CN114702547B - 通过对氨基酸侧链修饰获得的穿膜性多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明属于化学生物学穿膜性多肽领域，提供了一种制备细胞穿膜肽的方法，包括：以主链Fmoc保护、侧链Alloc保护的鸟氨酸为原料，在固相进行酰胺缩合反应，形成肽键；使用吗啡啉的N,N‑二甲基甲酰胺溶液脱除Fmoc保护基，以游离被Fmoc保护的氨基；四(三苯基膦)钯催化下，在干燥的DCM溶剂中，反应瓶内氮气保护下，脱去侧链Alloc保护基团；在有机溶剂中，在碱二异丙基乙基胺存在下，侧链修饰上带苄基的鸟氨酸。本发明通过胺酯交换反应实现肽键的逐个形成，在氨基酸侧链修饰上必要基团，达到改变多肽性质的目的，适合实验室多肽合成和工业化生产。

Description

通过对氨基酸侧链修饰获得的穿膜性多肽
技术领域
本发明属于化学生物学穿膜性多肽领域，具体涉及硫脲类似物氧化修饰得到的穿膜性多肽。本发明还涉及穿膜性多肽的制备方法和应用。
背景技术
近30年来的研究发现，某些较小且相对无毒的肽能够穿越细胞膜。这些现在被称为细胞穿透肽的肽，不仅能够自身穿过细胞膜，而且还可以携带许多不同的治疗剂进入细胞，包括小分子、质粒DNA、siRNA、治疗性蛋白质、病毒、成像剂和其他各种纳米粒子。细胞穿透肽(CPP)被称为蛋白质转运结构域(PTD)，膜转运序列(MTS)或Trojan肽(TP)，能够使用不同的机制穿过生物膜而没有明显的毒性，并促进多种有生物活性的药物。CPP可以克服药物输送的某些局限性，并且可以抵抗多种疾病的耐药菌株。尽管CPP传递了不同的治疗分子，但它们缺乏细胞特异性，并且作用时间短。这些局限性导致了组合式货运系统的设计以及随后临床应用的改善。
由于CPP与其他载体相比具有较低的细胞毒性，并且最终可以降解为氨基酸，因此适合进行临床前和临床研究。通常，CPP的效率适合穿透细胞膜并将不同的货物运送到特定的细胞内部位。但是，尚未有FDA批准基于CPP的治疗方法。因为CPP具有一些缺点，包括血液中的半衰期短以及非特异性CPP介导的向正常组织的递送。因此，一些方法被用于在体外和体内开发CPP的功能，包括通过可活化的CPP增强细胞特异性，通过插入相应的定位序列将其特异性转运到细胞器中，将CPP掺入多功能树状或脂质体纳米载体中以改善选择性和效率，尤其是在肿瘤细胞中。已经有许多穿透细胞的肽衍生自天然蛋白质，但是已经开发了嵌合或完全合成的其他几种穿透细胞的肽。如何将穿透细胞的肽内化到细胞中一直是一个争论的话题。
尽管仍未完全了解CPP进入机制，但它似乎取决于肽的类型，肽的浓度，肽运输的货物和测试的细胞类型。随着新的细胞内疾病靶标的发现，细胞穿透肽为将药物递送至这些细胞内靶标提供了令人兴奋的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是寻找一种在鸟氨酸侧链修饰的化学方法，以增加多肽的亲脂性，提高穿膜性。
针对现有技术,本发明提供了一种可以选择性在鸟氨酸侧链修饰的化学方法技术。该方法通过对氨基酸的侧链修饰增加了多肽的穿膜性，且保持多肽进入细胞后性质完好。
一方面，本发明提供了一种制备细胞穿膜肽的方法，如图5所示，所述的方法包括如下步骤：
1)以主链Fmoc保护、侧链Alloc保护的鸟氨酸为原料，进行酰胺缩合反应，形成肽键；
2)使用吗啡啉的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除Fmoc保护基，以游离被Fmoc保护的氨基；
3)将反应瓶抽成真空状态，保持无水无氧条件下，在手套箱中加入四(三苯基膦)钯催化，注射DCM溶剂到反应瓶溶解，脱去侧链Alloc保护基团；
4)在DMF溶剂中、10eq.的DIPEA，侧链修饰上带苄基的鸟氨酸。
其中，鸟氨酸的苄基修饰方法为：在固相，使用活性苄基脒底物选择性修饰鸟氨酸侧链，以合成侧链鸟氨酸修饰的穿膜肽。所述的进行酰胺缩合反应、形成肽键，所使用的试剂选自但不限于以下组合：
HATU缩合剂和二异丙基乙基胺；
Fmoc-Orn-OH，HATU和N,N-二异丙基乙胺混匀；
Fmoc-Orn-OH，PyBOP和N-甲基吗啡啉混匀；
Fmoc-Orn-OH，PyBOP和N-甲基吗啡啉。
本发明中的HATU缩合剂是一种常用的多肽缩合试剂，应用在羧基与氨基合成肽键的反应之中。其系统命名为2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，英文名2-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphate。
本发明中的Fmoc即9-芴甲氧羰基，用作氨基保护基，可通过市售获得。
本发明中的Alloc即烯丙氧羰基，亦可通过市售获得。
本发明中的DCM即二氯甲烷，其分子式为CH2Cl2，是不可燃低沸点溶剂，常用来代替易燃的石油醚、乙醚等，并可用作牙科局部麻醉剂、制冷剂和灭火剂等。
本发明中的orn是氨基酸的其中一种，称之为鸟氨基酸，该氨基酸对于吸收和消化蛋白质具有很重要的功效，可以促进人体吸收蛋白质，除此之外，还可以对所吸收的蛋白质进行氮平衡处理，防止摄入过量。鸟氨酸与活化剂的比例可以为1：(0.9-2.0)；例如，在本发明的一个优选例中，鸟氨酸与活化剂1:1当量加入。
本发明中的四(三苯基膦)钯即四三苯基膦钯，其CAS号为14221-01-3。
本发明中，DIPEA是一种无色或淡黄色透明液体，用于有机合成。化合物信息中文名称:N，N-二异丙基乙胺；英文名称:N,N-Diisopropylethylamine；N-Ethyldiisopropylamine；分子式:C8H19N分子量:129.25。
PyBop是一种化学物质，分子式是C18H28F6N6OP2，中文名为六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷，128625-52-5。
本发明中的FMOC-ORN-O，CB号为CB62640028，分子式是C20H22N2O4。英文名称为L-Ornithine,N2-[(9H-fluoren-9-ylMethoxy)carbonyl]-，英文同义词有：L-Ornithine,N2-[(9H-fluoren-9-ylMethoxy)carbonyl]-；5-amino-2-Chemicalbook(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)pentanoicacid；(2S)-5-amino-2-({[(9H-fluoren-9-yl)methoxy]carbonyl}amino)pentanoicacid。
进一步的，所述的吗啡啉的体积百分比浓度为40-60，例如42％、46％、48％、50％、52％、56％、58％等。
进一步的，用于固相鸟氨酸侧链修饰活性苄基脒底物包括吡唑苄基脒III-1、苄基甲基异硫脲III-2和/或磺酸苄基脒III-3。
本发明在碱存在的条件下形成肽键。进一步的，所述的碱选自无机碱或者有机碱，所述的无机碱为碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠或者氢氧化钾中的任意一种，所述的有机碱为二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯和N-甲基吗啡啉中的任意一种。
进一步的，所述的有机溶剂为二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二氯甲烷、甲醇、乙腈或者二甲基亚砜中的任意一种。
通过对氨基酸的侧链修饰设计穿膜性多肽。
进一步的，可以重复步骤1)和步骤2)，得到1-5个氨基酸残基的多肽产物。例如，所述氨基酸数量为1、2、3、4或者5。
本发明的一个优选例中，制备方法如下：
1)以主链Fmoc保护、侧链Alloc保护的鸟氨酸为原料，使用HATU缩合剂(3-5当量)和二异丙基乙基胺(3-5当量)在固相进行酰胺缩合反应，形成肽键；
2)使用吗啡啉的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除Fmoc保护基，以游离被Fmoc保护的氨基；
3)四(三苯基膦)钯催化下，在干燥的DCM溶剂中，反应瓶内氮气保护下，脱去侧链Alloc保护基团；
4)在DMF溶剂中，在碱二异丙基乙基胺(3-5当量)存在下，侧链修饰上带苄基的鸟氨酸。
另一方面，本发明提供了一种细胞穿膜肽，所述的细胞穿膜肽是硫脲类似物氧化鸟氨酸后获得的。
所述的细胞穿膜肽可以通过上述方法制备获得，也可以根据短肽的序列人工合成获得。
再一方面，本发明提供了所述的细胞穿膜肽的应用，所述的细胞穿膜肽用于携带具有药物活性的物质穿过细胞膜；
所述的具有药物活性的物质选自下列中的一种或者几种：
小分子化合物、质粒DNA、siRNA、治疗性蛋白质、病毒、成像剂、纳米粒子。
进一步的，所述的细胞穿膜肽在制备药物转运剂中的应用；所述的药物是抗肿瘤药物、精神疾病药物或者免疫制剂。
TAT肽是一种小的碱性多肽，已被成功地用于多种多样的物质包括小的颗粒、蛋白质、多肽和核酸的转运。TAT多肽中具有细胞渗透功能的“转导结构域”或转运区局限于一小段碱性氨基酸内，共有9个氨基酸。目前，随着各种发现的报道，TAT展示出一定的多肽黏附和穿透细胞质膜作用。
本发明公开了一种对精氨酸(如图6)选择性烃基化修饰的方法。应用到多肽序列中，增加多肽的亲脂性，以达到增加穿膜性(参见图4和实施例2)的作用。小分子合成方法如图5所示。采用过氧化氢对硫脲的氧化的方法得到硫脲氧化物，在碱性条件下，硫脲氧化物可以高选择性的和鸟氨酸发生反应得到Arg类似物。获得良好的穿膜性多肽后助于将药物运输到胞类，对特定靶点起到药物作用。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明适用于多肽固相合成的酰胺化反应技术，通过胺酯交换反应实现肽键的逐个形成，在氨基酸侧链修饰上必要基团，达到改变多肽性质的目的。本发明使用安全低毒的锍盐作为活化试剂，适合实验室多肽合成和工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是三肽中Lys侧链通过本方法甲基化MS图。
其中，MS图显示在分子量约565.40处有特异性峰，与Arg的分子量吻合，表明本发明成功获得甲基化的Arg。
图2是三肽侧链修饰上胍基的MS图。
其中，MS图显示在分子量约552.7处有特异性峰，与胍基的分子量吻合，表明本发明该修饰步骤成功。
图3是五肽侧链修饰上苄基的MS图。
其中，MS图显示在分子量约337、421、534、598、743处有特异性峰，与修饰上苄基的五肽侧链的分子量吻合，表明本发明该修饰步骤成功。
图4是加入多肽5-Bn和TAT处理hela细胞4h后的confocal图。
其中，DAPI显示细胞核的位置，lyso显示溶酶体的分布，FAM显示荧光的分布，Merg为上述图片拼合的效果，TD显示细胞所在位置。可见，TAT处理4h后，hela细胞中FAM标识的分子未在细胞中显现，而多肽5Arg-Bn处理的在细胞中有大量分布。这表明，本发明的细胞穿膜肽能够快速、有效的携带分子穿过细胞膜。
图5是精氨酸选择性烃基化修饰的方法。
其中，使用光延反应对吡唑脒底物进行烃基化。
图6是细胞穿膜肽制备方法示意图。
在碱性条件下，硫脲氧化物可以高选择性的和鸟氨酸发生反应得到Arg类似物。获得良好的穿膜性多肽后助于将药物运输到胞类，对特定靶点起到药物作用。
具体实施方式
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。以下实施例用于进一步详细说明本发明，但本发明绝非仅限于此。
实施例1
1.称取Rink amide MBHA树脂于接肽管中，加入二氯甲烷(DCM)，鼓氮气溶胀10min。加入50％(v/v)吗啡啉的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，鼓氮气30min，脱去Fmoc保护基团，并重复1次。用DMF和DCM交替洗涤树脂6次之后，将配好的Fmoc-Orn-OH(5eq,DMF)溶液，HATU(5eq，DMF)溶液，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(10eq)混匀后加入树脂中鼓氮气2h。抽掉反应液，用DMF和DCM交替洗涤树脂。
2.加入50％(v/v)吗啡啉的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，鼓氮气30min，脱去Fmoc保护基团，并重复一次。用DMF和DCM交替洗涤树脂6次，按上述接氨基酸至多肽合成完毕。
3.用甲醇缩树脂，转至反应瓶中，加四(三苯基膦)钯、1,3-二甲基巴比妥酸，抽真空并氮气保护，加入DCM反应脱去侧链Alloc基团。
4.取苄基修饰的吡唑苄基脒III-1III-1(10eq)，溶解于DMF中，加N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(10eq)与树脂上多肽反应。
5.将多肽从树脂上切下：取20mg树脂于离心管中，加入0.5ml的TFA/TIPS/H2O/EDT(v:v:v:v＝94:1:2.5:2.5)剪切液震荡反应2h,树脂过滤除去，用氮气把剪切液吹干，然后加入0.5ml冷的乙醚沉淀两分钟；离心弃去上清液，沉淀的多肽于空气中挥发至干。
6.多肽的纯化：将反应完全的反应液离心，过膜，使用高效液相色谱纯化。使用液相色谱-质谱联用技术可以直接分析产物的收率。
结果如图1-图3所示，本发明成功的制备了基于鸟氨酸的细胞穿膜肽5-Bn。
实施例2
1.称取Rink amide MBHA树脂于接肽管中，加入二氯甲烷，鼓氮气溶胀10min。加入50％(v/v)吗啡啉的N,N-二甲基甲酰胺溶液，鼓氮气30min，脱去Fmoc保护基团，并重复1次。用DMF和DCM交替洗涤树脂6次之后，将配好的Fmoc-Orn-OH(5eq,DMF)溶液，PyBOP(5eq)N-甲基吗啡啉(NMM)(10eq)混匀后加入树脂中鼓氮气2h。抽掉反应液，用DMF和DCM交替洗涤树脂。
2.加入20％(v/v)哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，鼓氮气30min，脱去Fmoc保护基团，并重复一次。用DMF和DCM交替洗涤树脂6次，按上述接氨基酸至多肽合成完毕。
3.用甲醇缩树脂，转至反应瓶中，加四(三苯基膦)钯、1,3-二甲基巴比妥酸，抽真空，加入DCM反应脱去侧链Alloc基团。
4.取苄基修饰的苄基甲基异硫脲III-2(20eq)，溶解于DMF中，加N-甲基吗啡啉(NMM)(20eq)与树脂上多肽反应。
5.将多肽从树脂上切下：取20mg树脂于离心管中，加入0.5ml的TFA/TIPS/H2O/EDT(v:v:v:v＝94:1:2.5:2.5)剪切液震荡反应2h,树脂过滤除去，用氮气把剪切液吹干，然后加入0.5ml冷的乙醚沉淀两分钟；离心弃去上清液，沉淀的多肽于空气中挥发至干。
6.多肽的纯化：将反应完全的反应液离心，过膜，使用高效液相色谱纯化。使用液相色谱-质谱联用技术可以直接分析产物的收率。
实施例3
1.称取Rink amide MBHA树脂于接肽管中，加入二氯甲烷(DCM)，鼓氮气溶胀10min。加入50％(v/v)吗啡啉的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，鼓氮气30min，脱去Fmoc保护基团，并重复1次。用DMF和DCM交替洗涤树脂6次之后，将配好的Fmoc-Orn-OH(5eq,DMF)溶液，PyBOP(5eq)，N-甲基吗啡啉(NMM)(10eq)混匀后加入树脂中鼓氮气2h。抽掉反应液，用DMF和DCM交替洗涤树脂。
2.加入20％(v/v)哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，鼓氮气30min，脱去Fmoc保护基团，并重复一次。用DMF和DCM交替洗涤树脂6次，按上述接氨基酸至多肽合成完毕。
3.用甲醇缩树脂，转至反应瓶中，加四(三苯基膦)钯、1,3-二甲基巴比妥酸，抽真空，加入DCM反应脱去侧链Alloc基团。
4.取磺酸苄基脒III-3(15eq)，溶解于DMF中，加N-甲基吗啡啉(NMM)(15eq)与树脂上多肽反应。
5.将多肽从树脂上切下：取20mg树脂于离心管中，加入0.5ml的TFA/TIPS/H2O/EDT(v:v:v:v＝94:1:2.5:2.5)剪切液震荡反应2h,树脂过滤除去，用氮气把剪切液吹干，然后加入0.5ml冷的乙醚沉淀两分钟；离心弃去上清液，沉淀的多肽于空气中挥发至干。
6.多肽的纯化：将反应完全的反应液离心，过膜，使用高效液相色谱纯化。使用液相色谱-质谱联用技术可以直接分析产物的收率。
实施例4
苄基化精氨酸IV的制备例A。
图5第一步反应具体为：在250毫升双口圆底烧瓶中加入3.1克(Z)-(((叔丁氧基羰基)氨基)(1H-吡唑-1-基)亚甲基)氨基甲酸叔丁酯I，1.1克苄醇II，2克偶氮二甲酸二异丙酯和2.6克三苯基膦。加入100毫升反应溶剂四氢呋喃。TLC监测反应完全后，减压浓缩除去多余溶剂，残余物经100～200目硅胶柱层析纯化得吡唑苄基脒产物III-1，洗脱剂为60～90摄氏度的石油醚:乙酸乙酯，体积比为6:1，产物为白色粉末3.6克，收率90％。该化合物的核磁数据如下：1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ7.66(dd,J＝4.7,2.0Hz,2H),7.52–7.41(m,2H),7.36–7.20(m,3H),6.34(dd,J＝2.8,1.6Hz,1H),4.93(s,2H),1.46(s,10H),1.24(s,10H)。
图5第二步反应具体为：在50毫升双口圆底烧瓶中加入0.4克化合物III-1，0.13克N,N-二异丙基乙胺和0.35克Fmoc-Orn-OH。加入20毫升反应溶剂二氯甲烷。TLC监测反应完全后，减压浓缩除去多余溶剂，残余物经100～200目硅胶柱层析纯化得苄基化精氨酸IV，洗脱剂为60～90摄氏度的石油醚:乙酸乙酯，体积比为4:1，产物为白色粉末0.60克，收率88％。该化合物的核磁数据如下：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.78(dd,J＝7.7,2.0Hz,3H),7.62(t,J＝6.9Hz,3H),7.41(td,J＝7.5,4.2Hz,3H),7.38–7.27(m,11H),5.83(d,J＝7.8Hz,1H),4.37(q,J＝10.8,9.0Hz,2H),4.30–4.18(m,2H),1.54(m,20H).
实施例5
苄基化精氨酸IV的制备例B。
图5第一步反应具体为：在250毫升双口圆底烧瓶中加入3.4克苄基硫脲V，2.8克碘甲烷。加入100毫升反应溶剂丙酮。TLC监测反应完全后，减压浓缩除去多余溶剂，残余物经100～200目硅胶柱层析纯化得苄基甲基异硫脲III-2，洗脱剂为60～90摄氏度的石油醚:乙酸乙酯，体积比为6:1，产物为白色粉末3.31克，收率92％。该化合物为已知化合物。
图5第二步反应具体为：在50毫升双口圆底烧瓶中加入1.8克化合物III-2，1.0克N-甲基吗啡啉和0.35克Fmoc-Orn-OH。加入20毫升反应溶剂二氯甲烷。TLC监测反应完全后，加入0.8克二碳酸二叔丁酯，继续反应。TLC监测反应完全后，减压浓缩除去多余溶剂，残余物经100～200目硅胶柱层析纯化得苄基化精氨酸IV，洗脱剂为60～90摄氏度的石油醚:乙酸乙酯，体积比为4:1，产物为白色粉末0.49克，收率71％。该化合物的核磁数据同实施例4。
实施例6
苄基化精氨酸IV的制备例C。
图5第一步反应具体为：在250毫升双口圆底烧瓶中加入3.4克苄基硫脲V和0.03克二水合钨酸钠。加入50毫升反应溶剂水。将反应瓶置于冰盐浴冷却，并缓慢滴加24毫升30％双氧水。TLC监测反应完全后，减压浓缩除去多余溶剂，并使用水合丙酮重结晶得磺酸苄基脒III，产物为白色粉末3.21克，收率75％。该化合物的核磁数据如下：1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.16(s,1H),9.38(s,1H),9.36(s,1H)7.44–7.35(m,2H),7.31(ddp,J＝5.5,3.7,1.6Hz,3H),4.48(d,J＝6.5Hz,2H).
图5第二步反应具体为：在50毫升双口圆底烧瓶中加入2.1克化合物III-3，1.0克N-甲基吗啡啉和0.35克Fmoc-Orn-OH。加入20毫升反应溶剂二氯甲烷。TLC监测反应完全后，加入0.8克二碳酸二叔丁酯，继续反应。TLC监测反应完全后，减压浓缩除去多余溶剂，残余物经100～200目硅胶柱层析纯化得苄基化精氨酸IV，洗脱剂为60～90摄氏度的石油醚:乙酸乙酯，体积比为4:1，产物为白色粉末0.53克，收率77％。该化合物的核磁数据同实施例4。
实施例7
将Hela细胞与含有10％FBS(v/v)的DMEM一起培养在成像皿中(50000个细胞/孔)。先将实施例6制备的穿膜肽溶解在DMSO中制成原液，然后加入细胞中至终浓度10μM，并与细胞在37℃下孵育4小时。之后，除去培养基并用PBS轻轻洗涤细胞2次，然后用PBS中的4％多聚甲醛(Alfa Aesar，MA)固定10分钟。细胞再次用PBS洗涤2次，并用PBS中的1μg/ml 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Invitrogen,CA)染色5分钟。在相同参数下，在PerkinElmer共聚焦显微镜上拍摄细胞中穿膜肽定位的图像(FAM荧光显色)，并使用Volocity软件包(Zeiss Imaging)进行处理。
实施例8
1)在37℃细胞培养箱用10％牛血清的DMEM培养基培养Hela细胞。
2)在24孔板中放入圆形盖玻片种板，使细胞密度达到50％左右，24h后加入5uM的多肽5-Bn，对照组5uM TAT。
3)4h后，加入400nM的溶酶体染色剂，37度培养箱培养半小时。
4)用PBS洗三次后，加0.05％的台盼蓝淬灭细胞外围的荧光基团10min，进而PBS清洗三遍后，加4％的多聚甲醛固定15min固定细胞。
5)取出盖玻片反扣在载玻片上，放在4℃冰箱过夜，在激光共聚焦显微镜下拍图。
6)如图4所示，DAPI是细胞核成像，lyso是溶酶体成像，Fam是多肽带Fam的荧光基团成像，TD为明场，merge为lyso和Fam成像的兼并。
可见，目前常用的药物运载多肽TAT对照处理4h后，hela细胞中FAM标识的分子未在细胞中显现，而本发明使用的穿膜多肽5-Bn处理的在细胞中有大量荧光分布。这表明，本发明的方法通过对氨基酸的侧链修饰增加了多肽的穿膜性且保持多肽进入细胞后性质完好，所得的细胞穿膜肽能够快速、有效的携带分子穿过细胞膜。
本发明采用通过使用活性苄基脒化合物，在碱性条件下可以高选择性的和鸟氨酸发生反应得到Arg类似物。获得良好的穿膜性多肽后助于将药物运输到细胞内，对特定靶点起到药物作用。
相比于目前效果最好的类似物，本发明有更好的优越性。由实施例8多肽细胞穿膜实验的对比可知，相比目前常用的TAT和多聚精氨酸类药物运载多肽，本发明使用的穿膜多肽具有明显增强的穿膜性。并且，目前常用的TAT和多聚精氨酸类药物运载多肽的氨基酸数量通常达到10个左右，而本发明使用的穿膜多肽只有5个氨基酸。这大大缩减了其使用成本，具有较高的经济效益。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.一种制备细胞穿膜肽的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
1)以主链Fmoc保护、侧链Alloc保护的鸟氨酸为原料，进行酰胺缩合反应，形成肽键；
2)使用吗啡啉的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除Fmoc保护基，以游离被Fmoc保护的氨基；
重复步骤1)和步骤2)，得到氨基酸数量为5的多肽产物；
3)四(三苯基膦)钯催化下，在干燥的DCM溶剂中，反应瓶内氮气保护下，脱去侧链Alloc保护基团；
4)在有机溶剂中，在N,N-二异丙基乙基胺存在下，鸟氨酸的侧链修饰上苄基脒；
其中，鸟氨酸的苄基脒修饰方法如下：
在固相，使用活性苄基脒底物选择性修饰鸟氨酸侧链，以合成侧链鸟氨酸修饰的穿膜肽；
用于固相鸟氨酸侧链修饰活性苄基脒底物是N-Boc-N’-苄基-1H-吡唑-1-甲脒、N-苄基-S-甲基异硫脲和/或N-苄基二氧化硫脲；
用于多肽合成的氨基酸C端为羧基；
所述的进行酰胺缩合反应、形成肽键，所使用的试剂选自以下组合：
HATU缩合剂和N,N-二异丙基乙基胺；
Fmoc-Orn-OH、HATU和N,N-二异丙基乙胺；
Fmoc-Orn-OH、PyBOP和N-甲基吗啡啉；或者
Fmoc-Orn-OH、PyBOP和N-甲基吗啡啉。
2.根据权利要求1所述的制备细胞穿膜肽的方法，其特征在于，
HATU缩合剂、N,N-二异丙基乙基胺的用量均为3-5当量。
3.根据权利要求1所述的制备细胞穿膜肽的方法，其特征在于，所述的有机溶剂为二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二氯甲烷、甲醇、乙腈或者二甲基亚砜中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的制备细胞穿膜肽的方法，其特征在于，所述的吗啡啉的体积百分比浓度为50％。
5.一种细胞穿膜肽，其特征在于，所述的细胞穿膜肽由权利要求1-4中任意一项的方法制备获得。
6.权利要求5所述的细胞穿膜肽的应用，其特征在于，所述的细胞穿膜肽在制备药物转运剂中的应用；
所述的药物包括抗肿瘤药物、精神疾病药物或者免疫制剂。
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