SE443790B - Nya angiotensin-ii-analoger, som i l-stellningen innehaller en alfa-aminooxisyra och som har angiotensinantagoniserande verkan - Google Patents

Description

10 15 20 25 50 55 40 7807823-5 Den första angiotensin-II-analogen beskrevs första gången' 1970. Det visade sig att denna förening fungerar som en specifik konkurrerande inhibitor av angiotensin II 1 försök såväl in vivo som in vitro (G.R. Marshall och medarbetare: Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 67, 1624 (l970); P.A. Khairralah och medarbetare: J.Med.Chem. 15, 181 (1970)). Denna upptäckt har orsakat ett omfattande intresse och stimulerat många laboratorier till syntes och observation av nya angiotensin-II-analoger som har antagoniserande egenskaper och följaktligen kan användas för diagnostik eller till och med behandling av hypertension beroende på renin. Alldeles i början av dessa undersökningar visade det sig att analoger, i vilka grup- pen 8-Phe substituerats med en aminosyra med en alifatisk sido- kedja är de mest lovande föreningarna för detta ändamål. Denna förening av angiotensin-II-molekylens struktur innebär nämligen att den agonistiska aktiviteten praktiskt taget försvinner och en kraftig antagonistisk aktivitet uppträder (D. Gagnon och med- arbetare: Br. J. Pharmacol., 45, 409 (1971), D.T. Pals och med- arbetare: Circ. Res., 29, 664 (1971)). Den antagonistiska akti- viteten kan väsentligt ökas, när man förutom modifikationen i 8-ställningen utbyter gruppen l-asp mot en Sar-enhet (D.T. Pals eeh medarbetare: cire. Res., 29, 675 (1971)). (serl, A1a8)-engio- tensin-II framställd på detta sätt har redan kommit till använd- ning i praktiken. De fördelaktiga egenskaperna hos denna förening hänför sig till en minskning av den enzymatiska nedbrytningen in vivo och till dess höga affinitet ill receptorställena.

Det antages att de antagonistisïe analogerna av angiotensin II kan användas för diagnostik och i vissa fall för behandling av hypertensioner beroende på renin (D. Ganton och F. Gross: Med. Klin. 7l, 2045 (l976); J.L. Marx: Science 194, 821 (l976); P. Needelman och G.R. Marshall. Fed. Pree. 55. 2486 (1976)).

Jämförelsen mellan strukturen och den biologiska aktiviteten hos hittills framställda angiotensin-II-analoger har givit nägra mycket viktiga informationer för förståelsen av den agonistiska- antagonistiska aktiviteten (M.C. Khosla och medarbetare: Handbook of Experimental Pharmacology, vol. 57, I.H. Page och P.M. Bumpus eds. 1974; G.R. Marshall: Fed. Proc. 55, 2494 (1976)).

I centrum för aktuell forskning står framställning av nya antagonister som är fria från oönskade biverkningar och som har längre biologisk halveringstid (M.C. Khosla och medarbetare: J.Mea.chem. 19, 244 (197e); ibiaem ao, 255 (1977)).

HIP-älvan .xr-nvnuønní-f* I' *VIJW-rI "r ' 10 15 20 25 50 55 5 7807823-5 Det har nu visat sig, att när man utbyter 8-feny1alanin- delen i angiotensin-II-molekylen mot en alifatisk CK -amino- karboxylsyraradikal och samtidigt inför en alifatisk oxikarboxylsyraradikal i 1-ställningen erhålles nya angiotensin- II-konkurrerande inhibitorer, som avsevärt sänker hypertension inducerad av renin vid försök in vivo, till och med vid subkutan administration.

Enligt uppfinningen framställes föreningar med den all- männa formeln X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y (I) där X och Y har ovan angivna betydelser, genom att ett reaktivt heptapeptidderivat med den allmänna formeln H-Arg(A)-Val-Tyr(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG (II) där A är en grupp lämplig för temporärt skydd av guanidinogruppen i Arg; B är en grupp lämplig för temporärt skydd av den aromatiska hydroxylgruppen i Tyr; E är en grupp lämplig för temporärt skydd av imidazolgruppen i His; G är väte eller en grupp lämplig för skydd av karboxylgruppen på den C-terminala alifatiska aminosyran, vilken skyddsgrupp är stabil under milda sura betingelser men kan. avspjälkas med hjälp av starka syror eller baser; och Y har ovan angiven betydelse, omsättes med ett reaktivt aminooxi-karboxyl- syraderivat med den allmänna formeln w-x-M (III) där X har ovan angiven betydelse; W är en skyddsgrupp som kan avlägsnas genom acidolys; och M är en hydroxylgrupp eller en i och för sig känd aktiverande grupp, varpå man selektivt, den ena efter den andra eller samtidigt i ett enda reaktionssteg av- spjälkar skyddsgrupperna i den så erhållna föreningen med den allmänna formeln W-X-Arg(A)-Val-Tyr(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG (IV) där W,X,Y,A,B,E och G har ovan angivna betydelser, och, om så önskas, omvandlar en så erhållen förening med den allmänna for- meln I till ett syraadditionssalt eller ett komplex därav.

I föreningar med den ovan angivna allmänna formeln II representerar A företrädesvis en nitro- eller tosylgrupp, B före- trädesvis en bensyl- eller substituerad bensylgrupp och E före- trädesvis en dinitrofenylgrupp. I utgångsföreningarna III repre- senterar W företrädesvis en bensyloxikarbonyl- eller en t-butoxi- 7807823-5 karbonylgrupp och M företrädesvis en pivaloyloxi-, nitrofenoxi-, 2,3,5~triklorfenyoxi-, pentaklorfenoxi-, pentafluorfenoxi-, N-succinimidoxi- eller azidogrupp.

De reaktiva heptapeptidderivaten II som användes som utgångs- material vid syntesen av föreningarna enligt uppfinningen kan framställas på vilket som helst inom peptidkemin känt sätt. En lämplig metod beskrives exempelvis i den ungerska patentskriften 168.451. Enligt denna metod skyddas de funktionella grupperna i sidokedjorna med grupper som är stabila under betingelserna för den acidolys, som genomföras vid elmineringen av skyddsgrupperna efter kopplingen.

Enligt en föredragen utföringsform av sättet enligt före- varande uppfinning för temporärt skydd av karboxylgruppen på den C-terminala aminosyran användes en p-nitrobensylgrupp (NB).

Hydroxylgruppen i tyrosin skyddas medelst en bensylgrupp (Bzl); för skydd av imidazolringen i histidin användes en dinitrofenyl- grupp (Dnp). Argininets guanidingrupp skyddas medelst en tosyl- grupp (Tos). Alla dessa skyddsgrupper är stabila under milt sura betingelser och följaktligen kan den N-terminala t-butoxikarbonyl- gruppen (Boo) elimineras utan risk att dessa grupper avspjälkas.

Elimineringen av dinitrofenylgrupp kan åstadkommas genom tiolys och de resterande skyddsgrupperna kan avspjälkas med hjälp av fluorväte.

Föreningarna I kan renas på i och för sig känt sätt, lämp- ligen genom kromatografering på jonbytare av karboximetylcellulosa.

Som ett resultat därav erhålles föreningarna i allmänhet som lyo- filiserade pulver, som lätt kan omvandlas till olika salter eller komplex.

Den antagonistiska aktiviteten hos föreningarna I har pro- vats på narkotiserade hankatter. Blodtrycket mättes i halspuls- ådern. Proven genomfördes på det sättet, att man införde en hyper- tension-(CIBA) infusion i en lateral làrven med en hastighet av 0,5/ng/kg och minut. När blodtrycksökningen stabiliserats administre- rades vattenlösningarna av testföreningarna, som var fysiologiska eller innehöll bärare och SARALASIN (angiotensidfïl-analogen N- metylglycyl-L-arqinyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-propyl- alanin) administrerades i en enda dos intravenöst eller subkutant, varpå blodtryckssänkningen bestämdes.

Av tabell l framgår artärblodtrycket under inverkan av en intra- venös administration av testföreningarna . Som jämförelsesub- stans användes SARALASIN. De i tabellen sammanställda data har :mamman-a f-fif-fl» - 10 15 20 .-. 5 7807823-5 erhållits genom beräkning av medelvärdet för resultaten från sex försök. Felmarginalerna indikerar spridningen av huvudvärdet.

Tabell 1 Olika angiotensin-II-analogers inverkan på blodtrycket vid intravenös administration under intravenös infusion av angiotensin_II.

Blodtryckssänkning, mmHG, efter Analog ' administration av 10 /Llg/kg 20 /ug/kg 1.v. . . 4 8 Ie _ (âgšïgoxiacetyl , u ) _55i5,6 _42ï4,2 . . . 'I (åšlïëïïfišåïïxlpr°pl°nyl * -ßoïw -ßßiæß . . 1 8 <â:šÉÉox1acetyl , Ile )- _28¿2,O _4O¿5,7 saralasin -4112,; - Av de i ovanstående tabell sammanställda data framgår det, att varje angiotensin-II-analog substituerad med en alifatisk ot-aminooxikarboxylsyra i 4-ställningen har en avsevärd blod- tryckssänkande aktivitet. Graden av aktivitet är proportionell till den administrerade dosen.

Man genomförde också prov med subkutan administration.

Det är att märka, att detta administrationsätt för angiotensin-II eller analoger däravualdrig tidigare beskrivits i litteraturen.

För subkutan administration kompletterades en fysiologisk koksalt- lösning innehållande den för provning avsedda föreningen med kar- boximetylcellulosa respektive gelatin. Resultaten svarande mot medelvärdet av fem separata prov angives i tabell 2 här nedan.

Felmarginalen hänför sig till huvudvärdet.

\J\ 10 EG 25 7807823-S *Tabell 2 inverkan av olika, ønbkntant adninistrernde engriotensin-ïï- annloger på bloátrgyeket under inr. infusion av angiotenain-II.

Tíllsate älodtryckssänkzzing i mšíg Analogcr- Dos till efàer lösningen lfi 30 60 120 nia. sin. nin, nin.

(Ani ooxieceïylfl, *__ § é 4 Lou )-Ang-ll 200 Cl-SC -2l->,B -2-3-73 -13-93 -5-4, zon gelaem -2æ12.o -21123 -1o12,a -11-5, (I)- Oß-aningo :i- propionyl Leu Ang-II zoo cec -e1.ß,7 -en-5,7 -1e+s,1 -1+a, zoo gelazin -2a15.? -21I5,a - 915,7 -aia, Enligt de i ovanstående tabell sammanställda date sjunker genom subknren administration av de nya föreningarna enligt upp- finningen de: blodtryck som avsiktlig: inducerats och en signifikant 'olocirryekssêïnkning bibeinålles till och med 60 minuter efter administrationen.

Peptiderna enligt uppfinningen likson även farmooutiskt godtagbara salter och konple: därav användes för farmkologiskn ändamål i form av konventionella fernaceutiskn beredningar. Ved 'farmeceutiskt godtagbara komplex' av peptiderna enlig: uppfinningen avses i förevarande sammanhang komplexföreningr bildade med vissa, exempelvis organiska material, som förlà peptidernn 'retarderad aktivitet. representanter för dessa föreningar är gelntin, karbofimetyloellulose , alginsyraestrnr, poly( fluonetinfosfnt) , aninosyrnpolymerer eller andra polynerer och sampolymerer. Som farmneentiskt godtagbara salter han användas de konventionella, fnrmeeeutiskt godtagbara syrandriitionsselternn, enamel-vis aoetet.

.De femzeceutiskn bereáningarne innehåller föreningarna enligt uppfinningen i blandning med organiska eller oorgnnizka bärare lämpliga för enteræl eller pnrenternl administration. Sålunda kan de fnrmeeeutish elnndnigarnn box-enas son fasta lyofilisac, i vilka olika inerte föreningar som icke reagerar ned pepfsifier, exempelvis knlvâiten, kan användas som bärare. Når de fnmoenriskn blnndningerne beredas som utnpïisidn eller kommunerna suspension-er 10 15 20 25 55 7 7307823-5 eller enulaioner, kan de och! innehålla olika konserter-inga- ocn atabiliaaringanadel.

Farnacentiaka blandningar innehållande föreningarna enlflgt uppfinningen kan användas för differentierad detektion av renala hypertenaioner liksom även för behandling av varje ayndron orsa- kad av en stegring av renalblodtrycket.

Ytterligare detaljer beträffande uppfinningen frangår av följande icke begränsande exempel. De i exemplen använda för- knrtningarna överensstânner med de i litteraturen allmänt an- vända (J. Biol. Chen. 24% 97? (1972)). OC-aninoorisyrorna be- tecknas ned ett 0 som sätten före symbolen för ifrågavarande aninosyra. Sålunda betyder 0Gly aninooziittikayra; Oslo betyder ax-aminooxipropíonsyra etc. Ytterligare förkortningar är exempel- vis PF? som betyder pentafluorfenyl och Z son betyder karbonatoxi.

Vid förfarandet enligt uppfinningen har indunntning alltid genomförts i en indunstningsanordning son betecknas non Bächi šotavapor. Snšltpunkter nar bestänts i en apparat enligt Dr Tot- toli (son franstâlles av šüchi). Thnnskiktskronatografering har genomförts på 'Kieselgel nacn Stanl', dvs. kiaaldiozidgelplattor från E. Merck, Darnstadt. Kronatogrannen har frankallats med föl- jande lšsningsmedelsbl zdningarz 1. Etylacetat: (en 20:6:ll blandning av pyridin, âttiksyra och vatten) = 9§:5. 2. Etylacetat: (en 20:6:ll blandning av pyridin, âttiksyra och vatten) = 90,9:10. 5. Etylacetat: (en 20:6:ll blandning av pyridin, âttiksyra och vat.en) = 8D:20. 4. Etylacetat: (en 20:6:ll blandning av pgridin, ättiknyra och vatten) = ?0:30.

S. h 4:15 blandning av n-bntanol, âttiksyra och vatten. 6. En 30:6:20:24 blandning av n-butanol, âttiksyra, pyriziin och vatten. 7. En l:1:l:l blandning av n-bntanol, etylacetat, âttiksyra och vatten.

När EI-värden angiven i exemplen är den son exponent angivna siffran en hänvisning till någon av de ovan angivna sin lönn* p - ndelsblandningarna.

Papperselektrpfores genomfördes i en borisontell IMI!-anord- ning men medelnâg spinning på att MM 214 papper i en bnffertlës- ning men P5 1,9 förutom glntaminsyra. Spänning mfio W, rid: 5 rimmr. 10 20 25 50 55 14-0 7807823-5 8 Tunnnkiktskronatogrannon franknllsdes dels med en nínhynrin- lösning och dela med konventionell kloreringsteknik genomförd med en o-tolidin-KI-lösning.

Slutprodukten renades på sitt son angiven bärnedsn: Salterna av de fria peptiderna med vštefluorid :enades på ett hurts 'Sepbacryl S-200$~§*ff=fi”“ (Pnarnaclo, Fine Chemicals, Uppsala) medelst grndientelueringsteknik genomförd med en 0,01 E - (pä &.5) och därefter med en 0,ß M - (pä 6,7) anmoniunacetot- lösning. Eluaten registrerades medelst en LES Üvicord II (LZ3, Uppsala) med hjälp av en automatisk frsktionskollektor.

Euvudfraktionen renedes ytüerligare på nšrnedan angivet sätt: 0,5 liner av en knrboxinetylcellulosn-(GMC-S2) ïolonn bringades i jämvikt med den första sv de ovan beskrivna buffert- lösningarns. 0,5 g av en peptid löstes 1 ß nl av en 0,01 I- amoniunscetstbnffert. Den så erhållna lösningen överskiktados på karbozinetylcellulosekolonnen. 1,5 liter av en 0,01 fl-emnoniun- acetatlösning blandades med 1,5 liter av en 0,4 H-elnoniunacetat- lösning i en grsdientomrörare och gradienteluering genomfördes.

Strömníngshastígheten injusterades på 25 nl/tinme och fraktioner om vardera 10 nl nppsanlndes. Eluatet son avgick från kolonnen registrerades kontinuerligt med njâlp av en LK3 Uvicord-II. Qen slntprodukt erhölls genom lyofilisering av nuvudïraktionen.

Exempel 1: (Aminoofiecetyl1, Ile8)-anziotensin-II.

Steg 1: 30c-Arw(Tos)-Val-!yr(Bzl)-Ile-Eis(Dnp)-Pro-Ile-Oflâ. #,5 g (15 anal) Ile-ONB löstes i 50 ml klorotorn och lösningen försattes med 2,1 nl trietylanin och 3,81 5 (10 anol) 3oc-Pro- OP¥?. Reaktionsnlnndningen omrördes vid rnnstenperaturen i 20 minuter, skakades därefter med vatten och en 10% vattenlösning av citronsyra, varpå den torkades och indunstades. den erhöll på detta sätt en skyddad peptid (B: - 0,8) som omedelbar: löstes i 20 ml av en 8-molar lösning sv E01 i dioznn. Lösningen fick stå i 10 minnzer och utïâlldes därefter med torr eter och indnnstadss.

Den så erhållna Iris dipeptid-hydrokloridsn (kg - 0,ß#) löszes i 50 nl kloroform och pâ injusterndes på 8 med triotylsnin och 8,0 5 (15 mmol) 3oc-Hís(.'!>np)-0PFP tillsattes. Efter lå tiznme .försattes lösningen med 1,65 ml N,N-dimetylsndnoetylenin och efter lä minnes: skakades resktínnsblandningen med en 10% vntzenlösning ev citron- syra, därefter med en l-normal vattenlösning av ëfil, med versen och slutligen ned en 5% vnttenlösning av natriunwiteknrnnnær.

Efter torkning och indunsrníng löstes den så ernállna, skyndade ,......_._:..s.e _ _, _ 10 15 20 25 30 55 9 vsovazs-s tripeptiden (Eg - 0,50) utan isolering 1 20 nl av en 8-solar lösning av 801 i diozsa och den trio tripeptiden (RÉ - 0,25) atfílldes genom tillsats av torr eter. Den erhållna tällnigen avtiltrerades och tvättades med eter, varpå den oledelbort löstes i en blandning av S0 nl klorotori och 20 al dizatyl- fornanid, pH in¿nsterades på 8 sed trietylanin och ê,0 f (15 nnol) Boc-Ile-OPYP sattes till lösningen. Efter šO ninuter utbyttes lösningsmedlet not etylacetat och blandningen skakades med en 100% vattenlösning av citronsyra, därefter sed en 1-oolsr vattenlösning av E01 och slutligen med vatten. Genoa torkning och efterföljande incunstning av den oronnnflkn 1š§fifin@~fi erhölls en skyddad tetrapeptid (Eg - 0,65) son isolerades med hjälp av en blandning av eter och n-hexan 1:9. Den löstes 1 25 nl av en 8-molar lösning av E61 i dioxan och den fria tetra- peptiden (3: = G,ål) fälldes efter šO minuter med hjälp av torr eter. Fâl1cicg-n evfi treredes och tvättades med eter. Den lšs- tes omedelbart 4 70 ml av en blandning av dinetylfornasid och kloroforn l:l och lësningecs pä injusterades på 8 med tríetyl- smin och 6,0 g (ll,5 mmol) Boo-Tyr(3zl)-CPFP tillsattes. lös- ningen fick stå i 15 minuter, varpå lösningsmedlet utbyttes mot etylecetet och Û,êê ml R,H-dimetylaainoetylamin tillsattes. Efter lä minuter skakades blandningen ned en I É vattenlösning av citron- syra, därefter med en l-solar vattenlösning av 561 och slutligen sed vatten. Genom torkning och indunstning erhölls en skyddad pectepeptid (Eg = 0,59) vilken utfâlldes med eter, avfiltrerades och tvšttedes ned eter. Den löstes därefter i 20 ml av en 8-solar lösning av E01 i dioxan och lösningen fick stå i 15 ninnter. Ben fria pentspeptiáen (B: = 0,4) utïâlldes därefter med torr eter, evïiltreredes och tvâttedes med eter. Ben löstes omedelbart i 50 ml dimetylformamid, lösningens på icjustersdes på 8 med tri- etylamin och 4,62 g (12 mml) Boc-Val-O??P tillsattes. Efter en timme utbyttes lösningsmedlet not kloroíorm och lösningen skakades med en 10! vettenlösaing av citronsyra, därefter med en 1-molar vsttenlösning av H1-och slutligen ned vatten. Genom torkning och :amning av »meningen erhölls en :men eenpepevm (s: - ofia) som därefter isoleredes ned hjälp av eter och tvättaáes sed eter.

Produkten löstes i 2G ml av en 8-mole: lösning av EC! i dloxss ses fr: senpßpriu m? - ngar) serum; m: me: ere-f. mineral-l avfiltrerofles och tvättades med stor. flen löstes omedelbart i šfl nl dimetylrormamid och lösningen: pH injusteredes på 8 med trietylssin. 1G ning :med erclxz: 15 25 50 55 ä-O 7807823-5 10 7,2 g (12 nnol) Boc-Arg(Tos)-OPFP tillsattes, blandningen oo- rördes i en time och lösningsnedlet utbyttes mot kloroíorn.

Den så erhållna lösningen skakades ned en 10% vettenlösning av citronsyra, därefter med en l-nornsl vottenlösning av äC1 och slutligen med vatten, varpå den torïodes och iounstadas.

Indunetningsåterstoden triturerades med etc: och :sn ernöll l2,& g av den notsvarande skyddade neptapeptiden (501 av de: teoretiska utbytet). smiizpunxe 139-192°c; så . o,ss.

Steg 2: Boe-0613-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-äis-Pro-Ile-Ofi. §,l 5 (2 nnol) Eco-Arg(?os)-Val-$yr(Bzl)-Ile-äis(Dop)-Pro-Ile-ONE löstes i 5 ml dinetylformamid och 2,9 nl 2-oerkeptoetanol till- satr~s. Efter en timme utfälldes peptiden ned torr eter, av- f':;1'..:"c:"¿1.lio.><, :xnézznaznc-.s :må one: c-Lfi: cement: 30:21:11; i. rL-'lwlcl cci. :Lflälcl- qn¿nu¿?,0 g (7ë%) Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(3zl)íle-ëis-Pro-I1e- ons erhölls (nä = ø,1). Produkten zësfes 1 ao al av en b1annn1ng av metanol, ättíksyre och vatten i nëngdförnållandat 5:l:l och l,0 g sv en katalysator bestående av 10% palladiun på träkol tillsattes. Därefter buboledes väte genom lösningen i 5 tinnar, kntelysatorn avfiltrerades och lösningen indunstades. återsto- den triturerades med eter och man erhöll 1,22 g (?S$) av en par- tíellt skyddad hptapeptid med formeln Boc-Arg(Tos)-Yal-E1r-Ile-31s- Pre-Ile-os med så = o,e. 0,6 g (0,5 sol) av den erhållna pee- dukten löstes i 5 ml av en 8-solar lösning av Hcl i diozan och efter 20 minuters omrörning avfiltrerndes den från neptapeptiden (3: = 0,1) och tvâttades md eter. Den löstes omedelbart i 15 nl dimetylformsmid, på ínjusterades på 8 ned rzietylanin och 0,ß5 3 l,2 mnol) šoc-0Gly-0P?P tillsattes. Efter 30 minuter inunstades renktíonsblannningen, indunstningsåterstoden löstes i 50 ml av en blandning av kloroforn ocn dinetylíorasnid i nängdïörnšllandet 5:1 och lösningen skakades med en 10% vattenlösning av citronsyra och därefter med vatten. Extrsktet torkndes och indunstedes och återstoden triturersdes med etylacetat. Efter filtrering och tvätt- ning med eter erhölls 0,46 5 (?25) Boo-0Gly~Arg(Tos)-Vel-Tyr- Ile-sin-sve-Ile-os. sš - o,25; 2? - 0,40.

Steg 5: Elímínering av skyddszrugpernn. 0,46 g (0,55 mmol) Soc- Arg(Tos)-vel-Tyr-Ile-Ein-?ro-Ile-05 löstes i 2 nl vitsknrornig viteíluoríd och 0,5 ml tíonnísol tillsattes. lösningnn hölls vid 0°C i en timme, peptíden utfâlldos med oter, svtiltrorodos och tvittades med eter och man erhöll 0,§5 5 (1005) av produkten.

Den erhållna nyfirofluoriden renndes på ovan angivet sitt och 10 15 50 35 #0 11 vsøvzzs-5 (aninooxiacetylq, Ileg)-angíotenein-I;-unelagens egenskaper var ra1¿=nae= 2? - o,2e; Q? - o,se; R; - ø,§f; :G13 . ;,oo. lninosyrnanalysz Pro: 1,02/1/; Val: 1,0f2/; Ile: 1,98/2/; fyr: 0,65/1/; Ris: 1,0/1/3 Arg: 1:03/1/å Exempel 2: (L-ufamínooxínropíony1“, Ile')-ongiotennin-II, Steg 1: Boo-Okla-Angíïos)-Vol-Ty:-Ile-Ein-Pro-Ile-Oë. 0,á 5 (0,5 3 nmol) Boo-Arg(¶oa)-Val-Tyr-Ile-äis-Pro-Ile-GQ (tranställt på sätt som angiven-i steg 2 1 exnlpel 1) löstes i S nl av en 8-solar lösning av B01 i dioxnn. Lösningen fick stå 1 20 ninntcr, varpå den frin beptapeptíden (Rç - 0,1) ntfälldes ned torr eter, avfíltreredes och tvättedes med eter. Den lästes onedeltert 1 20 nl dimetylformaníd, pä ínjusterndes på 8 med trietylnnln och 0,7 5 (1,9 mmol) šoc-0Ala-0??P tillsattes. Efter 50 níanter in- dunstades lösningen och återstoden löstes 1 50 nl av en blandning av kloroforn och dímetylformnníd i nängdtörnállandet åzl. Lås- ningen skakades med en 10% vattenlösning av citronsyra och dir- efter med vatten, torkedes och índunstades. Indunstningaåtorstoden trítuxeredes med etylacetat, evfiltreredes och tvättade: och man ercöll 0,55 g (êßë) av rubrikföreningen (ned rnbríkfäreningen av- forrsâttningen den i rubriken till ifrågavarande Å ses här ocn exempel angivna föreningen). B, = 0,&š; 3: = 0,80. steg 2; zlininering av szynnszšunoerne. 0,52 g (o,=2 mnol) ace- 0Ala-Argfïos)-Val-Ty:-Ile-His-Fre-Ile-OH löstes i 2 nl vätska- íorudgt Iluorvâte och 0,55 nfl.tíoanisol tillsattes. Lösningen hölls vífi 0°C i en timme, fälldes med torr eter, íšllningen av- filtreredes och tvâttades med eter och man ernöll 0,41 g (0¿la1, Ilea)-engíozensin-II. Efter rening på ovan angivet sätt hade pro- dukten zalgenee earak:eris:ixa= 3? - 0,52; 2? - o,se; az - o,59; sein = 1,0. àminosyraannl : Pr : 1,0/l/; Val: 1,1/1/; Ile: 2,02/2/3 5151 0»9/l/3 Tïfï 9,95/1/3 ¿I8= 11G5/l/- Exemgel 5: (Amínooxiecet711, Lena)-enzíotensín-II.

Steg 1: Boc-Arg(Tos)~Val-Tyr(B:1)-Ile-Eís(3np)-?ro-len-UNB. 4,2 g (12 mncl) Leu-0NB.HBr löstes i 30 ml kloroïorm och 1,68 nl tr”- etylnmin och 5,81 g (10 mmol) Eoc-Pro-GPT? tillsattes. Lösningen omrördes vid xnmsnençeretuxen i 20 minuter, varpå den skakades ned en~l0% vnttenlšnning av citronsyra och dixettor ned vatten. ßen skyddade fiípeptíden (B: - 0,8), son eräâlls efter torkning och índunsrning löstes í 20 ml av en ßqmolar lösning av E01 1 díoxnn och efter 10 minuter ntsçindes lösningen med torr ere: *JF 10 15 20 50 55 40 7807823-5 12 och xnaunßcaaofl. ngn fria clpupalaøn (3: - 0,56) xaszøa 1 so ul kloroforn arna Iëregloadc isolering och lösniagccs pä iajustoradoo på 8 med trietylanio, varpå 8,8 g (15 mol) Boo-âls(Dnp)-OPVP tillsattes. Efter 50 minuter försattes lösningen med l,65 nl N,N-dimetylaminoetylamin, varpå den fick stå i 10 slantar. äär- efter skakades lösningen först med en 10% vatcenlöanic; av citron- syra, därefter med en l-normal vattenlësniog sv QCI, sodsa and en natriumväteksrbonatlösning och slutligen mod vatten. Extrokcot torkades och índunstadcs och den så erhållna, skyddade :ripoptidon (SE - 0,65) löstes utan isolering i 25 ml sv en 8-solar lösning av E01 i dioxnn. Den fria tripeptídon utfälldes med torr otur (R§- 0,ä7), avfíltrcrodes och tvättadcs och lästes osodolbort 1 enàblanánicg av 50 ml kloroform och 20 ml dimetylfornasid. Lös- ningens pï icjustercdes på 8 med tríctylumic och ê,0 g (lå szol) Bcc-Ile-OFF? zillsattes. Efter 30 minuter acoyttos lësniagssedlet mot etylscerar och läsningen skakades med en 10% vnttenlösaing av citronsyra och áš-:f:er med vatten. Efter torkning ocà ináunsraing isolerades den s”7ddade cetrapeptíden (R: = 9,65) med hjälp av en blandning av :-:eran och eter 7:å. Den låstes därefter i 25 nl av en 8-molar lösning av šC1 i díozan och efrcr 15 minuter utfšlldcs den fria tetrapepriden (3: = 0,65) med torr eter, avfiltrcrades och tvëtcades med eter. Don löstes omedelbart i 50 nl av en blandning av kloroform och dimetylforaamid 1:1, lösningen: pä injnstcrsdes på 8 medirrietylanin och 6,0 3 (ll,S sol) 3oc-!yr- OPT? tillsattes. Efter 15 mianter utbyttes lösningsmdlet mot etylscecat, 0,66 ml N,N-dimctylaminoetylanin tillsattes ocà lös- ningen fick stå i 15 minuter, varpå den skakades först med en 19% vartenlösnicg av citronsyra, därefter med en l-normal varten- lösning av E01 och slutligen med vatten. Eïter torkning ocb in- iunsrning isoieraaes den sxyucsae penrßpepsicen (aš = 0,8) maa etcr. Den erààllns produkten (B: - 0,8) löstes i 20 ml av en 8~molar lösning av Hcl i dioznn, utíälldcs genom tillsats av torr eter, avfíltrernfies och tvitcndes med etcr, varpå don omccsl- bart löstes i 50 ml dimetylformnmid. Iösningsns pä isjuscorsdcs på B md trietylamin och 5,85 g (19 mmol) Eoc-Val-0??? tillsaccos.

Efter en timme utbyttes lösníngsmodlot sot kloroform och läsningar skakades på konventionellt sätt, varpå dan skycdado boxnpepridoa (så -«o,a2> isuleraaes med ngäap av gror. man iasros carerzer 1 20 ml av en 8-molar lösning av ECl i diozan och efter 15 misstar isoloroces den fria hexspeptidon (Bg - 0,55) mod hjälp av torr amor. to 10 15 20 25 50 35 40 15 vsovszs-s Den löstes omedelbart i 40 ml dimetylformamid, lösningens pä injusterades till 8 med trietylamin och 5,0 g (10 mmol) Soc- Arg(Tos)-OPFP tillsattes. Efter 30 minuter utbyttes lösninga- medlet mot kloroform och lösningen skakades med en l-normal vattenlösning av H01 och därefter med vatten. Extraktet torkades och indunstades, varigenom man erhöll en skyddad heptapeptid (Rš = 0,62), som isolerades med hjälp av etanol. Utbyte 7,5 g (50% i förhållande till utgângsmaterialet Boc-Pro-OPFP). Smält- pankt las-l9o°c.

Steg 2: Boc-0Gly-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Leu-03. 5,45 g (2,26 mmol) Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Leu-OHB löstes i 10 ml dimetylformamid och lösningen försattes med 6,6 ml 2-merkaptoetanol och den delvis skyddade heptapeptiden fälldes med torr eter sedan reaktionsblandningen fått stå i 2 timmar.

Produkten renades genom metanol/eterutfällning. Man erhöll 2,9 g (93%) Bee-nrg(Tea)-val-Tyr(Bzl)-Ile-sia-Pre-Lea-ons. nå = 0,12; Rš = 0,26. Produkten löstes i ao nl av en blandning av necanel, ättiksyra och vatten 5:l:l, varpå 1,0 g av en katalysator bestå- ende av l0% palladium på träkol tillsattes och väte bubblades genom blandningen i 6 timmar. Därefter avfiltrerades katalysa- torn, lösningen indunstades och återstoden triturerades med eter, varigenom man erhöll 2,5 g (89%) av produkten. R; = 0,75; Bg = 0,20. 1,1 g (l mmol) Boo-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Lea-OH löstes i 10 ml av en 8-molar lösning av HC1 i dioxan. Efter 30 minuter utfälldes den fria heptapeptiden (R: = 0,08) med torr eter, av- filtrerades och tvättades med eter, varpå den omedelbart löstes i 10 ml dimetylformamid. Lösningens pH injusterads på 8 med tri- etylamin och 0,54 g (1,5 mmol) Boc-0Gly-OPFP tillsattes. Efter 50 minuter utspäddes lösningen med 50 ml kloroform och skakades ned vatten. Extraktet torkades och indunstades och återstoden tritu- rerades med etylacetat, avfiltrerades och tvättades med etylacetat.

Man erhöll 1,05 g (86%) Bee-0Gly-Arg(Tos)Jkfl-Tyr-Ile-äie-Pro-Leu-03.

R; = 0,25; R? = 0,40.

Steg 5: Eliminering av skyddsgrupberna. 0,9 g (0,75 mmol) 300-0613- Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH löstes l 5 ml vâtskeíornigt fluorväte och 1,5 ml tioanisol tillsattes. Beaktionsblandningen nalle vid o°c i 1,5 tinnar, varpå den behandlades ned ter: eter och den utfällda peptiden avfiltrerades och tvâttades med eter. nan erhöll 0.59 e (80%) (oelyfl, lang)-angiecenein-II, een aenaaea på ovan angivet sätt. R; = 0,33; R: = 0,60; BZ = 0,55; Ešln - 1,18.

V1 10 15 20 7 807823-5 14 Aninosyraanalys: Pro: 1,0/l/; Val: 1,0/1/; Ile: 1,0/1/; Leu: 1,1/l/; sia: o,95/1/; Ars= 1.0/l/; Tyr: 00/1/- Exenpel 4: (D-oc-aminooxiyropionyl1, Leua)-angiotensin-II.

Steg l: Boc-D-OAIa-Argflros)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-0H. 1,1 g (l mmol) Boo-Arg(!os)-Val-Tyr-Ile-gis-Pro-Leu-OH löstes i 10 ml av en 8-molar lösning av B01 i dioxan. Efter 30 minuter utfälldes den fria heptapeptiden med torr eter, avfiltrerades, tvättades ned eter och löstes omedelbart i lO ml dimetylformamid. Lösníngens pH injusterades på 8 med trietylamin och 0,56 g (1,5 mmol) Boc-D- 0Ala-OPFP sattes till lösningen. Efter 30 minuter utspäddes lös- ningen med kloroform och skakades med vatten. Efter torkning och indunstning triturerades återstoden med etylacetat, avfiltrerades och tvättades med etylacetat. Man erhöll på detta sätt 0,95 g (77%) Boc-D-0Ala-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH, R: = 0,29.

Steg 2: Eliminerin: av skyddsgrupperna. 0,95 g (0,7? mmol) Boc- D-0Ala-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Leu-OH löstes i 4 ml vätske- formigt íluorvëte och 1,2 ml tioanisol tillsattes. Lösningen hölls vid 0°C, substansen fälldes med torr eter, avfiltrerades och tvät- tades med eter. På detta sätt erhölls 0,6 g (90%) (D-0Ala1, Leu8)- antiotensin-II, som kan renas på konventionellt sätt. Rf = 0,53; aï = 0,61; R: = 0,56; Eêlu = 1,10.

Aminosyraanalys: Pro: 1,02/l/; Val: 1,0/l/; Leu: 1,02/l/; Ile: l,O3/ ll: His: 1,01/l/; Arg: 0,92/1/; Tyr: 0,8/1/.

Claims (1)

1. 'I 5 7807823-5 V5 Patentkrav Peptid med den allmänna formeln X-Arg-Val-Tyr-Ile~His-Pro-Y där X är en aminooxiacetyl- eller L-a-aminooxipropionyl- grupp och Y är en L-leucyl- eller L-isoleucylgruPP, och syraadditionssalter därav.