CN110054673A - 一种固液结合制备齐考诺肽的方法 - Google Patents

一种固液结合制备齐考诺肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及多肽合成领域，本发明采用固液结合的方法制备齐考诺肽，能够很好的避免杂质肽的产生，提高粗肽纯度，降低生产成本。本发明首次采用二肽单体Fmoc‑Gly‑Lys(Boc)‑OH、Fmoc‑Gly‑Ala‑OH、Fmoc‑Leu‑Met‑OH和Fmoc‑Gly‑Ser(tBu)‑OH固相合成齐考诺肽；同时引入半胱氨酸单体Fmoc‑Cys(tButhio)‑OH和Boc‑Cys(tButhio)‑OH参与合成齐考诺肽，避免了线性肽裂解过程中巯基被氧化，能够有效的提高线性肽的纯度，从而提高终产品的收率，有利于合成规模的放大，降低生产成本。

Description

一种固液结合制备齐考诺肽的方法
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种固液结合制备齐考诺肽的方法。
背景技术
齐考诺肽(ziconotide)是由爱尔兰Elan公司研制的一种N-型钙通道阻滞剂，是从圆锥型蜗牛软体动物体内分离出的芋螺毒素，可用于鞘内给药的非阿片类镇痛药物。齐考诺肽注射液(商品名：PRIALT)于2005年1月11日首次在美国获批上市，并于2006年相继在英国、爱尔兰和德国上市，于2007年在瑞典上市，之后在奥地利、比利时、希腊、荷兰、卢森堡、意大利、西班牙、葡萄牙、丹麦、芬兰、法国等多国上市，适用于适合鞘内注射而其他治疗方法(比如全身性镇痛药、辅助治疗或鞘内注射吗啡)不能耐受或不能控制的严重慢性疼痛的成人患者的治疗，相比于阿片类镇痛药物，具有疗效好、无耐药性和无成瘾性等优势。
齐考诺肽是由3对二硫键连接在内的25个氨基酸组成的多肽，分子量为2639.12，肽序较长且结构复杂，C1-C16、C8-C20和C15-C25三对二硫键使多肽折叠成为ω结，除此之外还有3股β折叠进一步稳定其空间结构。其氨基酸序列和二硫键桥接模式如下所示：
齐考诺肽的合成，国内多采用固相Fmoc化学法合成，CN101412752B，CN102268082B，CN107216374A和CN106496315A采用3对不同保护基保护半胱氨酸，分步形成3对二硫键，采用此策略合成，合成周期长，收率较低；采用Fmoc-Cys(TButhio)-OH合成肽树脂，裂解后一步氧化形成3对二硫键，采用碘氧化，会对齐考诺肽肽链造成破坏，导致收率降低；CN103304655A中线性肽的合成使用了Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH共3种二肽片段作为原料，避免了[+Gly]-齐考诺肽和[-Gly]-齐考诺肽杂质的产生；CN104974237B和CN109021087A采用片段合成法，固液结合合成齐考诺肽，有效的提高了粗肽纯度，但是会造成合成成本的提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种固液相结合制备齐考诺肽的方法，主要解决现有合成方法存在的合成周期长，生产成本高，产品收率低不利于后期工业化放大的技术问题。
为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：一种固液相结合制备齐考诺肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)合成二肽单体Fmoc-Gly-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-Ala-OH、Fmoc-Leu-Met-OH和Fmoc-Gly-Ser(tBu)-OH；
(b)以氨基树脂为固相载体，依次和
偶联，得到肽树脂；
(c)裂解得到巯基被保护的线性肽：
H-Cys(tButhio)-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys(tButhio)-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys(tButhio)-Cys(tButhio)-Thr-Gly-Ser-Cys(tButhio)-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys(tButhio)-NH2；
(d)脱掉巯基侧链保护基并一步氧化成三对二硫键，得到齐考诺肽，经纯化、冻干得精肽。
优选的，步骤(a)中Fmoc-Gly-Lys(Boc)-OH合成的具体操作步骤为：在低温浴下将H-Lys(Boc)-OH溶解于碱性溶液中；低温下向该溶液中滴加Fmoc-Gly-OSu/有机溶剂的溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体Fmoc-Gly-Lys(Boc)-OH。
优选的，步骤(a)中Fmoc-Gly-Ala-OH合成的具体操作步骤为：在低温浴下将丙氨酸溶解于配置好的碱性溶液中，低温下向该反应液中滴加Fmoc-Gly-OSu/有机溶剂溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体Fmoc-Gly-Ala-OH。
优选的，步骤(a)中Fmoc-Leu-Met-OH合成的具体操作步骤为：在低温浴下将甲硫氨酸溶解于配置好的碱溶液中，低温下向该反应液中滴加Fmoc-Leu-OSu/有机溶剂溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体Fmoc-Leu-Met-OH。
优选的，步骤(a)中Fmoc-Gly-Ser(tBu)-OH合成的具体操作步骤为：在低温浴下将H-Ser(tBu)-OH溶解于配置好的碱溶液中，低温下向该反应液中滴加Fmoc-Gly-Osu/有机溶剂溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体Fmoc-Gly-Ser(tBu)-OH。
更为优选的，所述的碱性溶液可以是氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾水溶液或与水互溶的有机溶剂的混合溶液；也可以是三乙胺、二乙胺、N，N-二异丙基乙胺有机碱的有机溶液或与水互溶的有机溶剂的混合溶液；所述的有机溶剂可以是四氢呋喃、二氧六环、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮中的一种或一种以上的混合液。
优选的，步骤(b)所述的氨基树脂是替代度为0.1-0.8mmol/g的Rink amideresins、Rink amide AM-resins和Rink amide-MBHA resins中的一种；偶联反应中所用的缩合剂为以下组合DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA中的一种。
优选的，所述步骤(c)中，裂解所用的试剂为加入体积比1-5％清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、苯酚、水和TIS中的一种或几种。
优选的，所述步骤(d)中，脱掉巯基侧链保护基并一步氧化形成三对二硫键，得到齐考诺肽的具体操作步骤为：步骤(c)所得到巯基被保护的线性肽溶解在盐D的溶液中，待完全溶解后，加入脱tButhio试剂，搅拌反应；然后加入胱氨酸或氧化型谷胱甘肽，低温下静置。更为优选的，所用的盐D为碳酸氢铵、醋酸铵、柠檬酸铵、甲酸铵、碳酸铵、醋酸三乙胺、柠檬酸三乙胺盐中的一种；脱tButhio试剂为DTT、EDT中的一种。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明首次采用二肽单体Fmoc-Gly-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-Ala-OH、Fmoc-Leu-Met-OH和Fmoc-Gly-Ser(tBu)-OH固相合成齐考诺肽；同时引入半胱氨酸单体Fmoc-Cys(tButhio)-OH和Boc-Cys(tButhio)-OH参与合成齐考诺肽，避免了线性肽裂解过程中巯基被氧化，能够有效的提高线性肽的纯度，从而提高终产品的收率，有利于合成规模的放大，降低生产成本。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但不限定本专利；根据本发明改变原料的投料比、或是反应溶剂或及缩合剂等，均在本发明的保护范围内。
说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下：
Fmoc 9-芴甲氧羰基
tBu 叔丁基
Pbf 2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基
Trt 三苯甲基
DCM 二氯甲烷
DMF N，N-二甲基甲酰胺
DIPEA N，N-二异丙基乙胺
DIC N，N-二异丙基碳二亚胺
HBTU 苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸
酯
TBTU O-苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲四氟硼酸
HOBT 1-羟基苯并三唑
HOAT 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
TFA 三氟乙酸
TIS 三异丙基硅烷
tButhio 叔丁硫基
Su 琥珀酰亚胺基
DTT 二硫苏糖醇
实施例1：Fmoc-Gly-Ser(tBu)-OH的合成
准确称取H-Ser(tBu)-OH 1.61kg(1.0mol)于50L反应釜中，加入10％碳酸钠水溶液12L，搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入Fmoc-Gly-OSu 3.94kg(1mol)/12L四氢呋喃溶液，搅拌反应，TLC监测终点；经减压浓缩、调酸、乙酸乙酯萃取、干燥、析晶，得纯度99.2％的二肽单体Fmoc-Gly-Ser(tBu)-OH 3.43kg，收率78.0％。
实施例2：Fmoc-Gly-Ala-OH的合成
准确称取丙氨酸1.07kg(1.2mol)于50L反应釜中，加入10％碳酸钠水溶液12L，搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入Fmoc-Gly-OSu 3.94kg(1mol)/12L四氢呋喃溶液，搅拌反应，TLC监测终点；经减压浓缩、调酸、乙酸乙酯萃取、干燥、析晶，得纯度99.0％的二肽单体Fmoc-Gly-Ala-OH 3.10kg，收率82.0％。
实施例3：Fmoc-Leu-Met-OH的合成
准确称取甲硫氨酸1.79kg(1.2mol)于50L反应釜中，加入10％碳酸钠水溶液12L，搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入Fmoc-Leu-OSu 4.50kg(1mol)/12L四氢呋喃溶液，搅拌反应，TLC监测终点；经减压浓缩、调酸、乙酸乙酯萃取、干燥、析晶，得纯度99.1％的二肽单体Fmoc-Leu-Met-OH 3.92kg，收率81.0％。
实施例4：Fmoc-Gly-Lys(Boc)-OH的合成
准确称取H-Lys(Boc)-OH 2.46kg(1.0mol)于50L反应釜中，加入10％碳酸钠水溶液12L，搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入Fmoc-Gly-OSu 3.94kg(1mol)/12L四氢呋喃溶液，搅拌反应，TLC监测终点；经减压浓缩、调酸、乙酸乙酯萃取、干燥、析晶，得纯度99.0％的二肽单体Fmoc-Gly-Lys(Boc)-OH 4.01kg，收率76.8％。
实施例5：肽树脂的制备
准确称取替代度为0.42mmol/g的Rink amide AM-resins 576g(合成规模36mmol)置于10L合成柱中，加入5000ml DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，5600ml DMF洗涤2次，加入20％哌啶/DMF溶液5000ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用5600ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；依次和Fmoc-Cys(tButhio)-OH、Fmoc-Gly-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(tButhio)-OH、Fmoc-Gly-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(tButhio)-OH、Fmoc-Cys(tButhio)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Leu-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Cys(tButhio)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-Ala-OH、Fmoc-Gly-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)–OH、Boc-Cys(tButhio)-OH偶联，得到肽树脂Boc-Cys(tButhio)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys(tButhio)-Ser(tBu)-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp(OtBu)-Cys(tButhio)-Cys(tButhio)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Cys(tButhio)-Arg-Se(tBu)r-Gly-Lys(Boc)-Cys(tButhio)-Rinkamide AM-resins 1329.2g。
实施例6：肽树脂裂解
将实施例5得到的500g肽树脂，加入到冷冻的4000mL裂解液(体积配比为TFA/苯甲硫醚/TIS/H20＝90/5/2.5/2.5)中，室温下搅拌反应4h；裂解反应结束，过滤树脂，500mlTFA洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，旋蒸浓缩至2000ml，倒入20L冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得到巯基被保护的线性肽H-Cys(tButhio)-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys(tButhio)-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys(tButhio)-Cys(tButhio)-Thr-Gly-Ser-Cys(tButhio)-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys(tButhio)-NH2 245.6g，收率101.0％，纯度82.6％。
实施例7：肽树脂裂解
将实施例5得到的500g肽树脂，加入到冷冻的4000mL裂解液(体积配比为TFA/TIS/H20＝90/2.5/5)中，室温下搅拌反应4h；裂解反应结束，过滤树脂，500mlTFA洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，旋蒸浓缩至2000ml，倒入20L冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得巯基被保护的线性肽H-Cys(tButhio)-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys(tButhio)-Ser-Arg–Leu-Met-Tyr-Asp-Cys(tButhio)-Cys(tButhio)-Thr-Gly-Ser-Cys(tButhio)-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys(tButhio)-NH2 242.8g，收率99.8％，纯度83.8％。
实施例8：环化
准确称取实施例6所得粗肽200g，加入100L 0.1mol/L的碳酸氢钠溶液中，完全溶解后，加入95.2g DTT，搅拌反应2h，HPLC监测反应终点；待反应达到终点后，加入胱氨酸148.4g，搅拌至完全溶解，4℃下静置，HPLC监测反应终点；粗肽溶液纯度为78.6％。
实施例9：环化
准确称取实施例6所得粗肽200g，加入100L 50mmol/L的醋酸铵溶液(pH值为7.8)中，完全溶解后，加入95.2g DTT，搅拌反应2h，HPLC监测反应终点；待反应达到终点后，加入胱氨酸148.4g，搅拌至完全溶解，4℃下静置，HPLC监测反应终点；粗肽溶液纯度为79.2％。
实施例10：齐考诺肽的纯化
将实施例8所得粗肽溶液用0.45um滤膜过滤备用。
内径为150mm C18制备柱，流动相为0.1％TFA/水-0.1％TFA/乙腈体系，上样量为30g/次，流速500ml/min，梯度洗脱；峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度合格的精肽溶液，脱盐后冻干得精肽78.6g，收率47.0％，纯度99.1％，单杂均小于0.2％。
实施例11：齐考诺肽的纯化
将实施例9所得粗肽溶液用0.45um滤膜过滤备用。
内径为150mm C18制备柱，流动相为0.1％TFA/水-0.1％TFA/乙腈体系，上样量为30g/次，流速500ml/min，梯度洗脱；峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度合格的精肽溶液，脱盐后冻干得精肽79.2g，收率47.3％，纯度99.1％，单杂均小于0.2％。

Claims (10)

1.一种固液相结合制备齐考诺肽的方法，其特征在于，
包括如下步骤：
(a)合成二肽单体Fmoc-Gly-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-Ala-OH、Fmoc-Leu-Met-OH和Fmoc-Gly-Ser(tBu)-OH；
(b)以氨基树脂为固相载体，依次和
偶联，得到肽树脂；
(c)裂解得到巯基被保护的线性肽：
H-Cys(tButhio)-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys(tButhio)-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys(tButhio)-Cys(tButhio)-Thr-Gly-Ser-Cys(tButhio)-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys(tButhio)-NH2；
(d)脱掉巯基侧链保护基并一步氧化成三对二硫键，得到齐考诺肽，经纯化、冻干得精肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤(a)中Fmoc-Gly-Lys(Boc)-OH合成的具体操作步骤为：在低温浴下将H-Lys(Boc)-OH溶解于碱性溶液中；低温下向该溶液中滴加Fmoc-Gly-OSu/有机溶剂的溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体Fmoc-Gly-Lys(Boc)-OH。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤(a)中Fmoc-Gly-Ala-OH合成的具体操作步骤为：在低温浴下将丙氨酸溶解于配置好的碱性溶液中，低温下向该反应液中滴加Fmoc-Gly-OSu/有机溶剂溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体Fmoc-Gly-Ala-OH。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤(a)中Fmoc-Leu-Met-OH合成的具体操作步骤为：在低温浴下将甲硫氨酸溶解于配置好的碱溶液中，低温下向该反应液中滴加Fmoc-Leu-OSu/有机溶剂溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体Fmoc-Leu-Met-OH。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤(a)中Fmoc-Gly-Ser(tBu)-OH合成的具体操作步骤为：在低温浴下将H-Ser(tBu)-OH溶解于配置好的碱溶液中，低温下向该反应液中滴加Fmoc-Gly-Osu/有机溶剂溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体Fmoc-Gly-Ser(tBu)-OH。
6.根据权利要求2或3或4或5任一所述的制备方法，其特征在于，
所述的碱性溶液可以是氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾水溶液或与水互溶的有机溶剂的混合溶液；也可以是三乙胺、二乙胺、N，N-二异丙基乙胺有机碱的有机溶液或与水互溶的有机溶剂的混合溶液；
所述的有机溶剂可以是四氢呋喃、二氧六环、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮中的一种或一种以上的混合液。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤(b)所述的氨基树脂是替代度为0.1-0.8mmol/g的Rink amide resins、Rinkamide AM-resins和Rink amide-MBHA resins中的一种；偶联反应中所用的缩合剂为以下组合DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA中的一种。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤(c)中，裂解所用的试剂为加入体积比1-5％清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、苯酚、水和TIS中的一种或几种。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤(d)中，脱掉巯基侧链保护基并一步氧化形成三对二硫键，得到齐考诺肽的具体操作步骤为：步骤(c)所得到巯基被保护的线性肽溶解在盐D的溶液中，待完全溶解后，加入脱tButhio试剂，搅拌反应；然后加入胱氨酸或氧化型谷胱甘肽，低温下静置。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，
所用的盐D为碳酸氢铵、醋酸铵、柠檬酸铵、甲酸铵、碳酸铵、醋酸三乙胺、柠檬酸三乙胺盐中的一种；所用的脱tButhio试剂为DTT和EDT中的一种。
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