CN115925813A - 穿膜环肽及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种穿膜环肽及其制备方法和用途，属于药物化学技术领域。所述穿膜环肽由穿膜序列、连接单元和活性序列组成，其中穿膜序列和活性序列中至少一个序列为环状结构。包括七种穿膜环肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2‑8所示，对应的结构式如式(Ⅰ)‑(Ⅶ)所示。本发明通过将多肽药物进行环化修饰，提高了穿膜效率、体外血浆稳定性和神经保护活性；并通过建立小鼠MCAO模型，证明可用于治疗神经损伤和脑梗死。
Description
技术领域
本发明涉及一种穿膜环肽及其制备方法和用途，属于药物化学技术领域。
背景技术
AMPA受体是谷氨酸离子型受体，其能够通过囊泡介导的质膜插入和内化作用在细胞区室内和质膜之间调节，这些过程可以导致突触后膜上AMPA受体数量的快速变化，从而有助于表达包括长时程增强和长时程压抑两个过程。生理情况下，突触后膜AMPA受体内吞和上膜处于动态平衡状态，突触后膜上稳定数量的AMPA受体能够维持神经信号正常传递。在某些病理状态下，兴奋性谷氨酸受体的大量激活会导致AMPA受体内吞数量超过上膜数量，导致突触后膜AMPA受体数目减少，造成Ca2+大量内流，故AMPA受体内吞是神经退行性病变的原因。在构造上，AMPA受体是由4个亚基(A1，A2，A3，A4)构成的四异聚体，其中，A2亚基属于AMPA受体的功能性亚基，其主要功能是阻止Ca2+内流。相关研究表明，AMPA受体内吞主要是由A2亚基C末端含有3个酪氨酸的多肽磷酸化发挥着重要作用。其中，Brag2蛋白与GluA2的配体结合导致酪氨酸磷酸化后激活Arf6，最终导致AMPA受体内吞。相关研究在3Y的N端加上一段Tat序列使多肽能够通过血脑屏障，设计的Tat-GluA2-3Y在脑卒中、药物成瘾、重度抑郁、阿尔茨海默病等疾病中有较好的疗效，目前，已进入一期临床研究阶段。
多肽是一类由氨基酸借助肽键连接而成的有机化合物，多肽药具有极性亲水性特点，与生物体内蛋白成分相同，故多肽药具有生理活性强，免疫原性低等特点，多肽药具有较强疗效且较小药物毒性作用的优势，广泛用于治疗神经系统疾病、肿瘤等；但多肽药是体内多种水解酶的自然底物以及分子量大，因此药物半衰期比较短，稳定性差，透膜性差，同时多肽药也难以通过血脑屏障，进而降低了药物治疗神经系统疾病的效果。以Tat为代表的聚阳离子穿膜肽可介导大分子药物进入细胞，并且具有生物相容性高、毒副作用低等优点，一直是多肽研究领域的热点。但是，Tat存在穿膜效率低以及血浆蛋白耐受性差的问题，亟待解决。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种穿膜环肽及其制备方法和用途，通过将多肽药物进行环化修饰，提高其穿膜效率、体外血浆稳定性和神经保护活性。
本发明所述的穿膜环肽，是由穿膜序列、连接单元和活性序列组成，其中，穿膜序列和活性序列中至少一个序列为环状结构。
优选的，所述的活性序列的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选的，所述的穿膜序列可以引入D型氨基酸和非天然氨基酸。
优选的，所述的连接单元包括氨基酸、聚乙二醇或长链烷烃。
进一步优选的，本发明所述的穿膜环肽包括七种环肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO：2-8所示，分别命名为CTat-3Y1、CTat-3Y2、C9R-3Y1、C9R-3Y2、CMT-3Y2、MT-C3Y、CMT-C3Y，其对应的结构式如式(Ⅰ)-(Ⅶ)所示。
本发明提供了上述穿膜环肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)树脂准备：将树脂和二氯甲烷加入反应器中溶胀后抽干；
(2)脱Fmoc保护基：将20％哌啶/DMF溶液加入反应器，茚三酮检测阳性时反应完成，洗涤并抽干；
(3)氨基酸活化、偶联：称取氨基酸、缩合剂和二异丙基乙胺，加入二甲基甲酰胺中溶解进行预活化，将预活化后的混合液加入反应器中，茚三酮检测阴性时反应完成，洗涤并抽干；
(4)按照多肽的氨基酸序列依次连接氨基酸，保留环化前最后一个氨基酸的Fmoc保护基，连接完成后洗涤并抽干；
(5)脱烯丙基、环化方法：将四(三苯基磷)钯和苯硅烷加入无水二氯甲烷中在反应器中避光条件下反应，洗涤并抽干，重复步骤(2)，称取六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羟基苯并三唑和二异丙基乙胺加入反应器，对多肽进行环化；
(6)多肽切割：待树脂晾干，加入三氟乙酸、二硫代苏糖醇、去离子水进行切割，抽滤得到切割液，用三氟乙酸洗涤树脂，洗涤液合并入切割液中，加入冰叔丁基甲醚静置沉淀，离心后弃去上清，冻干，获得相应环肽粗品。
优选的，所述的缩合剂为苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)或2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)。
上述制备方法中，步骤(3)和步骤(4)所述的氨基酸，是按照多肽的氨基酸序列依次加入连接，包括天然氨基酸、最短长度的聚乙二醇(miniPEG)、D型氨基酸、含脂肪族侧链的非天然氨基酸。
特别注意的，步骤(4)中，为提高环肽合成的成功率，多肽序列的所有氨基酸连接完成后，保留环化前最后一个氨基酸的Fmoc保护基，在四(三苯基磷)钯为催化剂脱除谷氨酸侧链羧基上的烯丙基后，进行脱Fmoc保护的处理。
优选的，步骤(5)中，四(三苯基磷)钯为催化剂脱除谷氨酸侧链羧基上的烯丙基，反应2次；对多肽进行环化，反应2次。
优选的，获得环肽粗品后，可根据实际需求用RP-HPLC对环肽粗品进行纯化。
需特别说明的，上述制备方法可制备树脂连接在环肽氨基酸序列C端且穿膜序列为环状结构的穿膜环肽。
优选的，当树脂连接的首个氨基酸为连接单元氨基酸时，应先连接穿膜序列氨基酸，然后加入脱除剂脱除Mmt保护基，再连接活性序列氨基酸。
优选的，当只有环肽的活性序列环化时，按照步骤(4)先连接穿膜序列氨基酸，然后加入脱除剂脱除Mmt保护基，洗涤并抽干，脱除后继续按照步骤(4)-(6)，连接活性序列氨基酸并完成环化得到相应的环肽。
优选的，当环肽的活性序列和穿膜序列均成环时，先完成步骤(5)穿膜序列的环化，然后加入脱除剂脱除Mmt保护基，洗涤并抽干，脱除后继续按照步骤(4)-(6)，连接活性序列氨基酸并完成环化得到相应的环肽。
进一步优选的，脱除剂各组分质量比为三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶二氯甲烷＝2∶4∶94。
上述的制备方法中，20％哌啶/DMF溶液、四(三苯基磷)钯、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、二异丙基乙胺(DIEA)、三氟乙酸以及序列中的氨基酸和miniPEG等均为市售购买。
另一方面，本发明提供了上述穿膜环肽用于治疗神经损伤和脑梗死的用途。
优选的，在治疗神经损伤和脑梗死的用途中，CMT-C3Y在本发明所述的七种环肽中效果最优。
再一方面，本发明还提供了一种药物，其中包含治疗有效量的本发明所述穿膜环肽的一种或多种的醋酸盐、盐酸盐或其他药学上可接受的盐型。
优选的，这种药物可以包含本发明所述穿膜环肽的任意比例的组合。
与现有技术相比，本发明环肽的穿膜效率提高，血浆稳定性增强，细胞活性增强，具备制药的安全性，在改善神经损伤症状和减少脑梗死面积有显著效果。
附图说明
图1为环肽CTat-3Y1的RP-HPLC图；
图2为环肽CTat-3Y1的质谱图；
图3为环肽CTat-3Y2的RP-HPLC图
图4为环肽CTat-3Y2的质谱图；
图5为环肽C9R-3Y1的RP-HPLC图；
图6为环肽C9R-3Y1的质谱图；
图7为环肽C9R-3Y2的RP-HPLC图；
图8为环肽C9R-3Y2的质谱图；
图9为环肽CMT-3Y2的RP-HPLC图；
图10为环肽CMT-3Y2的质谱图；
图11为环肽MT-C3Y的RP-HPLC图；
图12为环肽MT-C3Y的质谱图；
图13为环肽CMT-C3Y的RP-HPLC图；
图14为环肽CMT-C3Y的质谱图；
图15-A为小鼠脑片TTC染色图；
图15-B为小鼠脑梗死面积图，*表示与模型组相比差异显著(P<0.05),△表示与Tat-GluA2-3Y组相比差异显著(P<0.05)；
图15-C为小鼠神经系统评分图，*表示与模型组相比差异显著(P<0.05),△表示与Tat-GluA2-3Y组相比差异显著(P<0.05)。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了环肽CTat-3Y1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，结构如式(Ⅰ)所示，制备方法包括以下步骤：
(1)树脂准备：称取0.2mmol的Rink Amide MBHA树脂，将树脂加入反应器中，同时加入20mL二氯甲烷，反应器在恒温振荡器中以220rpm，25℃条件溶胀3h，抽干；
(2)脱Fmoc保护基：将20mL 20％哌啶/DMF溶液加入反应器中，反应器在恒温振荡器中以220rpm，25℃条件反应30min，茚三酮检测为阳性时反应结束，依次加入DMF、MeOH、DCM、DMF、DCM、DMF、DMF洗涤并抽干，每种试剂均加入20mL后洗涤并抽干，间隔5min加入下一种试剂，以下洗涤步骤同理；
(3)氨基酸活化、偶联：称取3eq的Fmoc-Gly-OH，3eq的HATU，5eq的DIEA，加入20mLDMF，室温磁力搅拌15min后加入反应器中，反应器在恒温振荡器中以220rpm，25℃条件反应1h，茚三酮检测阴性时反应完成，依次分别加入20mLDMF、DCM、DMF、DCM、DMF、DMF洗涤并抽干，3min/次；
(4)重复步骤(2)和步骤(3)，按照多肽的氨基酸序列依次连接Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-miniPEG、Fmoc-Lys(Mmt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH，保留Fmoc-Arg(Pbf)-OH的Fmoc保护基，连接完成后洗涤并抽干；
(5)脱烯丙基、环化方法：将0.3eq四(三苯基磷)钯、10eq苯硅烷加入无水二氯甲烷中，将反应器置于恒温振荡器中以220rpm、25℃避光条件反应15min，脱除谷氨酸侧链上的烯丙基，反应2次；依次加入20mLDMF、DCM、DMF、DCM、DMF、DMF洗涤并抽干，3min/次；重复步骤(2)脱Fmoc保护基；称取5eq的PyBOP，5eq的HOBT和5eq的DIEA在恒温振荡器中以220rpm、25℃条件反应1.5h，反应2次，对多肽进行环化。
(6)多肽切割：待树脂晾干，向树脂中加入9.4mL三氟乙酸、0.5g二硫代苏糖醇、0.5mL去离子水，室温搅拌3h，抽滤得到切割液，用三氟乙酸洗涤树脂三次，洗涤液合并入切割液中，加入100mL冰叔丁基甲醚静置沉淀，离心后弃去上清，冻干。经RP-HPLC检测后用质谱表征各个多肽的分子量。
(7)RP-HPLC检测及纯化：
分析条件：用RP-HPLC 1220对所合成多肽进行色谱表征，色谱柱为PositisilOSD-P反相C18(分析型)5μm，4.6mm×250mm，流速为1mL/min，色谱条件：水相为去离子水+0.05％TFA(v/v)；有机相为乙腈+0.05％TFA(v/v)，在10％-90％(v/v)乙腈中梯度洗脱，时间为32min，检测波长为280nm。
纯化条件：用RP-HPLC 1260对合成的多肽进行纯化，色谱柱为Positisil反相C18(半制备型)5μm，4.6mm×250mm、，流量为3mL/min，色谱条件：水相为去离子水+0.0 5％TFA(v/v)；有机相为乙腈+0.05％TFA(v/v)，在10％～70％(v/v)乙腈中梯度洗脱，时间为35min，检测波长为280nm。冻干后，称量纯肽重量，计算分离收率：分离收率(％)＝(实际重量/理论重量)×100。
本实施制备的环肽CTat-3Y1在0.05％TFA去离子水和0.05％TFA乙腈比例为45：55下出峰，粗肽色谱纯度为60.78％；纯化后色谱纯度为98.48％(见图1)，CTat-3Y1理论分子量是2888.5906g/mol，测得分子量ESI m/z：2888.5947g/mol(见图2)，两者结果一致。
实施例2
本实施例提供了环肽CTat-3Y2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，结构如式(Ⅱ)所示，制备方法包括以下步骤：
(1)树脂准备：称取0.2mmol的Rink Amide MBHA树脂，将树脂加入反应器中，同时加入20mL二氯甲烷，反应器在恒温振荡器中以220rpm，25℃条件溶胀3h，抽干；
(2)脱Fmoc保护基：将20mL 20％哌啶/DMF溶液加入反应器中，反应器在恒温振荡器中以220rpm，25℃条件反应30min，茚三酮检测为阳性时反应结束，依次加入DMF、MeOH、DCM、DMF、DCM、DMF、DMF洗涤并抽干，每种试剂均加入20mL后洗涤并抽干，间隔5min加入下一种试剂，以下洗涤步骤同理；
(3)氨基酸活化、偶联：称取3eq的Fmoc-Gly-OH，3eq的HATU，5eq的DIEA，加入20mLDMF，室温磁力搅拌15min后加入反应器中，反应器在恒温振荡器中以220rpm，25℃条件反应1h，茚三酮检测阴性时反应完成，依次分别加入20mL DMF、DCM、DMF、DCM、DMF、DMF洗涤并抽干，3min/次；
(4)重复步骤(2)和步骤(3)，按照多肽的氨基酸序列依次连接Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-miniPEG、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH，保留Fmoc-Arg(Pbf)-OH的Fmoc保护基，连接完成后洗涤并抽干；
(5)脱烯丙基、环化方法：将0.3eq四(三苯基磷)钯、10eq苯硅烷加入无水二氯甲烷中，将反应器置于恒温振荡器中以220rpm、25℃避光条件反应15min，脱除谷氨酸侧链上的烯丙基，反应2次；依次加入20mLDMF、DCM、DMF、DCM、DMF、DMF洗涤并抽干，3min/次；重复步骤(2)脱Fmoc保护基；称取5eq的PyBOP，5eq的HOBT和5eq的DIEA在恒温振荡器中以220rpm、25℃条件反应1.5h，反应2次，对多肽进行环化。
(6)多肽切割：待树脂晾干，向树脂中加入9.4mL三氟乙酸、0.5g二硫代苏糖醇、0.5mL去离子水，室温搅拌3h，抽滤得到切割液，用三氟乙酸洗涤树脂三次，洗涤液合并入切割液中，加入100mL冰叔丁基甲醚静置沉淀，离心后弃去上清，冻干。经RP-HPLC检测后用质谱表征各个多肽的分子量。
(7)RP-HPLC检测及纯化：步骤同实施例1(7)。
本实施制备的环肽CTat-3Y2在0.05％TFA去离子水和0.05％TFA乙腈比例为45：55下出峰，粗肽色谱纯度为39.08％；纯化后色谱纯度为98.98％(见图3)，CTat-3Y2理论分子量是2888.5906g/mol，测得分子量ESI m/z：2888.4907g/mol(见图4)，两者结果一致。
实施例3
本实施例提供了环肽C9R-3Y1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，结构如式(Ⅲ)所示，制备方法包括以下步骤：
(1)树脂准备：称取0.2mmol的Rink Amide MBHA树脂，将树脂加入反应器中，同时加入20mL二氯甲烷，反应器在恒温振荡器中以220rpm，25℃条件溶胀3h，抽干；
(2)脱Fmoc保护基：将20mL 20％哌啶/DMF溶液加入反应器中，反应器在恒温振荡器中以220rpm，25℃条件反应30min，茚三酮检测为阳性时反应结束，依次加入DMF、MeOH、DCM、DMF、DCM、DMF、DMF洗涤并抽干，每种试剂均加入20mL后洗涤并抽干，间隔5min加入下一种试剂，以下洗涤步骤同理；
(3)氨基酸活化、偶联：称取3eq的Fmoc-Gly-OH，3eq的HATU，5eq的DIEA，加入20mLDMF，室温磁力搅拌15min后加入反应器中，反应器在恒温振荡器中以220rpm，25℃条件反应1h，茚三酮检测阴性时反应完成，依次分别加入20mLDMF、DCM、DMF、DCM、DMF、DMF洗涤并抽干，3min/次；
(4)重复步骤(2)和步骤(3)，按照多肽的氨基酸序列依次连接Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-miniPEG、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH，保留Fmoc-Arg(Pbf)-OH的Fmoc保护基，连接完成后洗涤并抽干；
(5)脱烯丙基、环化方法：将0.3eq四(三苯基磷)钯、10eq苯硅烷加入无水二氯甲烷中，将反应器置于恒温振荡器中以220rpm、25℃避光条件反应15min，脱除谷氨酸侧链上的烯丙基，反应2次；依次加入20mLDMF、DCM、DMF、DCM、DMF、DMF洗涤并抽干，3min/次；重复步骤(2)脱Fmoc保护基；称取5eq的PyBOP，5eq的HOBT和5eq的DIEA在恒温振荡器中以220rpm、25℃条件反应1.5h，反应2次，对多肽进行环化。
(6)多肽切割：待树脂晾干，向树脂中加入9.4mL三氟乙酸、0.5g二硫代苏糖醇、0.5mL去离子水，室温搅拌3h，抽滤得到切割液，用三氟乙酸洗涤树脂三次，洗涤液合并入切割液中，加入100mL冰叔丁基甲醚静置沉淀，离心后弃去上清，冻干。经RP-HPLC检测后用质谱表征各个多肽的分子量。
(7)RP-HPLC检测及纯化：步骤同实施例1(7)。
本实施制备的环肽C9R-3Y1在0.05％TFA去离子水和0.05％TFA乙腈比例为70：30下出峰，粗肽色谱纯度为30.53％；纯化后色谱纯度为97.54％(见图5)，C9R-3Y1理论分子量是2751.5243g/mol，测得分子量ESI m/z：2751.5269g/mol(见图6)，两者结果一致。
实施例4
本实施例提供了环肽C9R-3Y2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，结构如式(Ⅳ)所示，制备方法包括以下步骤：
(1)树脂准备：称取0.2mmol的Rink Amide MBHA树脂，将树脂加入反应器中，同时加入20mL二氯甲烷，反应器在恒温振荡器中以220rpm，25℃条件溶胀3h，抽干；
(2)脱Fmoc保护基：将20mL 20％哌啶/DMF溶液加入反应器中，反应器在恒温振荡器中以220rpm，25℃条件反应30min，茚三酮检测为阳性时反应结束，依次加入DMF、MeOH、DCM、DMF、DCM、DMF、DMF洗涤并抽干，每种试剂均加入20mL后洗涤并抽干，间隔5min加入下一种试剂，以下洗涤步骤同理；
(3)氨基酸活化、偶联：称取3eq的Fmoc-Gly-OH，3eq的HATU，5eq的DIEA，加入20mLDMF，室温磁力搅拌15min后加入反应器中，反应器在恒温振荡器中以220rpm，25℃条件反应1h，茚三酮检测阴性时反应完成，依次分别加入20mLDMF、DCM、DMF、DCM、DMF、DMF洗涤并抽干，3min/次；
(4)重复步骤(2)和步骤(3)，按照多肽的氨基酸序列依次连接Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-miniPEG、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH，保留Fmoc-Arg(Pbf)-OH的Fmoc保护基，连接完成后洗涤并抽干；
(5)脱烯丙基、环化方法：将0.3eq四(三苯基磷)钯、10eq苯硅烷加入无水二氯甲烷中，将反应器置于恒温振荡器中以220rpm、25℃避光条件反应15min，脱除谷氨酸侧链上的烯丙基，反应2次；依次加入20mLDMF、DCM、DMF、DCM、DMF、DMF洗涤并抽干，3min/次；重复步骤(2)脱Fmoc保护基；称取5eq的PyBOP，5eq的HOBT和5eq的DIEA在恒温振荡器中以220rpm、25℃条件反应1.5h，反应2次，对多肽进行环化。
(6)多肽切割：待树脂晾干，向树脂中加入9.4mL三氟乙酸、0.5g二硫代苏糖醇、0.5mL去离子水，室温搅拌3h，抽滤得到切割液，用TFA洗涤树脂三次，洗涤液合并入切割液中，加入100mL冰叔丁基甲醚静置沉淀，离心后弃去上清，冻干。经RP-HPLC检测后用质谱表征各个多肽的分子量。
(7)RP-HPLC检测及纯化：步骤同实施例1(7)。
本实施制备的环肽C9R-3Y2在0.05％TFA去离子水和0.05％TFA乙腈比例为70：30下出峰，粗肽色谱纯度为58.25％；纯化后色谱纯度为99.64％(见图7)，C9R-3Y2理论分子量是2751.5243g/mol，测得分子量ESI m/z：2751.5286g/mol(见图8)，两者结果一致。
实施例5
本实施例提供了环肽CMT-3Y2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，结构如式(Ⅴ)所示，制备方法包括以下步骤：
(1)树脂准备：称取0.2mmol的Rink Amide MBHA树脂，将树脂加入反应器中，同时加入20mL二氯甲烷，反应器在恒温振荡器中以220rpm，25℃条件溶胀3h，抽干；
(2)脱Fmoc保护基：将20mL 20％哌啶/DMF溶液加入反应器中，反应器在恒温振荡器中以220rpm，25℃条件反应30min，茚三酮检测为阳性时反应结束，依次加入DMF、MeOH、DCM、DMF、DCM、DMF、DMF洗涤并抽干，每种试剂均加入20mL后洗涤并抽干，间隔5min加入下一种试剂，以下洗涤步骤同理；
(3)氨基酸活化、偶联：称取3eq的Fmoc-Lys(Mmt)-OH，3eq的HATU，5eq的DIEA，加入20mL DMF，室温磁力搅拌15min后加入反应器中，反应器在恒温振荡器中以220rpm，25℃条件反应1h，茚三酮检测阴性时反应完成，依次分别加入20mLDMF、DCM、DMF、DCM、DMF、DMF洗涤并抽干，3min/次；
(4)重复步骤(2)和步骤(3)，按照多肽的氨基酸序列依次连接Fmoc-miniPEG、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-2-naphthylalanine、Fmoc-D-Phe-OH，保留Fmoc-D-Phe-OH的Fmoc保护基，连接完成后洗涤并抽干。
(5)脱烯丙基、环化方法：将0.3eq四(三苯基磷)钯、10eq苯硅烷加入无水二氯甲烷中，将反应器置于恒温振荡器中以220rpm、25℃避光条件反应15min，脱除谷氨酸侧链上的烯丙基，反应2次；依次加入20mLDMF、DCM、DMF、DCM、DMF、DMF洗涤并抽干，3min/次；重复步骤(2)脱Fmoc保护基；称取5eq的PyBOP，5eq的HOBT和5eq的DIEA在恒温振荡器中以220rpm、25℃条件反应1.5h，反应2次，对多肽进行环化。
(6)脱Mmt保护基：向反应器中加入20mL脱除剂脱除Mmt保护基，脱除剂各成分质量比为三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶二氯甲烷＝2∶4∶94，洗涤并抽干，脱除后继续连接Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH，连接完成后洗涤并抽干。
(7)多肽切割：待树脂晾干，向树脂中加入9.4mL三氟乙酸、0.5g二硫代苏糖醇、0.5mL去离子水，室温搅拌3h，抽滤得到切割液，用三氟乙酸洗涤树脂三次，洗涤液合并入切割液中，加入100mL冰叔丁基甲醚静置沉淀，离心后弃去上清，冻干。经RP-HPLC检测后用质谱表征各个多肽的分子量。
(8)RP-HPLC检测及纯化：步骤同实施例1(7)。
本实施制备的环肽CMT-3Y2在0.05％TFA去离子水和0.05％TFA乙腈比例为45：55下出峰，粗肽色谱纯度为70.6827％；纯化后色谱纯度为99.26％(见图9)，CMT-3Y2理论分子量是2443.2662g/mol，测得分子量ESI m/z：2443.2371g/mol(见图10)，两者结果一致。
实施例6
本实施例提供了环肽MT-C3Y，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，结构如式(Ⅵ)所示，制备方法包括以下步骤：
(1)树脂准备：称取0.2mmol的Rink Amide MBHA树脂，将树脂加入反应器中，同时加入20mL二氯甲烷，反应器在恒温振荡器中以220rpm，25℃条件溶胀3h，抽干；
(2)脱Fmoc保护基：将20mL 20％哌啶/DMF溶液加入反应器中，反应器在恒温振荡器中以220rpm，25℃条件反应30min，茚三酮检测为阳性时反应结束，依次加入DMF、MeOH、DCM、DMF、DCM、DMF、DMF洗涤并抽干，每种试剂均加入20mL后洗涤并抽干，间隔5min加入下一种试剂，以下洗涤步骤同理；
(3)氨基酸活化、偶联：称取3eq的Fmoc-Lys(Mmt)-OH，3eq的HATU，5eq的DIEA，加入20mL DMF，室温磁力搅拌15min后加入反应器中，反应器在恒温振荡器中以220rpm，25℃条件反应1h，茚三酮检测阴性时反应完成，依次分别加入20mLDMF、DCM、DMF、DCM、DMF、DMF洗涤并抽干，3min/次；
(4)重复步骤(2)和步骤(3)，按照多肽的氨基酸序列依次连接Fmoc-miniPEG、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-2-naphthylalanine、Fmoc-D-Phe-OH，对多肽链N端进行乙酰化处理。
(5)脱Mmt保护基：向反应器中加入20mL脱除剂脱除Mmt保护基，脱除剂各成分质量比为三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶二氯甲烷＝2∶4∶94，洗涤并抽干，脱除后继续连接Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH，保留Fmoc-Gly-OH的Fmoc保护基，连接完成后洗涤并抽干。
(6)脱烯丙基、环化方法：将0.3eq四(三苯基磷)钯、10eq苯硅烷加入无水二氯甲烷中，将反应器置于恒温振荡器中以220rpm、25℃避光条件反应15min，脱除谷氨酸侧链上的烯丙基，反应2次；依次加入20mLDMF、DCM、DMF、DCM、DMF、DMF洗涤并抽干，3min/次；重复步骤(2)脱Fmoc保护基；称取5eq的PyBOP，5eq的HOBT和5eq的DIEA在恒温振荡器中以220rpm、25℃条件反应1.5h，反应2次，对多肽进行环化。
(7)多肽切割：待树脂晾干，向树脂中加入9.4mL三氟乙酸、0.5g二硫代苏糖醇、0.5mL去离子水，室温搅拌3h，抽滤得到切割液，用三氟乙酸洗涤树脂三次，洗涤液合并入切割液中，加入100mL冰叔丁基甲醚静置沉淀，离心后弃去上清，冻干。经RP-HPLC检测后用质谱表征各个多肽的分子量。
(8)RP-HPLC检测及纯化：步骤同实施例1(7)。
本实施制备的环肽MT-C3Y在0.05％TFA去离子水和0.05％TFA乙腈比例为67：33下出峰，粗肽色谱纯度为62.55％；纯化后色谱纯度为98.64％(见图11)，MT-C3Y理论分子量是2658.3251g/mol，测得分子量ESI m/z：2658.3247g/mol(见图12)，两者结果一致。
实施例7
本实施例提供了环肽CMT-C3Y，其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，结构如式(Ⅶ)所示，制备方法包括以下步骤：
(1)树脂准备：称取0.2mmol的Rink Amide MBHA树脂，将树脂加入反应器中，同时加入20mL二氯甲烷，反应器在恒温振荡器中以220rpm，25℃条件溶胀3h，抽干；
(2)脱Fmoc保护基：将20mL 20％哌啶/DMF溶液加入反应器中，反应器在恒温振荡器中以220rpm，25℃条件反应30min，茚三酮检测为阳性时反应结束，依次加入DMF、MeOH、DCM、DMF、DCM、DMF、DMF洗涤并抽干，每种试剂均加入20mL后洗涤并抽干，间隔5min加入下一种试剂，以下洗涤步骤同理；
(3)氨基酸活化、偶联：称取3eq的Fmoc-Lys(Mmt)-OH，3eq的HATU，5eq的DIEA，加入20mL DMF，室温磁力搅拌15min后加入反应器中，反应器在恒温振荡器中以220rpm，25℃条件反应1h，茚三酮检测阴性时反应完成，依次分别加入20mLDMF、DCM、DMF、DCM、DMF、DMF洗涤并抽干，3min/次；
(4)重复步骤(2)和步骤(3)，按照多肽的氨基酸序列依次连接Fmoc-miniPEG、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-2-naphthylalanine、Fmoc-D-Phe-OH，保留Fmoc-D-Phe-OH的Fmoc保护基，洗涤并抽干。
(5)脱烯丙基、环化方法：将0.3eq四(三苯基磷)钯、10eq苯硅烷加入无水二氯甲烷中，将反应器置于恒温振荡器中以220rpm、25℃避光条件反应15min，脱除谷氨酸侧链上的烯丙基，反应2次；依次加入20mLDMF、DCM、DMF、DCM、DMF、DMF洗涤并抽干，3min/次；重复步骤(2)脱Fmoc保护基；称取5eq的PyBOP，5eq的HOBT和5eq的DIEA在恒温振荡器中以220rpm、25℃条件反应1.5h，反应2次，对多肽进行环化。
(6)脱Mmt保护基：向反应器中加入20mL脱除剂脱除Mmt保护基，脱除剂各成分质量比为三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶二氯甲烷＝2∶4∶94，洗涤并抽干，脱除后继续连接Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH，保留Fmoc-Gly-OH的Fmoc保护基，连接完成后洗涤并抽干；重复步骤(5)。
(7)多肽切割：待树脂晾干，向树脂中加入9.4mL三氟乙酸、0.5g二硫代苏糖醇、0.5mL去离子水，室温搅拌3h，抽滤得到切割液，用三氟乙酸洗涤树脂三次，洗涤液合并入切割液中，加入100mL冰叔丁基甲醚静置沉淀，离心后弃去上清，冻干。经RP-HPLC检测后用质谱表征各个多肽的分子量。
(8)RP-HPLC检测及纯化：步骤同实施例1(7)。
本实施制备的环肽CMT-C3Y在0.05％TFA去离子水和0.05％TFA乙腈比例60∶40下出峰，粗肽色谱纯度为60.55％；纯化后色谱纯度为99.64％(如图13)，CMT-C3Y理论分子量是2555.2982g/mol，测得分子量ESI m/z：2555.2931g/mol(如图14)，两者结果一致。
上述实施例综合评价实验分析：
1.多肽的穿膜评价实验
为了探究环肽的穿膜效率，本实施构建了MDCK-MDR1细胞跨膜转运模型和PAMPA跨膜转运模型，MDCK-MDR1细胞跨膜转运模型的生理学特性与血脑屏障相似，能够评价多肽药物的穿透血脑屏障的能力；PAMPA跨膜转运模型作为药物穿膜效率评价的快速筛选模型只能评价药物被动转运的能力，不能够用于评价多种穿膜方式并存的多肽药物吸收能力，所以本实施采取MDCK-MDR1和PAMPA两种跨膜转运模型评价的方法，探究环肽的穿膜效率。
细胞准备：MDCK-MDR1细胞以1.7×105个铺入Transwell板上层(AP侧)中，在AP侧加入含10％FBS的DMEM培养基200μL，同时在Transwell板下层(BL侧)加入含10％FBS的DMEM培养基1.2mL。将Transwell板放到37℃，5％CO2的培养箱中培养，分别于1、3、5、7天用电阻仪测电阻及测定荧光黄渗透性来评价模型的可靠性。当MDCK-MDRI细胞跨膜转运模型电阻值(TEER)＞150Ω·cm2且荧光黄的表观渗透系数(Papp)值小于2×10-6cm2/s时，说明MDCK-MDR1细胞跨膜转运模型紧密连接性良好且细胞具备分化功能，可以用于多肽药物的穿膜评价。
药物准备：分别将MDCK-MDR1细胞跨膜转运模型和PAMPA跨膜转运模型分成阴性对照组GluA2-3Y、阳性对照组Tat-GluA2-3Y和实验药物组：CTat-3Y1、CTat-3Y2、C9R-3Y1、C9R-3Y2、CMT-3Y2、MT-C3Y、CMT-C3Y。用HBSS缓冲液分别将各组多肽配成2mg/mL的浓度，并用HBSS稀释成500μg/mL的终浓度。在MDCK-MDR1细胞跨膜转运模型中，Tranwell板AP侧加入400μL的终浓度为500mg/L的各组多肽药，Transwell板BL侧加入600μL的HBSS缓冲液，置于培养箱中共孵育3h，从BL侧取样进行RP-HPLC分析其浓度(进样量为300mL)。同时将母液用HBSS缓冲液稀释成62.5、125、250、500、1000μg/mL做标准曲线。在PAMPA跨膜转运模型上，在模型AP侧加入100μL的药，BL侧加入370μL的HBSS缓冲液，避光室温共孵育3h，从BL侧取样进行RP-HPLC分析其浓度，每组3个复孔，结果取均值。计算两个跨膜转运模型上各组多肽药物在表观渗透系数(Papp)＝穿膜浓度/(时间s×膜面积×初始浓度)，其中两个模型的膜面积均为0.33cm2。
由表1分析可得，CMT-3Y2、MT-C3Y和CMT-C3Y在两种跨膜转运模型上的Papp值均显著高于Tat-GluA2-3Y(P＜0.05)，说明环肽CMT-3Y2、MT-C3Y和CMT-C3Y的穿膜效率显著高于Tat-GluA2-3Y。其中，CMT-C3Y在MDCK-MDR1跨膜转运模型和PAMPA跨膜转运模型上的Papp值为(17.73±0.02)×10-5cm/s和(18.65±0.56)×10-5cm/s，显著高于其他多肽(P＜0.05)。
表1各多肽药物在MDCK-MDR1和PAMPA模型上Papp值(×10-5cm/s，n＝3，
)
2.多肽细胞活性评价实验
为了探究环肽对损伤神经细胞存活率的影响，本实施选择了神经兴奋性毒性方法来构建细胞活性评价模型。
细胞准备：PC-12细胞以4×103个/孔的数目铺至96孔板中，在细胞中加入含10％FBS的DMEM，将其置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。
药物准备及谷氨酸配置方法：将PC-12细胞分为空白组、模型组、阴性对照组GluA2-3Y、阳性对照组Tat-GluA2-3Y和实验药物组CTat-3Y1、CTat-3Y2、C9R-3Y1、C9R-3Y2、CMT-3Y2、MT-C3Y、CMT-C3Y，用不含10％FBS的DMEM将各组多肽配置成2mM的初始浓度，再用不含10％FBS的DMEM将各组多肽分别梯度稀释到10、50、100、500、1000μM的终浓度。模型组中Glu的配置方法：先用1M浓度的NaOH溶液溶解谷氨酸至200mM的浓度，再用浓盐酸调PH至7，并用含10％FBS的DMEM稀释谷氨酸至150mM。
各组多肽药物细胞活性评价方法：弃去培养24h的PC-12细胞的培养基，用PBS洗涤细胞一遍。空白组和模型组均加入200μL不含10％FBS的DMEM，其他组均加入200μL各个浓度的不同多肽药物，与PC-12细胞共孵育30min。然后弃去所有液体，用PBS洗涤细胞一遍。空白组加入160μL含10％FBS的DMEM和40μL配制谷氨酸用的溶剂；其他组均加入160μL含10％FBS的DMEM和40μL浓度为150mM的谷氨酸，使谷氨酸终浓度为20mM，与细胞共孵育24h。24h后往各孔里加入10μL的CCK8，与细胞共孵育2h，在酶标仪450nm波长下检测，不同浓度的各组药物实验重复5次，结果取均值，比较各组的细胞存活率，并用SPSS22.0软件计算有活性多肽的EC50值。
根据表2分析可知，组别、浓度、组别和浓度的交互作用对Glu诱导损伤的PC-12细胞在各多肽药物干预下的存活率有明显影响(P＜0.001)，且随着药物浓度的提高，Tat-GluA2-3Y、CTat-3Y1、CTat-3Y1、C9R-3Y1，C9R-3Y2、CMT-3Y2、MT-C3Y、CMT-C3Y干预Glu诱导损伤PC-12细胞的存活率也随之提高(P＜0.001)；LSD-t检验结果显示，GluA2-3Y干预下的细胞存活率与模型组差异不显著(P＞0.05)，其它多肽干预下的细胞存活率与模型组之间差异显著(P＜0.05)；CMT-3Y2、MT-C3Y和CMT-C3Y与阳性对照组Tat-GluA2-3Y相比，细胞存活率显著提高(P＜0.05)，其中，CMT-C3Y细胞存活率最高(P＜0.05)。从表3可以看出，CMT-C3Y的EC50值为29.82μM，在所有肽中最低，神经保护活性最优。
表2 Glu诱导损伤的PC-12细胞在不同浓度各多肽药物干预下的存活率(X/％，n＝5，
)
注：空白组细胞存活率为(100±2.13)％，模型组细胞存活率为(9.98±1.06)％
表3 Glu诱导损伤的PC-12细胞在不同浓度各多肽药物干预下的EC50值(μM)
3.多肽稳定性评价实验
为了探究环肽在血浆中的稳定性，用去离子水分别将阳性对照Tat-GluA2-3Y、实验药物组CTat-3Y1、CTat-3Y2、C9R-3Y1、C9R-3Y2、CMT-3Y2、MT-C3Y、CMT-C3Y配置成5mg/mL的药物母液，取40μL药物溶液加至160μL的大鼠血浆中，使其终浓度为1mg/mL，在37℃烘箱中共孵育。分别于0、0.5、1、2、4、6、8、12、24h取样进行HPLC检测，梯度方法见第一部分多肽合成HPLC分析方法，进样量为200μL。分析前样品处理：用5％TFA/乙腈萃取血浆中的多肽，离心后取上清检测，同时将母液血浆稀释到62.5μg/mL，125μg/mL，250μg/mL，500μg/mL和1mg/mL做标准曲线，比较其不同时间的浓度变化和酶降解率，各时间点的各组药物实验重复3次，结果取均值。(酶降解率＝1-((S各时间的的峰/S 0h峰)*100(％))。
从表4分析可知，随着与血浆孵育的时间延长，各组多肽的酶降解率显著提高(P＜0.001)。与阳性对照组Tat-GluA2-3Y相比，CTat-3Y1、CTat-3Y1、C9R-3Y1，C9R-3Y2、CMT-3Y2、MT-C3Y和CMT-C3Y在血浆中的酶降解率显著降低(P＜0.05)，其中CMT-C3Y在血浆中的酶降解率最低，说明实验药物组环肽的血浆稳定性均显著高于Tat-GluA2-3Y，CMT-C3Y血浆稳定性最高；此外，CTat-3Y1在血浆中的酶降解率与CTat-3Y2差异显著(P＜0.05)，C9R-3Y1在血浆中的酶降解率与C9R-3Y2差异显著(P＜0.05)。
表4各组多肽在血浆中的酶降解率(X/％，n＝3，
)
4.多肽安全性评价实验
为了确认环肽的安全性，本实施从细胞毒性和溶血两方面，进行试验探究环肽的安全性。
(1)多肽的细胞毒性评价方法
将PC-12细胞以4×104个/孔铺入96孔板中，在细胞中加入含10％FBS的DMEM，将其置于37℃，5％CO2环境中培养24h。分别将Tat-GluA2-3Y和三种细胞活性较好的环肽CMT-3Y2、MT-C3Y和CMT-C3Y梯度配置成1、10、20、50、100、500、1000μM的浓度，与细胞共孵育3h，3h后用PBS洗涤细胞三次，加入CCK8，孵育2h，酶标仪450nm波长下检测各组细胞吸光度(A)值，各组药物的不同浓度实验重复5次，结果取均值，比较各组药物的细胞存活率。
从表5中可以看出，随着药物浓度的升高，PC-12细胞存活率显著降低，多肽药物的细胞毒性升高。实验组三种环肽和对照组Tat-GluA2-3Y在同样药物浓度下，细胞存活率差异不显著(P＞0.05)，细胞毒性差异不显著。多肽药物引起细胞死亡率在30％以下时，说明多肽对细胞没有毒性，故实验组环肽CMT-3Y2、MT-C3Y、CMT-C3Y和对照组多肽Tat-GluA2-3Y均没有细胞毒性。
表5 PC-12细胞在不同浓度多肽中的存活率(X/％，n＝5，
)
(2)多肽的溶血评价方法
用PBS缓冲液分别将对照组Tat-GluA2-3Y和实验组CMT-3Y2、MT-C3Y、CMT-C3Y配置成2mg/mL的初始浓度，然后梯度稀释成2、20、40、100、200、1000、2000μg/mL的浓度，分别取2.5mL的各浓度下的各组多肽加入2.5mL的6％大鼠红细胞中，使各组多肽的终浓度分别为1、10、20、50、100、500、1000ug/mL，同时增设PBS为溶血阴性组，0.1％的Triton X-100为溶血组。将各组不同浓度的多肽置于转速为100rpm和温度为37℃的低速摇床上与大鼠红细胞共孵育3h，将各组红细胞用高速冷冻离心机以3500rpm的转速4℃的温度离心5min，取上清至96孔板中酶标仪450nm波长下检测各组细胞吸光度(A)值，各组药物的不同浓度实验重复5次，结果取均值，比较各组药物的溶血率：溶血率＝(各浓度下的各组多肽OD值-溶血阴性组OD值)/(溶血组OD值-溶血阴性组OD值)。
从表6中可以看出，随着浓度的升高，各组多肽的溶血率也随之升高(P＜0.001)，当多肽的溶血率低于10％时，即可认定为多肽没有发生溶血，本实施各组多肽溶血率均低于10％，未发生溶血，只有MT-C3Y在1000μg/mL的高浓度下发生轻度溶血，溶血率为(14.64±0.65)％。
从细胞毒性和溶血实验结果得到，环肽CMT-3Y2、MT-C3Y、CMT-C3Y具备制药的安全性。
表6不同浓度的各组多肽中的溶血率(X/％，n＝5，
)
5.环肽CMT-C3Y的动物活性评价实验
用SPSS22.0软件将C57小鼠按体重随机分成假手术组、模型组、阳性对照Tat-GluA2-3Y低剂量组(2mg/kg)、阳性对照Tat-GluA2-3Y中剂量组(4mg/kg)、阳性对照Tat-GluA2-3Y高剂量组(8mg/kg)、实验药物CMT-C3Y低剂量组(2mg/kg)、实验药物CMT-C3Y中剂量组(4mg/kg)、实验药物CMT-C3Y高剂量组(8mg/kg)，每组5只，比较各组的脑梗死面积和神经系统评分，结果取均值。
给予小鼠腹腔注射10％水合氯醛(0.04mL/10g)，小鼠取仰卧位，在体视镜下剪开颈部正中皮肤，在剪开的皮肤处滴入2％利多卡因局部浸润麻醉。分离小鼠左侧的颈内动脉、颈外动脉、颈总动脉和迷走神经后，暂时夹闭颈总动脉和颈内动脉，同时结扎颈外动脉的远心端，在近心端打活结，在颈外动脉剪一小口后插入合适线栓，剪断颈外动脉并调节线栓经颈内动脉入大脑中动脉，遇到阻力立即停止(假手术组只剪断颈外动脉，不插入线栓)，将小鼠置于37℃环境中保暖1.5h，然后取出线栓形成缺血再灌注损伤，在37℃环境中复苏两小时，按照纳入标准和排除标准腹腔注射用生理盐水配置的各组药物(其中模型组和假手术组均给予生理盐水)。24h后运用改良的神经系统缺陷症状评分Berseron5级量表评价各组小鼠的神经功能，评分越高说明神经损伤越明显(评分内容见表7)。然后，将小鼠断头取脑，将脑片切成1mm的厚度，将其置于2％TTC/PBS染色液中，在避光、37℃环境中孵育20min，用Image J软件计算小鼠的脑梗死面积。
表7神经系统缺陷症状评分Berseron5级量表
纳入标准：给药前神经系统评分在2～3分之间，为中度神经损伤；排除标准：给药前小鼠死亡或出现蛛网膜下腔出血症状。
从图15-A、15-B和15-C中可以看出，Tat-GluA2-3Y和CMT-C3Y在4mg/kg和8mg/kg两个剂量下均能改善小鼠的神经系统损伤症状(P＜0.05)和减少小鼠的脑梗死面积(P＜0.05)；CMT-C3Y在4mg/kg和8mg/kg剂量下对小鼠MCAO模型的神经保护作用优于Tat-GluA2-3Y，差异显著(P＜0.05)。
综上所述，得到以下结论：
(1)在穿膜效率方面，在环肽中引入一些疏水性侧链、精氨酸、降低氨基CPP氨基酸数目显著提高了多肽的穿膜效率；从环肽穿膜评价实验结果可知，本发明所述环肽CMT-3Y2、MT-C3Y和CMT-C3Y在两种细胞跨膜转运模型中跨膜效率均显著高于Tat-GluA2-3Y。
(2)在稳定性方面，环肽通过掩盖多肽中一些酶的识别位点，同时通过引入血浆中酶不能识别的D型氨基酸和非天然氨基酸以及引入最短长度的聚二乙醇，提高了多肽药的血浆稳定性；从环肽的稳定性评价实验结果可知，与阳性对照组Tat-GluA2-3Y相比，本发明所述七种环肽在血浆中的酶降解率均显著降低，进而说明，本发明所述七种环肽的血浆稳定性均显著高于Tat-GluA2-3Y，解决了Tat-GluA2-3Y存在的血浆蛋白耐受性差的技术问题。
(3)在细胞活性方面，随着穿膜效率的提高，细胞活性也会随之增强；此外，环化降低了构象自由度，大大增强了它们的代谢稳定性和与靶分子的结合亲和力/特异性，提高了环肽的活性；从环肽的细胞活性评价实验结果可知，CMT-3Y2、MT-C3Y和CMT-C3Y三组细胞存活率显著高于Tat-GluA2-3Y组，且随着药物浓度的提高，环肽干预Glu诱导损伤神经细胞的存活率也随之提高。
(4)在环肽安全性和动物活性方面，由于两亲性CPP中D型氨基酸数在合理范围内，故合成的环肽安全性较好，细胞毒性和溶血实验结果证明了环肽的安全性；通过建立小鼠MCAO模型，得到CMT-C3Y在改善小鼠的神经系统损伤症状和减少小鼠的脑梗死面积方面具有显著效果，优于Tat-GluA2-3Y，可用于制备神经损伤和脑梗死药物。
Claims (10)
1.一种穿膜环肽，其特征在于：由穿膜序列、连接单元和活性序列组成，穿膜序列和活性序列中至少一个序列为环状结构。
2.根据权利要求1所述的穿膜环肽，其特征在于：活性序列的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1所述的穿膜环肽，其特征在于：包括七种穿膜环肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2-8所示，对应的结构式如式(Ⅰ)-(Ⅶ)所示：
4.一种权利要求1所述穿膜环肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)树脂准备：将树脂和二氯甲烷加入反应器中溶胀后抽干；
(2)脱Fmoc保护基：将20％哌啶/DMF溶液加入反应器，茚三酮检测阳性时反应完成，洗涤并抽干；
(3)氨基酸活化、偶联：称取氨基酸、缩合剂和二异丙基乙胺，加入二甲基甲酰胺中溶解进行预活化，将预活化后的混合液加入反应器中，茚三酮检测阴性时反应完成，洗涤并抽干；
(4)按照多肽的氨基酸序列依次连接氨基酸，保留环化前最后一个氨基酸的Fmoc保护基，连接完成后洗涤并抽干；
(5)脱烯丙基、环化方法：将四(三苯基磷)钯和苯硅烷加入无水二氯甲烷中在反应器中避光条件下反应，洗涤并抽干，重复步骤(2)，称取六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羟基苯并三唑和二异丙基乙胺加入反应器，对多肽进行环化；
(6)多肽切割：待树脂晾干，加入三氟乙酸、二硫代苏糖醇、去离子水进行切割，抽滤得到切割液，用三氟乙酸洗涤树脂，洗涤液合并入切割液中，加入冰叔丁基甲醚静置沉淀，离心后弃去上清，冻干，获得相应环肽粗品。
5.根据权利要求4所述的穿膜环肽的制备方法，其特征在于：当树脂连接的首个氨基酸为连接单元氨基酸时，应先连接穿膜序列氨基酸，然后加入脱除剂脱除Mmt保护基，再连接活性序列氨基酸。
6.根据权利要求5所述的穿膜环肽的制备方法，其特征在于：当环肽的活性序列环化时，按照步骤(4)先连接穿膜序列氨基酸，然后加入脱除剂脱除Mmt保护基，洗涤并抽干，脱除后继续按照步骤(4)-(6)，连接活性序列氨基酸并完成环化得到相应的环肽。
7.根据权利要求5所述的穿膜环肽的制备方法，其特征在于：当环肽的活性序列和穿膜序列均环化时，先完成步骤(5)穿膜序列的环化，然后加入脱除剂脱除Mmt保护基，洗涤并抽干，脱除后继续按照步骤(4)-(6)，连接活性序列氨基酸并完成环化得到相应的环肽。
8.根据权利要求5-7任一所述的穿膜环肽的制备方法，其特征在于：脱除剂各组分质量比为三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶二氯甲烷＝2∶4∶94。
9.一种权利要求1所述穿膜环肽的用途，其特征在于：可用于治疗神经损伤和脑梗死。
10.一种药物，其特征在于：其中包含治疗有效量的权利要求1所述的穿膜环肽中的一种或多种的醋酸盐、盐酸盐或其他药学上可接受的盐型。
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