DE2438352A1

DE2438352A1 - Peptidcyclopropylamide mit lh-rh/fshrh-wirkung

Info

Publication number: DE2438352A1
Application number: DE2438352A
Authority: DE
Inventors: Rolf Dr Geiger; Wolfgang Dr Koenig; Juergen Dr Sandow
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1974-08-09
Filing date: 1974-08-09
Publication date: 1976-02-26
Also published as: LU73168A1; FR2281133A1; SE7508927L; DK361375A; JPS5141359A; BE832311A; IL47879A0; AU8374575A; NL7509259A

Description

HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT

Aktenzeichen:

HOE 74/F 227

Datum: 8. August 1974

Dr.HG/Rp

Peptidcyclopropylamide mit LH-RH/FSH-RH-Wirkung

Analoga des Hypothalamushormons LH-RH der Formel

Kilu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-

NH,

7 8

in denen Glycinamid durch Äthyl-, Propyl- oder Isopropylamld ersetzt ist, besitzen nach J. Med. Chem. Λ§_ (1973),. Seite 1144,. verstärkte biologische Wirkung._ In ähnlicher Weise wird die Wirkung des Hormons verstärkt, wenn Glycin in Position β dvrch D-Alanin- ersetzt wird. Beim Ersatz von GIy duroh D-VaUn₄ D-Leucin oder D-F_rolin nimmt die Wirkung gegenüber der:» natürlichen Hormon jedoch ab (Abstr. of the Endocrine Society, 55th

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. ■ ' ■ - *- 2O8352

Ann. Meeting, 1973, Seite A 145). Wird der Austausch von GIy gegen D-AIa mit demjenigen von Glycinamid gegen die oben genannten Amide miteinander kombiniert, so findet man nach Biochem. Biophys. Res. Commun. J5£ (1974), Seite 335, eine weitere Steigerung der biologischen Wirkung.

Gegenstand der Erfindung sind Peptide der allgemeinen Formel I

L-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH- CHf j (I)

-CH₉

7 t

worin ggf. zusätzlich Tyr durch Phe und Leu' durch Ser(3u ),

Thr(Bu ), Asp(OBu ), GIu(OBu ), Cys(Bu ), Lys(Boc) oder Orn (Boa) ersetzt sein kann. ·

Peptide der allgemeinen Formel I in denen keine Aminesäurebausteine ausgetauscht sind entfalten überraschenderweise im Qvulationstest an der Ratte eine extrem starke biologische Wirkung. Dieser Test stellt das beste Kriterium für die praktische Brauchbarkeit eines solchen Peptide dar, "weil er das Integral über die Zeit-Wirkungskurve widerspiegelt. Verfolgt man die zeitliche Ausschüttung von LH, so findet man, daß diese starke Wirkung; nicht nur durch die Intensität, sondern vor allem zusätzlich durch die

unerwartet lange Wirkungsdauer bedingt ist. Etwa dieselbe intern

grale Wirkung wird erhalten, wenn zusätzlich Ty r gegen Phe und/ oder Leu⁷ gegen Ser(Bu^fc), Thr(Bu^fc), Α5ρ(Βυ^ϋ), GIu(OBu*), CysfBu*), Lys(Boc) oder Orri(Boc) ausgetauscht ist. Vor allern der Austausch in Position 7 bewirkt eine bedeutende zusätzliche Verlängerung der LH- und FSH-ausschüttenden Wirkung dieser Verbindungen...

Darüber hinaus sind die Peptide der Formel I auch peroral wirksam. Dieser überraschende Effekt, der bisher an keinem Peptid .. dieser Kettenlänge beobachtet worden ist, eröffnet neue Therapiemöglichkeiten, und stellenldie er-findung'sgeinäSen Verbindungen über alle bisher dargestellten Analoga des LK-RH. Verbindungen . der Formel I worin Leu' durch Lys(Boc) oder Om(Bo-C) ersetzt ist, wirken lediglich parenteral, da in dienen beiden Amino-

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säurederivaten die Bog-Gruppe gegen Magensäure nicht ausreichend stabil ist. Jedoch sind Analoga mit Aminosäurederivaten in Position 7» die tert.-Butyläther und -estergruppen enthalten, oral wirksam, obwohl auch solche Gruppen in saurem Medium abspaltbar sind.

Gegenstand der Erfindung sind ferner Zubereitungen zur peroralen, intranasalen, intramuskulären, subcutanen oder intravenösen Verabreichung des Peptids der Formel II und der oben genannten Ans,-loga sowie Verfahren zu ihrer Herstellung.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dieser Peptide, dadurch gekennzeichnet,.daß mail sie

a) durch in der Peptidchemie übliche Pragmentkondensation von Peptidbruchstücken nach dem Kondensationssohe;na 1-3 +4-10 oder 1 - 2 + 5 - 10 oder

b) durch stufenweisen Aufbau herstellt.

wobei andere funktioneile Gruppen durch abhydrierbare, oder im alkalischen oder schwach sauren Medium abspalfcbare Schutzgruppe^ ggf, intermediär blockiert werden.

Als Verbindungen mit dem erfindungsgcrcäfien zusätzlichen Austausch von Aminosäuren in den Positionen 5 und 7 kommen. z.B. folgende Verbindungen in Betracht:

123456 7 8 9 CH

COlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu - 3er(BvP) -Arg-Pro-NH^ |

Phe SerCBu")

CyS(Bu¹¹)
ASp(OBu¹¹)

Phe Asp(OEu )

Phe GIu(OBu¹)

Phe

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Bei der Synthese der Verbindung der Formel II worin Leu nicht ausgetauscht ist; ist die Verwendung von Schutzgruppen, nicht kritisch. Als intermediäre ok-Aminoschutzgruppe kommen z.B. der Benzyloxycarbonyl- oder der tert.-Butyloxycarbonylrest in Frage. Die Guanidofunktion des Arginins kann ungeschützt bleiben oder durch eine Nitrogruppe blockiert werden, welche bei der nächstfolgenden Hydrierung abgespalten wird. Dasselbe gilt für die Benzyloxycarbonylgruppe. Des weiteren kommt der Tosylrest als Guanidoschutzgruppe in Frage. Er kann, ggf. zusammen mit weiteren sauer abspaltbaren Schutzgruppen, nach beendeter Synthese oder auf einer früheren Synthesestufe durch KF/Anisol entfernt werden. Auch die Nitrogruppe wird durch HF/Anisol abgespalten und kann deshalb z.B. in Kombination mit dem tert.-Butyloxycarbonylrest als σό-Aminoschutzgruppe, während der ganzen Synthese zum Schutz der Guanidofunktion eingesetzt werden.

Wennibeu' durch ein Aminosäurederivat mit säurelabilem tert.-Butylrest ersetzt ist, muß die Abspaltung der Nitro- oder Tosylgruppe durch HF/Anisol schon auf der Dipeptidstufe erfolgen. Dasselbe gilt für einen intermediären Schutz der Amidgruppe.

Als intermediäre o6-Aminoschutzgruppen bieten sich für diesen Fall abhydrierbare Gruppen wie z.B. der Benzyloxycarbcnylrest oder schwach sauer abspaltbare Gruppen wie z..B. der 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl- oder 2-(5.5-Dimethoxyphenyl)-isopropyloxycarbonylrest an. .

Bei der Synthese der schwefelhaltigen Verbindungen müssen Benzyloxycarbonylschutzgruppen durch katalytische Hydrierung in an sich bekannter Weise unter Zugabe eines Amins wie z.B. Triäthylamin, N-Ä'thylmorpholin oder Cyclohexylamin abgespalten werden, da die hydrogenolytische Abspaltung der Schutzgruppe in neutralem oder saurem Milieu in diesem Falle unvorteilhaft ist.

Bei der Fregmentkupplimg nach a).verwendet man verzugsweise die ohne Racemisierung verlaufende Azidkupplung oder die DO'C/i-

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Hydroxybenzotriazol- bzw.
benzotriazin-Methode. Man kann auch aktivierte Ester von Fragmenten einsetzen.

Für die stufenweise Kondensation von Aminosäuren nach b) eignen sich besonders gut aktivierte Ester von Benzyloxycarbonylaminosäuren, wie z.B. N-Hydroxysuccinimidester oder 2.4.5-Trichlorphenylester und 4-Nitrophenylester. Die Aminolyse der beiden letzteren Aktivester läßt sich sehr gut durch N-Hydroxyverbindungen, die in etwa die Azidität der Essigsäure besitzen, wie z.B. 1-Hydroxybenzotriazol katalysieren.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen gegenüber den 6-Gly-, aber auch gegenüber den 6-D-Ala-Analogen im Ovulationstest und im Ascorbinsäuredepletionstest eine stärkere und längere Wirkung.

Die orale Wirkung eröffnet diesen Arzneimitteln einen weiteren Anwendungsbereich als den bis jetzt nur parenteral oder nasal applizierbaren LH-RH. Sie stellen neuartige Arzneimittel dar., die bei H3^rpothalamus- und Hypophysen-Insuffizienz die Ausschüttung des luteinisierenden und des folikelstimulierenden Hormons aus dem Hypophysenvorderlappen bewirken und v/erden deshalb zur Behandlung von weiblicher und männlicher Sterilität verwendet, soweit diese hypothalamisch-hycophysären Ursprungs ist. Eine :-,^fe5.-tere Anwendung der erfindungsgemäßen Substanzen ist die Festlegung des Ovulationszeitpunktes bei der Frau. Kurz vor dem erwarteten OvulationsZeitpunkt kann durch Applikation der neuen Arzneimittel eine Ovulation sicher ausgelöst werden. Das ist von Bedeutung für die Familienplanung sowohl nach der Kethcäa Xnaus-Ugino als auch für die künstliche Insemination.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind intravenös, intramuskulär oder subcutan applizierbar, kennen intranasal in Form von Nasentropfen oder Nasenspray und mit der oben genannten Einschränkung auch peroral angewendet werden. Die bei Ce η verschiedenen Anwendungsarten bevorzugt anwandten DosAarungen sind

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intravenös 20 - 1000 ng/kg

subcutan 20 - 2000 ng/kg

intramuskulär 20 - 10 000 ng/kg

intranasal 100 - 50 000 ng/kg

peroral 10 000 - 200 000 ng/kg

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen. Sie konnten alle auf einem der erfindungsgemäßen Wege synthetisiert v/erden.

Die Peptide wurden dünnschichtchromatograDhisch auf Einheitlichkeit geprüft und durch opt. Drehung, Aminosäureanalyse und OCH-,-BeStimmung charakterisiert. Berechnete und gefundene Werte stimmen bei allen Peptiden gut überein.

Die Beschreibung der erfindungsgemäßen Zubereitungen stellt nur charakteristische Beispiele für Herstellung und Zusammensetzung der Präparate vor. Es gibt zahlreiche weitere Formulierungsrncglichkeiten, die dem Fachmann jedoch bekannt sind und im Rahmen dieser Erfindung liegen.

Abkürzungen:

DCC Dicyclohexylcarbodiimid HOBt 1-Hydroxybenzotriazol 0OBt 3-Hydroxy-4-oxo-5.4-dihydro~1.2.5-benzotriazin8ster

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Beispiel 1 ; ^J

-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-cyclopropylamid

a) Z-Pro-cyclopropylamid

Zu einer Lösung von 25 g (0,1 Mol) Z-Prolin, 13,5 g (0.1 Mol) HOBt und 5,71 g (0,1 Mol) Cyclopropylamin in 200 ml absolutem Tetrahydrofuran gibt man bei 0°C 22 g DCC, gelöst in 50 ml kaltem absolutem Tetrahydrofuran. Man läßt eine Stunde bei 0 C und drei Stunden bei Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab und engt das Filtrat ein. Der ölige Rückstand wird in Essigester gelöst und nacheiander mit gesättigter NaHCO-Lösung, 2n HCl, NaHCO -Lösung und Wasser ausgeschüttelt, über Na SO. getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird mit Petroläther verrieben und abgesaugt. Zur Reinigung wird aus Essigester/Petroläther umkristallisiert. Ausbeute 23 g (= 80 fo) . Schmp. 120 - 123°, [a]p = - ^5,5° (c=l, in Methanol)

b) H-Pro-cyclopropylamid . HCl

19g Z-Pro-cyclopropylamid werden in 200 ml Methanol gelöst. Dazu gibt man eine Spatelspitze Pd/BaSO. - Katalysator und hydriert indem man unter Rühren Wasserstoff durch die Lösung leitet. Der pH der Lösung wird mit Hilfe eines Autotitrators durch Zugabe von 1 η methanolischer Salzsäure auf 4,5 gehalten. Der Katalysator wird nach beendigter Hydrierung abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und abgesaugt. Ausbeute 11 g (= 88 #), Schmp. 1 69 - 173°

c) Z-Arg (Z₂)-Pro-cyclopropylamid

Zu einer Lösung von 28,85 g (50 mMol) Z-Arg (Ζ_ρ)-ΟΗ, 9,5 g (50 mMol) H-Pro-cyclopropylamid . HCl und 6,75 g (50 mMol) HOBt in 100 ml Methylenchlorid und 25 ml Dimethylformamid gibt man 6,5 ml N-Äthylmorpholin und bei 0° eine Lösung von 11 g DCC in wenig Methylenchlorid* Man läßt eine Stünde bei 0°C und über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Der Niederschlag wird abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird in Essigoster aufgenommen und mit Wasser, NaHCO„-Lösung, 1 η HCl und NaHCO-Lösung gewaschen, mit Na₂SOr getrocknet und eingeengt. Der Rückstand kristallisiert aus Essigester/Petroläthei". Die Rohsubstanz (26,3 g) wird an einer 250 g-Kieselgelsäule in

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Methylenchlorid/Aceton vie 9:1 und 8:2 chromatographisch gereinigt. Ausbeute 22,2 g (62 #) , Schrap. 171 °C [<x]j:¹= - 33,0° (c=l, in Methanol)

d) H-Arg-Pro-cyclopropylamid . 2 HCl

22 g (30,9 mMol) Z-Arg (Z_o)-Pro-cyclopropylamid werden in Methanol analog b) katalytisch hydriert.

Der Rückstand wird im Hochvakuum getrocknet. Es resultieren 11 g (89 $) eines amorphen Schaums.

e) Z-D-Leu-Leu-Arg-Pro-cyclopropylamid

Zu einer Lösung von 3»83 g (1O mMol) H-Arg-Pro-cyclopropylamid 2 HCl in 20 ml Dimethylformamid gibt man bei 0°C 2,6 ml N-Äthylmorpholin und 2,75 g Z-Leu-ONSu. Man läßt über Nacht bei Raumtemperatur stehen, engt ein und verreibt den Rückstand je ein mal mit Essigester und Äther. Man dekantiert die Lösungsmittel ab und trocknet das Öl im Hochvakuum.

Der Rückstand wird in Methanol gelöst und analog b)katalytisch hydriert. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. Es entstehen 5 t 45 g amorphes H-Leu-Arg-Procyclopropylamid . 2 HCl, das durch Salze verunreinigt ist (4,96 g = 100 # bezogen auf H-Arg-Pro-cyclopropylamid . 2 HCl). Die gesamte Substanz wird zusammen mit 1,35 g HOBt, 2,6 ml N-Äthylmorpholin und 4,4 g Z-D-Leu-OTcp in 20 ml Dimethylformamid gelöst. Man läßt 2 Stunden stehen, engt ein und verreibt den Rückstand 2 mal mit gesättigter NaHCO -Lösung, löst in Methylenchlorid, trocknet über Na SO. , engt ein und verreibt den Rückstand zwei mal mit gesättigter NaHCO--Lösung, löst in Methylenchlorid, trocknet über Na„SO^, engt ein und verreibt den Rückstand mit Äther. Ausbeute 4,15 g (62 # bezogen auf H-Arg-Procyclopropylamid . 2 HCl). Die Substanz ist amorph und wird ohne weitere Reinigung weiterverarbeitet.

f) Z-Ser-Tyr (BzI )-OH

Zu einer Suspension von 5i52 g (20 milol) H-Tyr (BzI )-OH in OO ml Dirnethylacetamid gibt man 7i68 g Z-Ser-OOBt und rührt sechs Stunden bei Raumtemperatur. Von Ungelöstem wird abgesaugt und das auf 0°C abgekühlte Filtrat mit 300 ώΙ Wasser versetzt. Der

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Niederschlag wird abgesaugt, mit iimethylacetamid/Wasser-Mischung (1:10) und Wasser gewaschen und mit 1 η H₃SO₄ verrührt. Nun wird wieder abgesaugt und mit Wasser gewaschen und getrocknet. Aus Essigester/Petroläther wird umkristallisiert. Ausbeute 7,35 g (75 #), Schmp. 166°C, [α]*⁰= + 20,9° (c=l, Methanol)

g) H-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-cyclopropylatnid . 2 HCl 3»35 S (5 mMol) Z-D-Leu-Leu-Arg-Pro-cyclopropylamid werden in Methanol gelöst und analog b) katalytisch hydriert. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. Ausbeute 2,9 g amorphes Material (95 ^). Obige 2,9 g (k,7 mMol) H-D-Leu-Leu-Arg-Pro-cyclopropylamid . 2HCl werden zusammen mit 2,32 g (4,7 mMol) Z-Ser-Tyr (BzI )-0H, 635 mg HOBt und 1,22 ml N-Äthylnrorpholin in 10 ml Dimethylformamid suspendiert. Bei 0°C gibt man 1,θ4 g DCC zu und läßt 1 Stunde bei 0°C rühren und über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Der Niederschlag wird anderntags abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird zwei mal mit gesättigter NaHCO-Lösung verrieben, in Methylenchlorid gelöst und die Lösung über Na SO. getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und abgesaugt. Es resultieren 3,5 g (71 $) amorphes Z-Ser-Tyr (BzI )-D-Leu-Leu-Arg-Pro-cyclopropylamid die analog b)katalytisch hydriert werden. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. Ausbeute 2,92 g (=70 ,0 bezogen auf Z-Ser-Tyr(Bzl)-OH). Die Rohsubstanz wird an unten beschriebener Verteilungschromatographie-Säule gereinigt. Aufbau der Säule: 4θΟ ml Eisessig, 800 ml n-Butanol und h Liter Wasser werden geschüttelt. 300 ml der oberen Phase werden mit 2kO s Sephadex LH 20^s ' verrührt. Dabei wird das gesamte Lösungsmittel aufgesaugt. Diese so vorbehandelte Säulenfüliung wird in einer entsprechenden Menge der unteren Phase suspendiert. Man Läßt 3 Stunden quellen und füllt die Säule (1m χ h cm)-Mit der unteren Phase wird eluiert.

Ausbeute an chromatographisch reiner Substanz: 1,3 S [a]^² = - 43,8° (c=l, in Methanol)

h)-GIu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Ar^-Pro-cyclororopylainid Zu einer Lösung von 500 mg MSIu-Hi s-Trp-NH-NII in 6 ml Dimethylformamid gibt man bei - 30 C 0,66 ml einer 6,0 5 η HCl/Dioxan-

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Lösung und 1,2 ml einer 10-proz. tert.-Buüylnitrit-Lösung in absolutem Dioxan. Man läßt 20 Minuten bei -10 C rühren und gibt bei -kO C 860 mg H-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-cyclopropylamid . 2 HCl und 0,78 ml N-Äthylmorpholin zu. Man läßt über Nacht im Kühlschrank bei 4 C stehen, engt ein und verreibt den Rückstand mit Äther. Die Substanz wird in Wasser gelöst und über

(r)

Dowex '1x2 (Acetat-Form) ehromatographiert. Das Eluat wird eingeengt und über eine Carboxymethylcellulosesäule (90x1,5cm), die mit 0,002 m NHi-acetat-Lösung äquilibriert ist, gereinigt. Die Substanz wird gelöst in 0,002 m NH.-acetat-Lösung aufgegeben. Eluiert wird mit einer 0,002 m NH.-acetat-Lösung, der ein Gradient einer 0,1 m NHr-acetat-Lösung angelegt vird (Hischvolumen 250 ml).

Die Fraktionen, die das gewünschte Peptid enthielten wurden zwei mal gefriergetrocknet. Ausbeute 4O5 isg chromatographisch reine Substanz. Der Gehalt an Peptidbase ist laut UV-Spektrum 77 % (Ausbeute 2.6 %) . -[«]_D = -39,9 (c=l, in Dime thylac et amid)

Beispiel 2:
l«Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Ser(Bu )-Arg-Pro-cyclopropylamid

a) H-Ser(Bu )-Arg-Pro-cyclopropylamid . 2 HCl

Zu einer Lösung von 2,3 g (6 mMpl) H-Arg-Pro-cyclopropylamid 2 HCl und 810 mg HOBt in 10 ml Dimethylformamid gibt man 1,56 ml N-Äthylmorpholin und 3,12 g Z-Ser(Bu )-0Tcp und rührt 2 Stunden bei Raumtemperatur. Danach wird im Vakuum eingeengt, der Rückstand in Essigester gelöst und die Lösung zwei mal mit gesättigter NaHCO -Lösung ausgeschüttelt, über Na₂SO. getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. Es werden 2,k g amorphe Substanz erhalten, die analog Beispiel 1 b in Methanol katalytisch hydriert werden. Ausbeute 2,S g (88 $) amorphe Substanz. Dünnschientehromatο graphisch nicht einheitlich (durch etwa 3 Nebenprodukte verunreinigt.

b) H-D-Leu-Ser(Bu )-Arg-Pro-cyclopropylamid . 2 HCl

Zu einer· Lösung von 2,62 g (5 mMol) H-Ser(3u )-Arg-Pro-cyclo» propylamid . 2 HCl und 675 mg HOBt in 5 ml Dimethylformamid gibt man bei Oc 1,3 ml N-Äthylmorphölin und 2,22 g Z-D-Lau-

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OTcρ zu. Man läßt über Nacht stehen, enge ein und löst den Rückstand in Essigester. Mit gesättigter NaHCO -Lösung wird 2 mal ausgeschüttelt, über Na SO, getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. Ausbeute 2,4 g einer amorphen Substanz, die analog Beispiel 1 b in Methanol katalytisch hydriert wird. Der Rückstand wird mit Äther verrrieben. Ausbeute 2,1 g einer amorphen Substanz (66 $ bezogen auf Z-D-Leu-OTcp. Die Substanz wird ohne weitere Reinigung weiterverarbeitet.

c) H-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Ser(Bu )-Arg-Pro-cyclopropylamid . 2 HCl Zu einer Lösung von 1,99 g (3»3 mMol) Z-Trp-Ser-Tyr-NH.-NH- in 25 ml Dimethylformamid gibt man bei - 30 C 2*18 ml einer 6,05 η HCl/Dioxan-Lösung und 3»97 ml einer 10-prozentigen tert.-Butylnitrit-Lösung in absolutem Dioxan. Man läßt 20 Minuten bei - 10 C rühren und gibt bei - 40 C 2,6 ml N-Äthylmorpholin und 2,1 g (3»3 mMol) H-D-Leu-Ser(Bu )-Arg-Pro-eyelopropylamid . 2 HCl zu. Man läßt über Nacht im Kühlraum bei 4 C stehen, engt ein und verreibt den Rückstand mit Äther. Analog Beispiel 1 b wird -hydriert und die Rohsubstanz analog Beispiel 1 g an Sephadex LH 20 chromatographisch gereinigt. Ausbeute an reiner amorpher Substanz 1,25 g (35 $)

d)*-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Ser(Bu )-Arg-Pro-eye lopropylarniddiacetat

Zu einer Lösung von 538 mg (0,5 mMol) H-Trp-Ser-Tyr-D-LeuiSer(Bu )-Arg-Pro-cyclopropylamid . 2 HCl, 151 mg (0,5 mMol) »•Glu-His-OH und 135 mg HOBt in 5 ml Dimethylformamid gibt men bei 0°C 0,13 ml N-Äthylmorpholin und 110 mg DCC. Man läßt 1 Stunde bei 0 C und über Nacht bei Raumtemperatur stehen, saugt den Niederschlag ab, engt ein, und verreibt den Rückstand mit Äther. Man löst in Wasser, filtriert von Unlöslichem und reinigt analog Beispiel 1 h über Dowex 1x2 und Carboxymethylcellulose. Anschließend wird noch über Sephadex LH 20 analog Beispiel 1 g gereinigt. Ausbeute 165 mg. Der Gehalt an Peptid ist laut UV-Spektrum 78$ (20,5 # Ausbeute)
[oc]p³= - 28,9° (c=l, in Dime thylac et amid)

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Beispiel 3 (Zubereitung zur oralen Anwendung);

ι—ι
10 gKJlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-cyclopropylamiddiacetat werden mit 542 g Lactose verrieben. Man mischt die Verreibung mit 3OO S Kartoffelstärke, befeuchtet mit der alkoholischen Lösung von 8 g Gelatine und granuliert. Nach dem Trocknen mischt man 60 g Kartoffelstärke, 10 g Magnesiumsterat, 20 g hochdisperses Siliciumoxid und 60 g Talk zu und preßt die Mischung zu 10 000 Tabletten von je 150 mg Gewicht. Jede Tablette enthält 1 mg Wirkstoff.

Beispiel 4 (Zubereitung zur intranasalen Anwendung); 4,0 g*-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Ser(Bu )-Arg-Pro-cyclopropylamid-diacetat werden in 100 ml dest. Wasser gelöst. Gleichzeitig löst man 31,2 g NaHPO. . 2 HO, 66,29 g Na HPOl, 25 g Natriumchlorid und 100 g Benzylalkohol in 8 1 dest. Wasser und gibt 500 g Polyvinylalkohol mit einem K-Wert von ca. 90 zu. Die beiden Lösungen werden vereinigt und filtriert. Die Einzeldosis von 20 ug ist in 0,05 ml enthalten.

Beispiel 5 (Zubereitung zur intranasalen Anwendung); 100 g wasserfreies Lanolin und 440 g Vaseline werden zusammengeschmolzen. Zu der erkalteten Schmelze gibt man eine Suspension von 800 mg mikrofeinem*-Glu-His-Trp-Ser-Phe-D-Leu-Ser(Bti )-Arg-Pro-cyclopropylamid-diacetat in 359»2 g flüssigem Paraffin. Zum Schluß werden 10 g Benzylalkohol dazugegeben und die Salbe homogenisiert. Die Einzeldosis von 40 ug ist in 0,05 g Salbe enthalten.

Beispiel 6 (Zubereitung für Injektionen);

Man löst 2 nigl-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-cyciopropylamid-diacetat in 500 ml bidest. Wasser und versetzt mit IOC ml Phosphatpuffer pH 4,5· Dann gibt man 1 g Mannit und die errechnete Menge NaCl zur Isotonie zu und füllt mit Wasser auf 1 1 auf. Nach Sterilfiltration wird in Ampullen zu 1 bzw. 2 «1 abgefüllt und lyophilisiert.

Beispiel 7 (Zubereitung für Injektionen);

Man arbeitet nach Beispiel 6, gibt aber vor dem Auffüllen niit Wasser 2,5 g 4-Hydroxybenzoesäuremethylester zu. Nach Sterilfiltration wird in Ampullen zu 1 oder 2 ml abgefüllt.

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Claims

PATENTANSPRÜCHE:

1) Peptide der allgemeinen Formel I

Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-CHy j (I)

7 2 t

worin ggf. zusätzlich Tyr durch Phe und Leu' durch Ser(Bu ),

Thr(Bu^t), ASp(OBu¹¹), GIu(OBu¹^), CyS(Bu¹¹), Lys(Boc) oder Orn (Boc) ersetzt sein kann. ·

2) Verfahren zur Herstellung von Peptiden gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß man sie

a) durch in der Peptidchemie übliche Fragmentkondensation von Peptidbruchstiicken nach dem Kondensaticnsschema 1-3 +4-10 oder 1-2+3-10 oder

b) durch stufenweisen Aufbau herstellt,

wobei andere funktioneile Gruppen durch abhydrierbare, oder im alkalischen oder schwach sauren Medium abspaltbare Schutzgruppen ggf. intermediär blockiert werden.

3) Pharmazeutische Zubereitungen zur peroraien, intranasalen, intramuskulären, subcutanen oder intravenösen Verabreichung bestehend aus oder enthaltend Verbindungen gemäß Anspruch 1.

4) Pharmazeutische Zubereitungen zur peroralen Verabreichung bestehend aus oder enthaltend Verbindungen gemäß Anspruch 1.

5) Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen, gemäß Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen gemäß Anspruch 1 ggf. mit pharmazeutisch üblichen Trägerstoffen und/oder Stabilisatoren in eine für therapeutische Zwecke geeignete Anwendungsform bringt.

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