CN115626954B - 卡贝缩宫素的制备方法 - Google Patents

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    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Abstract

本发明提出了一种卡贝缩宫素的制备方法，所述方法包括将卡贝缩宫素粗肽与乙腈溶液进行第一混合处理；将第一混合处理产物进行聚合物填料吸附处理；将吸附有第一混合处理产物的聚合物填料进行洗脱处理，以便获得洗脱液；以及将所述洗脱液进行纯化处理，以便获得所述卡贝缩宫素。采用此方法能够有效的避免使用乙醚或甲基叔丁基醚等易燃易爆试剂的使用，降低了安全风险，同时减少了粗肽沉淀，离心及真空干燥的步骤，节省了生产时间，提高了生产效率。

Description

卡贝缩宫素的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽药物合成技术领域，具体地，本发明涉及一种卡贝缩宫素的制备方法。
背景技术
卡贝缩宫素是一种合成的具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物。硬膜外或腰麻下剖腹产术后可以立即单剂量静脉给药，以预防子宫张力不足和产后出血。卡贝缩宫素的临床和药理特性与天然产生的催产素类似。像缩宫素一样，卡贝缩宫素与子宫平滑肌的缩宫素受体结合，引起子宫的节律性收缩，在原有的收缩基础上，增加其频率和增加子宫张力。
目前，开发一种新的合成卡贝缩宫素的方法有待研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
目前，卡贝缩宫素的合成方案主要以Fmoc固相合成为主，环化主要分为液相环化和固相环化。肽树脂合成完后，一般采用TFA等试剂将肽从树脂载体上切落，然后用无水乙醚或甲基叔丁基醚等沉淀试剂进行沉淀，再通过离心或过滤的手段进行分离，洗涤以及真空干燥后，得到粗肽产品。
由于卡贝缩宫素没有明显的亲水基团，导致其在水中的溶解性较差，因此粗肽在纯化前的溶解需要使用大量的醋酸或TFA等酸进行助溶。鉴于卡贝缩宫素的这种性质，发明人提出了粗肽裂解后不采用沉淀方式获取固体粗肽，而通过选择合适的溶剂对裂解液进行稀释，然后采用聚合物填料进行吸附的方式富集卡贝缩宫素粗肽。
本发明通过固相合成法合成卡贝缩宫素树脂，采用特定的裂解液进行裂解得到，裂解液过滤，减压旋蒸到原体积的40％-50％；浓缩后的裂解液加入到2～5倍体积的10％-20％乙腈的水溶液中进行稀释，然后加入理论粗肽量8倍的聚合物填料(UNIPS、UNIPSN)进行粗肽吸附；过滤收集聚合物填料，然后用40％-60％的乙腈水溶液进行浸泡洗脱，收集肽溶液；稀释后进行纯化，得到卡贝缩宫素精肽。
为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种制备卡贝缩宫素的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括将卡贝缩宫素粗肽与乙腈溶液进行第一混合处理；将第一混合处理产物进行聚合物填料吸附处理；将吸附有第一混合处理产物的聚合物填料进行洗脱处理，以便获得洗脱液；以及将所述洗脱液进行纯化处理，以便获得所述卡贝缩宫素。通过采用此方法能够有效的避免使用乙醚或甲基叔丁基醚等易燃易爆试剂的使用，降低了安全风险，同时减少了粗肽沉淀，离心及真空干燥的步骤，节省了生产时间，提高了生产效率。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
在本发明的一个方面，本发明提出了一种制备卡贝缩宫素的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括将卡贝缩宫素粗肽与乙腈溶液进行第一混合处理；将第一混合处理产物进行聚合物填料吸附处理；将吸附有第一混合处理产物的聚合物填料进行洗脱处理，以便获得洗脱液；以及将所述洗脱液进行纯化处理，以便获得所述卡贝缩宫素。通过采用此方法能够有效的避免使用乙醚或甲基叔丁基醚等易燃易爆试剂的使用，降低了安全风险，同时减少了粗肽沉淀，离心及真空干燥的步骤，节省了生产时间，提高了生产效率。
根据本发明的实施例，上述制备卡贝缩宫素的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述卡贝缩宫素粗肽是通过固相合成方法获得。
根据本发明的实施例，所述卡贝缩宫素粗肽是通过如下方式获得的：(1)将Fmoc-Gly-OH与氨基酸树脂载体进行第一连接处理，以便获得Fmoc-Gly-树脂；(2)将所述Fmoc-Gly-树脂依次与具有Fmoc保护基团的预定氨基酸进行连接处理，以便得到卡贝缩宫素肽-树脂；以及(3)将所述卡贝缩宫素-肽树脂进行裂解处理，以便获得裂解液，所述裂解液包括所述卡贝缩宫素粗肽。
需要说明的是，本方案中所述“预定氨基酸”是指将依次接入从Fmoc-Gly-树脂起算第1-7个氨基酸相对应的保护氨基酸以及N末端的丁酸，其中，所述的保护氨基酸为：Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH，N末端的丁酸为4-氯基丁酸。
根据本发明的实施例，所述洗脱处理后进一步包括将所述洗脱液进行纯化处理和任选的浓缩处理。使得所制备的卡贝缩宫素具有较高的纯度。
根据本发明的实施例，所述纯化处理采用反相制备色谱进行。
根据本发明的具体实施例，所述第一混合处理中，所述裂解液与乙腈溶液的体积比为1：(2～4)，优选地，所述乙腈溶液中乙腈为体积分数为10％～20％。采用所述裂解液与乙腈溶液的体积比在此范围内，能够增加卡贝缩宫素的产率。
根据本发明的具体实施例，所述聚合物填料的质量是预定粗肽量的8倍。因此，聚合物填料能够将裂解液中的粗肽较完全的吸附出来。
需要说明的是，本方案中所述“预定粗肽量”是指卡贝缩宫素-肽树脂在各种条件最优化时，忽略各种操作误差、损耗完全生成卡贝缩宫素粗肽的量。
根据本发明的实施例，所述聚合物填料为UNIPS或UNIPSN。采用此填料，能够将裂解液中的粗肽较完全的吸附出来。
根据本发明的实施例，所述吸附时间为30min～1h。
根据本发明的实施例，所述氨基酸树脂载体为Rink-AM Amide Resin树脂。
根据本发明的实施例，进一步包括将所述裂解液进行过滤、浓缩处理，浓缩液为所述裂解液体积的40％～50％。
根据本发明的实施例，所述裂解处理是在TFA(三氟乙酸)水溶液中进行的。TFA水溶液能够有助于混合液中的粗肽溶解，进而提高卡贝缩宫素的产率。
根据本发明的实施例，所述TFA水溶液中TFA的体积分数为90％～95％。在所述TFA的体积分数范围内，能够使粗肽较完全的溶解，进而提高卡贝缩宫素的产率。
根据本发明的实施例，裂解时间为1～3h。在所述裂解时间范围内，能够使粗肽较完全的溶解，进而提高卡贝缩宫素的产率。
根据本发明的实施例，所述洗脱处理是在含10％醋酸的50％乙腈水溶液中进行的。因此，能够将聚合物填料中吸附的肽较完全的洗脱下来，进而提高卡贝缩宫素产量。
根据本发明的实施例，反相制备色谱的条件包括：在采用150×250mm C18柱为色谱柱，0.1％TFA水溶液为流动相A，乙腈为流动相B的条件中进行预纯化处理；以及将预纯化处理产物进行转盐处理，任选地，所述转盐过程在采用150×250mm C18柱为色谱柱，0.2％醋酸铵溶液为流动相A1，0.1％醋酸溶液为流动相A2，乙腈为流动相B的条件中进行的。采用所述条件进行纯化，能够使制备得到的卡贝缩宫素具有较高的纯度。
根据本发明的实施例，所述浓缩处理是在温度＜30℃的条件下进行的。
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例中所用试剂或化学药品的简称如下所示：
英文缩写及含义
Fmoc 9-芴甲氧羰基
Mmt 对甲氧基苯基二甲基
TFA 三氟乙酸
DCM 二氯甲烷
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DIC N,N-二异丙基碳二亚胺
HOBt 1-羟基苯并三唑
TIS 三异丙基硅烷
Trt 三苯甲基
DBU 1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯
实施例1卡贝缩宫素制备
(1)卡贝缩宫素肽树脂合成
称取浓度为0.9mmol/g的Rink-AM Amide Resin 55.5g(50mmol)，加入到固相反应柱中，加入DMF洗涤2次，抽调DMF，然后再加入DMF溶胀15～30分钟。加入5％哌嗪/DMF溶液脱除Fmoc保护两次，每次10分钟，然后分别用DMF洗涤6次。称取Fmoc-Gly-OH 29.7g(100mmol)和HOBt 16.2g(120mmol)，加入250ml DMF溶解，反应液降温至5～10℃后加入DIPCDI 15.1g(120mmol)，活化5分钟，加入反应柱中进行反应。常温反应1小时后，取树脂进行茚三酮检测，如果树脂检测为无色则反应结束。
重复上述的脱Fmoc步骤和氨基酸偶联步骤，分别偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH、4-氯丁酸。
肽树脂采用3％TFA/DCM溶液脱除Mmt保护基10次，然后加入500ml DMF洗涤8次，再加入DBU 22.8g(150mmol)进行环化1～2小时，用Ellman试剂检测巯基反应是否完全。反应结束后用DMF洗涤6次，再用甲醇收缩3次，干燥后得到卡贝缩宫素肽树脂140.0g。
(2)肽树脂裂解
称取(1)中的卡贝缩宫素肽-树脂35.0g加入到500ml圆底烧瓶中，加入预先配置好的裂解液TFA/H2O＝95/5(V/V)285ml，室温反应2小时，过滤树脂，收集滤液。用30ml TFA洗涤树脂，合并滤液260ml。将滤液减压浓缩至120ml。
(3)粗肽预处理
将浓缩后的裂解液加入到240ml 20％乙腈水溶液中进行稀释，检测溶液中的肽含量为17.6mg/ml；然后加入约50g聚合物填料(UNIPSN)，搅拌反应1小时，检测溶液中没有肽存在。
过滤收集聚合物填料，将聚合物填料装入直径5cm的玻璃层析柱中，用纯化水洗涤两次。加入含10％醋酸的50％乙腈水溶液进行洗脱，洗脱液体积为500ml。检测洗脱液中的肽含量为12.6mg/ml，合成收率为51.0％。
(4)样品处理
将上述粗肽溶液(洗脱液)用纯化水稀释到1500ml，用0.45μm滤膜过滤后收集滤液；
第一步纯化：色谱柱为150×250mm C18柱；流动相A为0.1％TFA，流动相B为乙腈；梯度：流动相B比例为20-40％，收集纯度≥98％的合格馏分；
第二步转盐：色谱柱为150×250mm C18柱；流动相A1为0.2％醋酸铵溶液，A2为0.1％醋酸溶液，流动相B为乙腈；将第一步合格的馏分上样后，用流动相A1和5％的流动相平衡15分钟；然后用流动相A2，流动相B梯度为20-40％收集产品。
合格的馏分进行浓缩，浓缩温度不高于30℃，浓缩后的馏分进行冷冻干燥，得到纯度≥99.0％的卡贝缩宫素5.5g，总收率为44.1％。
实施例2粗肽预处理过程中有机溶剂的选择
(1)卡贝缩宫素肽树脂合成
称取替代度为0.9mmol/g的Rink-AM Amide Resin 55.5g(50mmol)，加入到固相反应柱中，加入DMF洗涤2次，抽调DMF，然后再加入DMF溶胀15～30分钟。加入5％哌嗪/DMF溶液脱除Fmoc保护两次，每次10分钟，然后分别用DMF洗涤6次。称取Fmoc-Gly-OH29.7g(100mmol)和HOBt 16.2g(120mmol)，加入250ml DMF溶解，反应液降温至5～10℃后加入DIPCDI 15.1g(120mmol)，活化5分钟，加入反应柱中进行反应。常温反应1小时后，取树脂进行茚三酮检测，如果树脂检测为无色则反应结束。
重复上述的脱Fmoc步骤和氨基酸偶联步骤，分别偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH、4-氯丁酸。
肽树脂采用3％TFA/DCM溶液脱除Mmt保护基10次，然后加入500ml DMF洗涤8次，再加入DBU 22.8g(150mmol)进行环化1～2小时，用Ellman试剂检测巯基反应是否完全。反应结束后用DMF洗涤6次，再用甲醇收缩3次，干燥后得到卡贝缩宫素树脂140.2g。
(2)肽树脂裂解
称取(1)中的卡贝缩宫素肽树脂92.8g加入到1000ml圆底烧瓶中，加入预先配置好的裂解液TFA/H2O＝95/5(V/V)786ml，室温反应2小时，过滤树脂，收集滤液。用80ml TFA洗涤树脂，合并滤液710ml。将滤液减压浓缩至350ml。
(3)粗肽预处理1
将(2)中的50ml浓缩后的裂解液加入到100ml 20％乙腈水溶液中进行稀释，检测溶液中的肽含量为17.1mg/ml；然后加入约20g聚合物填料(UNIPSN)，搅拌反应1小时，检测溶液中没有肽存在。
过滤收集聚合物填料，将聚合物填料装入直径5cm的玻璃层析柱中，用纯化水洗涤两次。加入含10％醋酸的50％乙腈水溶液进行洗脱，洗脱液体积为200ml。检测洗脱液中的肽含量为12.4mg/ml，合成收率为50.2％。
(4)粗肽预处理2
将(2)中的50ml浓缩后的裂解液加入到200ml 20％乙腈水溶液中进行稀释，检测溶液中的肽含量为10.2mg/ml；然后加入约20g聚合物填料(UNIPSN)，搅拌反应1小时，检测溶液中没有肽存在。
过滤收集聚合物填料，将聚合物填料装入直径5cm的玻璃层析柱中，用纯化水洗涤两次。加入含10％醋酸的50％乙腈水溶液进行洗脱，洗脱液体积为200ml。检测洗脱液中的肽含量为12.2mg/ml，合成收率为49.4％。
(5)粗肽预处理3
将(2)中的50ml浓缩后的裂解液加入到100ml 10％乙腈水溶液中进行稀释，检测溶液中的肽含量为17.0mg/ml；然后加入约20g聚合物填料(UNIPSN)，搅拌反应1小时，检测溶液中没有肽存在。
过滤收集聚合物填料，将聚合物填料装入直径5cm的玻璃层析柱中，用纯化水洗涤两次。加入含10％醋酸的50％乙腈水溶液进行洗脱，洗脱液体积为200ml。检测洗脱液中的肽含量为12.3mg/ml，合成收率为49.8％。
(6)对比粗肽预处理4
将(2)中的50ml浓缩后的裂解液加入到250ml 20％乙腈水溶液中进行稀释，溶液中有絮状固体析出，检测溶液中的肽含量为6.4mg/ml；过滤后，溶液加入约20g聚合物填料(UNIPSN)，搅拌反应1小时，检测溶液中没有肽存在。
过滤收集聚合物填料，将聚合物填料装入直径5cm的玻璃层析柱中，用纯化水洗涤两次。加入含10％醋酸的50％乙腈水溶液进行洗脱，洗脱液体积为200ml。检测洗脱液中的肽含量为9.4mg/ml，合成收率为38.1％。
(7)对比粗肽预处理5
将(2)中的50ml浓缩后的裂解液加入到100ml 20％甲醇水溶液中进行稀释，溶液中有絮状固体析出，检测溶液中的肽含量为11.2mg/ml；过滤后，溶液加入约20g聚合物填料(UNIPSN)，搅拌反应1小时，检测溶液中没有肽存在。
过滤收集聚合物填料，将聚合物填料装入直径5cm的玻璃层析柱中，用纯化水洗涤两次。加入含10％醋酸的50％乙腈水溶液进行洗脱，洗脱液体积为200ml。检测洗脱液中的肽含量为8.3mg/ml，合成收率为33.6％。
(8)对比粗肽预处理6
将(2)中的50ml浓缩后的裂解液加入到50ml 20％乙腈水溶液中进行稀释，检测溶液中的肽含量为25.5mg/ml；然后加入约20g聚合物填料(UNIPSN)，搅拌反应1小时，检测溶液中肽含量为25.2mg/ml，聚合物填料基本无法将肽吸附。
(9)对比粗肽预处理7
检测(2)中的50ml浓缩后的裂解液中的肽含量为50.2mg/ml；然后加入约20g聚合物填料(UNIPSN)，搅拌反应1小时，检测溶液中肽含量为50.2mg/ml，聚合物填料无法将肽吸附的。
通过比较粗肽预处理方法1～7发现，若在粗肽预处理过程中，若裂解液中加入过多的乙腈溶液(对比粗肽预处理4)或者加入其他溶剂(对比粗肽预处理5)，会导致溶液中有絮状固体产生，从而导致合成收率降低。当裂解液中加入过少的乙腈溶液，即加入1倍体积的20％的乙腈溶液(对比实施例6)或裂解液中不加乙腈溶液(对比实施例7)进行吸附实验时，聚合物填料无法吸附溶液中的肽，进而无法进行之后的实验操作。而采用粗肽预处理1～3时，粗肽合成收率相差不大，说明裂解液中加入2～4倍体积的10％～20％的乙腈溶液有利于粗肽的回收，增加肽的合成收率。
对比实施例3
称取实施例1中步骤(1)的卡贝缩宫素肽树脂35.5g加入到500ml圆底烧瓶中，加入预先配置好的裂解液TFA/H2O＝95/5(V/V)285ml，室温反应2小时，过滤树脂，收集滤液。用30ml TFA洗涤树脂，合并滤液260ml。将裂解液加入2.6L甲基叔丁基醚中沉淀，离心收集固体沉淀，再用500ml甲基叔丁基醚洗涤3次，真空干燥得到14.2g，含量为39.4％，合成收率为45.3％。
将14.2g卡贝缩宫素粗肽用140ml冰醋酸溶解，然后用纯化水稀释到500ml，然后用实施例1中的步骤4的纯化方法进行纯化，得到得到纯度≥99.0％的卡贝缩宫素4.6g，总收率为37.2％。
通过比较实施例1与对比实施例3发现，采用本发明的方法合成的卡贝缩宫素精肽的收率，要高于采用现有技术即对比实施例3所合成的卡贝缩宫素精肽的收率。此外，本方法不仅减少了乙醚或甲基叔丁基醚等易燃易爆试剂的使用，降低了安全风险，还减少了粗肽沉淀，离心及真空干燥的步骤，节省了生产时间，提高了生产效率。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (14)

1.一种制备卡贝缩宫素的方法，其特征在于，包括：
将包含卡贝缩宫素粗肽的裂解液与乙腈溶液进行第一混合处理；
将第一混合处理产物进行聚合物填料吸附处理；
将吸附有第一混合处理产物的聚合物填料进行洗脱处理，以便获得洗脱液；以及
将所述洗脱液进行纯化处理，以便获得所述卡贝缩宫素；
其中，
所述聚合物填料为UNIPS或UNIPSN；
所述卡贝缩宫素粗肽是通过固相合成方法获得的，具体过程如下：
(1)将Fmoc-Gly-OH与氨基酸树脂载体进行第一连接处理，以便获得Fmoc-Gly-树脂；
(2)将所述Fmoc-Gly-树脂依次与具有Fmoc保护基团的预定氨基酸进行连接处理，以便得到卡贝缩宫素肽-树脂；以及
(3)将所述卡贝缩宫素肽-树脂进行裂解处理，以便获得裂解液，所述裂解液包括所述卡贝缩宫素粗肽；
所述第一混合处理中，所述裂解液与乙腈溶液的体积比为1：(2～4)；
所述乙腈溶液中乙腈的体积分数为10％～20％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱处理后进一步包括将所述洗脱液进行纯化处理和浓缩处理。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述纯化处理采用反相制备色谱进行。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚合物填料的质量是预定粗肽量的8倍。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述吸附时间为30min～1h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸树脂载体为Rink-AM AmideResin树脂。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括将所述裂解液进行过滤、浓缩处理，浓缩液为所述裂解液体积的40％～50％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在，所述裂解处理是在TFA水溶液中进行的。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在，所述TFA水溶液中TFA的体积分数为90％～95％。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在，裂解时间为1～3h。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱处理是在含10％醋酸的50％乙腈水溶液中进行的。
12.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，反相制备色谱的条件包括：
在采用150×250mm C18柱为色谱柱，0.1％TFA水溶液为流动相A，乙腈为流动相B的条件中进行预纯化处理；以及
将预纯化处理产物进行转盐处理。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述转盐处理是在采用150×250mm C18柱为色谱柱，0.2％醋酸铵溶液为流动相A1，0.1％醋酸溶液为流动相A2，乙腈为流动相B的条件中进行的。
14.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述浓缩处理是在温度＜30℃的条件下进行的。
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