CN112574285B - 一种含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法，包括以下步骤：1)采用Serb Resin树脂制备氨基酸树脂Fmoc‑AA‑NH2‑Serb Resin，然后采用特定的弱酸敏感的保护基Fmoc氨基酸，合成肽树脂；2)树脂裂解，同时形成二硫键；3)沉淀得到粗肽。本发明的合成方法可以避免使用高浓度的TFA裂解，同时可以实现侧链保护基脱保护、树脂裂解、成环在同一条件下完成；采用0.5～1.5％碘‑DCM溶液在裂解后期添加的策略，能够在裂解的同时完成氧化，极大的简化工艺，同时避免了二次制备；反应毕浓缩1/2再进行乙醚沉淀，即可得到纯度较高的粗肽，且杂质和主峰分离度较好，便于制备纯化；该工艺操作简单，操作步骤大大简化，工期缩短，后处理方便。

Description

一种含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法
技术领域
本发明属于药物合成方法技术领域，涉及一种含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法。
背景技术
二硫键是由两个巯基(SH)氧化而成的一类环状化合物结构，是多肽化合物中，常见的一种结构形式。例如已上市多肽药物：缩宫素、去氨加压素、精氨酸加压素、赖氨酸加压素、特利加压素、兰瑞肽等等。
该类多肽产品的合成方法主要有两大类，一类是液相合成；另一类是固相合成。其中液相合成的策略主要是采用片段缩合法，即合成不同片段，再片段缩合；比如十肽化合物精氨酸加压素采用“4+6”、“5+5”、“3+7”等策略。最后再进行氧化成环。而固相合成的策略主要是针对保护基策略和脱保护方法。比如精氨酸加压素常用的策略有先合成全保护肽，再进行切割得到线性肽，最后再通过氧化剂氧化等方式得到二硫的精氨酸加压素。
具体到该类化合物的二硫键形成，主要也有两大类：即液相氧化和固相氧化。多肽二硫键的固相氧化，通常步骤是：Fmoc固相合成策略合成多肽，然后采用一定量的碘进行氧化成环，再进行裂解，沉淀制备得到目标肽。液相氧化大致过程是：固相合成多肽，然后裂解得到线性肽(不带保护基的肽)，然后将线性肽溶解在水-乙腈等溶液体系，为防止分子间二聚等，通常采用较低浓度的体系，加入氧化剂(碘、氧气、双氧水等)进行氧化成环，然后浓缩，制备得到目标肽。
以上方法是多肽化合物形成二硫键的常用方法。
液相片段缩合存在合成周期长，合成操作繁琐，后处理纯化等比较复杂，粗肽纯度低且需用到氢溴酸等强酸，不易放大生产，该方案已逐渐被多肽领域淘汰。
现今，Fmoc策略成为多肽合成中的主流策略。这类多肽按照氧化的形式又分为固相氧化和液相氧化。
液相氧化工艺大致如下：先固相合成肽树脂，然后在强酸体系下裂解(10倍体积的95％TFA)，再制备得到线性肽，最后在极稀的浓度下进行氧化(一般在1mg/ml，甚至0.5mg/ml)，最后在较大的反应液体积的情况下二次制备，得到目标化合物。该方法是现阶段常规的精氨酸加压素类多肽(精氨酸加压素、缩宫素、特利加压素等含有一对二硫键的多肽)的合成方案；该方案显而易见的缺点是：整个实验过程繁琐，需要两次制备纯化，且在线性肽氧化时，需要较大体积的溶剂溶解(防止二聚体产生，要求反应浓度极稀)，因此在氧化后的纯化工作时，大量溶剂的分离给纯化工作带来较大的工作量，且存在三废处理麻烦，两步纯化的总收率较低等等问题。
固相氧化工艺大致如下：选用Trt或者Mmt保护巯基。采用Fmoc固相合成策略合成肽树脂，然后采用10-15倍当量的碘/DCM溶剂，一起在柱子中氧化1小时，反应毕抽干树脂，然后采用强酸(10倍体积的三氟乙酸)裂解肽树脂，10倍体积的乙醚沉淀，制备，得到目标化合物。该方法操作简便，但是因为在固相树脂中进行氧化，需要大量的碘(一般采用10-15倍当量的碘)，反应才能完全氧化成环，在精氨酸加压素、缩宫素、去氨加压素等多肽肽序中含有Tyr等易氧化基团，因此采用该方案进行固相氧化，杂质多，粗肽纯度低。
再者以上无论固相氧化还是液相氧化，均需要采用高浓度强酸(一般95％的三氟乙酸)进行树脂的裂解和保护基脱除。
我们试图开发一种新的合成工艺来解决以上：操作繁琐，粗肽纯度低，总收率低等一系列问题，同时避免使用三氟乙酸等强酸造成三废问题，已达到绿色环保的目的。
发明内容
为了解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的目的在于提供一种含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法，包括以下步骤：
1)采用Serb Resin树脂制备氨基酸树脂Fmoc-AA-NH2-Serb Resin，然后采用特定的弱酸敏感的保护基Fmoc氨基酸，合成肽树脂；
2)树脂裂解，同时形成二硫键；
3)沉淀得到粗肽。
进一步地，所述含一对二硫键的多肽为肽序中的氨基酸侧链保护基可以是采用TFE的DCM溶液，其中TFE与DCM的体积比为1：4，或体积百分数为1～5％的TFA的DCM溶液脱离或氨基酸不需要保护，且在合成过程中不宜发生副反应的一类多肽。
进一步地，所述步骤1)为采用Serb Resin树脂为合成起点，制备氨基酸树脂Fmoc-AA-NH2-Serb Resin，然后根据多肽固相合成法，按照肽序从C端至N端依次偶联氨基酸合成多肽树脂，其中多肽树脂中引入的Cys采用的原料为Fmoc-Cys(弱酸敏感的保护基)-OH，若多肽树脂中含有Arg，则引入Arg采用的原料为Fmoc-Arg(HCl)-OH，若多肽树脂中含有His，则引入His采用的原料为Fmoc-His(弱酸敏感的保护基)-OH，若多肽树脂中含有Tyr，则引入Tyr采用的原料为Fmoc-Tyr-OH，若多肽树脂中含有Asn，则引入Asn采用的原料为Fmoc-Asn-OH，若多肽树脂中含有Gln，则引入Gln采用的原料为Fmoc-Gln-OH(Tyr侧链的酚羟基和Asn、Gln侧链的酰胺，均较为稳定，不宜发生副反应)。例如精氨酸加压素的合成：先合成氨基酸树脂Fmoc-Gly-NH2-Serb Resin，再选择Fmoc-Arg(HCl)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH等合成肽树脂NH2-Cys(Mmt)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Mmt)-Pro-Arg(HCl)-Gly-NH2-Serb Resin。
进一步地，所述步骤2)为采用TFE的DCM溶液，其中TFE与DCM的体积比为1：4，或体积百分数为1～5％的TFA的DCM溶液裂解树脂，然后滴加重量百分数为0.5～1.5％碘的DCM溶液。
进一步地，所述步骤2)为采用肽树脂重量的8-10倍体积的TFE的DCM溶液(即相对于树脂重量采用的溶剂为8ml/g-10ml/g)，其中TFE与DCM的体积比为1：4，或体积百分数为1～5％的TFA的DCM溶液裂解树脂2-3小时后，滴加等体积的重量百分数为0.5～1.5％碘的DCM溶液，继续搅拌15-35分钟。(前2-3小时为裂解步骤，后15-35分钟为氧化步骤，均相状态碘氧化充分，且酸性条件下有利于氧化。需要碘量较低，副反应较少。)
进一步地，所述步骤3)为室温浓缩混合液至1/2体积，采用裂解液8-10倍体积的乙醚沉淀，得到粗肽。
进一步地，所述弱酸敏感的保护基为在体积百分数为1-5％的TFA的DCM溶液或者TFE与DCM的体积比为1：4的TFE的DCM溶液中能脱离的弱酸性保护基，优选为Mmt。
进一步地，所述Serb Resin树脂的替代度为0.4-0.7mmol/g。
进一步地，所述粗肽的合成步骤后还包括纯化步骤；所述纯化步骤以高压液相色谱法进行纯化。
本发明的有益效果是：1、采用Serb Resin树脂和本发明的保护氨基酸组合，这样避免使用高浓度的TFA裂解，同时可以实现侧链保护基脱保护、树脂裂解、成环在同一条件下完成。该工艺操作简单，操作步骤大大简化，工期缩短，后处理方便，同时采用不需要侧链保护的其他氨基酸(因为酰胺键反应活性较低，具有反应选择性)，从物料成本和原子经济性考虑，大量的节约了整体工艺的成本。
2、采用0.5～1.5％碘-DCM溶液在裂解后期添加的策略，能够在裂解的同时完成氧化。极大的简化工艺，同时避免了二次制备，和线性肽单独的碱性体系氧化。而该合成工艺简单，安全性高，设备要求较低。
3、反应毕浓缩1/2再进行乙醚沉淀，即可得到目标化合物，因为采用的氨基酸侧链保护体系，其杂质较低，侧链影响较低，能得到纯度较高的粗肽，且杂质和主峰分离度较好，便于制备纯化。
附图说明
图1为固相氧化精氨酸加压素的合成流程图；
图2为固相氧化精氨酸加压素粗肽的HPLC图；
图3为固相氧化精氨酸加压素精肽的HPLC图；
图4为液相氧化精氨酸加压素的合成流程图；
图5为液相氧化精氨酸加压素线性肽粗肽的HPLC图；
图6为液相氧化精氨酸加压素精肽的HPLC图；
图7为本发明的方法精氨酸加压素合成流程图；
图8为本发明的方法精氨酸加压素粗肽的HPLC图；
图9为本发明的方法精氨酸加压素精肽的HPLC图；
图10为本发明的方法缩宫素精肽的HPLC图；
图11为本发明的方法去氨加压素精肽的HPLC图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限以下实施例。
说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中：
缩写及英文 含义
DMF N，N-二甲基甲酰胺
TFA 三氟乙酸
TFE 三氟乙醇
Mmt 甲基三苯基
DCM 二氯甲烷
AA 氨基酸
本发明以精氨酸加压素，去氨加压素，缩宫素为例，该多肽化合物结构如下：式Ⅰ为精氨酸加压素，式Ⅱ为去氨加压素，式Ⅲ为缩宫素。
Figure BDA0002220796870000051
对比例1：固相氧化精氨酸加压素的合成
流程图如图1所示。
1.1粗肽合成
称取0.5mmol/g的Rink Amide Resin树脂100g，DMF洗涤1次，DCM溶胀30分钟，加入体积百分数为20％哌啶-DMF，脱除Fmoc2次，分别5分钟和7分钟。DMF洗涤6次，加入已预冷处理的Fmoc-Gly-OH(297.3，59.5g，200mmol)和HOBt(29.7g，220mmol)DMF溶液，搅拌，再加入DIC(126.3，34.5ml，220mmol)，室温反应2小时，茚三酮检测(树脂球透明，认为反应充分)，反应完毕，抽滤，DMF洗涤5次，抽干，加入体积百分数为20％哌啶-DMF，脱除Fmoc2次：5+7分钟。DMF洗涤6次，加入已预冷处理的Fmoc-Arg(pbf)-OH(648.7，130g，200mmol)和HOBt(29.7g，220mmol)DMF溶液，搅拌，再加入DIC(126.3，34.5ml，220mmol)，室温反应2小时，茚三酮检测(树脂球透明，认为反应充分)，反应完毕，抽滤，DMF洗涤5次，抽干，加入体积百分数为20％哌啶-DMF，脱除Fmoc2次：5+7分钟。再依次偶联Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH，最后脱除Fmoc，DMF洗涤5次。称取碘(253.8，152.5g，600mmol)加入反应柱中，加入DCM溶解反应2小时，抽干，DMF洗涤6次，DCM洗涤5次，甲醇收缩树脂，得到187g，增重约87g。
配置裂解液：TFA：TIS：EDT：H2O＝95：1.5：1.5：2(体积比)；1870mL裂解液中加入肽树脂187g，搅拌，反应2小时。倒入18.7L乙醚中，沉淀。得到粗肽：48.5g，收率约89.45％，HPLC 78.32％，如图2所示。
1.2纯化制备
直接采用制备色谱进行制备，约得到精肽17.3g，HPLC 99.29％，总收率31.9％，如图3所示。
对比例2：液相氧化精氨酸加压素的合成
流程图如图4所示。
称取0.5mmol/g的Rink Amide Resin树脂100g，DMF洗涤1次，DCM溶胀30分钟，加入体积百分数为20％哌啶-DMF，脱除Fmoc2次，分别5分钟和7分钟。DMF洗涤6次，加入已预冷处理的Fmoc-Gly-OH(297.3，59.5g，200mmol)和HOBt(29.7g，220mmol)DMF溶液，搅拌，再加入DIC(126.3，34.5ml，220mmol)，室温反应2小时，茚三酮检测(树脂球透明，认为反应充分)，反应完毕，抽滤，DMF洗涤5次，抽干，加入体积百分数为20％哌啶-DMF，脱除Fmoc2次：5+7分钟。DMF洗涤6次，加入已预冷处理的Fmoc-Arg(pbf)-OH(648.7，130g，200mmol)和HOBt(29.7g，220mmol)DMF溶液，搅拌，再加入DIC(126.3，34.5ml，220mmol)，室温反应2小时，茚三酮检测(树脂球透明，认为反应充分)，反应完毕，抽滤，DMF洗涤5次，抽干，加入体积百分数为20％哌啶-DMF，脱除Fmoc2次：5+7分钟。再依次偶联Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH，最后脱除Fmoc，DMF洗涤5次。DCM洗涤5次，甲醇收缩树脂，得到193g，增重约93g(1882)。
配置裂解液：TFA：TIS：EDT：H2O＝95：1.5：1.5：2(体积比)；1930mL裂解液中加入肽树脂193g，搅拌，反应2小时。倒入19.3L乙醚中，沉淀。得到线性肽粗肽：52.3g，HPLC：84.81％，如图5所示。制备至纯度90％，约41.1g，加入乙腈-水(体积比为1:9)约84.2L(0.5mg/ml)，溶解，加入体积浓度为0.5％(40ml)双氧水，碳酸钠调节pH至9-10，搅拌反应，HPLC监控反应过程，线性肽完全反应完成后，加入Vc终止反应，浓缩42L溶剂至5L体积，然后分多批次进行制备。得到目标化合物。纯化后得到目标化合物约30.32g，HPLC99.54％，总收率约55.94％,如图6所示。
实施例1精氨酸加压素合成
流程图如图7所示。
1.1合成
称取0.5mmol/g的Sieber Resin树脂100g，DMF洗涤1次，DCM溶胀30分钟，加入体积百分数为20％哌啶-DMF，脱除Fmoc2次，分别5分钟和7分钟。DMF洗涤6次，加入已预冷处理的Fmoc-Gly-OH(297.3，59.5g，200mmol)和HOBt(29.7g，220mmol)DMF溶液，搅拌，再加入DIC(126.3，34.5ml，220mmol)，室温反应2小时，茚三酮检测(树脂球透明，认为反应充分)，反应完毕，抽滤，DMF洗涤5次，抽干，加入体积百分数为20％哌啶-DMF，脱除Fmoc2次：5+7分钟。DMF洗涤6次，加入已预冷处理的Fmoc-Arg(HCl)-OH(432，86g,200mmol)和HOBt(29.7g，220mmol)DMF溶液，搅拌，再加入DIC(126.3，34.5ml，220mmol)，室温反应2小时，茚三酮检测(树脂球透明，认为反应充分)，反应完毕，抽滤，DMF洗涤5次，抽干，加入体积百分数为20％哌啶-DMF，脱除Fmoc2次：5+7分钟。再依次偶联Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH，最后脱除Fmoc，DMF洗涤5次。DCM洗涤5次，甲醇收缩树脂，得到186g，增重约86g(1670)。
配置裂解液：TFE：DCM＝20：80(体积比)；1860mL裂解液中加入肽树脂186g，搅拌，反应2小时。然后加入等体积的重量百分数为1％碘的DCM溶液(1860ml)，继续搅拌30分钟，室温浓缩DCM混合液至约1/2，然后倒入18.6L乙醚中，沉淀。得到粗肽：51.3g，粗肽HPLC：87.68％(分子量1084)，收率94.6％，如图8所示。
1.2纯化制备
采用制备色谱进行纯化制备后，得到目标化合物约38.5g，HPLC 99.59％，总收率约70.98％,如图9所示。
实施例2缩宫素合成
称取0.7mmol/g的Sieber Resin树脂70g，DMF洗涤1次，DCM溶胀30分钟，加入体积百分数为20％哌啶-DMF，脱除Fmoc2次，分别5分钟和7分钟。DMF洗涤6次，加入已预冷处理的Fmoc-Gly-OH(297.3，59.5g，200mmol)和HOBt(29.7g，220mmol)DMF溶液，搅拌，再加入DIC(126.3，34.5ml，220mmol)，室温反应2小时，茚三酮检测(树脂球透明，认为反应充分)，反应完毕，抽滤，DMF洗涤5次，抽干，加入体积百分数为20％哌啶-DMF，脱除Fmoc2次：5+7分钟。再依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-IIe-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH，最后脱除Fmoc，DMF洗涤5次。DCM洗涤5次，甲醇收缩树脂，得到139.2g，增重约69.2g(分子量1555)。
配置裂解液：TFE：DCM＝20：80(体积比)；1110mL裂解液中(约8倍)，加入肽树脂139g，搅拌，反应2小时。然后加入等体积的重量百分数为0.5％碘的DCM溶液(1110ml)，继续搅拌30分钟，室温浓缩DCM混合液至约1/2，然后倒入11.0L乙醚中，沉淀。得到粗肽：45.8g，经制备色谱纯化制备得到精肽34.5g，HPLC 98.99％，总收率约70％(分子量1007)，如图10所示。
实施例3去氨加压素合成
称取0.5mmol/g的Sieber Resin树脂100g，DMF洗涤1次，DCM溶胀30分钟，加入体积百分数为20％哌啶-DMF，脱除Fmoc2次，分别5分钟和7分钟。DMF洗涤6次，加入已预冷处理的Fmoc-Gly-OH(297.3，59.5g，200mmol)和HOBt(29.7g，220mmol)DMF溶液，搅拌，再加入DIC(126.3，34.5ml，220mmol)，室温反应2小时，茚三酮检测(树脂球透明，认为反应充分)，反应完毕，抽滤，DMF洗涤5次，抽干，加入体积百分数为20％哌啶-DMF，脱除Fmoc2次：5+7分钟。再依次偶联Fmoc-D-Arg(HCl)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr-OH、Mpr(Mmt)-OH，最后脱除Fmoc，DMF洗涤5次。DCM洗涤5次，甲醇收缩树脂，得到177.4g，增重约77.4g(分子量1617)。
配置裂解液：TFE：DCM＝20：80(体积比)；1770mL裂解液中(10倍)，加入肽树脂177g，搅拌，反应1.5小时。然后加入等体积的重量百分数为0.5％碘的DCM溶液(1770ml)，继续搅拌1分钟，室温浓缩DCM混合液至约1/2，然后倒入17.0L乙醚中，沉淀。得到粗肽：43.1g，经制备色谱纯化制备得到精肽37.9g，HPLC 99.61％，总收率约71％(分子量1068)，如图11所示。
以上所述仅为本发明的具体实施方式，不是全部的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

Claims (7)

1.一种含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采用Serb Resin树脂制备氨基酸树脂Fmoc-AA-NH2-Serb Resin，然后采用特定的弱酸敏感的保护基Fmoc氨基酸，合成肽树脂；
2)树脂裂解，同时形成二硫键；
3)沉淀得到粗肽；
所述步骤1)为采用Serb Resin树脂为合成起点，制备氨基酸树脂Fmoc-AA-NH2-SerbResin，然后根据多肽固相合成法，按照肽序从C端至N端依次偶联氨基酸合成多肽树脂，其中多肽树脂中引入的Cys采用的原料为Fmoc-Cys(弱酸敏感的保护基)-OH，若多肽树脂中含有Arg，则引入Arg采用的原料为Fmoc-Arg(HCl)-OH，若多肽树脂中含有His，则引入His采用的原料为Fmoc-His(弱酸敏感的保护基)-OH，若多肽树脂中含有Tyr，则引入Tyr采用的原料为Fmoc-Tyr-OH，若多肽树脂中含有Asn，则引入Asn采用的原料为Fmoc-Asn-OH，若多肽树脂中含有Gln，则引入Gln采用的原料为Fmoc-Gln-OH；
所述步骤2)为采用肽树脂重量的8-10倍体积的TFE的DCM溶液，其中TFE与DCM的体积比为1：4，滴加等体积的重量百分数为0.5～1.5％碘的DCM溶液，继续搅拌15-35分钟；
所述弱酸敏感的保护基为Mmt；
所述的含一对二硫键的多肽药物是精氨酸加压素、去氨加压素或缩宫素。
2.根据权利要求1所述的含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法，其特征在于，所述含一对二硫键的多肽为肽序中的氨基酸侧链保护基可以是采用TFE的DCM溶液，其中TFE与DCM的体积比为1：4，且在合成过程中不宜发生副反应的一类多肽。
3.根据权利要求1所述的含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法，其特征在于，所述步骤2)为采用TFE的DCM溶液，其中TFE与DCM的体积比为1：4，然后滴加重量百分数为0.5～1.5％碘的DCM溶液。
4.根据权利要求1所述的含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法，其特征在于，所述步骤3)为室温浓缩混合液至1/2体积，采用裂解液8-10倍体积的乙醚沉淀，得到粗肽。
5.根据权利要求1-4任一所述的含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法，其特征在于，所述Serb Resin树脂的替代度为0.4-0.7mmol/g。
6.根据权利要求1所述的含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法，其特征在于，所述粗肽的合成步骤后还包括纯化步骤。
7.根据权利要求6所述的含一对二硫键的多肽药物的固液相合成方法，其特征在于，所述纯化步骤以高压液相色谱法进行纯化。
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