を行った。NTCT(0.55ナノモル)及びCT(1.28ナノモル)の薄膜がコントロール材料として使用され、同じ方法で処理された。
NTCT及びCTは、単一鎖断片変異体(scFv1)と命名される操作された抗体断片との融合体として産生された。scFv1は、自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス(SLE)に特異的な抗原を認識する、27kDaの一価、操作された抗体断片である。我々の目標は、NTCTに融合したscFv1タンパク質ドメイン(His6−scFv1−NTCTと表記;配列番号76)及びCTに融合したscFv1タンパク質ドメイン(His6−scFv1−CTと表記;配列番号78)からそれぞれなる融合タンパク質から、例えば、繊維、発泡体及び薄膜などの構造体を生成し、及びscFv1タンパク質ドメインの抗原結合能力、並びにNTCT及びCTの構造形成特性をなお保持することが可能であるかどうかを探索することであった。そのために、NTCT及びCTのN末端に融合したscFv1ドメインからなる2つの融合タンパク質がクローニングされた。
His6−scFv1−CT融合タンパク質(配列番号78)をコードする遺伝子(配列番号77)が実施例6に記載されるように構築されたが、プライマーは、scFv1配列などを含むベクターからドメインscFv1のPCR断片を生成するために設計された。標的ベクターは、pAff8His6TrxHis6CTと記され、His6TrxHis6部分はNdeI及びEcoRIによる処理により切断された。正確に連結されたベクターは、pT7His6scFv1−CTと示される。
His6−scFv1−CT及びHis6−scFv1−NTCTの産生は、pT7His6−scFv1−NTCTの産生が、6リットルの培養培地の総容量で行ったことを除いて、実施例6に記載したのと同様に行われた。
His6−scFv1−CT及びpHis6−scFv1−NTCTの精製は、実施例6に記載したのと同様に行われた。
His6−scFv1−NTCTの溶出物含量は4.86mgであった。タンパク質の濃度が2.14mg/mlに到達後、2.57mgのHis6−scFv1−NTCT融合タンパク質の最終量が得られた。
His6−scFv1−CTの薄膜は、薄膜あたり5μMの可溶性融合タンパク質の1μlからマイクロアレイスライド(プラスチックMaxiSorp、Nunc)上にスポットされた。次いで、温度と湿度が調節された部屋で、薄膜を一晩凝固させた。5μMのタンパク質溶液の1μlからHis6−scFv1−NTCTの薄膜を成型するために同じ手順が続けられた。
純粋な抗体(scFv1、コントロール)及び糸が融合した抗体(scFv1−NTCT)は、透明及び黒のポリマーマキシソープマイクロアレイスライド(NUNC、25x76mm)上に5μMのタンパク質溶液の1μLを手動で添加することでマイクロアレイ形式にスポットされ、135ピコモルの純粋な抗体(scFv1)及が274ピコモルの融合した抗体(scFv1−NTCT)をそのスポットされた薄膜中に得た。薄膜形態中にタンパク質をスポットした後、薄膜を、温度と湿度が調節された部屋で一晩乾燥させた。次いで、アレイは、200μlのサンプルバッファー(PBS中に1%(w/v)の無脂肪粉乳及び1%(v/v)のTween−20を含む)を90分間適用することによりブロックし、その後、200〜300μlの洗浄緩衝液(PBS中に0.05%(v/v)のTween−20を含む)を適用することによって3回洗浄した。全てのインキュベーションは、室温で穏やかに撹拌して行った。次に、100−200μlのサンプルバッファー中で希釈されたビオチン化抗原サンプル(10nM)が適用され、1時間インキュベートした。アレイは、その後、200〜300μlの洗浄緩衝液を適用することによって3回洗浄し、結合した抗原を検出するために、試料緩衝液中に希釈されたアレクサ647標識ストレプトアビジン(1μg/ml)の100〜200μlを、アレイ上に適用し、1時間インキュベートした。最後に、アレイを200〜300μlの洗浄緩衝液で3回洗浄し、窒素気流下で乾燥した。アレイは、共焦点マイクロアレイ蛍光スキャナー(ScanArray Express, Perkin-Elmer Life & Analytical Sciences)を用いてスキャンした。スキャンアレイエクスプレス(ScanArray Express)ソフトウェアV2.0(Perkin-Elmer Life & Analytical Sciences)を用いて各スポットの強度を定量した。同じ分析手順を、His6−scFv1−CT融合タンパク質を分析するために行った。
酵素活性を有するタンパク質をNTCT及びCTと融合させる概念を証明するために、枯草菌由来の酵素のキシラナーゼAはNTCT及びCTのそれぞれとの融合体で産生された。キシラナーゼA(エンド−1,4−β−キシラナーゼA)は185アミノ酸長であり(シグナルペプチドなし)、グリコシルヒドロラーゼ11(セルロースG)ファミリーに属する。キシラナーゼAの酵素機能は、植物細胞壁中のヘミセルロースの主要成分であるキシランのβ−1,4グリコシド結合を切断することである。我々の目標は、NTCTに融合したキシラナーゼA(Xyl−NTCTと表記;配列番号80)及びCTに融合したキシラナーゼA(Xyl−CTと表記;配列番号82)からそれぞれなる融合タンパク質から、例えば、繊維、発泡体及び薄膜などの構造体を生成し、及びキシラナーゼの酵素活性、並びにCTの構造形成特性をなお保持することが可能であるかどうかを探索することであった。そうするために、1)NTCT及び2)CTのN末端側のキシラナーゼからなる2つの融合タンパク質がクローニングされた。
His6Xyl−CT融合タンパク質(配列番号82)をコードする遺伝子(配列番号81)が実施例6に記載されるように構築されたが、プライマーは、キシラナーゼ配列などを含むベクターからキシラナーゼドメインのPCR断片を生成するために設計された。標的ベクターは、pAff8His6TrxHis6CTと記され、His6TrxHis6部分はNdeI及びEcoRIによる処理により切断された。正確に連結されたベクターは、pT7His6Xyl−CTと示される。
His6Xyl−CT及びHis6Xyl−NTCTの産生は、実施例6に記載したのと同様に行われた。
His6Xyl−CT及びHis6Xyl−NTCTの精製は、実施例6に記載したのと同様に行われた。
His6Xyl−CTの薄膜は96ウェルプレート(組織培養プレート、浮遊細胞、83.1835.500、ザルスタット)中で成型された。各薄膜は、1.0mg/mlの可溶性のHis6Xyl−CTの15μlから、pH8とpH6の両方で作成された。次いで、薄膜を一晩凝固させた(20℃、35%相対湿度)。同じ手順がHis6Xyl−NTCTの薄膜の成型のために行われ、各薄膜は0.41mg/mlの可溶性His6Xyl−NTCTの15μlから(pH8とpH6の両方で)成型された。
キシラナーゼは、2つのキシロース残基の間のβ−1,4グリコシド結合を切断する酵素である。NTCT又はCTに融合したキシラナーゼ(Xyl)の酵素の能力を試験するため、His6Xyl−CT及びHis6Xyl−NTCTの各薄膜は、90μlのMcIlvaine緩衝液(pH6.0)によりインキュベートする。全ての薄膜について50℃で10分間のプレインキュベーション後、40mMのPNX(p−ニトロフェニルキシロピラノシド)基質10μlが添加され、少なくとも10分間、50℃でさらにインキュベートした。次いで、停止溶液(0.5MのNa2CO3)100μlが各薄膜に添加され、酵素反応からの生成物を同定するために410nmで吸光度測定を行った。前述したのと同じ手順により成型されたNTCT及びCTの薄膜がコントロールとしてインキュベートされた。
細胞刺激作用を有するペプチドをNTCT及びCTと融合させる概念を証明するために、ヒト上皮成長因子(EGF)がNTCT及びCTのそれぞれとの融合体で産生された。EGFは、多くの細胞型、例えばケラチノサイトの細胞表面に見られる上皮成長因子受容体(EGFR)に対して高い親和性を有する53アミノ酸残基長の成長因子である。EGFRに結合すると、タンパク質−チロシンキナーゼ活性が刺激され、細胞内で様々な生化学的変化を生じ、細胞成長及び増殖を誘発する。我々の目標は、NTCTに融合したEGF(EGF−NTCTと表記;配列番号84)及びCTに融合したEGF(EGF−CTと表記;配列番号86)からそれぞれなる融合タンパク質から、例えば、繊維及び薄膜などの構造体を生成し、及びEGFの細胞刺激作用、並びにCTの構造形成特性をなお保持することが可能であるかどうかを探索することであった。そうするために、1)NTCT及び2)CTのN末端側のEGFからなる2つの融合タンパク質がクローニングされた。
His6EGF−CT(配列番号86)融合タンパク質をコードする遺伝子(配列番号85)が実施例6に記載されるように構築されたが、プライマーは、EGF配列などを含むベクターからEGFのPCR断片を生成するために設計された。標的ベクターは、pAff8His6TrxHis6CTと記され、His6TrxHis6部分はNdeI及びEcoRIによる処理により切断された。正確に連結されたベクターは、pT7His6EGF−CTと示される。
His6EGF−CT及びHis6EGF−NTCTの産生は、実施例6に記載したのと同様に行われた。
His6EGF−CT及びHis6EGF−NTCTの精製は、実施例6に記載したのと同様に行われた。
薄膜及び繊維は、His6EGF−CT及びHis6EGF−NTCTの両方から、実施例6に記載したように作成される。
CTに融合した場合(His6EGF−CTと表記)又はNTCTに融合した場合(His6EGF−NTCTと表記)、EGFのケラチノサイトに対する細胞刺激能力が調べられた。この目的のために、融合タンパク質His6EGF−CT及びHis6EGF−NTCTの薄膜がそれぞれ使用される。正常ヒト表皮ケラチノサイト(初代細胞)は、細胞培養培地(KGM−GOLD、Lonza)中に3500又は7000細胞/cm2の密度でマトリックス上に組換えヒトEGF含み又は含まずに播種される。培地は一日おきに交換される。生存細胞及び死細胞を、24、48、72及び96時間後に生/死アッセイ(Molecular Probes)で染色する。顕微鏡写真は10倍の倍率で倒立蛍光顕微鏡(ニコンエクリプスTi)の中で行われる。
Claims (47)
- B及びCTの部分を含む組換え融合タンパク質であって、
融合タンパク質は、クモ糸タンパク質の反復断片に由来する任意の部分を含んでいないという条件で、
Bは有機ターゲットとの選択的相互作用の能力を提供する非スピドロイン部分であり;及び
CTは70から120アミノ酸残基からなる部分で、クモ糸タンパク質のC末端断片に由来する、組換え融合タンパク質。 - CT部分が、配列番号9に少なくとも50%同一性、又は配列番号7に少なくとも80%同一性を有する、請求項1に記載の組換え融合タンパク質。
- B部分が、配列番号6から10の何れかに30%未満の同一性を有する、請求項1又は2の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質。
- 有機ターゲットが、免疫グロブリン及び免疫グロブリン又はその誘導体を含む分子からなる群から選択される、請求項1から3の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質。
- 免疫グロブリンがヒト由来の免疫グロブリンのサブクラスのIgG1、IgG2、IgG4、IgA及びIGMから選択される、請求項4に記載の組換え融合タンパク質。
- B部分が、ブドウ球菌プロテインAに由来するZドメイン、及びそのE、D、A、B及びCドメイン、連鎖球菌プロテインG、及びそのC1、C2及びC3ドメイン;及びこれらのアミノ酸配列の何れかに少なくとも70%同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される、請求項4又は5の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質。
- B部分が、ブドウ球菌プロテインAに由来するZドメイン、ブドウ球菌プロテインAのBドメイン、及び連鎖球菌プロテインGのC2ドメイン;及びこれらのアミノ酸配列の何れかに少なくとも70%同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される、請求項6に記載の組換え融合タンパク質。
- B部分が、ブドウ球菌プロテインAに由来するZドメイン、及び連鎖球菌プロテインGのC2ドメインからなる群から選択される、請求項7に記載の組換え融合タンパク質。
- 有機ターゲットが、アルブミン及びアルブミン又はその誘導体を含む分子からなる群から選択される、請求項1から3の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質。
- B部分が、連鎖球菌プロテインG、連鎖球菌プロテインGのアルブミン結合ドメイン、Finegoldia magna由来のGAモジュール;及びこれらのアミノ酸配列の何れかに対して少なくとも70%同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される、請求項9に記載の組換え融合タンパク質。
- B部分が、連鎖球菌プロテインGのアルブミン結合ドメイン、及びこれに対して少なくとも70%同一性を有するタンパク質断片を含む、請求項9又は10の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質。
- B部分が、連鎖球菌プロテインGのアルブミン結合ドメインである、請求項11に記載の組換え融合タンパク質。
- 有機ターゲットが、ビオチン及びビオチン又はその誘導体若しくは類似体を含む分子からなる群から選択される、請求項1から3の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質。
- B部分が、ストレプトアビジン、単量体ストレプトアビジン(M4);及びこれらのアミノ酸配列の何れかに対して少なくとも70%同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される、請求項13に記載の組換え融合タンパク質。
- B部分が、単量体ストレプトアビジン(M4)である、請求項14に記載の組換え融合タンパク質。
- 式Bx−CT−Bzにより定義され、x及びzは0から5の整数であり、及びx+z≧1である、タンパク質の群から選択される、請求項1から15の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質。
- 式Bx−CT及びCT−Bzにより定義され、x及びzは1から5の整数である、タンパク質の群から選択される、請求項16に記載の組換え融合タンパク質。
- 式B−CT及びCT−Bにより定義されるタンパク質の群から選択される、請求項17に記載の組換え融合タンパク質。
- 配列番号61−66;及びこれらのタンパク質の何れかに対して少なくとも80%同一性を有するタンパク質からなる群から選択される、請求項1から18の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質。
- 請求項1から19の何れか一項に記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸。
- 請求項19に記載の融合タンパク質をコードする核酸からなる群から選択される、請求項20に記載の単離された核酸。
- 有機ターゲットと選択的相互作用が可能なタンパク質構造であって、前記タンパク質構造が、請求項1から19の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質を反復構造単位として含有するポリマーであり、B部分が有機ターゲットとの選択的相互作用の能力を提供する、タンパク質構造。
- 前記タンパク質構造が少なくとも2次元で少なくとも0.1μmの大きさを有する、請求項22に記載のタンパク質構造。
- 前記タンパク質構造が、繊維、薄膜、発泡体、網、メッシュ、球及びカプセルからなる群から選択される物理的形態である、請求項22から23の何れか一項に記載のタンパク質構造。
- タンパク質構造が、組換え融合タンパク質を反復構造単位として含有するポリマーであり、B部分が有機ターゲットとの選択的相互作用の能力を提供することを特徴とする、有機ターゲットと選択的相互作用が可能な前記タンパク質構造の産生のための、請求項1から19の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質の使用。
- サンプルからの有機ターゲットの分離における、請求項22から24の何れか一項に記載のタンパク質構造の使用。
- 細胞の培養における、請求項22から24の何れか一項に記載のタンパク質構造の使用。
- 以下の工程:
a)適切な宿主において、請求項1から19の何れか一項に記載の融合タンパク質を発現し;及び
b)融合タンパク質を含む混合物を得て、任意で融合タンパク質を単離することを含む、融合タンパク質を生産する方法。 - (a)請求項1から19の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質を提供し;
(b)融合タンパク質を、組換え融合タンパク質を含むポリマーの形成を達成するための条件にさらす工程を含む、
有機ターゲットに対する結合活性を示す、請求項22から24の何れか一項に記載のタンパク質構造を提供する方法。 - 有機ターゲットの固定化のための親和性培地であって、前記親和性培地が請求項1から19の何れか一項に記載の融合タンパク質を含み、B部分が有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である、親和性培地。
- 前記親和性培地が請求項22から24の何れか一項に記載のタンパク質構造を含み、該タンパク質構造が組換え融合タンパク質を含むポリマーである、請求項30に記載の親和性培地。
- 前記有機ターゲットを更に含み、B部分が前記有機ターゲットと選択的相互作用が可能であり該有機ターゲットに結合される、請求項30から31の何れか一項に記載の親和性培地。
- 前記有機ターゲットが第二有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である、請求項32に記載の親和性培地。
- 細胞表面に存在する有機ターゲットを有する細胞の培養のための細胞足場材料であって、前記細胞足場材料が請求項22から24の何れか一項に記載のタンパク質構造を含む細胞足場材料。
- B部分が、細胞表面上に存在する有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である、請求項34に記載の細胞足場材料。
- 前記細胞足場材料が中間体有機ターゲットを更に含み、B部分が、前記中間体有機ターゲットとの選択的相互作用が可能であり前記中間体有機ターゲットに結合され、前記中間体有機ターゲットが細胞表面に存在する有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である、請求項34に記載の細胞足場材料。
- 請求項34から36の何れか一項に記載の細胞と細胞足場材料の組み合わせ。
- 有機ターゲットを含むサンプルを提供し;
親和性培地は有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である、請求項30から33の何れか一項に記載の親和性培地を提供し;
前記親和性培地を、親和性培地と有機ターゲット間の結合を達成するために適した条件下で前記サンプルと接触させ;及び
非結合サンプルを除去する工程を含む、
サンプルからの有機ターゲットの分離のための方法。 - 第一有機ターゲットと第二有機ターゲット間の結合を達成するために適した条件下で、第一有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である、第二有機ターゲットと、前記親和性培地及び固定化有機ターゲットを接触させる工程を更に含む、請求項38に記載の方法。
- 親和性培地中の融合タンパク質は、親和性培地と有機ターゲット間の結合を達成するために前記親和性培地と前記サンプルを接触させると、請求項22から24の何れか一項に記載のタンパク質構造として存在する、請求項38又は39の何れか一項に記載の方法。
- 親和性培地と有機ターゲットの間の結合を達成するために前記親和性培地を前記サンプルと接触させると、親和性培地中の融合タンパク質が溶液中に存在し、有機ターゲットに結合した融合タンパク質の複合体に、請求項22から24の何れか一項に記載の融合タンパク質構造を形成させる、請求項38又は39の何れか一項に記載の方法。
- 前記親和性培地上で固定化ターゲットの存在を検出し、及び任意で定量化する工程を更に含む、請求項38から41の何れか一項に記載の方法。
- 親和性培地から有機ターゲットを放出し、及び回収する工程を更に含む、請求項38から42の何れか一項に記載の方法。
- 化学的処理及び/又は滅菌加熱処理により親和性培地を再生する最終工程を更に含む、請求項38から43の何れか一項に記載の方法。
- 化学的処理がNaOH及び/又は尿素による処理を含む、請求項44に記載の方法。
- 目的の細胞を含むサンプルを提供し;
前記サンプルを請求項34から36の何れか一項に記載の細胞足場材料に適用し、前記細胞足場材料が細胞表面に存在する有機ターゲットとの選択的相互作用が可能であり;及び
前記細胞を、細胞表面上の有機ターゲットと前記細胞足場材料との間の結合により、前記細胞足場材料に対して固定化させることを含む、
細胞を固定化するための方法。 - 請求項40に記載の細胞足場材料に目的の細胞を固定化し;及び
それに適用された細胞を有する前記細胞足場材料を細胞培養に適した条件下で維持することを含む、
細胞を培養するための方法。
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