CN118026984A - 一种罗丹明b修饰的新型赖氨酸衍生物及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种罗丹明B修饰的新型赖氨酸衍生物及其合成方法和应用，其中罗丹明B修饰的新型赖氨酸衍生物的结构式如下所示：本发明首先以商业可购买的Fmoc‑Lys(Boc)‑OH为原料合成Fmoc‑Lys(Boc)‑OtBu，然后选择性脱除侧链氨基的Boc保护基团后与罗丹明B缩合生成Fmoc‑Lys(Rho)‑OtBu，最后脱除tBu保护基制得Fmoc‑Lys(Rho)‑OH。本发明合成的Fmoc‑Lys(Rho)‑OH可以通过Fmoc固相多肽合成技术装载到多肽上，用于罗丹明B修饰多肽的快速、自动化合成。
Description
技术领域
本发明涉及一种罗丹明B修饰的新型赖氨酸衍生物及其合成方法和应用，属于多肽合成领域。
背景技术
多肽荧光探针具有高选择性与高生物相容性，且易于制备和修饰，在疾病检测、医学诊断、药物评估和基础科学研究中发挥着突出作用。荧光基团罗丹明B因其价格低廉、结构稳定且荧光量子产率高而被广泛应用。
目前，一般通过侧链缩合策略获取罗丹明B修饰的多肽。如在文章(Angew.Chem.Int.Ed.2022,61,e20220379)中，首先通过基于9-芴甲氧基羰基的固相多肽合成技术(Fmoc-SPPS)将4-甲基三苯甲基(Mtt)保护侧链氨基的赖氨酸(Fmoc-Lys(Mtt)-OH)引入至多肽序列中，然后将赖氨酸侧链氨基上的Mtt基团脱除，并在侧链氨基上缩合偶联罗丹明B，最终合成了罗丹明B修饰的泛素蛋白。以上合成策略需要使用侧链氨基正交保护的赖氨酸，如商业购买的Fmoc-Lys(Mtt)-OH、Fmoc-Lys(ivDde)-OH，这些正交保护基的脱除条件通常与自动化固相多肽合成不兼容，通过该方法获取罗丹明修饰多肽需要繁琐的手动操作。更重要的是，在一些案例中通过赖氨酸侧链氨基缩合罗丹明B获取荧光标记多肽的效率极低(例如多肽序列：Cys-AEEA2-Lys-AEEA2-SUMO(1-47)中的Lys侧链氨基)。
在此，我们提出一种罗丹明B修饰的新型赖氨酸衍生物及其合成方法。新型赖氨酸衍生物可以通过自动化Fmoc-SPPS合成仪直接引入多肽序列中，使用该分子可以高效获取侧链缩合策略难以合成的罗丹明B修饰多肽。
发明内容
本发明针对上述现有技术所存在的不足，提供了一种罗丹明B修饰的新型赖氨酸衍生物及其合成方法和应用。本发明合成的Fmoc-Lys(Rho)-OH可以通过Fmoc固相多肽合成技术装载到多肽上，用于罗丹明B修饰多肽的高效快速自动化获取。
本发明罗丹明B修饰的新型赖氨酸衍生物，简记为Fmoc-Lys(Rho)-OH，其结构式如下所示：
本发明罗丹明B修饰的新型赖氨酸衍生物的合成方法，首先以商业购买的Fmoc-Lys(Boc)-OH为原料合成Fmoc-Lys(Boc)-OtBu，然后选择性脱除Boc保护基并与罗丹明B反应生成Fmoc-Lys(Rho)-OtBu，最后脱除tBu保护基得到Fmoc-Lys(Rho)-OH；合成路线如下所示：
本发明罗丹明B修饰的新型赖氨酸衍生物的合成方法，包括如下步骤：
步骤1：Fmoc-Lys(Boc)-OtBu的合成
将Fmoc-Lys(Boc)-OH溶于二氯甲烷(DCM)中，之后向反应体系中依次加入二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)搅拌溶解，最后加入叔丁醇(tBu-OH)反应过夜；反应完成后，过滤除去沉淀物，所得有机相经减压浓缩后通过柱层析纯化得到Fmoc-Lys(Boc)-OtBu。
步骤1中，Fmoc-Lys(Boc)-OH、tBu-OH、DCC和DMAP的摩尔比为1：2：2：0.125。
步骤2：Fmoc-Lys(Rho)-OtBu的合成
2a、将Fmoc-Lys(Boc)-OtBu溶解于氯化氢的1,4二氧六环溶液中并搅拌反应20分钟；反应完成后，将反应液浓缩得到粗产物Fmoc-Lys-OtBu。
2b、将罗丹明B和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)后，加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA)振荡活化1分钟，然后将该混合溶液加入到含有粗产物Fmoc-Lys-OtBu的DMF溶液中并搅拌反应2小时；反应结束后，向反应体系中加水稀释并使用乙酸乙酯多次萃取，收集有机相并用饱和NaCl溶液洗涤，干燥后浓缩，最后通过柱层析纯化获得Fmoc-Lys(Rho)-OtBu。
步骤2a中，氯化氢的1,4二氧六环溶液中氯化氢的浓度为4M。
步骤2b中，粗产物Fmoc-Lys-OtBu、罗丹明B、HATU、DIEA的摩尔比为1：1.1：1.1：2。
步骤3：Fmoc-Lys(Rho)-OH的合成
将Fmoc-Lys(Rho)-OtBu溶解于DCM中，然后加入三氟乙酸(TFA)搅拌过夜；反应结束后，使用减压蒸馏除去反应体系中剩余的TFA，最终获得Fmoc-Lys(Rho)-OH。
步骤3中，Fmoc-Lys(Rho)-OtBu与TFA的摩尔比为1：60。
步骤3中，DCM与TFA的体积比为1：1。
本发明罗丹明B修饰的新型赖氨酸衍生物的应用，是利用Fmoc-Lys(Rho)-OH并通过自动化多肽固相合成仪直接引入多肽序列中，实现罗丹明B修饰多肽的快速、自动化获取。
具体的，本发明使用Fmoc-Lys(Rho)-OH并通过自动化多肽固相合成仪(CSBioCS136)自动化合成了罗丹明B修饰的SUMO(1-47)，以及获取了罗丹明B修饰的cR10。
本发明的有益效果体现在：
本发明设计了一种新型赖氨酸衍生物Fmoc-Lys(Rho)-OH，可以用于罗丹明B修饰多肽的高效快速、自动化获取。使用本发明提供的Fmoc-Lys(Rho)-OH，能够自动化合成罗丹明B修饰的SUMO(1-47)(多肽序列为
H2N-Cys-AEEA2-K(Rho)-AEEA2-Nle-ADEKPKEGVKTENNDHINLKVAGQDGSVVQFKIKRHTPLSKLMKAY-CONHNH2)。此外，罗丹明B修饰的cR10还可以用于活细胞内荧光成像，检测cR10的穿膜效果。
附图说明
图1是化合物Fmoc-Lys(Boc)-OtBu的氢谱图。
图2是化合物Fmoc-Lys(Rho)-OtBu的氢谱图。
图3是化合物Fmoc-Lys(Rho)-OtBu的碳谱图。
图4是化合物Fmoc-Lys(Rho)-OH的氢谱图。
图5是化合物Fmoc-Lys(Rho)-OH的碳谱图。
图6是多肽Cys-AEEA2-Lys-AEEA2-SUMO(1-47)-CONHNH2的高相液相色谱图。
图7是多肽Cys-AEEA2-Lys-AEEA2-SUMO(1-47)-CONHNH2的质谱图。
图8是在Cys-AEEA2-Lys-AEEA2-SUMO(1-47)-CONHNH2赖氨酸侧链缩合Rho B后粗肽的高相液相色谱图。
图9是多肽Cys-AEEA2-K(Rho)-AEEA2-SUMO(1-47)-CONHNH2的质谱图。
图10是使用Fmoc-Lys(Rho)-OH合成Cys-AEEA2-K(Rho)-AEEA2-SUMO
(1-47)-CONHNH2粗肽的高相液相色谱图。
图11是多肽K(Rho)-AEEA2-cR10-G-CONH2粗肽的高效液相色谱图。
图12是多肽K(Rho)-AEEA2-cR10-G-CONH2的质谱图。
图13是Hela细胞与多肽K(Rho)-AEEA2-cR10-G-CONH2孵育后激光共聚焦成像图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合具体实施范例对本发明实施过程作进一步说明，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征及优点，而不是对发明权利要求的限制。
实施例1：
1、将Fmoc-Lys(Boc)-OH(3g,6.4mmol)加入圆底烧瓶中并加入20mL二氯甲烷(DCM)溶解，然后向圆底烧瓶中依次加入二环己基碳二亚胺(DCC,2.6g,12.6mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP,97.5mg,0.8mmol)，最后加入叔丁醇(tBu-OH,1.2mL,12.5mmol)并在常温下反应过夜。反应结束后，抽滤除去沉淀物，通过旋转蒸发仪将收集的滤液减压浓缩，再通过柱层析纯化得到化合物Fmoc-Lys(Boc)-OtBu(1.8g，收率53％)。
2、将化合物Fmoc-Lys(Boc)-OtBu(1.8g，3.4mmol)用10mL的4M氯化氢的1,4二氧六环溶液溶解。搅拌反应20分钟后，通过旋转蒸发仪除去溶剂，得到Fmoc-Lys-OtBu的粗产物。
3、将上步粗产物溶于10mL的N,N-二甲基甲酰胺溶剂(DMF)中，然后将罗丹明B(1.5g，3.1mmol)和2-(7-氮杂苯并三唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，1.2g，3.1mmol)用10mLDMF溶解并加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA，1mL，5.7mmol)震荡活化1分钟。之后将混合溶液加入至上述含粗产物的DMF溶液中，室温下搅拌反应2小时。反应完成后，加100mL水稀释并用乙酸乙酯(100mL×3)萃取反应液，将合并的萃取液用饱和NaCl溶液(100mL×3)洗涤，无水Na2SO4干燥后减压浓缩，最后通过柱层析纯化得到化合物Fmoc-Lys(Rho)-OtBu(525mg，收率19％)。
4、将化合物Fmoc-Lys(Rho)-OtBu(525mg，0.617mmol)加入圆底烧瓶中，依次加入5mLDCM和5mL三氟乙酸(TFA)，在常温下反应过夜。反应完成后通过旋转蒸发仪除去TFA，得到目标产物Fmoc-Lys(Rho)-OH(470mg)。
对比例：侧链缩合策略合成罗丹明B修饰的SUMO(1-47)
称取312.65mg(0.1mmol)取代度为0.32mmol/g的2-Cl-Trt-Cl树脂放入多肽固相合成管中。在树脂中加入10mL体积比为1：1的DMF/DCM混合溶液，静置溶胀20分钟后，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂。向上述树脂中加入4mL 5％(体积分数)水合肼溶液(0.2mL水合肼，3.8mLDMF)，放入常温摇床中振荡反应30分钟，再使用用DMF冲洗五次，再次加入4mL 5％(体积分数)水合肼溶液反应30分钟，用同样的洗涤方法洗涤后外加4mL 5％(体积分数)甲醇溶液(0.2mL甲醇，3.8mLDMF)继续振荡10分钟，封闭树脂上未反应的活泼基团，使用DMF充分洗涤后得到肼树脂。
后续的多肽合成步骤均在CS Bio公司的多肽合成仪CS136中进行。每一个标准的氨基酸偶联步骤主要包括：1)加入含有20％(体积分数)哌啶的DMF溶液，常温反应5分钟后用DMF洗涤三次，再次加入20％的哌啶常温反应10分钟以全部脱除树脂上氨基的Fmoc保护基，再用DMF洗涤树脂三次除去反应后残余的哌啶；2)加入5倍当量的氨基酸(0.2M的DMF储液)，5倍当量的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，0.5M的DMF储液)，5倍当量的N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt，0.5M的DMF储液)和10倍当量的N,N-二异丙基乙胺(DIEA,1.0M的DMF储液)，常温反应30分钟后用DMF洗涤三次；3)再次加入5倍当量的氨基酸(0.2M的DMF储液)，5倍当量的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，0.5M的DMF储液)，5倍当量的N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt，0.5M的DMF储液)和10倍当量的N,N-二异丙基乙胺(DIEA,1.0M的DMF储液)，常温反应30分钟后用DMF洗涤三次。使用以上合成步骤将Fmoc保护的氨基酸依次偶联依次自动化偶联，最后一个Cys是Boc-Cys(Trt)-OH(多肽序列为Cys-AEEA2-K(Mtt)-AEEA2-Nle-ADEKPKEGVKTENNDHINLKVAGQDGSVVQFKIKRHTPLS KLMKAY)，得到Cys-AEEA2-K(Mtt)-AEEA2-SUMO(1-47)-CONHNH树脂。偶联结束后，加入含1-羟基苯并三唑(HOBt，68mg，0.5mmol，5eq)的六氟异丙醇(HFIP)/1,2-二氯乙烷(DCE)混合溶液(体积比1:1)4mL，用于脱除Mtt保护基，常温振荡3分钟后，再使用DCM冲洗三次，继续加入4mL混合溶液重复上述步骤六次，以全部脱除赖氨酸的Mtt保护基。
取少量上述树脂，加入1mL预先配置好的切割试剂(三氟乙酸、苯酚、水和三异丙基硅烷的混合物，体积比为：三氟乙酸：水：苯酚：三异丙基硅烷＝88:5:5:2)，室温下反应1.5小时，将多肽链从树脂上裂解下来后收集滤液至离心管中，利用氮气鼓泡法浓缩切割液。最后待切割液浓缩至0.2mL以内后，加入1mL冰乙醚进行沉淀，用低速离心机(4500转/分钟)离心，使粗肽沉降到底部。除去上清液后再次加入冰乙醚，超声至形成粗肽悬浮液，切除的小分子杂质溶解于冰乙醚中，最后通过离心除去。两次结束后将固体沉降物置于阴凉处风干，得到固体粗肽。取少量粗肽用含20％乙腈的水溶液溶解，过膜后使用反向高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析。分析梯度为20％-90％的乙腈浓度，时间为30min。色谱分析后对主峰进行ESI-MS鉴定验证了固体粗肽Cys-AEEA2-K-AEEA2-SUMO(1-47)-CONHNH2的正确性。
随后将罗丹明B(96mg，0.2mmol，2eq)，PyAOP(104mg，0.2mmol，2eq)和HOAt(27mg，0.2mmol，2eq)用4mL DMF溶解(罗丹明B溶解度较低，可用振荡超声辅助溶解)，再加入NMM(44μL，0.4mmol，4eq)活化1分钟后添加到上述肼树脂中，放入摇床中常温振荡12个小时，将罗丹明B与赖氨酸残基的ε-氨基偶联，最后脱除肽链N端Fmoc保护基。将树脂使用DCM洗涤三次后抽干去残余的DCM溶剂，再向干燥的树脂中加入5mL预先配置好的切割试剂(三氟乙酸、苯酚、水和三异丙基硅烷的混合物，体积比为：三氟乙酸：水：苯酚：三异丙基硅烷＝88:5:5:2)，室温下反应2.5小时，将多肽链从树脂上裂解下来后收集滤液至离心管中，利用氮气鼓泡法浓缩切割液。最后待切割液浓缩至1mL以内后，加入20mL冰乙醚进行沉淀，用低速离心机(4500转/分钟)离心，使粗肽沉降到底部。除去上清液后再次加入冰乙醚，超声至形成粗肽悬浮液，切除的小分子杂质溶解于冰乙醚中，最后通过离心除去。两次结束后将固体沉降物置于阴凉处风干，得到固体粗肽。取少量粗肽用含20％乙腈的水溶液溶解，过膜后使用反向高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析。分析梯度为20％-90％的乙腈浓度，时间为30min。色谱分析后进行ESI-MS鉴定指出主峰是未缩合上罗丹明B的原料(Cys-AEEA2-K-AEEA2-SUMO(1-47)-CONHNH2)，而罗丹明B修饰的产物(Cys-AEEA2-K(Rho)-AEEA2-SUMO(1-47)-CONHNH2)在色谱的峰面积上只占主峰的5％。因此通过赖氨酸侧链缩合法难以获取Cys-AEEA2-K(Rho)-AEEA2-SUMO(1-47)-CONHNH2。
实施例2：使用Fmoc-Lys(Rho)-OH合成罗丹明B修饰的SUMO(1-47)
本实施例中直接使用Fmoc-Lys(Rho)-OH合成Cys-AEEA2-K(Rho)-AEEA2-SUMO(1-47)-CONHNH2。合成步骤与对比例相似，只需将其中Fmoc-Lys(Mtt)-OH替换为Fmoc-Lys(Rho)-OH即可。偶联完成后，将粗肽从树脂切割下来以及获取固体粗肽的步骤与对比例的第四段一致。取少量粗肽用含20％乙腈的水溶液溶解，过膜后使用反向高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析。分析梯度为20％-90％的乙腈浓度，时间为30min。色谱分析后对主峰进行ESI-MS鉴定指出主峰即为目标产物Cys-AEEA2-K(Rho)-AEEA2-SUMO
(1-47)-CONHNH2。因此使用Fmoc-Lys(Rho)-OH可以高效快速获取赖氨酸侧链缩合方法难以获取的罗丹明B修饰多肽。
我们推断全长的SUMO(1-47)在树脂上产生了刚性二级结构，导致修饰位点的赖氨酸侧链氨基包埋在肽链中。因此在对比例中，通过侧链缩合策略合成罗丹明B修饰的SUMO(1-47)极低。使用本发明的分子砌块Fmoc-Lys(Rho)-OH可以在主链延伸的过程中进行缩合，有效避免了这个问题。
实施例3：
称取263.15mg(0.1mmol)取代度为0.38mmol/g的Rink amideAM树脂放入CS Bio公司的多肽合成仪CS136中，每一个氨基酸偶联步骤与对比例一致。依次将Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OAllyl)-OH)、Nα-Fmoc-Nω-(2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基磺酰基)-D-精氨酸(Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH)、Nα-Fmoc-Nω-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Mtt)-OH缩合至树脂，最终获得线性R10树脂：Fmoc-K(Mtt)-RrRrRrRrRr-E(OAllyl)-G-CONH树脂(R代表L型Arg，r代表D性Arg)。
向上述树脂中加入4mL的Pd(PPh3)4与PhSiH3的混合溶液脱除谷氨酸侧链的Allyl保护基，常温摇床中振荡反应3小时，再依次用DMF、DCM、DMF和DCM冲洗树脂各三次。混合溶液配方如下：称取Pd(PPh3)4(115mg，0.1mmol，1eq)，PhSiH3(124μL，1mmol，10eq)加入10mLep管中，用DCM定容至4mL。由于树脂中残留多余的钯试剂，使用洗钯试剂(二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物)的DMF溶液，常温振荡反应5分钟，重复操作直至树脂洗净黑色恢复为淡黄色。随后加入含1-羟基苯并三唑(HOBt，68mg，0.5mmol，5eq)的六氟异丙醇(HFIP)/1,2-二氯乙烷(DCE)混合溶液(体积比1:1)4mL，用于脱除Mtt保护基，常温振荡3分钟后，再使用DCM冲洗三次，继续加入4mL混合溶液重复上述步骤六次，以全部脱除赖氨酸的Mtt保护基。接着向上述树脂中加入3mL环化试剂，合成管放入37℃摇床中振荡过夜，使线性肽分子两端裸露的氨基和羧基发生分子内环化反应。环化试剂配方如下：PyAOP(209mg，0.4mmol，4eq)、HOAt(55mg，0.4mmol，4eq)、NMM(90μL，0.8mmol，8eq)用DMF定容至3mL。接着使用CS Bio公司的多肽合成仪CS136，使用相同的偶联步骤，依次将2-[2-(N-Fmoc-氨基)乙氧基]乙氧基]乙酸(Fmoc-AEEA-OH)、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Lys(Rho)-OH缩合至树脂并将最后一个Fmoc脱除，得到H2N-K(Rho)-AEEA2-cR10-G-CONH树脂。
向获得的树脂中加入5mL预先配置好的切割试剂(三氟乙酸、苯酚、水和三异丙基硅烷的混合物，体积比为：三氟乙酸：水：苯酚：三异丙基硅烷＝88:5:5:2)，室温下反应2.5小时，将多肽链从树脂上裂解下来后收集滤液至离心管中，利用氮气鼓泡法浓缩切割液。最后待切割液浓缩至1mL以内后，加入20mL冰乙醚进行沉淀，用低速离心机(4500转/分钟)离心，使粗肽沉降到底部。除去上清液后再次加入冰乙醚，超声至形成粗肽悬浮液，切除的小分子杂质溶解于冰乙醚中，最后通过离心除去。两次结束后将固体沉降物置于阴凉处风干，得到固体粗肽。取少量粗肽用含5％乙腈的水溶液溶解，过膜后使用反向高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析。分析梯度为5％-70％的乙腈浓度，时间为30min。色谱分析后对主峰进行ESI-MS鉴定指出主峰即为目标产物K(Rho)-AEEA2-cR10-G-CONH2。
接着，我们使用荧光活细胞成像技术在海拉(Hela)细胞中检测
K(Rho)-AEEA2-cR10-G-CONH2的细胞穿透性。将冻干后的K(Rho)-AEEA2-cR10-G-CONH2直接溶于纯水中配置成500μM储液。然后加入培养基中与细胞孵育4小时后去除剩余的K(Rho)-AEEA2-cR10-G-CONH2，通过共聚焦显微镜观测到细胞内有均匀分布的红色荧光，表明K(Rho)-AEEA2-cR10-G-CONH2能高效穿透细胞膜进入到细胞内。
Claims (9)
1.一种罗丹明B修饰的新型赖氨酸衍生物，简记为Fmoc-Lys(Rho)-OH，其特征在于其结构式如下所示：
2.权利要求1所述罗丹明B修饰的新型赖氨酸衍生物的合成方法，其特征在于：
首先以Fmoc-Lys(Boc)-OH为原料合成Fmoc-Lys(Boc)-OtBu，然后选择性脱除Boc保护基并与罗丹明B反应生成Fmoc-Lys(Rho)-OtBu，最后脱除tBu保护基得到Fmoc-Lys(Rho)-OH；合成路线如下所示：
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：Fmoc-Lys(Boc)-OtBu的合成
将Fmoc-Lys(Boc)-OH溶于二氯甲烷中，之后向反应体系中依次加入二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶搅拌溶解，最后加入叔丁醇反应8-12h；反应完成后，过滤除去沉淀物，所得有机相经减压浓缩后通过柱层析纯化得到Fmoc-Lys(Boc)-OtBu；
步骤2：Fmoc-Lys(Rho)-OtBu的合成
2a、将Fmoc-Lys(Boc)-OtBu溶解于氯化氢的1,4二氧六环溶液中并搅拌反应20分钟；反应完成后，将反应液浓缩得到粗产物Fmoc-Lys-OtBu；
2b、将罗丹明B和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯溶于N,N-二甲基甲酰胺后，加入N,N-二异丙基乙胺振荡活化1分钟，然后将该混合溶液加入到含有粗产物Fmoc-Lys-OtBu的DMF溶液中并搅拌反应2小时；反应结束后，向反应体系中加水稀释并使用乙酸乙酯多次萃取，收集有机相并用饱和NaCl溶液洗涤，干燥后浓缩，最后通过柱层析纯化获得Fmoc-Lys(Rho)-OtBu；
步骤3：Fmoc-Lys(Rho)-OH的合成
将Fmoc-Lys(Rho)-OtBu溶解于DCM中，然后加入三氟乙酸搅拌过夜；反应结束后，使用减压蒸馏除去反应体系中剩余的三氟乙酸，最终获得Fmoc-Lys(Rho)-OH。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：
步骤1中，Fmoc-Lys(Boc)-OH、叔丁醇、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1：2：2：0.125。
5.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：
步骤2a中，氯化氢的1,4二氧六环溶液中氯化氢的浓度为4M。
6.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：
步骤2b中，粗产物Fmoc-Lys-OtBu、罗丹明B、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1：1.1：1.1：2。
7.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：
步骤3中，Fmoc-Lys(Rho)-OtBu与三氟乙酸的摩尔比为1：60。
8.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：
步骤3中，DCM与三氟乙酸的体积比为1：1。
9.权利要求1所述罗丹明B修饰的新型赖氨酸衍生物的应用，其特征在于：
利用Fmoc-Lys(Rho)-OH并通过自动化多肽固相合成仪直接引入多肽序列中，实现罗丹明B修饰多肽的快速、自动化获取。
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