CN113150075A

CN113150075A - 一种新型环状聚精氨酸穿膜肽分子及其合成方法和应用

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Publication number: CN113150075A
Application number: CN202110526684.9A
Authority: CN
Inventors: 李宜明; 陈竞楠; 王容天
Original assignee: Hefei University of Technology
Current assignee: Hefei University of Technology
Priority date: 2021-05-14
Filing date: 2021-05-14
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2041-05-14
Also published as: CN113150075B

Abstract

本发明公开了一种新型环状聚精氨酸穿膜肽分子及其合成方法和应用，其中环状穿膜肽分子的结构式如下：

本发明首先以N‑芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽合成方法合成环状穿膜肽分子的线性序列K(Mtt)RrRrRrRrRrE(OAll)(PEG)₂G‑NHNH₂，然后分别脱除赖氨酸侧链氨基保护基甲基三苯甲基与谷氨酸侧链羧基保护基烯丙基，最后通过这两个侧链间的环化反应制得环状穿膜肽分子。本发明cR10‑NHNH₂可以通过多肽酰肼连接策略选择性与目标蛋白的N端半胱氨酸连接，进而将蛋白递送至细胞内部。

Description

一种新型环状聚精氨酸穿膜肽分子及其合成方法和应用

技术领域

本发明涉及一种新型环状聚精氨酸穿膜肽分子及其合成方法和应用，属于蛋白质合成技术领域。

背景技术

具有细胞渗透能力的合成蛋白被广泛用于细胞内蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质定位和结构-功能关系等研究。向细胞内递送与疾病发生、调节细胞生理状态、应对胞外刺激等生物学相关的蛋白质，对于基础研究和疾病治疗具有潜在的应用价值。但是，由于这些蛋白质的物理特性以及细胞膜的屏障作用，使得它们难以穿透细胞膜进入细胞内部，这将其大多数应用限制在细胞外靶标或固定化组织上。因此，开发更有效的蛋白质递送策略将大大增加蛋白质试剂和治疗剂的潜在应用范围。

在过去的几十年中，已经开发出许多不同的方法用于蛋白质的细胞递送，例如通过显微注射或电穿孔等物理透膜方式或利用病毒载体、纳米颗粒、增压蛋白质、脂质介导的递送系统。其中，最常用的蛋白质递送方法是利用细胞穿膜肽以共价键形式与外源蛋白形成稳定的复合物，可以有效地将蛋白质通过无受体介导、无耗能的方式，导入活细胞中，且在一定浓度范围内不会造成细胞损伤。

细胞穿膜肽(Cell penetrating peptides CPPs)是一类富含精氨酸的短肽，目前研究较多且应用最广泛的是来源于人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的转录活性因子(Trans-activating transcriptional activator TAT)及其衍生物和全L型/D型多聚精氨酸如R9。最近研究发现，与线性和环状TAT肽相比，环状聚精氨酸肽(cR10)的穿膜效率更高。因为cR10中的精氨酸残基数量更多，而在碱性细胞穿膜肽中对于穿膜起决定作用的是精氨酸中带正电荷的胍基头部，并且胍基的数目对于其效率有明显的影响，会在一定范围内随着数目的增加而效率有所提高。另外，cR10具有更加刚性的环状骨架结构，因而与细胞膜的接触面积更大(Nat.Commun.2011,2,453.Angew.Chem.,Int.Ed.2015,54(6),1950-3.Nat.Chem.2017,9(8),762-771.)。

目前，cR10与目标蛋白偶联的方式主要有以下几种：

文章(Nat.Chem.2017,9(8),762-771.)报道了一种表达蛋白连接(EPL)的策略，将目标蛋白——绿色荧光蛋白互作蛋白(GBP)融合在内含肽突变体(C端的Asn突变为Ala)的N端，并将用于纯化的几丁质结合域融合在内含肽突变体C端。通过外加硫醇试剂处理蛋白，由于内含肽不能发生剪切，目标蛋白与内含肽形成的硫酯中间体在外加的硫醇试剂的作用下发生硫酯交换反应，解离为GBP硫酯，进而可与N端为半胱氨酸的cR10进行自然化学连接获得GBP-cR10。该策略的缺点是：当目标蛋白C端含有修饰，如泛素活性探针Ub-PA(炔丙胺)、Ub-VME(乙烯基甲酯)、Ub-Dha(脱氢丙氨酸)中的泛素C端则无法形成活性硫酯，因而无法与cR10偶联。

文章(J.Am.Chem.Soc.2018,140(39),12424-12433.)报道了一种二硫键连接的策略，目标蛋白——泛素(Ub)上的硫醇(Ub-SH)被5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)激活转化为活化的Ub-DTNP/DTNB二硫化物，这个二硫化物可以与带有半胱氨酸位点的cR10进行反应，生成二硫键连接的Ub-cR10偶联物。该策略的缺点是当目标蛋白上含有多个半胱氨酸位点时，难以获取均一的目标蛋白-cR10偶联物。

发明内容

本发明针对上述现有技术所存在的不足，提供了一种新型环状聚精氨酸穿膜肽分子(cR10-NHNH₂)及其合成方法和应用。本发明cR10-NHNH₂可以通过多肽酰肼连接策略装载到目标蛋白的N端半胱氨酸(Cys)上，进而将目标蛋白递送至细胞内部。

本发明环状聚精氨酸穿膜肽分子cR10-NHNH₂，其结构式如下所示：

本发明环状聚精氨酸穿膜肽分子cR10-NHNH₂的合成方法，首先以Fmoc固相多肽合成方法合成环状穿膜肽分子的线性序列K(Mtt)RrRrRrRrRrE(OAll)(PEG)₂G-NHNH₂(R代表L型精氨酸，r代表D型精氨酸)，然后分别脱除赖氨酸侧链氨基保护基甲基三苯甲基(Mtt)与谷氨酸侧链羧基保护基烯丙基(Allyl)，最后通过这两个侧链间的环化反应制得cR10-NHNH₂。

合成路线如下所示：

本发明环状聚精氨酸穿膜肽分子cR10-NHNH₂的合成方法，具体包括如下步骤：

步骤1：以Fmoc固相多肽合成方法合成cR10-NHNH₂线性序列K(Mtt)RrRrRrRrRrE(OAll)(PEG)₂G-NHNH₂

1a、取0.25mmol的2-Cl-Trt-Cl树脂(取代度为0.32mmol/g)，加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)/二氯甲烷(DCM)溶液(体积比1:1)10ml，使树脂溶胀，溶胀时间为30分钟，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂；

1b、向1a的树脂中加入4ml含5％(体积分数)水合肼的DMF溶液，使树脂发生酰化反应，放入常温摇床中振荡反应30分钟，再分别依次用DMF、DCM和DMF冲洗各三次，再次加入4ml5％水合肼的DMF溶液反应30分钟，用同样的洗涤方法洗涤后外加4ml含5％(体积分数)甲醇的DMF溶液继续振荡10分钟，封闭树脂上未反应的活泼基团，充分洗涤后抽干得到多肽酰肼树脂用于固相合成；

1c、按照cR10线性氨基酸序列，以标准的Fmoc固相多肽合成(SPPS)方法(4倍量的Fmoc氨基酸，3.8倍量的6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)和8倍量的N,N-二异丙基乙胺(DIEA))进行氨基酸缩合，从C端依次连接Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu(OAll)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Mtt)-OH，获得线性Fmoc-K(Mtt)R(Pbf)r(Pbf)R(Pbf)r(Pbf)R(Pbf)r(Pbf)R(Pbf)r(Pbf)R(Pbf)r(Pbf)E(OAll)(PEG)₂G-NHNH₂树脂。

步骤2：环状cR10-NHNH₂的合成

2a、向1c的树脂中加入含1-羟基苯并三唑(HOBt)的六氟异丙醇(HFIP)/1,2-二氯乙烷(DCE)混合溶液4ml，用于脱除Mtt保护基，加入溶液的体积比为：HFIP:DCE溶液＝1:1，常温振荡3分钟后，再分别依次用DCM、DMF和DCM冲洗各三次，继续加入4ml混合溶液重复上述步骤三次，即可脱除多肽链上的Mtt保护基；

含HOBt的混合溶液配比如下：相对于树脂的5倍摩尔量的HOBt固体(下述制备过程中其它原料添加的当量均是相对于树脂的摩尔量倍)，HFIP：DCE溶液体积比为1:1。

2b、向2a的树脂中加入四(三苯基膦)钯(Pd(PPh₃)₄)与苯硅烷(PhSiH₃)的混合溶液4ml，用于脱除Allyl保护基，常温振荡3小时，再分别依次用DCM、DMF和DCM冲洗各三次，然后加入混合溶液重复上述步骤一次，即可脱除多肽链上的Allyl保护基。

Pd(PPh₃)₄与PhSiH₃的混合溶液配比如下：2倍量的Pd(PPh₃)₄，20倍量的PhSiH₃，用DCM定容至4ml。

2c、向2b的树脂中加入4ml环化试剂使裸露的氨基和羧基发生分子内环化反应，放入常温摇床中振荡反应12小时。

所述环化试剂为(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基六氟磷酸盐(PyAop)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAt)、N-甲基吗啡啉(NMM)和DMF混合物，试剂配比如下：4倍量的PyAop、4倍量的HOAt、8倍量的NMM，用DMF定容至4ml。

2d、向2c的树脂中，加入含有20％哌啶的DMF溶液反应5分钟，进行Fmoc的脱除，之后再分别依次用DMF、DCM和DMF冲洗各三次，再加入含有20％哌啶的DMF溶液反应10分钟，依次用DMF、DCM、DMF、DCM洗涤后减压除去树脂中残余的DCM溶剂，得到N端Fmoc脱除的树脂。

2e、向2d的树脂中加入15ml的切割试剂，室温下反应2.5小时，然后将切割液转移至离心管中，利用氮气鼓泡法进行切割液的浓缩，最后待切割液浓缩至5ml以内后，加入冰乙醚30ml，离心(4500转/分钟)除去上清液后再次加入30ml冰乙醚，除去上清液后风干得到固体粗肽；

所述切割试剂三氟乙酸、苯酚、水和三异丙基硅烷的混合物，体积比为：三氟乙酸：水：苯酚：三异丙基硅烷＝88:5:5:2。

2f、取少量上述步骤2e得到的固体粗肽用纯水溶液溶解，过膜后使用反向高效液相色谱(HPLC)进行分析。分析梯度为10％-70％的乙腈浓度，时间为30min。色谱分析后对主峰进行ESI-MS鉴定验证cR10-NHNH₂的正确性。验证正确后使用C18半制备柱，将上述步骤2e得到的固体粗肽进行纯化(半制备梯度为5％-60％的乙腈浓度，时间为30min)收集纯化后的溶液，并冻干，得到纯化后的cR10-NHNH₂。

本发明cR10-NHNH₂的应用，是通过多肽酰肼连接策略选择性与N端含半胱氨酸的目标蛋白连接，进而将蛋白递送至细胞内部。

反应过程示意如下：

本发明的有益效果体现在：

本发明设计了一种新型环状聚精氨酸穿膜肽分子(cR10-NHNH₂)，通过Fmoc固相多肽合成方法获得cR10-NHNH₂，具有合成效率高，操作简便，普适性强，产物纯度高，可大量制备的特点。该穿膜肽分子量小，氨基酸残基个数少，穿膜效率高，区别于以往的穿膜肽的最大特点在于其C末端为酰肼末端，可以通过多肽酰肼连接策略选择性与N端含半胱氨酸的目标蛋白连接。尤其是当目标蛋白上含有多个半胱氨酸位点时，该穿膜肽分子可以选择性与N端半胱氨酸反应，获得均一的cR10与目标蛋白偶联产物，具有选择性好，连接效率高，合成步骤简易，合成成本低的特点。

附图说明

图1是cR10-NHNH₂线性序列K(Mtt)RrRrRrRrRrE(OAll)(PEG)₂G-NHNH₂的高效液相色谱图。

图2是cR10-NHNH₂线性序列K(Mtt)RrRrRrRrRrE(OAll)(PEG)₂G-NHNH₂的质谱图。

图3是脱除侧链保护基后cR10-NHNH₂线性序列KRrRrRrRrRrE(PEG)₂G-NHNH₂的高效液相色谱图。

图4是脱除侧链保护基后cR10-NHNH₂线性序列KRrRrRrRrRrE(PEG)₂G-NHNH₂的质谱图。

图5是环状cR10-NHNH₂的高效液相色谱图。

图6是环状cR10-NHNH₂的质谱图。

图7是cR10-NHNH₂与目标蛋白的偶联产物cR10-Cys-Ub(A46C)-Rho的高效液相色谱图。

图8是cR10-NHNH₂与目标蛋白的偶联产物cR10-Cys-Ub(A46C)-Rho的质谱图。

图9是cR10-NHNH₂与目标蛋白的偶联产物cR10-Cys-Ub(A46C)-Rho的共聚焦显微荧光图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面结合具体实施范例对本发明实施过程作进一步说明，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征及优点，而不是对发明权利要求的限制。

实施例1：

称取781.25mg(0.25mmol)取代度为0.32mmol/g的2-Cl-Trt-Cl树脂，在树脂中加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)/二氯甲烷溶液(DCM)10ml，使树脂溶胀，加入溶液的体积比为：DMF:DCM＝1:1，溶胀时间为10分钟，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂。

向上述树脂中加入4ml5％(体积分数)水合肼溶液(0.2ml水合肼，3.8ml DMF)，使树脂发生酰化反应，放入常温摇床中振荡反应30分钟，再分别先后用DMF、DCM和DMF冲洗各三次，再次加入4ml5％(体积分数)水合肼溶液反应30分钟，用同样的洗涤方法洗涤后外加4ml5％(体积分数)甲醇溶液(0.2ml甲醇，3.8ml DMF)继续振荡10分钟，封闭树脂上未反应的活泼基团，充分洗涤后抽干得到多肽酰肼树脂用于固相合成。

将首个氨基酸Fmoc-Gly-OH(297mg，1mmol，4eq.)和缩合剂6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU，393.01mg，0.95mmol，3.8eq.)用4ml DMF溶解，加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA，330μl，2mmol，8eq.)活化1分钟后添加到上述肼树脂中，放入摇床中常温振荡30分钟；反应结束后用DMF、DCM、DMF各洗涤三次，再加入Fmoc-Gly-OH(297mg，1mmol，4eq.)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，361.22mg，0.95mmol，3.8eq.)、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt，129.30mg，0.95mmol，3.8eq.)、DIEA(330μl，2mmol，8eq.)溶于DMF放入树脂中，反应30分钟；反应结束后用DMF、DCM、DMF各洗涤三次，向树脂中加入含有20％(体积分数)哌啶的DMF溶液，反应5分钟后依次用DMF、DCM、DMF各洗涤三次，再次向树脂中加入20％的哌啶反应10分钟以全部除去树脂上氨基的Fmoc保护基，再用DMF、DCM、DMF各洗涤三次除去反应后残余的哌啶和脱离的小分子保护基，分别用DMF、DCM、DMF洗涤树脂。后面氨基酸的缩合类似进行至所有序列完成固相缩合，最终获得线性Fmoc-K(Mtt)R(Pbf)r(Pbf)R(Pbf)r(Pbf)R(Pbf)r(Pbf)R(Pbf)r(Pbf)R(Pbf)r(Pbf)E(OAll)(PEG)₂G-NHNH₂树脂。

实施例2：

向实施例1获得的树脂中加入预先配置好的含1-羟基苯并三唑(HOBt)的六氟异丙醇(HFIP)/1,2-二氯乙烷(DCE)混合溶液4ml(HOBt：169mg，1.25mmol，5eq.，HFIP：8ml，DCE：8ml)，常温振荡3分钟，用于脱除Mtt保护基，再分别先后用DCM、DMF和DCM冲洗各三次，继续加入4ml混合溶液重复上述步骤三次，洗涤后抽干即可脱除多肽链上的Mtt保护基；

将四(三苯基膦)钯(Pd(PPh₃)₄，580mg，0.5mmol，2eq.)用4ml DMF溶解，加入苯硅烷(PhSiH₃，617μl，5mmol，20eq.)后添加到上述树脂中，放入摇床中常温振荡3小时。反应结束后用DCM、DMF和DCM冲洗各三次，然后重复上述步骤一次，洗涤后抽干即可脱除多肽链上的Allyl保护基。

将(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基六氟磷酸盐(PyAop，521.38mg，1mmol，4eq.)和HOAt(136.11mg，1mmol，4eq.)用4ml DMF溶解，加入N-甲基吗啡啉(NMM，220μl，4mmol，8eq.)活化1分钟后添加到上述树脂中，放入摇床中常温振荡12小时，使树脂中裸露的氨基和羧基发生分子内环化反应。

用含有20％哌啶的DMF溶液两步脱除脱除N末端的Fmoc保护基，再用DMF、DCM、DMF、DCM各洗涤三次后减压除去树脂中残余的DCM溶剂，得到干燥的树脂。

实施例3：

向实施例2获得的树脂中加入15ml预先配置好的切割试剂(三氟乙酸、苯酚、水和三异丙基硅烷的混合物，体积比为：三氟乙酸：水：苯酚：三异丙基硅烷＝88:5:5:2)，室温下反应2.5小时，将多肽链从树脂上裂解下来后收集滤液至离心管中，利用氮气鼓泡法进行切割液的浓缩。最后待切割液浓缩至5ml以内后，加入30ml冰乙醚进行沉降，用低速离心机(4500转/分钟)离心，使粗肽沉降到底部。除去上清液后再次加入冰乙醚，超声至形成粗肽悬浮液，切除的小分子杂质溶解于冰乙醚中，最后通过离心除去。两次结束后将固体沉降物置于阴凉处风干，得到环状cR10-NHNH₂固体粗肽(170mg)。

取少量粗肽用纯水溶液溶解，过膜后使用反向高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析。分析梯度为10％-70％的乙腈浓度，时间为30min。色谱分析后对主峰进行ESI-MS鉴定验证cR10-NHNH₂的正确性。验证正确后用C18半制备柱对固体粗肽进行分离纯化(半制备梯度为5％-60％的乙腈浓度，时间为30min)，收集正确产物峰溶液并放入冻干机中冻干，得到白色絮状cR10-NHNH₂产物(80mg)。

实施例4：

在这里选取Cys-Ub(A46C)-Rho为目标蛋白作进一步的连接反应及细胞穿膜实验。

蛋白序列如下：

C(PEG)₂K(Rho)(PEG)₂MQIFVKTLTGKTITLE

VEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFCGK

QLEDGRTLSDYNIQKESTL HLVLRLRG(Cage)

其中Rho为荧光基团Rhodamine B，连接在第4位Lys的侧链氨基上，A46C代表泛素Ub第46位Ala突变为Cys，Cage为邻硝基苯甲基，连接在泛素第75位Gly的主链氨基上，目标蛋白分子量为9925.732。

取实施例3获得的cR10-NHNH₂4.4 mg(2μmol，2eq.)溶于1mL连接缓冲液(6M Gn-HCl，200mMNaH₂ PO₄，pH＝3.0)在冰浴(-10～-20℃)中预冷。然后逐滴加入28μL的500mMNaNO₂(14μmol，14eq.)，并将反应在-10～-20℃孵育20分钟以使酰肼完全转化为酰基叠氮化物。随后加入20mg 4-巯基苯乙酸(120μmol，120eq.)，并将pH调节至5.0～5.2，室温反应10分钟以产生硫酯肽。最后，加入10mgCys-Ub(A46C)-Rho(1μmol，1eq.)，并将pH调节至6.8～7.0后引发连接，室温反应10小时。通过RP-HPLC监测反应。分析梯度为10％-70％的乙腈浓度，时间为30min。色谱分析后对主峰进行ESI-MS鉴定验证产物的正确性。验证正确后用C18半制备柱对固体粗肽进行分离纯化(半制备梯度为20％-70％的乙腈浓度，时间为40min)，收集正确产物峰溶液并放入冻干机中冻干，收集纯化后的溶液，并冻干，得到偶联产物cR10-Cys-Ub(A46C)-Rho(9.6mg，产率：80％)。

实施例5：

取实施例4获得的偶联产物cR10-Cys-Ub(A46C)-Rho 4mg溶于0.3mL盐酸胍溶液中(6M Gn-HCl，0.2M NaH₂ PO₄，pH＝7.0)中，然后透析到MES buffer(20mM MES,100mM NaCl,pH 6.5)中过夜，偶联产物终浓度通过BCA法进行测定。

Hela细胞在加入10％(v/v)胎牛血清和1x青霉素/链霉素的高糖DMEM于37℃，5％二氧化碳的培养箱中生长，当细胞达到90％汇合度时，将其以15万/ml的密度接种到35mm共聚焦小皿里，生长24h。之后移除完全培养基，用冷PBS洗涤3次。提前取MES buffer溶解好的偶联产物，用无酚红培养基将其稀释到终浓度15μM。将配好的溶液加到PBS洗过的共聚焦小皿里，培养箱孵育4h。移除溶液，用冷PBS洗涤4次后，用Hoechst染料染核15min，之后用冷PBS洗涤4次，用共聚焦显微镜拍摄荧光图，结果显示cR10-NHNH₂偶联的目标蛋白能高效穿透细胞膜进入到细胞内。

综上所述，本发明提供了一种新型环状聚精氨酸穿膜肽分子及其合成方法和应用

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，也不因各实施例之间的前后次序对本发明造成任何限制，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭示的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种新型环状聚精氨酸穿膜肽分子，简记为cR10-NHNH₂，其特征在于其结构式如下所示：

2.一种权利要求1所述的环状聚精氨酸穿膜肽分子的合成方法，其特征在于：

首先以Fmoc固相多肽合成方法合成环状穿膜肽分子的线性序列，然后分别脱除赖氨酸侧链氨基保护基与谷氨酸侧链羧基保护基，最后通过两个侧链间的环化反应制得cR10-NHNH₂。

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1：以Fmoc固相多肽合成方法合成cR10-NHNH₂线性序列

1a、在2-Cl-Trt-Cl树脂中加入体积比为1：1的DMF和DCM混合溶液，使树脂溶胀，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂；

1b、向1a的树脂中加入含5vt％水合肼的DMF溶液，使树脂发生酰化反应，放入常温摇床中振荡反应30分钟，再分别依次用DMF、DCM和DMF冲洗，再次加入5vt％水合肼溶液反应30分钟，用相同的洗涤方法洗涤后外加含5vt％甲醇的DMF溶液继续振荡10分钟，封闭树脂上未反应的活泼基团，充分洗涤后抽干得到多肽酰肼树脂用于固相合成；

1c、按照cR10线性氨基酸序列，以标准的Fmoc固相多肽合成方法进行氨基酸缩合，从C端依次连接Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu(OAll)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Mtt)-OH，获得线性cR10-NHNH₂树脂；

步骤2：环状cR10-NHNH₂的合成

2a、向1c的树脂中加入含1-羟基苯并三唑的六氟异丙醇/1,2-二氯乙烷混合溶液，用于脱除赖氨酸侧链氨基保护基，常温振荡3分钟，再分别依次用DCM、DMF和DCM冲洗；重复上述步骤三次，即可脱除多肽链上赖氨酸侧链的氨基保护基；

2b、向2a的树脂中加入四(三苯基膦)钯与苯硅烷的混合溶液，用于脱除谷氨酸侧链羧基保护基，常温振荡3小时，再分别依次用DCM、DMF和DCM冲洗；重复上述步骤一次，即可脱除多肽链上谷氨酸侧链的羧基保护基；

2c、向2b的树脂中加入含环化试剂的DMF溶液使裸露的氨基和羧基发生分子内环化反应，放入常温摇床中振荡反应12小时；

2d、向2c的树脂中加入含有20％哌啶的DMF溶液反应5分钟，进行Fmoc的脱除，之后再分别依次用DMF、DCM和DMF冲洗，再加入含有20％哌啶的DMF溶液反应10分钟，依次用DMF、DCM、DMF、DCM洗涤后减压除去树脂中残余的DCM溶剂，得到N端Fmoc脱除的树脂；

2e、向2d的树脂中加入切割试剂，室温下反应2.5小时，然后将切割液转移至离心管中，利用氮气鼓泡法进行切割液的浓缩，最后加入加入冰乙醚，离心除去上清液后再次加入冰乙醚，除去上清液后风干得到固体粗肽，分离纯化后获得cR10-NHNH₂。

4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：

步骤1中，所述cR10-NHNH₂线性序列如下：

K(Mtt)RrRrRrRrRrE(OAll)(PEG)₂G-NHNH₂，R代表L型精氨酸，r代表D型精氨酸。

5.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：

步骤2a中，所述赖氨酸侧链氨基保护基为甲基三苯甲基Mtt。

6.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：

步骤2b中，所述谷氨酸侧链羧基保护基为烯丙基Allyl。

7.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：

步骤2c中，所述环化试剂为(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基六氟磷酸盐、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑和N-甲基吗啡啉。

8.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：

步骤2e中，所述切割试剂为三氟乙酸、苯酚、水和三异丙基硅烷的混合物，体积比为：三氟乙酸：水：苯酚：三异丙基硅烷＝88:5:5:2。

9.一种权利要求1所述的环状聚精氨酸穿膜肽分子的应用，其特征在于：

所述环状聚精氨酸穿膜肽分子通过多肽酰肼连接策略选择性与N端含半胱氨酸的目标蛋白连接，进而将目标蛋白递送至细胞内部。