CN111499719B - 一种合成普兰林肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种合成普兰林肽的方法，包括合成普兰林肽片段1和2、制作替代度为0.5‑0.8mmol/g酰肼2cl树脂、分别裂解普兰林肽片段1和普兰林肽片段2、合成晶状普兰林肽线性肽、氧化晶状普兰林肽线性肽；本发明采用Fmoc固相法、酰肼法合成长肽，通过二肽片段进行片段偶联反应，同时使用DMSO氧化，具有合成效率高、收率高且成本低等特点，适合规模化生产，具有可观的经济实用价值，同时在多肽药物设计合成领域具有广泛的应用前景。

Description

一种合成普兰林肽的方法
技术领域
本发明涉及化工技术领域，尤其涉及一种合成普兰林肽的方法，具体来说是涉及一种降血糖多肽药物普兰林肽的固相合成方法。
背景技术
普兰林肽是一种治疗糖尿病的多肽药物，其效果较好且副作用小，具有很好的市场前景。
普兰林肽(Pramlintide)中文制剂名称为醋酸普兰林肽，多肽序列为：KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2(S-S)，英文名为：Pramlintide，分子式：C171H267N51O53S2，分子量：3949.47，CAS登录号：196078-30-5。
在普兰林肽的合成工艺中，二硫键成环的介绍并不少，有关普兰林肽氧化的报导也有很多。但在实际的生产中，普兰林肽的氧化工艺给生产带来了极大的困扰，普兰林肽氧化完成后在弱碱性的条件下，容易形成类似乳浊液的状态，而这种状态会对后期纯化分离产生很大的影响，如果不经过滤就直接上样，不仅对纯化分离柱伤害较大，还会降低产品收率。因此，本发明在该前提下，对合成、氧化工艺进行优化，以达到再次提升普兰林肽收率的目的。
发明内容
本发明解决的技术问题是，克服现有技术的缺陷，提供一种合成效率高、成本低且收率较高的合成普兰林肽的方法，该方法能缩短合成时间，收率较高，同时能够很好地解决氧化难溶等问题，适合规模化生产。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：
一种合成普兰林肽的方法，包括如下步骤：
步骤一：对替代度为0.25-0.40mmol/g的Rink Amide MBHA树脂进行片段偶联反应；其中，考虑到步骤二的合成普兰林肽片段1，长度为31个氨基酸，选择的Rink AmideMBHA树脂替代度范围在0.25-0.40mmol/g为宜。
步骤二：合成普兰林肽片段1：从C端到N端依次偶联Fmoc-Tyr(tBu)-OH直至N端第7位Fmoc-Cys(Trt)-OH，脱除Fmoc保护基；其中，合成使用的氨基酸均为N端采用Fmoc保护的氨基酸，Cys侧链采用Trt保护，Asn侧链采用Trt保护，Thr侧链采用tBu保护，Gln侧链采用Trt保护，Arg侧链采用Pbf保护，His侧链采用Trt保护，Ser侧链采用tBu保护，Tyr侧链采用tBu保护；其中，N端28、29使用二肽氨基酸Fmoc-Pro-Pro-OH、N端24、25使用的二肽氨基酸Fmoc-Gly-Pro-OH、N端20、21位使用二肽氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-OH；本发明通过实验发现，相同的氨基酸在不同的偶联体系下偶联率是不同的，实验表明，普兰林肽三个合成难点是N端第21位Asn水解，N端24、25和N端28、29的反应时检测容易出现假阳性现象。使用Fmoc-Pro-Pro-OH、Fmoc-Gly-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-OH的效果优于Fmoc-Pro-OH和Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH和Fmoc-Asn(Trt)-OH，同时能够提高反应效率，降低副反应产生率，提高收率。
步骤三：制作替代度为0.5-0.8mmol/g酰肼2cl树脂；
步骤四：合成普兰林肽片段2：在酰肼2cl树脂上依次偶联Fmoc-Thr(tBu)-OH，直至最后一个氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH，脱除Fmoc保护基；其中，合成使用的氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH均为N端采用Fmoc保护的氨基酸，Lys侧链采用Boc保护，Cys侧链采用Trt保护，Asn侧链采用Trt保护，Thr侧链采用tBu保护。
步骤五：分别裂解普兰林肽片段1和普兰林肽片段2，加入乙醚沉淀并抽滤洗涤，然后通过高效液相色谱分别对裂解之后的普兰林肽片段1和普兰林肽片段2进行纯化，分别得到95％纯度的多肽片段1和多肽片段2；
步骤六：多肽片段2经PBS缓冲液溶解后,在-10-0℃、pH值小于7的酸性条件下经过亚硝酸钠氧化反应形成酰基叠氮产物，通过对巯基苯甲酸作用衍生成硫酯产物并与多肽片段1混合，通过质谱及HPLC分析判定，经过2小时后由多肽片段1和多肽片段2连接得到普兰林肽线性肽，分离纯化，冻干得到晶状普兰林肽线性肽；
步骤七：将晶状普兰林肽线性肽溶解于含有DMSO、乙腈、水的混合溶液中，在室温条件下进行氧化反应，经分析型HPLC监测原料完全转化，直至氧化反应停止；其中，在氧化反应之间，将混合容易的pH值调节至6.0；
步骤八：使用半制备色谱分离步骤七的混合溶液并纯化，冻干得到普兰林肽纯品。
作为优选，偶联反应形成的偶联体系为：由HOBT、HOAT、Cl-HOBT中的任意一个或一个以上与DIC组成的偶联体系，或者由HBTU、TBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上与DIEA组成的偶联体系。
作为优选，偶联反应形成的偶联体系为：由HOBT、HOAT、Cl-HOBT中的任意一个或一个以上、HBTU、TBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上与DIEA组成的偶联体系。
作为优选，步骤三中，采用NH2NH2·H2O与N,N-二异丙基乙胺(DIEA)合成酰肼2cl树脂，NH2NH2·H2O为酰肼2cl树脂摩尔量的9-15倍，N,N-二异丙基乙胺(DIEA)为酰肼2cl树脂摩尔量的3-6倍。进一步地，NH2NH2·H2O为酰肼2cl树脂摩尔量的9-12倍，N,N-二异丙基乙胺(DIEA)为酰肼2cl树脂摩尔量的3-4倍，反应时间为8-12小时，考虑到普兰林肽片段2肽链长度为6个氨基酸，树脂替代度可以尽量高，能够降低成本，适合规模化生产。
作为优选，步骤五中，采用裂解液1和裂解液2分别裂解普兰林肽片段1和普兰林肽片段2，裂解液1采用的裂解试剂配方体积比例为TFA：乙二硫醇：苯酚：三异丙基硅烷：水＝86：8：3：2：1，裂解液2采用的裂解试剂配方体积比例为TFA：巯基丙酸：三异丙基硅烷：苯酚：水＝88：5：3：3：1，裂解液1和裂解液2的体积所对应的重量为树脂肽重量的8-10倍，乙醚的体积为裂解液1或裂解液2的体积的5-8倍。
作为优选，步骤六中多肽片段1与多肽片段2连接时，亚硝酸钠摩尔体积比为3mmol/L，亚硝酸钠摩尔量为多肽摩尔量的5-8倍，氧化反应时间为5-8小时。
作为优选，步骤七的含有DMSO、乙腈、水的混合溶液中DMSO的体积含量为15％，水和乙腈的体积比为3:2，氧化反应时间为5-10小时。
本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：采用Fmoc固相法、酰肼法合成长肽，通过二肽片段进行片段偶联反应，同时使用DMSO氧化，具有合成效率高、收率高且成本低等特点，适合规模化生产，具有可观的经济实用价值，同时在多肽药物设计合成领域具有广泛的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种合成普兰林肽的方法，包括如下步骤：
步骤一：对替代度为0.25-0.40mmol/g的Rink Amide MBHA树脂进行片段偶联反应；其中，考虑到步骤二的合成普兰林肽片段1，长度为31个氨基酸，选择的Rink AmideMBHA树脂替代度范围在0.25-0.40mmol/g为宜。
步骤二：合成普兰林肽片段1：从C端到N端依次偶联Fmoc-Tyr(tBu)-OH直至N端第7位Fmoc-Cys(Trt)-OH，脱除Fmoc保护基；其中，合成使用的氨基酸均为N端采用Fmoc保护的氨基酸，Cys侧链采用Trt保护，Asn侧链采用Trt保护，Thr侧链采用tBu保护，Gln侧链采用Trt保护，Arg侧链采用Pbf保护，His侧链采用Trt保护，Ser侧链采用tBu保护，Tyr侧链采用tBu保护；其中，N端28、29使用二肽氨基酸Fmoc-Pro-Pro-OH、N端24、25使用的二肽氨基酸Fmoc-Gly-Pro-OH、N端20、21位使用二肽氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-OH；本发明通过实验发现，相同的氨基酸在不同的偶联体系下偶联率是不同的，实验表明，普兰林肽三个合成难点是N端20、21位的水解，N端24、25和N端28、29的反应时检测容易出现假阳性现象。使用Fmoc-Pro-Pro-OH、Fmoc-Gly-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-OH的效果优于Fmoc-Pro-OH和Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH和Fmoc-Asn(Trt)-OH，同时能够提高反应效率，降低副反应产生率，提高收率。
本实施例中，普兰林肽片段1的合成方法如下具体步骤：
步骤Ⅰ：溶胀Rink Amide MBHA树脂：称取0.34mmol/g的Rink Amide MBHA树脂14.70g置于500ml的反应柱中，加入30mlDCM(二氯甲烷)浸泡0.5小时，使树脂充分溶胀；
步骤Ⅱ：脱除Fmoc保护基：加入体积比为20％的六氢吡啶DMF溶液45ml，反应5min，用DMF(N,N-二甲基甲酰胺)洗涤一次，洗涤结束后，再次加入20％的六氢吡啶DMF溶液45ml，反应10分钟后抽干，DMF洗涤3遍，DCM洗涤2遍，DMF洗涤1遍，采用茚三酮检测法进行检测呈阳性。
步骤Ⅲ：偶联反应：将6.89g的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、2.02g的HOBT(1-羟基苯并三唑)、2.32ml的DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)在0℃下溶于20mlDMF中，完全溶解后加入反应柱中室温反应1小时，采用茚三酮检测法进行检测呈阴性来判断反应进程。
步骤Ⅳ：肽链的延长：偶联反应结束后，抽干反应液，用45mlDMF进行洗涤，20％的六氢吡啶DMF溶液45ml，反应5分钟，用DMF(N,N-二甲基甲酰胺)洗涤一次，洗涤结束后，再次加入20％的六氢吡啶DMF溶液45ml，反应10分钟后抽干，DMF洗涤3遍，DCM洗涤2遍，DMF洗涤1遍。洗涤之后的树脂按照上述偶联反应方法继续进行下一个氨基酸(Fmoc-Thr(tBu)-OH)的偶联反应，如此循环，反应至N端第7个氨基酸(Fmoc-Cys(Trt)-OH)偶联完成，脱除Fmoc保护基，收缩树脂的普兰林肽片段1全保护树脂肽，称重为38.55g。
步骤三：制作替代度为0.5-0.8mmol/g酰肼2cl树脂；
步骤四：合成普兰林肽片段2：在酰肼2cl树脂上依次偶联Fmoc-Thr(tBu)-OH，直至最后一个氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH，脱除Fmoc保护基；其中，合成使用的氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH均为N端采用Fmoc保护的氨基酸，Lys侧链采用Boc保护，Cys侧链采用Trt保护，Asn侧链采用Trt保护，Thr侧链采用tBu保护。
本实施例中，普兰林肽片段2的合成方法如下具体步骤：
步骤①：酰肼树脂的合成：称取取代度为1.15mmol/g的2-Chlorotrityl ChlorideResin树脂10g于500ml烧瓶内，使用20mLDCM溶胀0.5小时后抽干，DMF洗涤3遍；将5.06ml的NH2NH2·H2O、8.62ml的DIEA(N，N-二异丙基乙胺)分别加入烧瓶中，加入20mlDMF在室温下反应10小时；加入15ml甲醇继续反应0.5小时后，抽干反应液，分别用DCM、DMF、甲醇洗涤3遍；最后抽干，树脂称重13.25g，测定树脂替代度为0.72mmol/g。
步骤②：肽链的延长：称量6.94g的酰肼2cl树脂，加入15mlDCM溶胀0.5小时，抽干后DMF洗涤3遍抽干；将5.96g的Fmoc-Thr(tBu)-OH、7.8g的PyBop(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷)、4.9ml的DIEA在0℃下溶于20mlDMF中，完全溶解后加入反应柱中室温反应1小时，采用茚三酮检测法进行检测呈阴性来判断反应进程；偶联反应结束后，抽干反应液，用30mlDMF进行洗涤，20％的六氢吡啶DMF溶液30ml，反应5分钟，用DMF(N,N-二甲基甲酰胺)洗涤一次，洗涤结束后，再次加入20％的六氢吡啶DMF溶液30ml，反应10分钟后抽干，DMF洗涤3遍，DCM洗涤2遍，DMF洗涤1遍；洗涤完成之后的树脂按照偶联反应方法继续进行下一个氨基酸(Fmoc-Ala-OH)的偶联反应，如此循环，反应至N端第1个氨基酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)偶联完成，脱除Fmoc保护基，收缩树脂的普兰林肽片段2全保护树脂肽，称重为12.04g。
步骤五：分别裂解普兰林肽片段1和普兰林肽片段2，加入乙醚沉淀并抽滤洗涤，然后通过高效液相色谱分别对裂解之后的普兰林肽片段1和普兰林肽片段2进行纯化，分别得到95％纯度的多肽片段1和多肽片段2；
本实施例中，普兰林肽片段的裂解方法如下具体内容：
普兰林肽片段1的裂解方法的具体步骤如下：称取38.55g普兰林肽片段1至圆底烧瓶中，在0℃下缓慢加入配置好的350ml裂解液1缓慢搅拌，低温下反应0.5小时，室温下反应2小时，抽滤得到裂解液A，将裂解液A缓慢加入2L的无水冰乙醚中并搅拌，过滤分离粗品多肽，冰乙醚洗涤3遍，得到普兰林肽片段1粗肽；然后将普兰林肽片段1粗肽经过分离纯化，得到5.26g多肽片段1，收率为31.57％；
普兰林肽片段2的裂解方法的具体步骤如下：称取12.04g普兰林肽片段2至圆底烧瓶中，在0℃下缓慢加入配置好的100ml裂解液2缓慢搅拌，低温下反应0.5小时，室温下反应2小时，抽滤得到裂解液B，将裂解液B缓慢加入1L的无水冰乙醚中并搅拌，过滤分离粗品多肽，冰乙醚洗涤3遍，得到普兰林肽片段2粗肽；然后将普兰林肽片段2粗肽经过分离纯化，得到1.66g多肽片段2，收率为52.20％；
步骤六：多肽片段2经PBS缓冲液溶解后,在-10-0℃、pH值小于7的酸性条件下经过亚硝酸钠氧化反应形成酰基叠氮产物，通过对巯基苯甲酸作用衍生成硫酯产物并与多肽片段1混合，通过质谱及HPLC分析判定，经过2小时后由多肽片段1和多肽片段2连接得到普兰林肽线性肽，分离纯化，冻干得到晶状普兰林肽线性肽；
本实施例中，晶状普兰林肽线性肽的合成方法的具体内容如下：称取5.26g多肽片段1溶于20mLPBS缓冲液，在－5℃、pH＝4.0条件下加入3mmol/L的亚硝酸钠溶液3mL，搅拌0.5小时，然后缓慢加入20mmol/L的MPAA，调节pH值至7.0并得到混合液；称取1.21g多肽片段2，缓慢加入上述混合液中，3小时后，通过质谱及HPLC检测反应完全后，分离纯化，冻干得到5.68g纯度为95％的晶状普兰林肽线性肽。其中，PBS缓冲液由6.0mol/L Gn·HCl和0.2mol/L Na2HPO4混合而成。
步骤七：将晶状普兰林肽线性肽溶解于含有DMSO、乙腈、水的混合溶液中，在室温条件下进行氧化反应，经分析型HPLC监测原料完全转化，直至氧化反应停止；其中，在氧化反应之间，将混合容易的pH值调节至6.0；
本实施例中，晶状普兰林肽线性肽的氧化的具体步骤如下：将5.68g纯度为95％的晶状普兰林肽线性肽溶于30mL的15％DMSO，室温下氧化反应6小时后，经分析型HPLC监测原料完全转化，直至氧化反应停止；其中，15％DMSO中的水和乙腈的体积比为3∶2。
步骤八：使用半制备色谱分离步骤七的混合溶液并纯化，冻干得到纯度为98.25％的普兰林肽纯品4.38g，总收率达到22.18％。
本实施例中，偶联反应形成的偶联体系为：由HOBT、HOAT、Cl-HOBT中的任意一个或一个以上与DIC组成的偶联体系，或者由HBTU、TBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上与DIEA组成的偶联体系，或者由HOBT、HOAT、Cl-HOBT中的任意一个或一个以上、HBTU、TBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上与DIEA组成的偶联体系。
本实施例中，步骤三中，采用NH2NH2·H2O与N,N-二异丙基乙胺(DIEA)合成酰肼2cl树脂，NH2NH2·H2O为酰肼2cl树脂摩尔量的9-15倍，N,N-二异丙基乙胺(DIEA)为酰肼2cl树脂摩尔量的3-6倍。进一步地，NH2NH2·H2O为酰肼2cl树脂摩尔量的9-12倍，N,N-二异丙基乙胺(DIEA)为酰肼2cl树脂摩尔量的3-4倍，反应时间为8-12小时，考虑到普兰林肽片段2肽链长度为6个氨基酸，树脂替代度可以尽量高，能够降低成本，适合规模化生产。
本实施例中，步骤五中，采用裂解液1和裂解液2分别裂解普兰林肽片段1和普兰林肽片段2，裂解液1采用的裂解试剂配方体积比例为TFA：乙二硫醇：苯酚：三异丙基硅烷：水＝86：8：3：2：1，裂解液2采用的裂解试剂配方体积比例为TFA：巯基丙酸：三异丙基硅烷：苯酚：水＝88：5：3：3：1，裂解液1和裂解液2的体积所对应的重量为树脂肽重量的8-10倍，乙醚的体积为裂解液1或裂解液2的体积的5-8倍。
本实施例中，步骤六中多肽片段1与多肽片段2连接时，亚硝酸钠摩尔体积比为3mmol/L，亚硝酸钠摩尔量为多肽摩尔量的5-8倍，氧化反应时间为5-8小时。
本实施例中，步骤七的含有DMSO、乙腈、水的混合溶液中DMSO的体积含量为15％，水和乙腈的体积比为3:2，氧化反应时间为5-10小时。
实施例2：
步骤一：对替代度为0.25-0.40mmol/g的Rink Amide MBHA树脂进行片段偶联反应。
步骤二：合成普兰林肽片段1：从C端到N端依次偶联Fmoc-Tyr(tBu)-OH直至N端第7位Fmoc-Cys(Trt)-OH，脱除Fmoc保护基；其中，合成使用的氨基酸均为N端采用Fmoc保护的氨基酸，Cys侧链采用Trt保护，Asn侧链采用Trt保护，Thr侧链采用tBu保护，Gln侧链采用Trt保护，Arg侧链采用Pbf保护，His侧链采用Trt保护，Ser侧链采用tBu保护，Tyr侧链采用tBu保护；其中，N端28、29使用二肽氨基酸Fmoc-Pro-Pro-OH、N端24、25使用的二肽氨基酸Fmoc-Gly-Pro-OH、N端20、21位使用二肽氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-OH；本发明通过实验发现，相同的氨基酸在不同的偶联体系下偶联率是不同的，实验表明，普兰林肽三个合成难点是N端第21位的Asn水解，N端24、25和N端28、29的反应时检测容易出现假阳性现象。使用Fmoc-Pro-Pro-OH、Fmoc-Gly-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Asn(Trt)-OH的效果优于Fmoc-Pro-OH和Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH和Fmoc-Asn(Trt)-OH，同时能够提高反应效率，降低副反应产生率，提高收率。
本实施例中，普兰林肽片段1的合成方法如下具体步骤：
步骤Ⅰ：溶胀Rink Amide MBHA树脂：称取0.34mmol/g的Rink Amide MBHA树脂14.70g置于500ml的反应柱中，加入30mlDCM(二氯甲烷)浸泡0.5小时，使树脂充分溶胀；
步骤Ⅱ：脱除Fmoc保护基：加入体积比为20％的六氢吡啶DMF溶液45ml，反应5min，用DMF(N,N-二甲基甲酰胺)洗涤一次，洗涤结束后，再次加入20％的六氢吡啶DMF溶液45ml，反应10分钟后抽干，DMF洗涤3遍，DCM洗涤2遍，DMF洗涤1遍，采用茚三酮检测法进行检测呈阳性。
步骤Ⅲ：偶联反应：将6.89g的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、7.8g的PyBop(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷)、4.96ml的DIEA(N,N-二异丙基乙胺)在0℃下溶于20mlDMF中，完全溶解后加入反应柱中室温反应1小时，采用茚三酮检测法进行检测呈阴性来判断反应进程。
步骤Ⅳ：肽链的延长：偶联反应结束后，抽干反应液，用45mlDMF进行洗涤，20％的六氢吡啶DMF溶液45ml，反应5分钟，用DMF(N,N-二甲基甲酰胺)洗涤一次，洗涤结束后，再次加入20％的六氢吡啶DMF溶液45ml，反应10分钟后抽干，DMF洗涤3遍，DCM洗涤2遍，DMF洗涤1遍。洗涤之后的树脂按照上述偶联反应方法继续进行下一个氨基酸(Fmoc-Thr(tBu)-OH)的偶联反应，如此循环，反应至N端第7个氨基酸(Fmoc-Cys(Trt)-OH)偶联完成，脱除Fmoc保护基，收缩树脂的普兰林肽片段1全保护树脂肽，称重为39.45g。
步骤三：制作替代度为0.5-0.8mmol/g酰肼2cl树脂；
步骤四：合成普兰林肽片段2：在酰肼2cl树脂上依次偶联Fmoc-Thr(tBu)-OH，直至最后一个氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH，脱除Fmoc保护基；其中，合成使用的氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH均为N端采用Fmoc保护的氨基酸，Lys侧链采用Boc保护，Cys侧链采用Trt保护，Asn侧链采用Trt保护，Thr侧链采用tBu保护。
本实施例中，普兰林肽片段2的合成方法如下具体步骤：
步骤①：酰肼树脂的合成：称取取代度为1.15mmol/g的2-Chlorotrityl ChlorideResin树脂10g于500ml烧瓶内，使用20mLDCM溶胀0.5小时后抽干，DMF洗涤3遍；将5.06ml的NH2NH2·H2O、8.62ml的DIEA(N，N-二异丙基乙胺)分别加入烧瓶中，加入20mlDMF在室温下反应10小时；加入15ml甲醇继续反应0.5小时后，抽干反应液，分别用DCM、DMF、甲醇洗涤3遍；最后抽干，树脂称重13.25g，测定树脂替代度为0.72mmol/g。
步骤②：肽链的延长：称量6.94g的酰肼2cl树脂，加入15mlDCM溶胀0.5小时，抽干后DMF洗涤3遍抽干；将5.96g的Fmoc-Thr(tBu)-OH、7.8g的PyBop(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷)、4.9ml的DIEA在0℃下溶于20mlDMF中，完全溶解后加入反应柱中室温反应1小时，采用茚三酮检测法进行检测呈阴性来判断反应进程；偶联反应结束后，抽干反应液，用30mlDMF进行洗涤，20％的六氢吡啶DMF溶液30ml，反应5分钟，用DMF(N,N-二甲基甲酰胺)洗涤一次，洗涤结束后，再次加入20％的六氢吡啶DMF溶液30ml，反应10分钟后抽干，DMF洗涤3遍，DCM洗涤2遍，DMF洗涤1遍；洗涤完成之后的树脂按照偶联反应方法继续进行下一个氨基酸(Fmoc-Ala-OH)的偶联反应，如此循环，反应至N端第1个氨基酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)偶联完成，脱除Fmoc保护基，收缩树脂的普兰林肽片段2全保护树脂肽，称重为11.64g。
步骤五：分别裂解普兰林肽片段1和普兰林肽片段2，加入乙醚沉淀并抽滤洗涤，然后通过高效液相色谱分别对裂解之后的普兰林肽片段1和普兰林肽片段2进行纯化，分别得到95％纯度的多肽片段1和多肽片段2；
本实施例中，普兰林肽片段的裂解方法如下具体内容：
普兰林肽片段1的裂解方法的具体步骤如下：称取39.45g普兰林肽片段1至圆底烧瓶中，在0℃下缓慢加入配置好的350ml裂解液1缓慢搅拌，低温下反应0.5小时，室温下反应2小时，抽滤得到裂解液A，将裂解液A缓慢加入2L的无水冰乙醚中并搅拌，过滤分离粗品多肽，冰乙醚洗涤3遍，得到普兰林肽片段1粗肽；然后将普兰林肽片段1粗肽经过分离纯化，得到5.84g多肽片段1，收率为35.05％；
普兰林肽片段2的裂解方法的具体步骤如下：称取11.64g普兰林肽片段2至圆底烧瓶中，在0℃下缓慢加入配置好的100ml裂解液2缓慢搅拌，低温下反应0.5小时，室温下反应2小时，抽滤得到裂解液B，将裂解液B缓慢加入1L的无水冰乙醚中并搅拌，过滤分离粗品多肽，冰乙醚洗涤3遍，得到普兰林肽片段2粗肽；然后将普兰林肽片段2粗肽经过分离纯化，得到1.57g多肽片段2，收率为48.46％；
步骤六：多肽片段2经PBS缓冲液溶解后,在-10-0℃、pH值小于7的酸性条件下经过亚硝酸钠氧化反应形成酰基叠氮产物，通过对巯基苯甲酸作用衍生成硫酯产物并与多肽片段1混合，通过质谱及HPLC分析判定，经过2小时后由多肽片段1和多肽片段2连接得到普兰林肽线性肽，分离纯化，冻干得到晶状普兰林肽线性肽；
本实施例中，晶状普兰林肽线性肽的合成方法的具体内容如下：称取5.84g多肽片段1溶于20mLPBS缓冲液，在－5℃、pH＝4.0条件下加入3mmol/L的亚硝酸钠溶液3mL，搅拌0.5小时，然后缓慢加入20mmol/L的MPAA，调节pH值至7.0并得到混合液；称取1.36g多肽片段2，缓慢加入上述混合液中，3小时后，通过质谱及HPLC检测反应完全后，分离纯化，冻干得到5.59g纯度为95％的晶状普兰林肽线性肽。
步骤七：将晶状普兰林肽线性肽溶解于含有DMSO、乙腈、水的混合溶液中，在室温条件下进行氧化反应，经分析型HPLC监测原料完全转化，直至氧化反应停止；其中，在氧化反应之间，将混合容易的pH值调节至6.0；
本实施例中，晶状普兰林肽线性肽的氧化的具体步骤如下：将5.59g纯度为95％的晶状普兰林肽线性肽溶于30mL的15％DMSO，室温下氧化反应6小时后，经分析型HPLC监测原料完全转化，直至氧化反应停止；其中，15％DMSO中的水和乙腈的体积比为3∶2。
步骤八：使用半制备色谱分离步骤七的混合溶液并纯化，冻干得到纯度为98.17％的普兰林肽纯品4.43g，总收率达到22.43％。
上述实施例中，上述各原料名称简写与原料名称全称的对照表如表1所示。
表1原料名称简写与原料名称全称的对照表
Figure BDA0002417678790000101
Figure BDA0002417678790000111
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种合成普兰林肽的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一：对替代度为0.25-0.40mmol/g的RinkAmide MBHA树脂进行片段偶联反应；
步骤二：合成普兰林肽片段1：从C端到N端依次偶联Fmoc-Tyr(tBu)-OH直至N端第7位Fmoc-Cys(Trt)-OH，脱除Fmoc保护基；
普兰林肽片段1的合成方法如下具体步骤：
步骤Ⅰ：溶胀Rink Amide MBHA树脂：称取0.34mmol/g的Rink Amide MBHA树脂14.70g置于500ml的反应柱中，加入30mlDCM(二氯甲烷)浸泡0.5小时，使树脂充分溶胀；
步骤Ⅱ：脱除Fmoc保护基：加入体积比为20％的六氢吡啶DMF溶液45ml，反应5min，用DMF(N,N-二甲基甲酰胺)洗涤一次，洗涤结束后，再次加入20％的六氢吡啶DMF溶液45ml，反应10分钟后抽干，DMF洗涤3遍，DCM洗涤2遍，DMF洗涤1遍，采用茚三酮检测法进行检测呈阳性；
步骤Ⅲ：偶联反应：将6.89g的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、2.02g的HOBT(1-羟基苯并三唑)、2.32ml的DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)在0℃下溶于20mlDMF中，完全溶解后加入反应柱中室温反应1小时，采用茚三酮检测法进行检测呈阴性来判断反应进程；
步骤Ⅳ：肽链的延长：偶联反应结束后，抽干反应液，用45mlDMF进行洗涤，20％的六氢吡啶DMF溶液45ml，反应5分钟，用DMF(N,N-二甲基甲酰胺)洗涤一次，洗涤结束后，再次加入20％的六氢吡啶DMF溶液45ml，反应10分钟后抽干，DMF洗涤3遍，DCM洗涤2遍，DMF洗涤1遍；洗涤之后的树脂按照上述偶联反应方法继续进行下一个氨基酸(Fmoc-Thr(tBu)-OH)的偶联反应，如此循环，反应至N端第7个氨基酸(Fmoc-Cys(Trt)-OH)偶联完成，脱除Fmoc保护基，收缩树脂的普兰林肽片段1全保护树脂肽，称重为38.55g；
步骤三：制作替代度为0.5-0.8mmol/g酰肼2cl树脂；
步骤四：合成普兰林肽片段2：在酰肼2cl树脂上依次偶联Fmoc-Thr(tBu)-OH，直至最后一个氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH，脱除Fmoc保护基；
普兰林肽片段2的合成方法如下具体步骤：
步骤①：酰肼树脂的合成：称取取代度为1.15mmol/g的2-Chlorotrityl ChlorideResin树脂10g于500ml烧瓶内，使用20mLDCM溶胀0.5小时后抽干，DMF洗涤3遍；将5.06ml的NH2NH2·H2O、8.62ml的DIEA(N，N-二异丙基乙胺)分别加入烧瓶中，加入20mlDMF在室温下反应10小时；加入15ml甲醇继续反应0.5小时后，抽干反应液，分别用DCM、DMF、甲醇洗涤3遍；最后抽干，树脂称重13.25g，测定树脂替代度为0.72mmol/g；
步骤②：肽链的延长：称量6.94g的酰肼2cl树脂，加入15mlDCM溶胀0.5小时，抽干后DMF洗涤3遍抽干；将5.96g的Fmoc-Thr(tBu)-OH、7.8g的PyBop(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷)、4.9ml的DIEA在0℃下溶于20mlDMF中，完全溶解后加入反应柱中室温反应1小时，采用茚三酮检测法进行检测呈阴性来判断反应进程；偶联反应结束后，抽干反应液，用30mlDMF进行洗涤，20％的六氢吡啶DMF溶液30ml，反应5分钟，用DMF(N,N-二甲基甲酰胺)洗涤一次，洗涤结束后，再次加入20％的六氢吡啶DMF溶液30ml，反应10分钟后抽干，DMF洗涤3遍，DCM洗涤2遍，DMF洗涤1遍；洗涤完成之后的树脂按照偶联反应方法继续进行下一个氨基酸(Fmoc-Ala-OH)的偶联反应，如此循环，反应至N端第1个氨基酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)偶联完成，脱除Fmoc保护基，收缩树脂的普兰林肽片段2全保护树脂肽，称重为12.04g；
步骤五：分别裂解普兰林肽片段1和普兰林肽片段2，加入乙醚沉淀并抽滤洗涤，然后通过高效液相色谱分别对裂解之后的普兰林肽片段1和普兰林肽片段2进行纯化，分别得到95％纯度的多肽片段1和多肽片段2；
普兰林肽片段1的裂解方法的具体步骤如下：称取38.55g普兰林肽片段1至圆底烧瓶中，在0℃下缓慢加入配置好的350ml裂解液1缓慢搅拌，低温下反应0.5小时，室温下反应2小时，抽滤得到裂解液A，将裂解液A缓慢加入2L的无水冰乙醚中并搅拌，过滤分离粗品多肽，冰乙醚洗涤3遍，得到普兰林肽片段1粗肽；然后将普兰林肽片段1粗肽经过分离纯化，得到5.26g多肽片段1，收率为31.57％；
普兰林肽片段2的裂解方法的具体步骤如下：称取12.04g普兰林肽片段2至圆底烧瓶中，在0℃下缓慢加入配置好的100ml裂解液2缓慢搅拌，低温下反应0.5小时，室温下反应2小时，抽滤得到裂解液B，将裂解液B缓慢加入1L的无水冰乙醚中并搅拌，过滤分离粗品多肽，冰乙醚洗涤3遍，得到普兰林肽片段2粗肽；然后将普兰林肽片段2粗肽经过分离纯化，得到1.66g多肽片段2，收率为52.20％；
步骤六：多肽片段2经PBS缓冲液溶解后,在-10-0℃、pH值小于7的酸性条件下经过亚硝酸钠氧化反应形成酰基叠氮产物，通过对巯基苯甲酸作用衍生成硫酯产物并与多肽片段1混合，通过质谱及HPLC分析判定，经过2小时后由多肽片段1和多肽片段2连接得到普兰林肽线性肽，分离纯化，冻干得到晶状普兰林肽线性肽；
晶状普兰林肽线性肽的合成方法的具体内容如下：称取5.26g多肽片段1溶于20mL PBS缓冲液，在－5℃、pH＝4.0条件下加入3mmol/L的亚硝酸钠溶液3mL，搅拌0.5小时，然后缓慢加入20mmol/L的MPAA，调节pH值至7.0并得到混合液；称取1.21g多肽片段2，缓慢加入上述混合液中，3小时后，通过质谱及HPLC检测反应完全后，分离纯化，冻干得到5.68g纯度为95％的晶状普兰林肽线性肽；其中，PBS缓冲液由6.0mol/L Gn·HCl和0.2mol/L Na2HPO4混合而成；
步骤七：将晶状普兰林肽线性肽溶解于含有DMSO、乙腈、水的混合溶液中，在室温条件下进行氧化反应，经分析型HPLC监测原料完全转化，直至氧化反应停止；
晶状普兰林肽线性肽的氧化的具体步骤如下：将5.68g纯度为95％的晶状普兰林肽线性肽溶于30mL的15％DMSO，室温下氧化反应6小时后，经分析型HPLC监测原料完全转化，直至氧化反应停止；其中，15％DMSO中的水和乙腈的体积比为3∶2；
步骤八：使用半制备色谱分离步骤七的混合溶液并纯化，冻干得到普兰林肽纯品。
2.根据权利要求1所述的一种合成普兰林肽的方法，其特征在于：偶联反应形成的偶联体系为：由HOBT、HOAT、Cl-HOBT中的任意一个或一个以上与DIC组成的偶联体系，或者由HBTU、TBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上与DIEA组成的偶联体系。
3.根据权利要求2所述的一种合成普兰林肽的方法，其特征在于：偶联反应形成的偶联体系为：由HOBT、HOAT、Cl-HOBT中的任意一个或一个以上、HBTU、TBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上与DIEA组成的偶联体系。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种合成普兰林肽的方法，其特征在于：步骤三中，采用NH2NH2·H2O与N,N-二异丙基乙胺(DIEA)合成酰肼2cl树脂，NH2NH2·H2O为酰肼2cl树脂摩尔量的9-15倍，N,N-二异丙基乙胺(DIEA)为酰肼2cl树脂摩尔量的3-6倍。
5.根据权利要求4所述的一种合成普兰林肽的方法，其特征在于：步骤五中，采用裂解液1和裂解液2分别裂解普兰林肽片段1和普兰林肽片段2，裂解液1采用的裂解试剂配方体积比例为TFA：乙二硫醇：苯酚：三异丙基硅烷：水＝86：8：3：2：1，裂解液2采用的裂解试剂配方体积比例为TFA：巯基丙酸：三异丙基硅烷：苯酚：水＝88：5：3：3：1，裂解液1和裂解液2的体积所对应的重量为树脂肽重量的8-10倍，乙醚的体积为裂解液1或裂解液2的体积的5-8倍。
6.根据权利要求1或2或3或5所述的一种合成普兰林肽的方法，其特征在于：步骤六中多肽片段1与多肽片段2连接时，亚硝酸钠摩尔体积比为3mmol/L，亚硝酸钠摩尔量为多肽摩尔量的5-8倍，氧化反应时间为5-8小时。
7.根据权利要求6所述的一种合成普兰林肽的方法，其特征在于：步骤七的含有DMSO、乙腈、水的混合溶液中DMSO的体积含量为15％，水和乙腈的体积比为3:2，氧化反应时间为5-10小时。
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