FI64140C - Foerfarande foer framstaellning av nya terapeutiskt anvaendbara peptider - Google Patents

Description

Ιν£*Τ·| r , KUULUTUSjULKAISU £ Λ Λ Λ Π Ή8Γλ IBJ (11) utlAggnincsskrift ο4Ί4υ •S® c (45) r iri- : : ' ^ 1 3 (51) Kv.ik.3/int.ci.3 C 07 C 103/52 SUOM I — FI N LAN D (21) Pit*nttlhak«mu«— Patantana&kning 762250 t .. (22) H«k*ml«pilvi — An*Oknlng*dt( lU.O7.78 (23) AlkupUvi —Glltlghacidtg lU.O7.78 (41) Tulkit JuIMmIuI —· Mlvit off«Kllg IQ 01 70

Patentti- ja rekisterihallitus aeh_________(44) NIhtivUulpenon |a kimLjulkmlsufi pvm. —

Patent· ocn registerstyrelsan Amttkan utbgd och uti.ikrift*n pubik«rad 30.06.83 (32)(33)(31) pyydetty etuoikeus—Begird prlorltet 18.07.77 Unkari-Ungem (HU) RI-6U0 (71) Richter Gedeon VegySszeti Gyar R.T., 21 Gyömröi ut., Budapest X,

Unkari-Ungem (HU) (72) Lajos Kisfaludy, Budapest, György Nyeki , Budapest, Laszlo Szirmai,

Budapest, Egon Karpati, Budapest, Katalin Gidai, Budapest,

Laszlo Szporny, Budapest, Unkari-Ungem (HU) (7*0 Oy Kolster Ab (5U) Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi - Förfarande för framställning av nya terapeutiskt använd-bara peptider Tämän keksinnön kohteena on menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi, joiden yleinen kaava on X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y (I) jossa X on ami no-oks iasetyy 1 i - tai ;N>-amino-oksipropionyyliryhmä,Y on leusyyli-, isoleusyy li -, alanyyli- tai treonyyliryhmä, ja niiden hap-poadditiosuolojen valmistamiseksi.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että reaktiivinen heptapeptidijohdannainen, jonka yleinen kaava on H-Arg(A) - Val-Tyr(B) - He-His(E ) -Pro-Y-0G (II) jossa A on tosyyli- tai nitroryhmä, B on bentsyyli- tai substituoitu bentsyy1iryhmä, c on dinitrofenyy1iryhmä, G on vety tai p-nitrobent-syyliryhmä, ja Y merkitsee samaa kuin edellä, saatetaan reagoimaan amino-oksikarboksyy1ihappojohdannaisen kanssa, jonka yleinen kaava on W-X-M (III) jossa X merkitsee samaa kuin edellä, W on bentsyylioksikarbonyyli-tai tert-butoksikarbonyy 1 iryhmä , ja |vj on hydroksyyliryhmä tai si_ 2 64140 nänsä tunnettu aktivoiva ryhmä, ja saadusta yhdisteestä, jonka yleinen kaava on W-X-Arg(A)-Val-Tyr(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG CIV) jossa W, X, Y, A, B, E ja G merkitsevät samaa kuin edellä, poistetaan suojaryhmät selektiivisesti peräkkäin tai samanaikaisesti, ja haluttaessa saatu yleisen kaavan I mukainen yhdiste muutetaan happo-additiosuolaksi.

Kaavan I mukaisten yhdisteiden synteesissä lähtöaineina käytettyjä yleisen kaavan II mukaisia reaktiivisia heptapeptidi-johdannaisia voidaan valmistaa peptidikemiassa tunnetuin menetelmin. Sopiva menetelmä on esitetty esimerkiksi HU-patenttijulkaisussa 168 431. Tämän menetelmän mukaan sivuketjujen funktionaaliset ryhmät suojataan ryhmillä, jotka ovat stabiileja niissä happamissa olosuhteissa, joissa suojaryhmät poistetaan kytkennän jälkeen.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään C-pääteryhmän omaavan aminohapon karboksyyliryhmän väliaikaiseen suojaamiseen p-nitrobentsyy 1iryhmää (NB): tyrosiinin hydroksyyliryhmä suojataan bent-syyliryhmällä (Bzl); histidiinin imidatsolirenkaan suojaamiseen käytetään dinitrofenyyliryhmää (Dnp); ja arginiininguanidinoryhmän suojaukseen käytetään tosyy1iryhmää (Tos). Kaikki nämä suojaryhmät ovat stabiileja heikosti happamissa olosuhteissa, joten N-päätteinen t-butoksikarbonyy1iryhmä (Boc) voidaan poistaa ilman näiden ryhmien loh-keamisen vaaraa. Dinitrofenyyliryhmän poistaminen voidaan suorittaa tiolyysin avulla ja jäljellä olevat suojaryhmät voidaan erottaa fluo-rivedyn avulla.

Yleisen kaavan I mukaiset yhdisteet voidaan puhdistaa sinänsä tunnetulla tavalla, edullisesti karboksimetyy1iselluloosa-ioninvaihto-kromatografiän avulla. Yhdisteet valmistetaan yleensä lyofilisioiduik-si jauheiksi, jotka voidaan helposti muuttaa erilaisiksi suoloiksi.

Yleisen kaavan I mukaisilla peptideillä on angiotensiini II-aritagonistisia ominaisuuksia.

Angiotensiini II on oktapeptidi, jolla on hypertensiivinen vaikutus. Angiotensiini I:ä muodostuu elimistössä-\-globuliinista, jota syntyy maksassa reniiniksi kutsutun entsyymin avulla, jota vuorostaan muodostuu munuaisissa. Elimistössä tämä yhdiste muuttuu angiotensiini II:ksi .

Ensimmäinen angiotensiini-II-analogia koskeva kirjallisuustieto on vuodelta 1970. Havaittiin, että tämä yhdiste vaikutti spesi- 3 64140 fisenä angiotensiini II:n kilpailevana estoaineena ijn vivo ja in vitro kokeissa. (G.R. Marshall et ai.: Proc. Natl.Acad. Sei. USA 67, 1624 (1970); P.A. Khairralah et ai.: J. Med. Chem. 181 (1970).

Tänä havainto on aiheuttanut laajaa mielenkiintoa ja saanut lukuiset laboratoriot syntetisoimaan uusia angiotensiini-II -analogeja ja tutkimaan niiden antagonistisia ominaisuuksia, joita voitaisiin käyttää reniinistä johtuvan verenpainetaudin, diagnoosiin ja hoitoon.

Aivan tämän tutkimustyön alussa osoittautui, että analogit, joissa θ-Phe-ryhmä oli korvattu alifaattisen sivuketjun sisältävällä aminohapolla, olivat lupaavimpia yhdisteitä tähän tarkoitukseen. Tämän angiotensiini-II molekyylin rakenteen muutoksesta johtuu nimittäin käytännöllisesti katsoen agonistisen vaikutuksen häviäminen ja voimakkaan antagonistisen vaikutuksen ilmaantuminen. (□. Gagnon et ai.:

Br. J. Pharmacol., 4_3, 409 ( 1971), D.T. Pals et ai.: Circ. Res., 29, 664 (1971),)Antagonistista vaikutusta voidaan huomattavasti lisätä, jos 8-asemassa suoritetun muutoksen lisäksi l-Asp-ryhmä korvataan Sar-yksikö1lä (D.T. Pals et ai.: Circ. Res., 29, 673 (1971).) Tällä tavalla valmistettu (Sar , Ala )-angiotensiini-II on jo kaupallinen tuote. Tämän yhdisteen edulliset ominaisuudet johtuvat sen ijn vivo entsymaattisen hajaantumisen vähenemisestä ja voimakkaasta affiniteetista reseptorikohtiin.

On esitetty, että angiotensiini-II:n antagonistisia analogeja voidaan käyttää reniinin aiheuttaman verenpainetaudin diagnoosiin ja eräissä tapauksissa hoitoon, (D.Ganton ja F. Gross: Med.Klin., 71, 2043 (1976); J.L. Marx: Science 194, 821 (1976); P. Needelman ja G.R. Marschall: Red. Proc. 35, 2486 (1976)).

Tähän mennessä valmistettujen angiotensiini-II -analogien rakenteen ja biologisen vaikutuksen vertailu on antanut erittäin tärkeää tietoa agonistisen/antagonistisen tehokkuuden selvittämiseksi (M.C. Khasla et ai.: "Handbook of Experimental Pharmacology" voi. 37, I.H. Page ja P.M. Bumpus eds. 1974; G.R. Marshall: Red. Proc. 35, 2494 (1976)).

Nykyisen tutkimustyön kohteena on uusien antagonistien valmistus, joissa ei esiinny epäedullisia sivuvaikutuksia ja joiden biologinen puoliintumisaika on pidentynyt M.C. Khosla et ai.: J.Med. Chem. 19, 244 (1976); ibid. 20, 253 (1977)).

Nyt on havaittu, että korvaamalla 8-fenyylialaniini angiotensiini-II: n molekyylissä alifaattisella ami nokarboksyy 1 i happo -ryhmällä ja liittämällä samanaikaisesti alifaatti nen (/\-amino-oksi- 4 64140 karboksyylihapporyhmä 1-asemaan, saadaan uusia angiotensiini-II-analogeja, jotka buomattavasti alentavat reniinillä aiheutettua kohonnutta verenpainetta ijn vivo kokeissa myös subkutaanisesti annosteltuina .

Yleisen kaavan I mukaisten yhdisteiden antagonistinen vaikutus tutkiittiin narkoosissa olevilla uroskissoi1la. Verenpaine mitattiin niskava1timosta. Kokeet suoritettiin Hypertension (CIBA) infuusion avulla lateraaliseen reisisuoneon nopeudella 0,5 ^ug/kg/ min. Kun verenpaineen kohoaminen oli stabiloitunut, annosteltiin koeyhdisteen vesipitoista, fysiologista kantajaa sisältävää liuosta ja Saralasinia yhtenä annoksena suonensisäisesti tai subkutaanisesti ja mitattiin verenpaineen aleneminen.

Taulukossa I on esitetty valtimon verenpaineen lasku suonensisäisesti annostellun koeyhdisteen vaikutuksesta. Vertailua varten käytettiin Saralasinia'.'^Taulukossa I esitetyt arvot on saatu laskemalla keskiarvo kuuden kokeen tuloksista. Virhemarginaali osoittaa pääarvon hajontaa.

Taulukko I

Angiotensiini-II -analogien(iv-annostus) vaikutus kohonneeseen verenpaineeseen angiotensiini-II:1la aiheutettuun (iv-infuu- sio)_______

Verenpaineen lasku (mmHg) Λ -i . annostelun jälkeen

Anal°gl 10 g/kg 20 g/kg __ i v. annostus___ TO ^ ^ (Amino-oksiasetyyli ,Leu )-Ang-II -33-3,6 -42-4,2 (D-<?--ami no-oks ipropionyy 11 , Leu )-Ang-II -30-3,4 -38-3,8 (Amino-oksiasetyyli^,Ile^)-Ang-II -28-2,0 -40-5,7

Sara lasin*) -41-2,5 -40-5,7

^ 1-/(N-metyyliglysi ini)-5"L-val i ini-8-L-alani ini/angiotensi in? I I

II

5 641 40

Edellä olevassa taulukossa I esitetyistä arvoista ilmenee selvästi, että jokainen angiotensiini-II -analogi substituoituna alifaattisella 'Λ-amino-oksikarboksyylihapolla 1-asemassa omaa merkittävän verenpainetta alentavan vaikutuksen. Vaikutuksen suuruus on verrannollinen käytetyn annoksen suuruuteen.

Suoritettiin myös kokeita subkutaanisesti annostelemalla.

On huomattava, että tätä annostustapaa angiotensiini-11:11 e tai sen analogeille ei ole esitetty aikaisemmin kirjallisuudessa. Sub-kutaanista annostusta varten koeyhdistettä sisältävään fysiologiseen suolaliuokseen lisättiin karboksimetyyliselluloosaa tai gelatiinia. Tulokset, jotka vastaavat keskiarvoa viidestä eri kokeesta, on esitetty seuraavassa taulukossa II.

Virhemarginaali on esitetty Keskiarvon suhteen.

Taulukko II

Verenpaineen lasku (mmHg)

Lisäaine 15 30 60 120

Analogi Annos liuokseen minuutin kuluttua (Amino-oksiase- 200 CMC -21-5,0 -26-7,2 -13-9,4 -5-7,8 tyyli1,Leuö)Ang- gelatiini -23*2,0 -21*2,2 -10*2,8 -1*5,1 (D-a-amino-ok- 200 CMC -21*6,7 -24*5,7 -16*5,1 -1*4,0 fΐΡ8?Ρί°πΥτίΐ1' 200 gelatiini -24*5,7 -21*5,6 -9*5,7 -3*0,8

Leu°)-Ang-II &

Edellä esitettyjen arvojen mukaan tämän keksinnön mukaiset subkutaanisesti annostetut uudet yhdisteet alentavat tarkoituksellisesti aiheutettua kohonnutta verenpainetta merkittävästi vielä 60 minuutin kuluttua annostuksesta.

Keksinnön mukaisia peptidejä sekä niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja ja komplekseja käytetään farmakologisiin tarkoituksiin tavanomaisina farmaseuttisina koostumuksina. Termillä "farmaseuttisesti hyväksyttävät kompleksit" keksinnön mukaisten peptidien yhteydessä tarkoitetaan kömpieksiyhdist eitä, jotka on muodostettu määrättyjen, esimerkiksi orgaanisten aineiden kanssa hidastetun vaikutuksen saamiseksi peptideille. Tyypillisiä edustajia näistä yhdisteistä ovat gelatiinit, karboksimetyyliselluloosa, algiinihappoesterit, poly(fluoroetiinifosfaatit), aminohappopoly-meerit tai muut polymeerit ja kopolymeerit. Farmaseuttisesti hy- 64140 väksyttävinä suoloina käytetään tavanomaisia, farmaseuttisesti hyväksyttäviä happoadditiosuoloja, esimerkiksi asetaattia.

Farmaseuttiset koostumukset sisältävät keksinnön mukaisia yhdisteitä sekoitettuina orgaanisten tai epäorgaanisten kantajien kanssa, jotka soveltuvat enteraalista tai parenteraalista annostusta varten. Täten farmaseuttiset koostumukset voidaan muodostaa kiinteiksi lyofilisaateiksi, joissa erilaisia inerttejä yhdisteitä, jotka eivät reagoi peptidien kanssa, esimerkiksi hiilivetyjä, voidaan käyttää kantajina. Jos farmaseuttiset koostumukset muodostetaan laimeiksi tai väkevöidyiksi suspensioiksi tai emulsioiksi, sisältävät ne myös erilaisia säilytysaineita ja stabiloivia aineita .

Keksinnön mukaisia yhdisteitä sisältäviä farmaseuttisia koostumuksia voidaan käyttää renaalisten verenpainetautien havaitsemiseen sekä jokaisen oireen käsittelyyn, joka aiheutuu nousseesta renaalisesta verenpaineesta.

Keksinnön lisäyksityiskohtia on esitetty seuraavissa esimerkeissä. Fsimerkeissä käytetyt lyhennykset vastaavat yleisesti kirjallisuudessa käytettyjä (J. Biol. Chem. 247, 977 (1072). Kirjain "0" tarkoittaa «λ-amino-oksihappoa sijoitettuna aminohapon merkinnän edessä. Esimerkiksi OGLy tarkoittaa amino-oksietikkahappoa; OAla tarkoittaa <*-amino-oksipropionihappoa jne. Muita lyhennyksiä ovat esimerkiksi PFP = pentafluorifenyy1i ja Z » karbometoksi.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä haihdutus suoritettiin aina Buchi Rotavapor - laitteessa. Sulamispisteet määritettiin Dr. Tot-toli - laitteessa (valmistaa Buchi). Ohutkerroskromatografia suoritettiin "silikageeli-levyillä Stahl’in mukaan” (E. Merck, Darmstadt). Kromatogrammit kehitettiin seuraavilla liuotinseoksi11a: 1. etyyliasetaatti: (20:6:11 seos pyridiiniä/etikkahappoa/ vettä) = 96:5 2. etyyliasetaatti: (20:6:11 seos pyridiiniä/etikkahappoa/ vettä) 90:9:10 3. etyyliasetaatti: (20:6:11 seos pyridiiniä/etikkahappoa/ vettä) = 80:20 4. etyyliasetaatti: (20:6:11 seos pyridiiniä/etikkahappoa vettä) * 70:30

II

7 64140 5. 4:1:5 seos n-butano 1 ia/etikkahappoa/vettä 6. 30:6:20:24 seos n-butanoiia/etikkahappoa/pyridiiniä/ vettä 7. 1:1:1:1 seos n-butano1ia/etyy1iasetaattia/etikkahappoa/ vettä.

Jos esimerkeissä on mainittu R^-arvo, mainitaan siinä yhteydessä edellä esitettyjen liuotinsysteemien sarjanumero.

Paperielektroforeesi suoritettiin LMIM keskijännitteisessä vaakasuorassa laitteessa MN 214 paperilla pH-arvon 1,9 omaavassa puskuriliuoksessa rinnan glutamiinihapon kanssa. Jännite: 450 V, aika kolme tuntia.

Ohutkerroskromatogrammit kehitettiin osaksi ninhydriiniliuok-sella, osaksi tavanomaisten kloorausmenetelmien avulla o-tolidii-ni-KJ -liuoksen kanssa.

Lopputuotteet puhdistettiin seuraavasti:

Vapaiden peptidien suolat fluorivedyn kanssa puhdistettiin "Sephacryl S-200 Superfine” hartsilla (Pharmaoia, Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi) gradienttieluointimenettelyä käyttäen 0,01 N (pH = 4,5) ja sitten 0,4 M (pH = 6,7) ammoniumasetaattiliuoksen kanssa. Eluaatit rekisteröitiin ”LKB Uvicord II” laitteen avulla (LKB, Uppsala, Ruotsi) automaattista jaekerääjää käyttäen.

Pääjae puhdistettiin edelleen seuraavasti: 0,5 litraa karb-oksimetyyliselluloosapylvastä (CMC — 52) saatettiin tasapainoon edellä esitetyn ensimmäisen puskuriliuoksen avulla. 0,5 g peptidiä liuotettiin 4 ml:aan 0,01 M ammoniumasetaattipuskuria. Saatu liuos kerrostettiin karboksimetyyliselluloosapylväälle. 1,5 litraa 0,01 Π ammoniumasetaattiliuosta sekoitettiin 1,5 litran kanssa 0,4 ammoniumasetaattiliuosta gradienttisekoittajassa ja suoritettiin gradienttieluointi. Virtausnopeus säädettiin arvoon 25 ml/h ja 10 ml:n jakeet otettiin talteen. Pylväästä poistuva eluaatti rekisteröitiin jatkuvasti LKB Uvicord-II -laitteen avulla. Puhdistettu lopputuote saatiin lyofilisoimalla pääjae.

Esimerkki 1 1 Θ

(Amino-oksiasetyyli,Ile)-angiotensiini-II

Vaihe 1

Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-

Pro-Ile-ONB 4,5 g (15 mmoolia) Ile-ONB

64140 a liuotetaan 50 ml:aan kloroformia ja liuokseen lisätään 2,1 ml tri-etyy1iamiin ia ja 3,81 g (10 mmoolia) Boc-Pro-OPFP:tä. Reaktioseos-ta sekoitetaan huoneen lämpötilassa 20 minuuttia ja ravistellaan sitten veden ja 10-%:isen sitruunahapon vesiliuoksen kanssa. Kui- -i vaamisen ja haihduttamisen jälkeen saadaan suojattu peptidi (R_p = 0,8), joka liuotetaan välittömästi 20 ml:aan suolahapon 8 M liuokseen dioksaanissa. Liuoksen annetaan seistä 10 minuuttia ja laimennetaan kuivalla eetterillä ja haihdutetaan. Saatu vapaa dipepti- 3 dihydrokloridi (Rf = 0,44) liuotetaan 30 ml:aan kloroformia, pH säädetään arvoon 8 trietyyliamiini 1la ja lisätään 8,8 g (15 mmoolia) Boc-His(Dnp)-OPFP:tä. Puolentoista tunnin kuluttua lisätään liuokseen 1,65 ml N,N-dimetyy1iaminoetyy1iamiinia ja reaktioseosta ravistellaan 15 minuutin kuluttua 10-%:isen sitruunahapon vesi-liuoksen kanssa, 1 N suolahapon vesiliuoksen kanssa, veden kanssa ja lopuksi 5-%:isen natriumvetykarbonaatin vesiliuoksen kanssa.

Kuivaamisen ja haihduttamisen jälkeen saatu suojattu tripeptidi 1

(Rf = 0,50) liuotetaan - eristämättä - 20 ml.-aan suolahapon 8 M

' 4 liuosta dioksaanissa ja vapaa tripeptidi (R^, = 0,25) saostetaan lisäämällä kuivaa eetteriä. Saatu sakka eristetään suodattamalla ja pestään eetterillä. Se liuotetaan sitten välittömästi seokseen, joka sisältää 50 ml kloroformia ja 20 ml dimetyyliformamidia, pH säädetään arvoon 8 trietyy1iamiini1la ja lisätään liuokseen 6,0 g (15 mmoolia) Boc-1le-0PFP : tä. Liuotin korvataan 30 minuutin kuluttua etyyliasetaatilla ja seosta ravistellaan sitruunahapon 100-%:isen vesiliuoksen ja 1 M suolahapon vesiliuoksen ja lopuksi veden kanssa. Kuivaamalla ja haihduttamalla sitten orgaaninen liuos, saa- Ί ’ daan suojattu tetrapeptidi (R^, = 0,65), joka eristetään tämän jälkeen eetterin ja n-heksaanin suhteessa 1:9 olevalla seoksella.

Peptidi liuotetaan sitten 25 ml:aan suolahapon 8 H liuosta diok-. . 4 saamssa ja vapaa tetrapeptidi (R^. = 0,41) saostetaan 30 minuutin kuluttua kuivan eetterin avulla. Sakka erotetaan suodattamalla ja pestään eetterillä. Se liuotetaan välittömästi 1:1 suhteessa olevaan dimetyy1 iformamidin ja kloroformin seokseen (70 ml), liuoksen pH säädetään arvoon 8 trietyyliamiinilla ja lisätään 6,0 g (11,5 mmoolia) Boc-Tyr(Bz1)-OPFP:tä. Liuoksen annetaan seistä 15 minuuttia, minkä jälkeen liuotin korvataan etyyliasetaatilla. Lisätään 0,66 ml N,N-dimetyyliaminoetyyliamiinia ja 15 minuutin kuluttua seosta ravistellaan sitruunahapon 10-%:isen vesiliuoksen, 1 M suoli 9 64140 lahapon vesiliuoksen ja lopuksi veden kanssa. Kuivaamalla ja haih- 2 duttamalla saatu tuote, saadaan suojattu pentapeptidi (R^. = 0,59), joka seostetaan eetterillä, erotetaan suodattamalla ja pestään eetterillä. Se liuotetaan sitten 20 mlraan suolahapon Θ M liuosta di-oksaanissa ja annetaan seistä 15 minuuttia. Vapaa pentapeptidi 4 (R_P = 0,4) saostetaan sitten kuivalla eetterillä, erotetaan suodattamalla ja pestään eetterillä. Se liuotetaan välittömästi 50 ml:aan dimetyyliformamidia, liuoksen pH säädetään arvoon 8 trietyy1iamii-nilla ja lisätään 4,62 g (12 mmoolia) Boc-Vai-OPFP:tä. Liuotin korvataan tunnin kuluttua kloroformilla ja liuosta ravistellaan sitruunahapon 10-%:isella vesiliuoksella, 1(4 suolahapon vesiliuoksella ja lopuksi vedellä. Kuivaamalla ja haihduttamalla seos, saa- 2 daan suojattu heksapeptidi (R^ = 0,56), joka sitten eristetään eetterin avulla ja pestään eetterillä. Tuote liuotetaan 20 ml:aan 4 suolahapon 8 I4 liuosta dioksaanissa ja vapaa heksapeptidi (R_p = 0,47) saostetaan kuivalla eetterillä. Sakka erotetaan suodattamalla ja pestään eetterillä. Se liuotetaan välittömästi 50 ml:aan dimetyy1 iformamidia ja liuoksen pH säädetään arvoon 8 trietyyli-amiinilla. Lisätään 7,2 g (12 millimoolia) Boc-Arg(Tos)-OPFP:tä, seosta sekoitetaan yksi tunti ja liuotin korvataan kloroformilla. Saatua liuosta ravistellaan 10-%:isen sitruunahapon vesiliuoksen, 1 N suolahapon vesiliuoksen ja lopuksi veden kanssa. Kuivauksen ja haihdutuksen jälkeen jäännöstä trituroidaan eetterillä, jolloin saadaan 12,4 g vastaavasti suojattua heptapeptidiä (80 % teoreettisesta). Sulamispiste: 189-192°C; R^ = 0,55.

Vaihe 2

Boc-0Gly-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-0H

3,1 g (2 mmoolia) Boc-Arg(Tos)-Va1-TyrfBzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-0(\IB: tä liuotetaan 5 ml:aan dimetyylif ormamidia ja lisätään 2,9 ml 2-merkaptoetanolia. Yhden tunnin kuluttua peptidi saostetaan kuivan eetterin avulla, suodatetaan, pestään eetterillä ja puhdistetaan liuottamalla metanoliin ja seostamalla eetterillä, saadaan 2,0 g (74 %) Boc-Arg(Tos)-Va1-TyriBzl)-Ile-His-Pro-Ile -0NB:tä (R^. 0,1). Tuote liuotetaan 30 ml:aan suhteessa 5:1:1 olevaan metanoliin, etikkahapon ja veden seokseen ja lisätään 1,0 g 10 % palladiumia hiilellä sisältävää katalyyttia. Tämän jälkeen annetaan vedyn kuplia liuoksen lävitse viiden tunnin ajan, katalyytti Doistetaan suodattama 1la ia liuos haihdutetaan ja trituroidaan sitten eetterillä.

ίο 641 40

Saadaan 1,22 g [75 %) kaavan Boc-Arg(Tos)-Vai-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OH mukaista osittain suojattua heptapept id ia. R^. = 0,8. 0,6 g (0,5 mmoolia) saatua tuotetta liuotetaan 5 ml:aan suolahapon B ΙΊ liuosta dioksaanissa ja 20 minuutin sekoittamisen jälkeen vapaa hepta- 4 peptidi (R^. = 0,1) erotetaan suodattamalla ja pestään eetterillä.

Se liuotetaan välittömästi 15 ml:aan dimetyyliformamidia, pH säädetään arvoon 8 trietyyliamiinilla ja lisätään 0,45 g (1,2 mmoolia) 3oc-0Gly-0PFP:tä. Reaktioseos haihdutetaan 30 minuutin kuluttua, jäännös liuotetaan 30 ml:aan suhteessa 3:1 olevaan kloroformin ja dimetyyliformamidin seosta ja liuosta ravistellaan 10-%:isen sitruunahapon vesiliuoksen ja sitten veden kanssa. Uutos kuivataan ja haihdutetaan ja jäännöstä trituroidaan etyyliasetaatilla. Suodatuksen ja pesun jälkeen eetterillä, saadaan 0,46 g (72 %) Boc-OGly-Arg(Tos)-Va1-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OH:ta. R^ = 0,23; R^ = 0,4.

Vaihe 3

Suojaryhmien poistaminen 0,46 g (0,35 mmoolia) Boc-0Gly-Arg(Tos)-Ca1-Tyr-Ile-His-Pro-1le-QH:ta liuotetaan 2 ml:aan nestemäistä fluorivetyä ja lisätään 0,5 ml: aan tioanisolia. Liuosta pidetään 0°C:n lämpötilassa yksi tunti, peptidi saostetaan eetterin avulla, erotetaan suodattamalla ja pestään eetterillä. Tuotetta saadaan 0,35 g (100 %). Saatu vetyfluoridi- suola puhdistetaan edellä esitetyllä tavalla. (Amino-oksiasetyyli , 8 5

Ile ) - angiotensi ini -11 -analogin ominaisuudet ovat seuraavat: R^. = 0,26; R^ = 0,56; rJ = 0,57; EGlu = 1,00.

Aminohappoanalyysi: Pro: 1,02/1/; Vai: 1,0/1/; Ile: 1,98/ 2/; Tyr: 0,65/1/; His: 1,0/1/; Arg: 1,03/1/.

Esimerkki 2 1 8 (L-iX-amino-oksopropionyyli ,Ile)-angiotensiini-II Vaihe 1

Boc-OAla-Arg(Tos)-Vai-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OH

0,6 g (0,5 mmoolia) Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-0H:ta (valmistettu esimerkin 1 vaiheessa 2) liuotetaan 5 ml:aan suolahapon 8 M liuokseen dioksaanissa. Liuoksen annetaan seistä 20 minuuttia, minkä jälkeen vapaa heptapeptidi (R^ = 0,1) saostetaan kuivalla eetterillä, suodatetaan ja pestään eetterillä. Se liuote- 64140 π taan välittömästi 20 ml:aan dimetyy1 iformamidia, pH säädetään arvoon 8 trietyyliamiinilla ja lisätään 0,7 g (1,9 mmoolia) Boc-OAla-0PFP:tä. Liuos haihdutetaan 30 minuutin kuluttua ja jäännös liuotetaan 30 ml:aan suhteessa 3:1 olevaan kloroformin ja dimetyyli-formamidin seosta. Liuosta ravistellaan sitruunahapon 10-%:isen vesiliuoksen kanssa ja sitten veden kanssa. Kuivaamisen ja haihduttamisen jälkeen jäännöstä trituroidaan etyyliasetaatilla, suodatetaan ja pestään, jolloin saadaan 0,55 g (B4 %) otsikossa mai- 4 5 nittua tuotetta. R^. = 0,43; R^, = 0,80.

Vaihe 2

Suojaryhmien poistaminen 0,52 g (0,42 mmoolia) Boc-OAla-Arg(Tos)-Vai-Tyr-Ile-His-Pro-Ile-OH:ta liuotetaan 2 ml:aan nestemäistä fluorivetyä ja lisätään 0,55 ml tioanisolia. Liuosta pidetään 0°C:ssa yksi tunti, saostetaan kuivalla eetterillä, suodatetaan ja pestään eetterillä. Saadaan 0,41 g (OAla ,Ile )-angiotensiini-II:ta. Tuotteen puhdistamisen jälkeen edellä esitetyllä tavalla, saadaan seuraavat omi- 5 fi 7 naisuudet omaava tuote: R_p = 0,32; R^ = 0,58; R^. = 0,59; EGlu = 1,0.

Aminohappoanalyysi: Pro: 1,0/1/; Vai: 1,1/1/; Ile: 2,02/2/; His: 0,9/1/; Tyr:0,95/1/; Arg: 1,05/1/.

Esimerkki 3 1 8 (Amino-oksiasetyyli ,Leu )-angiotensiini-II Vaihe 1

Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Qnp)-Pro-Leu-ONB

4,2 g (12 mmoolia) Leu-ONB-Hbr -yhdistettä liuotetaan 50 ml:aan kloroformia ja lisätään 1,68 ml trietyyliamiinia ja 3,81 g (10 mmoolia) Boc-Pro-OPFP yhdistettä. Liuosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa 20 minuuttia, minkä jälkeen sitä ravistellaan sitruunahapon 10-%:isen vesiliuoksen ja sitten veden kanssa. Kuivaami-. -1 sen ja haihduttamisen jälkeen saatu suojattu dipeptidi (R^. = 0,8) liuotetaan 20 ml:aan suolahapon 8 M liuokseen dioksaanissa ja 10 minuutin kuluttua liuosta laimennetaan kuivalla eetterillä ja haihdutetaan. Vapaa dipeptidi (R^ = 0,56) liuotetaan 50 ml:aan kloroformia eristämättä, liuoksen pH säädetään arvoon 8 trietyyliamiinilla ja lisätään 8,8 g (15 mmoolia) Boc-HisfDnp)-OPFP:tä 30 mi- 12 641 40 nuutin kuluttua lisätään 1,65 ml IM, IM-d imetyyliami noetyyl iami i n ia ja liuoksen annetaan seistä 10 minuuttia. Tämän jälkeen sitä ravistellaan sitruunahapon 10-%:isen vesiliuoksen, 1 IM suolahapon vesi- liuoksen, natriumvetykarbonaattiliuoksen ja lopuksi veden kanssa.

*1

Uute kuivataan ja haihdutetaan ja saatu suojattu tripeptidi (R_p = 0,65) liuotetaan 25 ml;aan suolahapon 8 M liuosta dioksaanissa eristämättä. Vapaa tripeptidi saostetaan kuivalla eetterillä 4 (R_P = 0,47), erotetaan suodattamalla ja pestään. Se liuotetaan välittömästi seokseen, joka sisältää 50 ml kloroformia ja 20 ml di-metyyliformamidia, pH säädetään arvoon 8 trietyy1iamiini1 la ja lisätään 6,0 g (15 mmoolia) Boc-Ile-DPFP:tä. Liuotin korvataan 30 minuutin kuluttua etyyliasetaatilla ja liuosta ravistellaan sitruunahapon 10-%:isen vesiliuoksen ja sitten veden kanssa. Kuivauksen ja haihduttamisen jälkeen suojattu tetrapeptidi (R_p = 0,65) eristetään _n-heksaanin ja eetterin suhteessa 7:3 olevan seoksen avulla. Se liuotetaan sitten 25 ml:aan suolahapon 8 N liuosta dioksaa-nissa ja 15 minuutin kuluttua vapaa tetrapeptidi CR_p = 0,65) saostetaan kuivalla eetterillä, suodatetaan ja pestään eetterillä. Se saostetaan sitten kuivalla eetterillä, suodatetaan ja pestään eetterillä. Se liuotetaan välittömästi 50 ml:aan kloroformin ja dime-tyyliformamidin suhteessa 1:1 olevaa liuosta, pH säädetään arvoon ö trietyy1iamiini1la ja lisätään 6,0 g (11,5 mmoolia) Boc-Tyr-0PFP:tä. Liuotin korvataan 15 minuutin kuluttua etyyliasetaatilla, lisätään 0,66 ml IM , IM-d imetyy 1 iaminoetyy 1 iami inia ja liuoksen annetaan seistä 15 minuuttia. Sitä ravistellaan sitten suolahapon 10-%:isen vesiliuoksen, 1 N suolahapon vesiliuoksen ja lopuksi veden kanssa. Kuivauksen ja haihduttamisen jälkeen suojattu pentapeptidi 2 4 (R^. = 0,8) eristetään eetterin avulla. Saatu tuote (R^ = 0,8) liuotetaan 20 ml:aan suolahapon 8 H liuosta dioksaanissa, saostetaan lisäämällä kuivaa eetteriä, suodatetaan ja pestään eetterillä. Se liuotetaan välittömästi 50 ml:aan dimetyyliformamidia, pH säädetään arvoon 8 trietyy1iamiini 1la ja lisätään 3,85 g (10 mmoolia)

Boc-Val-OPFP:tä. Tunnin kuluttua liuotin korvataan kloroformilla, 2 ravistellaan tavanomaisella tavalla ja suojattu heksapeptidi (R^ = 0,82) eristetään eetterin avulla. Se liuotetaan sitten 20 ml:aan suolahapon 8 M liuosta dioksaanissa ja 15 minuutin kuluttua vapaa

O

heksapeptidi (R^ = 0,55) eristetään kuivan eetterin avulla. Se i3 641 40 liuotetaan välittömästi 40 ml:aan dimetyyliformamidia, pH säädetään arvoon 8 trietyy1iamiini1la ja lisätään 6,0 g (10 mmoolia)

Boc-Arg(Tos)-OPFP:tä. Liuotin korvataan 30 minuutin kuluttua kloroformilla ja liuosta ravistellaan 1 N suolahapon vesiliuoksen ja sitten veden kanssa. Uute kuivataan ja haihdutetaan suojatun hep-tapeptidin (R^ = 0,62) saamiseksi, joka eristetään etanolin avulla. Saanto: 7,5 g (50 % Boc-Pro-OPFP -lähtöaineesta laskettuna). Sulamispiste 186-19C°C.

Vaihe 2

B o o - 0 G 1 y - A rg ( T o s ) - V a 1 - T y r ( B z 1) - 11 e - H i s - P r o - L e u - U iJ

3,45 g (2,26 mmoolia) Boc-Arg(Tos)-Vai-Tyr(Bz1)-11e-His -(Dnp)-Pro-Leu-0ΝΒ:tä liuotetaan 10 ml:aan dimetyy1iformamidia, lisätään 6,5 ml 2-merkaptoetanolia ja osittain suojattu heptapeptidi seostetaan kuivan eetterin avulla kahden tunnin seisomisen jälkeen. Tuote puhdistetaan metanoli/eetteri-saostuksen avulla. Saadaan 2,9 g (93 %) tuotetta Boc-Arg(Tos)-Va1-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Leu-0ΝΒ, = 0,12 ja = 0,26. Tuote liuotetaan 40 ml:aan suhteessa 5:1:1 olevaan metanolin, etikkahapon ja veden seosta, lisätään 1,0 g 10 % palladiumia hiilellä sisältävää katalyyttiä ja vedyn annetaan kuplia kuusi tuntia seoksen lävitse. Katalyytti poistetaan suodattamalla ja liuos haihdutetaan. Jäännöstä trituroidaan 2 eetterillä, jolloin saadaan 2,5 g (89 %) tuotetta. = 0,75; R^ = 0,20.

1,1 g (1 mmoolia) Boc-Arg(Tos)-Vai-Tyr-11e-His-Pro-Leu-GH:ta liuotetaan 10 ml:aan suolahapon 8 M liuokseen dioksaanissa. Vapaa heptapeptidi (R_j. = 0,08) saostetaan 30 minuutin kuluttua kuivalla eetterillä, erotetaan suodattamalla ja pestään eetterillä. Se liuotetaan välittömästi 10 ml:aan dimetyyliformamidia, liuoksen pH säädetään arvoon Θ trietyy1iamiini1la ja lisätään 0,54 g (1,5 mmoolia) Boc-OGly-OPFP -yhdistettä. Liuos laimennetaan 30 minuutin kuluttua 30 ml:lla kloroformia ja ravistellaan veden kanssa. Uute kuivataan ja haihdutetaan ja jäännöstä trituroidaan etyyliasetaa-tilla, suodatetaan ja pestään etyyliasetaatilla. Saadaan 1,05 g (86 %) Boc-OGly-Arg(Tos)-Vai-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH:ta. R^ = 0,23; rJ = 0,40.

14

Vaihe 3

Suojaryhmien poistaminen 0,9 g (0,73 mmoolia) Boc-OGly-Arg(Tos)-Va1-Tyr-1le-His -Pro-Leu-OH:ta liuotetaan 5 ml:aan nestemäistä fluorivetyä ja lisätään 1,5 ml tioanisolia. Reaktioseosta pidetään 0°C:ssa 1,5 tuntia, minkä jälkeen sitä käsitellään kuivalla eetterillä ja saostunutta peptidiä pestään eetterillä ja erotetaan se sitten suodattamalla.

1 Q

Saadaan 0,55 g (80 %) (OGly ,Leu )-angiotensiini-II:ta, joka puhdistetaan edellä esitetyllä tavalla. = 0,33; R^ = 0,60; R^ = 0,55; RGlu = 1,18.

Aminohappoanalyysi: Pro: 1,0/1/; Vai: 1,0/1/; Ile: 1,0/1/; Leu: 1,1/1/; His: 0,95/1/; Arg: 1,0/1/; Tyr: 0,7/1/.

Esimerkki 4 1 Θ

( D-<x-amino-oksopropionyyli , Leu )- angiotensiini-II

Vaihe 1

Boc-D-QAla-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH

1,1 g (1 mmoolia) Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH:ta liuotetaan 10 ml:aan suolahapon 8 M liuosta dioksaanissa. Vapaa heptapeptidi seostetaan 30 minuutin kuluttua kuivalla eetterillä, erotetaan suodattamalla ja pestään kuivalla eetterillä. Se liuotetaan välittömästi 10 mlsaan dimetyyliformamidia, pH säädetään arvoon 8 trietyyliamiinilla ja liuokseen lisätään 0,65 g (1,5 mmoolia) Boc-D-0Ala-0PFP:tä. Liuos laimennetaan 30 minuutin kuluttua kloroformilla ja sitä ravistellaan veden kanssa. Kuivauksen ja haihdutuksen jälkeen jäännöstä trituroidaan etyyliasetaatilla, suodatetaan ja pestään etyyliasetaatilla. Tällöin saadaan 0,95 g (77 %) Boc-D-OAla(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH:ta R^ = 0,29.

Vaihe 2

Suojaryhmien poistaminen 0,95 g (0,77 mmoolia) Boc-D-OAla-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH:ta liuotetaan 4 ml:aan nestemäistä fluorivetyä ja lisätään 1,2 ml tioanisolia. Liuosta pidetään 0°C:ssa, aine seostetaan kuivalla eetterillä, poistetaan suodattamalla ja pestään eetterillä. Tällä tavalla saadaan 0,6 g (00 l) (0-0Ala1 ,LeiJÖ)-angioten.·;ii-ni-II -analogia, joka voidaan puhdistaa tavanomaisella tavalla.

= 0,33; R^ = 0,61; R7 0,56; E j - 1,10.

Aminohappoanalyysi: Pro: 1,02/1/; Vai: 1,0/1/; Leu: 1,02/1/; Ile: 1,03/1/; His: 1,01/1/; Arg: 0,92/1/; Tyr: 0,8/1/.

Claims (1)

1. 641 40 15 Patenttivaatimus Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi, joiden yleinen kaava on X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y (I) jossa X on amino-oksiasetyyli- tai ;>--amino-oksipropionyyliryhmä, Y on leusyyli-, isoleusyyli-, alanyyli- tai treonyyliryhmä, ja niiden happoadditiosuolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että reaktiivinen heptapeptidijohdannainen, jonka yleinen kaava on H-Arg(A)-Val-Tyr(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG (II) jossa A on tosyyli- tai nitroryhmä, B on bentsyyli- tai substitu-oitu bentsyyliryhmä, E on dinitrofenyy1iryhmä, G on vety tai p-nit-robentsyyliryhmä, ja Y merkitsee samaa kuin edellä, saatetaan reagoimaan amino-oksikarboksyylihappojohdannaisen kanssa, jonka yleinen kaava on W-X-M (III) jossa X merkitsee samaa kuin edellä, W on bentsyylioksikarbonyyli-tai tert-butoksikarbonyyliryhmä, ja M on hydroksyyliryhmä tai sinänsä tunnettu aktivoiva ryhmä, ja saadusta yhdisteestä, jonka yleinen kaava on W-X-Arg(A)-Vai-Tyr(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-0G (IV) jossa W, X, Y, A, B, E ja G merkitsevät samaa kuin edellä, poistetaan suojaryhmät selektiivisesti peräkkäin tai samanaikaisesti, ja haluttaessa saatu yleisen kaavan I mukainen yhdiste muutetaan happo-additiosuolaksi.