CN101372505B - 一种制备醋酸去氨加压素的方法 - Google Patents

一种制备醋酸去氨加压素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种制备醋酸去氨加压素的方法。现有的液相合成工艺，操作复杂，影响推广。本发明采用固相合成方法，包括以下步骤：1)由Fmoc-Gly-OH和合适替代度的Sieber Amide树脂出发，得到替代度在某一范围内的Fmoc-Gly-Sieber Amide树脂；2)将Fmoc-Gly-Sieber Amide树脂采用逐一偶联的方式合成得到线性去氨加压素-Sieber Amide树脂；3)采用固相氧化合成去氨加压素-Sieber Amide树脂；4)最后对去氨加压素-SieberAmide树脂进行裂解，得到的粗肽经过高压液相纯化、冻干得到醋酸去氨加压素。具有反应操作简单、后处理容易、收率高、成本低等特点，具有可观的经济实用价值，在二硫键成环类多肽药物设计合成领域具有广泛的应用前景。

Description

一种制备醋酸去氨加压素的方法
技术领域
本发明属于医药化工领域，具体涉及一种制备醋酸去氨加压素的固相合成方法。
背景技术
目前所使用的去氨加压素，与天然激素精氨酸加压素的结构类似，由于对半胱氨酸作脱氨基处理和以D-精氨酸取代L-精氨酸后，使临床剂量的去氨加压素的作用时间延长，而不产生加压的副作用，同时可避免因使用第VIII因子制剂而导致人类免疫缺陷病毒(HIV)及肝炎病毒感染的危险。但现有的液相合成工艺操作复杂，不利于工业生产，应用价值不高，影响了推广。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种制备醋酸去氨加压素的固相合成方法，利用固相法合成线性去氨加压素，通过固相氧化得到去氨加压素。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下步骤：
1)由Fmoc-Gly-OH(N-芴甲氧羰基保护甘氨酸)和合适替代度的SieberAmide(塞伯酰胺)树脂出发，得到替代度在某一范围内的Fmoc-Gly-SieberAmide(N-芴甲氧羰基保护甘氨酰塞伯酰胺)树脂；
2)将Fmoc-Gly-Sieber Amide树脂采用逐一偶联的方式合成得到线性去氨加压素-Sieber Amide树脂；
3)采用固相氧化合成去氨加压素-Sieber Amide树脂；
4)最后对去氨加压素-Sieber Amide树脂进行裂解，得到的粗肽经过高压液相纯化、冻干得到醋酸去氨加压素。
其中，如下面的反应方程式所示，所述保护的Fmoc-Gly-Sieber Amide树脂，是Fmoc-Gly-OH与合适替代度的Sieber Amide树脂在DICPDI(二异丙基碳二亚胺)和HOBt(1-羟基苯并三氮唑)的作用下生成的。
所述线性去氨加压素-Sieber Amide树脂是由Fmoc-Gly-Sieber Amide树脂采用逐一偶联的方式合成得到。
所述氧化去氨加压素-Sieber Amide树脂是由线性去氨加压素-SieberAmide树脂经过固相氧化得到。
所述醋酸去氨加压素是通过对去氨加压素-Sieber Amide树脂进行裂解，得到的粗肽经过高压液相纯化、冻干得到。
其中：
Fmoc-Gly-OH代表：N-芴甲氧羰基甘氨酸；
Fmoc-D-Arg(R6)-OH代表：N-芴甲氧羰基-N’-R6基-D-精氨酸；
DICPDI代表：二异丙基碳二亚胺；
HOBt代表：1-羟基苯并三氮唑；
TBTU代表：O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯；
TFA代表：三氟乙酸；
DMAP代表：4-二甲氨基吡啶；
DMF代表：N，N-二甲基甲酰胺
DCM代表：二氯甲烷
Acm代表：乙酰胺甲基
Trt代表：三苯甲基
OtBu代表：叔丁醚基
Pbf代表：2，2，4，6，7-五甲基二羟苯并呋喃-5-磺酰基
Pmc代表：2，2，5，7，8-五甲基二羟苯并吡喃-6-磺酰基
Mtr代表：4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基
Boc代表：叔丁氧羰基
R1代表Acm或Trt；R2代表OtBu；R3代表Trt；R4代表Trt；R5代表Acm或Trt；R6代表Pmc或Mtr或Pbf或(Boc)2。
如反应方程式所描述的工艺采用较高替代度的树脂，偶联采用低用量的投料比合成线性去氨加压素肽树脂，利用较方便的固相氧化，经过裂解得到了较高纯度的粗肽。
本发明的优点在于具有反应操作简单、后处理容易、原料投入少、成本低、收率高等特点，18步反应的总产出率可达50％，具有大的经济和社会效益，经济实用，在多肽药物设计合成领域具有广泛的应用前景，利于推广。
具体实施方式
下面以实施例对本发明做进一步详细说明：
(注：本说明书的英文名词再次出现时，不再打印括号内的中文)。
实施例1、Fmoc-Gly-Sieber Amide树脂的制备
在500ml的反应柱中加入30克Sieber Amide树脂(1.0mmol/g)，加入DMF溶胀30分钟；溶胀完后，用50％六氢吡啶的DMF溶液脱Fmoc10分钟，然后用DMF洗三次，DCM洗三次。将Fmoc-Gly-OH(60mmol)，HOBt(90mmol)和DICPDI(180mmol)用适量DCM溶解后加入至上述反应柱中，室温下搅拌反应60分钟。反应完成，真空抽去反应液，用DMF洗三次。茚三酮检测封闭完后，用DMF洗三次，DCM洗三次，甲醇收缩三次，取样测替代度0.76mmol/g。
实施例2、Fmoc-Gly-Sieber Amide树脂的制备
在1000ml的反应柱中加入75克Sieber Amide树脂(0.8mmol/g)，加入DMF溶胀30分钟；溶胀完后，用50％六氢吡啶的DMF溶液脱Fmoc10分钟，然后用DMF洗三次，DCM洗三次。将Fmoc-Gly-OH(120mmol)，HOBt(180mmol)，DICPDI(180mmol)和DMAP(180mmol)用适量DCM溶解后加入至上述反应柱中，室温下搅拌60分钟。反应完成，真空抽去反应液，用DMF洗三次。茚三酮检测封闭完后，用DMF洗三次，DCM洗三次，甲醇收缩三次，取样测替代度0.97mmol/g。
实施例3、线性去氨加压素-Sieber Amide树脂的制备
在500ml的反应柱中加入26.3克Fmoc-Gly-Sieber Amide树脂(0.76mmol/g)，加入DMF溶胀30分钟；溶胀完后，用50％六氢吡啶的DMF溶液脱Fmoc10分钟，然后用DMF洗三次，DCM洗三次。将Fmoc-D-Arg(R6)-OH，HOBt，DICPDI和DMAP用适量DCM溶解后加入至上述反应柱中，室温下搅拌120分钟。茚三酮检测反应完全，真空抽去反应液，用DMF洗三次，用50％六氢吡啶的DMF溶液脱Fmoc10分钟，然后用DMF洗三次，DCM洗三次。重复Fmoc-D-Arg(R6)-OH的操作，接下来对Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(R5)-OH(N-芴甲氧羰基保护侧链巯基R5保护半胱氨酸)、Fmoc-Asn(R4)-OH(N-芴甲氧羰基保护侧链酰胺基R4保护天冬酰胺)、Fmoc-Gln(R3)-OH(N-芴甲氧羰基保护侧链酰胺基R3保护谷氨酰胺)、Fmoc-Phe-OH(N-芴甲氧羰基保护苯丙氨酸)、Fmoc-Tyr(R2)-OH(N-芴甲氧羰基保护侧链酚羟基R2保护酪氨酸)和R1-SCH2CH2COOH(R1保护巯基丙酸)进行偶联，最后得到R1-SCH2CH2CO-Tyr(R2)-Phe-Gln(R3)-Asn(R4)-Cys(R5)-Pro-D-Arg(R6)-Gly-Sieber Amide(R1保护巯基丙酰侧链酚羟基R2保护酪氨酰苯丙氨酰侧链酰胺基R3保护谷氨酰胺酰侧链酰胺基R4保护天冬酰胺酰侧链巯基R5保护半胱氨酰脯氨酰D构型侧链胍基R6保护精胺酰甘氨酰塞伯酰胺)树脂。将得到线性去氨加压素-Sieber Amide树脂用DMF洗三次，DCM洗三次，甲醇收缩三次，真空干燥得到树脂增重收率大于97.5％的肽树脂。
实施例4、线性去氨加压素-Sieber Amide树脂的制备
在1000ml的反应柱中加入61.8克Fmoc-Gly-Sieber Amide树脂(0.97mmol/g)，加入DMF溶胀30分钟；溶胀完后，用50％六氢吡啶的DMF溶液脱Fmoc10分钟，然后用DMF洗三次，DCM洗三次。将Fmoc-D-Arg(R6)-OH，HOBt，TBTU和DMAP用适量DCM溶解后加入至上述反应柱中，室温下氮气搅拌120分钟。茚三酮检测反应完全，真空抽去反应液，用DMF洗三次，用50％六氢吡啶的DMF溶液脱Fmoc10分钟，然后用DMF洗三次，DCM洗三次。重复Fmoc-D-Arg(R6)-OH的操作，接下来对Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Cys(R5)-OH，Fmoc-Asn(R4)-OH、Fmoc-Gln(R3)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Tyr(R2)-OH和R1-SCH2CH2COOH进行偶联，最后得到R1-SCH2CH2CO-Tyr(R2)-Phe-Gln(R3)-Asn(R4)-Cys(R5)-Pro-D-Arg(R6)-Gly-Sieber Amide树脂。将得到线性去氨加压素-SieberAmide树脂用DMF洗三次，DCM洗三次，甲醇收缩三次，真空干燥得到树脂增重收率大于95.4％的肽树脂。
实施例5、线性去氨加压素-Sieber Amide树脂的固相氧化
取线性去氨加压素-Sieber Amide树脂20g加入到500ml反应柱中，然后加入适量H2O2(双氧水)，加入四氢呋喃(THF，Tetrahydrofuran)/水(2:8)的混合溶剂200ml进行反应4小时。反应结束，用四氢呋喃洗反应柱5次，DCM洗三次，甲醇收缩三次，真空干燥得到环肽树脂。
实施例6、线性去氨加压素-Sieber Amide树脂的固相氧化
取线性去氨加压素-Sieber Amide树脂1000g加入到20L反应柱中，然后加入适量H2O2(双氧水)，加入乙腈/水(2:8)的混合溶剂10L进行反应6小时。反应结束，用乙腈洗反应柱5次，DCM洗三次，甲醇收缩三次，真空干燥得到环肽树脂。
实施例7、氧化去氨加压素-Sieber Amide树脂的裂解
配制裂解液(三氟乙酸：苯甲硫醚＝94：6)29ml，将配制好的裂解液加入至28.9g环肽树脂中，裂解反应1小时。反应结束，将裂解液过滤，滤液倒入至300ml冰乙醇中，沉淀、离心、干燥，沉重得粗品6.4g，粗肽收率98.5％。
经过高效液相纯化得到醋酸去氨加压素精肽3.6g，收率55％。
综上所述：本发明采用替代度在特定范围内的Sieber Amide树脂，同时固相偶联投料比低，最后采用方便的固相氧化合成醋酸去氨加压素，该工艺具有反应操作简单、后处理容易、收率高、成本低等特点，具有可观的经济实用价值，同时在二硫键成环类多肽药物设计合成领域具有广泛的应用前景。

Claims (6)

1.一种制备醋酸去氨加压素的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)由Fmoc-Gly-OH和替代度为0.6-1.0mmol/g的Sieber-Amide树脂出发，得到Fmoc-Gly-Sieber-Amide树脂；
2)将Fmoc-Gly-Sieber-Amide树脂采用逐一偶联的方式合成得到线性去氨加压素-Si eber-Amide树脂；
3)采用固相氧化合成去氨加压素-Sieber-Amide树脂；
4)最后对去氨加压素-Sieber-Amide树脂进行裂解，得到的粗肽经过高效液相纯化、冻干得到醋酸去氨加压素。
2.根据权利要求1所述的一种制备醋酸去氨加压素的方法，其特征在于所述的Fmoc-Gly-Sieber-Amide树脂，是Fmoc-Gly-OH和替代度为0.6-1.0mmol/g的Sieber-Amide树脂在二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯并三氮唑的作用下生成的。
3.根据权利要求1所述一种制备醋酸去氨加压素的方法，其特征在于所述将Fmoc-Gly-Sie ber-Amide树脂采用逐一偶联的方式合成得到线性去氨加压素-Sieber-Amide树脂，而逐一偶联采用的偶联剂是二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯并三氮唑、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷和1-羟基苯并三氮唑、或O-苯并三氮唑-N，N，N，N-四甲基脲四硼酸酯和1-羟基苯并三氮唑。
4.根据权利要求1所述一种制备醋酸去氨加压素的方法，其特征在于所述将Fmoc-Gly-Sieber-Amide树脂采用逐一偶联的方式合成得到线性去氨加压素-Sieber-Amide树脂，而逐一偶联采用的有机碱是三乙胺、N-甲基吗啉或4-二甲氨基吡啶。
5.根据权利要求1所述一种制备醋酸去氨加压素的方法，其特征在于所述采用固相氧化合成去氨加压素-Sieber-Amide树脂。
6.根据权利要求1所述一种制备醋酸去氨加压素的方法，其特征在于所述对去氨加压素-S ieber-Amide树脂进行裂解，得到的粗肽经过高效液相纯化、冻干得到醋酸去氨加压素。
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