Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych peptydów o wzorze X-Arg-Val-Tyr- -Ile-His^Pro-Y, w którym X oznacza rodnik ali¬ fatycznego Ikwaisu a^ammoksylkairboksylowego, a Y oznacza rodnik alifatycznego kwasu a-amino- karboksyilowego oraz addycyjnych soli z kwasa¬ mi i kompleksów tych zwiazków.Korzystnymi rodnikami alifatjucznego kwasu a<- -aminoksykairibolksyloweigó X ,sa rodniki aimdnolksy- acetylowy i a-aminoksypropionylowy, a korzyst¬ nymi rodnikami Y rodnik leucylowy, izoleuicyIo¬ wy, alanylowy i treonylowy.Aingiotensyna II jest oktapeptydem wykazuj a- cym czynnoisc podwyzszania cisnienia krwi. Z a- -gloibuiliny wytwarzanej z udzialem enzymu zwa¬ nego irenina, wydzielanego w nerce, powstaje w organizmie angiotemsyna I, a ta jest transfor¬ mowana w angiotensyne II.Pierwszy analog angiotensyny II zostal opisa¬ ny w r. 1970. Stwierdzono, ze zwiazek ten dzia¬ la jako specyficzny, konkurencyjny inhibitor an- gioitensyny II, w próbach in vdvo i in vitro (G.R. Marshall i inni: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 67, 1624 (1970); P. A. Khalrralah i inni: J. Med.Chem. 13, 181 (1970)). Obserwacja ta wywolala szerokie zainteresowanie i zachecila liczne la¬ boratoria do syntezy i badania nowych analo¬ gów angiotemsyny II, majacych wlasciwosci an- tagonistyczne i znajdujacych zastosowanie w dia- 10 ii 20 30 gnoatyce, a nawet leczeniu nadcisnienia wywo¬ lanego renina. Na samym poczatlku prac badaw¬ czych okazalo sie, ze analogi, w których rodnik 8-Phe zostal zastapiony aminokwasem z alifa¬ tycznym lancuchem bocznym sa, zwiazkami naj¬ bardziej w tym wzgledzie obiecujacymi. Ta zmia¬ na w strukturze czasteczki angiotensyny II prak¬ tycznie oznacza zanik czynnosci agonistycznej i pojawienie sie silnej czynnosci awtagoniistycznej (D. Gagnon i inni: Br. J. Pharmacol., 43, 409 (1971), D. T. Pals i inni: Circ. Res., 29, 664 (1971)).Czynnosc antagonistyczna mozna znacznie zwiek¬ szyc, jezeli, oprócz modyfikacji w polozeniu 8, zastapi sie rodnik 1-Asp rodnikiem Sar (D. T.Pals i inni: Circ. Res., £9, 673 (1971)). (Sa^Ala8)- -aingiofoensyna II zostala juz wprowadzona do u- zytku. Korzystne wlasciwoscd 'tego zwiazku przy¬ pisuje sie zmniejszeniu in vivo rozkladu enzy¬ matycznego i duzemu powinowactwu do punktów receptorowych.Zalozono, ze antagonistyczne analogi angioten¬ syny II moga znalezc zastosowanie w diagno¬ styce i, w pewnych przypadkach, w leczeniu nadcisnienia wywolanego renina ((D. Ganton i F.Gross: Med. Klin., 71, 2043 (1976); J. L. Marx: Science 194, 821 1(1076); P. Neededman i G. R.Manschall: Fed. Proc. 35, 2486 (1976)).Porówjnanie sfarukituiry i biologicznej czynnosci zsyntetyzowanych dotychczas analogów angioten- 111 9791 3 syily II dostarczylo bardzo waznych informa¬ cji dotyczacych interpretacji czynnosci amgoni- styczno-antagonistycznej (M. C. Khosla i inni: „Hadbook of Experimental Pharmacology", vol. 37, wydawca I. H. Page i P. M. Bumpus (1974); G. R. Marshall: Fed. Proc. 35, 2494 (1976)).W centrum obecnych prac badawczych znaj¬ duje isie synteza nowych antagonistów, pozba¬ wionych niepozadanych dzialan ubocznych i ma¬ jacych dluzszy pólokres biologiczny (M. C. Khosla i inni: J. Med. Chem. 19, 244 <1976); ibid. 20, 253 (1977)).Obecnie ©twierdzono, ze zastapienie w czaste¬ czce angiotensyny II rodnika 8-fenyloalanylowe- go rodnikiem alifatycznego a-aminokwasu kar- boiksylowego z równoczesnym dolaczeniem .do po¬ lozenia 1 rodnika alifatycznego a^aminoksyikwaisu karboksyilowego daje nowe konkurencyjne inhi¬ bitory angiotensyny II, iktóre znacznie obnizaja nadcisnienie wywolane irenina, w próbach in vivo, nawet w przypadku podania podskórnego.Wedlug wynalazku, zwiazki o wzorze X-Arg- -VaJ-Tyr-Ile-iHis-Pro-Y,w iktórym X i Y maja wyzej podane znaczenia, wytwarza sie dziala¬ jac na* reaktywna pochodna heptapeptydu o wzo¬ rze H-Arg(A)-Vaa-Tyr,(B)Jile-Hiis(E)-Piro-YnOGr; w którym A oznacza grupe odpowiednia do przej¬ sciowej ochrony j grupy guanidynoweij argininy, B oznacza grupe odpowiednia do przejsciowej ochrony aromatycznej girupy hydroksylowej ty- roniny, E oznacza grupe odpowiednia do przej¬ sciowej ochrony imidazolowej grupy histydyny, G oznacza atom wodoru lub girupe odpowiednia do ochrony girupy karboksylowej C-jkoncoiwego alifatycznego aminokwasu, trwala w srodowdisku slabo kwasnym, a odszczepiajaca sie w srodo¬ wisku mocnego kwasu lub zasady, a Y ma wy¬ zej podane znaczenie, reaktywna pochodna kwa¬ su aminokisylkariboiksylowego o wzorze W-X-M, w którym X ma wyzej podane znaczenie, W oz¬ nacza grupe ochronna, odszczepialna w wairun-, kach hydrolizy ikwasowej, a M oznacza grupe hydroksylowa lub ogólnie znana grupe aktywuja¬ ca, odszczepiajac grupy ochronne z otrzymanych zwiazków o wzorze W-X-AngKA)-Val-Tyir(B)-Ile- -Hiis(E)nPiro-Y-OG, w którym W, X, Y, A, B, E i G maja wyzej podane -znaczenia, wybiórczo, jedna po drugiej lub równoczesnie w jednej o- peracjd i, jezeli to jest pozadane, przeprowa¬ dzajac otrzymany zwiazek o wzorze X-Arg-Val- -Tyr-Ile-Hiis-iPlro-Y *w addycyjna sól r kwasem lub w kompleks.W zwiazkach o wzorze H-Arg -Ile-Hiis(E)nPro-Y-OG korzystnie A oznacza gru¬ pe nitrowa lub tosylowa, B grupe benzylowa lub podstawiona benzylowa, a E grupe dwuni- trofenyLowa. W zwiazkach wyjsciowych o wzo¬ rze W-X-M korzystnie W oznacza grupe benzy- lojfcsykainbonyilowa lub III-irzjbuto(ksyikaribonylowa, X rodnik, aminoksyacetylowy lub aminoksypro- pkmyilowy, a M piwaloiloksylowa, nitrofenoksy- lowa, 2,3,5-tirójchlort)fenokisylowa, piecdochlorofeno- ksylowa, pieciofluorofenoksylowa, N^sukcynimido- ksylowa lub azydowa. i m Stosowane jako materialy" wyjsciowe * w syn¬ tezie realktywne pochodne heptapeptydów o wzo¬ rze H-Arg(A)-Val-Tyr(B)-Il€-His(E)-Pro-Y^OGmo¬ zna otrzymywac jakimikolwiek sposobem znanym 5 w chemii peptydów. Odpowiedni sposób jest przed¬ stawiony, np. w wegierskim opisie patentowym nr 168 431. W sposobie tym grupy funkcyjne lan¬ cuchów bocznych sa ochraniane grupami trwa¬ lymi w warunkach hydrolizy kwasowej, odszcze- 10 piajacej grupy ochronne po reakcji jsprzegania.W korzystnym wariancie s,poisobu wedlug wy¬ nalazku do przejsciowej ochrony girupy karbo¬ ksylowej C^koncowego aminokwasu stosuje sie grupe p-nitrobenzylowa (NB), girupe hydroksy- 15 Iowa tyroizyny ocihramia isie grupa benzylowa (Bzl), pierscien iimidazolowy ihistydyny grupa dwunitro- fenylowa (iDnp), a grupe guanidynowa argininy gruipa tosylowa (Tos). Wszystkie te grupy och-' ranne isa trwale w srodowisku slabo kwasnym, 20 co umozliwia odiszczepiamie N-koncowej grupy Illrz.butoksyikaribonyllowej (Boc) bez ryzyka od- szczepienia tych grup. Odszczepienia grupy dwu- niitrofenylowej mozna dokonac w drodze tioli- zy, a pozostale grupy ochronne mozna odsacze- 25 pic za pomoca fluorowodoru.Zwiazki o wzorze X-Arg-Val-Tyr-Ide^His-Pro-Y mozna oczyszczac ogólnie znanymi sposobami,; ko¬ rzystnie w drodze chromatografiii jonowymien¬ nej na ikanbokisymetyiloicelulliozie. W tej techno- 3i logii zwiazki otrzymuje sie zwylkle w postaci liofilizowanych proszków, iktóre latwo mozna prze¬ prowadzic w rózne -sole lub kompleksy.Ainitagoniistyczna czynnosc zwiazków o wzorze X-Arg-Vad-Tyr-ille-HJisHPiro-Y badano na narkoty¬ zowanych samicach kotóiw. Cisnienie krwi mie¬ rzono w tetnicy szyjnej. Próby przeprowadzano przez wlew czynnika wywolujacego nadcisnienie „Hipertenisin" (CTBA) do bocznej zyly udowej, z szybkoscia 0,5 jug/lkg/min. Pb ustabilizowaniu wzrostu cisnienia krwi podawano fizjologiczne lub zawierajace nosnik roztwory badanych zwiaz¬ ków, w jednej dawce, dozylnie lub podskórnie, mierzac obnizenie cisnienia krwi. W podobny sposób podawano' Saralazyne. 45 IW tablicy przedstawiono spadek tetniczego cis¬ nienia krwi pod wplywem dozyllnego podania ba¬ danych zwiazków. Dla porównania stosowano Sa¬ ralazyne. Podane w italblitcy 1 dane uzyskano z M obliczenia sredniej wyników 6 prób. Margines bledu wslkazuije rozrzut wartosci podstawowej.Z danych przedstawionych w tablicy wynika, ze kazdy analog amgiotensyny U podstawiony w polozeniu 1 rodnikiem alifatycznego kwasu w a-aminokisykarbóksytlowego ma znaczna czynnosc obnizania cisnienia fcrwi. Czynnosc jest propor¬ cjonalna do uzytej dawiki.Przeprowadzono TÓwiniez próby z podawaniem podiskórnym. Nalezy zwrócic uwage, ze ta dro- 60 ga podawania angiotensyny II luib jej analogów nie byla dotyfoihczais publikowana w literaturze.Do podania podgórnego, fizjologiczny roztwór so¬ li, zawierajacy badany zwiazek* uzupelniano kar- bokisymetyilo-iceluiloza lub zelatyna. W tablicy 2 M przedstawiono dane obliczone jako srednie z 5111979 Tablica 1 Wiplyw róznych analogów amgiotensyny II poda¬ nych dozylnie na cisnienie ktrtwi, przy dozylnym Witowie amgiotemsyny II Analog (aminoksyacetylo1, Leu8)-ang II (D-a-aminoksypropio- nylo1, Leu8)-ang II (aminoksyacetyl©1,Ile,)- amg II ISaralazyna Obnizenie cisnienia krwi (mm H|g) (po po- damdu tiawflri dozylnej 10 pg/k!g M33±3,6 ^30±3,4 -^281)2,0 20 {*gfkg --4l2±t4,2 ^38±M -^40±5,7 10 15 doTy. Jezeli farmaceutyczne srodki sa formulo¬ wane jako rozcienczone lulb stezone zawiesiny lub emulsje, to zawieraja równiez rozne czyn¬ niki konserwujajce i utrwalajace.Farmaceutyczne srodki zawierajace zwiazki wy¬ twarzane sipobosem wedluig wynalazku moga byc stosowane do zróznicowanego wykrywania nad¬ cisnienia nerkowego oraz leczenia objawów wy¬ wolanych podwyzszonym nerkowym cisnieniem krwi.[Dalsze szczególy wynalazku sa zilustrowane w nastepujacych przykladach.Stosowane w opdisie przykladólw skróty odpo¬ wiadaja ogólnie stosowanym w literaturze (J.Biol. Chem. 247, 9712 (19712)). cE-amdnoksykwaisy sa oznaczane litera „O" umieszczona przed symbo¬ lem danego aminokwasu. Tak wiec np. OGly l Tablica 2 Wplyw róznych analogów amgiotensyny II podanych podskórnie na cisnienie krwi przy dozylnym wlewie amgiotensyttiy H Analog (amkioksyacatyio1, Iieu^-ang II (D-a-aminoksyipropao- nylo1,Deu8)-ang II Daw¬ ka 200 200 1200 '200 iDodaitek - do roztworu CIMC zelatyna CMC zelatyna Obnizenie cdlsffiienda (krwi (mm Hg) po 15 minutach ^H2I1±5,8 -H23±|2,0 wH21i+6,7 -H24±5,7 30 minutach -H26±7,2 —G|ldj2,2 ^2&+j5,7 -H21±I5,6 00 minutach —»13±9,4 ¦—Il0±2,8 —9+5,7 120 minutach —5±7^8 ^l±5yl —1+4,0 -^3±8,8 oddzielnych prób. Margines bledu odnosi sie do wartosci podstawowej.Z przedstawionych danytch wynika, ze przy po¬ daniu podskórnym zwiazki otrzymywane sposo¬ bem wed-luig wynalazku w iznadznym stopniu ob¬ nizaja celowo wywolane wysokie cisnienie krwi, nawet w 60 minut po podaniu..Wyltwarzane sposobem wedlug wynalazku pep- tydy oraz ich dopuszczalne w farmacji sole i kompleksy gicznych w postaci konwencjonalnych srodków farmaceutyiciznyoh. - Termin „dopuszczalne w far¬ macji kompleksy" oznacza kompleksy peptydów z pewnymi materialami, nip. organicznymi, opóz¬ niajacymi ich czynnosc. Typowymi przedstawi¬ cielami tych zwiaizków sa zdlatyna, kariboksy- metyloceluloza, estry 'kwasu alginowego, poliflu- oroetynofOisforany, polimery aminokwasów i in¬ ne polimery i 'kopolimery. Jako dopuszczalne w farmacji sole stosuje sie konwencjonalne, dopusz- czailne w fanmacji addycyjne sole z kwasami, np. z kwasem octowym.Farmaceutycizne /srodki zawieraja zwiazki wy¬ twarzane siposobem wedlug wynalazku w mie¬ szaninie z organicznymi lub nieorganicznymi nos¬ nikami, odpowiednimi do podawania dojelitowe-^ go lub (pozajelitowego. FteirmaceutyCane srodki mo¬ ga byc formulowane jako stale liofilizaty, w -których nosnikami moga byc rózne obojetne zwia¬ zki, nie reagujace z peptyidaimi, np. weglowo- 40 45 50 60 65 oznacza kwas aminoksyoctowy, OAla oznacza kwas a-aminoksyiprctionowy itp. Dalszymi skrótami sa przykladowo: PFP — rodnik piecioflluorofenylo- wy, Z — grupa kairbometoklsyiowa.Odparowanie dokonuje sie w wyparce obro¬ towej Rotavapor (firmy Buchi). Chromatografie cienkowarstwowa Iprzeprowadza sie na plytach z zelem krzemionkowym wedlug Staihla (E. Merck, Darmstadt). Chromatograimy rozwija sie w na¬ stepujacych ukladach: 1. octaon etylu: (20:6:11 mieszanina pirydyna/ /kwas octowy/woda) = 95:5 2. -octan etylu: (20:6:11 mieszanina pirydyna/ /kswas octowy/woda) = 90:10 3. octan etylu: (20:6:11 mieszanina pirydyna/ /ikwais octowy/woda) = 80:20 4. octan etylu: (20:6:11 mieszanina pirydyna/ /kwas octowy/woda = 70:30 5. mieszanina 4:1:5 n-butainol/kwas octowy/woda 6. mieszanina 30:6:20:24 n-butanol/kwas octowy/ /pirydyna/woda 7. mieszanina 1:1:1:1 n-ibuftanol/octan etylu/ /kwas octowy/woda Podajac w przykladach wartosc Rf iczyni sie odniesienie do numeru seryjnego ukladu 'rozpu¬ szczalników.Elektroforeze bibulowa przeprowadza sie w sred- nionapieciowym aparacie LMlM na bibule NM 214, w roztworze buforowym- o pH 1,9, wobec kwasu glutaminowego. 'Napiecie: 450 V, czas; 3 godziny,, '111 979 . Chromatograimy ciemkowaTistwowe wywoluje sie nimhydryna lub konwencjonalna technika chlo¬ rowania za pomoca roztworu o-toIidyinaHKJ.Produkt koncowy oczysacza sie jak opisano ponizej.Sole wolnych peptydów z fluorowodorem oczy¬ szcza sie na zywicy „Septtiacryl S-200 Superfine" (Pharmacia, Fine OhemiJcaJs, Uplptsala, Szwecja), technika ducji gradientowej, za pomoca 0,01 M (ipH = 4,5), a nastepnie 0,4 M tworu octanu aimomiu. Wyciek odbiera sie za pomoca automatycznego koileikitora frakcji i ana¬ lizuje za pomoca aparatu LKB Uvicord II (UKB, Uppsala, Szwecja).Frakcje glówna oczyfcocza sie dale) w naste¬ pujacy sposób: KoHunme o pojemnosci 0,5 litra wypelniona kaitodklsymetyilocelluloiza (GMC—82) równowazy sie z pierwtezyim iz wyzej podanych roztworów .buforowych. 0,5 g peptydu rozpusz¬ cza sie w 4 ml 0,01 M buforu octanu anionu.Otrzymany rortwór podaje sie na kolumny z karboksyimetyflioceluloiza.W [mieszalniku gradientowym miesza sie 1,5 li¬ tra 0,01 M buforu octanu amonu z 1,5 litra M M buforu octanu amonu i pinzetprowadiza gradien¬ towa eHucje (kolumny z szyfUkoscia 25 md na go¬ dzine, zbierajac fraktije 10 ml. Eluat analizuje sie w sposób ciajgly za poimoca aparatu LKB TJvicord II. Oczyszczony 'produkt koncowy uzy¬ skuje sie przefc liofilizacje fraWcJi glównej.Przyklad I. Wyftwaraanie (aminoofiasyacetyilo1, Iief)an EUp 1. Bc«-Arg(TV»)-Val^Tyr(Bifl)^Sle--His(Dnp)- -Pro-Ile-ONB 4,5 g <15 mmoli) Ile-ONB-HOl rozpuszcza sie w 50 ml chloroformu, a do roztworu dodaje 2,1*" ml trójetyloaminy i 3,81 g (10 mmoli) Boc- -Pro-OPFP. Mieszanine reakcyjna miesza sie w temperaturze pokojowej w ciagu 30 minut, a* nastepnie wytrzasa z woda i 10^/t wodnym roz¬ tworem kwasu cytrynowego. Po wysuszeniu i odparowaniu otrzymuje sie ochroniony peptyd (R1* — 0,8), który natychmiast rozpuszcza sie w 20 ml 8 M roztworu chlorowodoru w dioksa¬ nie.Roztwór pozostawia sie w ciagu 10 minut w spoczynku, rozciencza sudhym eterem i odparo- wuje. Otrzymany chlorowodorek wolnego dwu- peptydu (R*f = 0,44) rozpuszcza sie w .30 ml chloroformu, roztwór doprowadza sie trójetylo- amina do pH 8 i dodaje 8,8 g (16 mmoli) Boc- -His(Dmp)-OPPP. Po uplywie 1,5 godziny do roz¬ tworu dodaje sie 1,65 md N,N-dwumetyloamino- etyloamfeiy, a po 15 mimrtach wytrzasa miesza¬ nine Teakcyjna z 10*h wodnym roztworem kwa¬ su ^cytrynowego, 1 N "roztworem kwasu solnego, woda, a na koncu z 5% wodnym roztworem wo¬ doroweglanu sodu. Po wysuszeniu i odparowaniu ochroniony trójpeptyd (Rlt =* 0,50) rozpuszcza sie — bez wyodrebniania — w 20' ml 8 M roz¬ tworu kwasu solnego w dioksanie i dodaniem suchego eiteru wytraca wolny trójpejptyd (BS = 0,25). Otrzymany osad odsacza sie i przemywa 19 15 30 35 45 65 eterem, po czym natychmiast rozpuszcza w mie¬ szaninie 50 ml chloroformu i 20 ml dwwmetylo- formamidu. Trójatyloaimdna doprowadza sie roz¬ twór do pH 8 i dodaje 6,0 g (15 mmodii) Boc- -Ile-OPFP, Po 30 minutach rozpuszczalnik zastepuje sie octanem etylu i wstrzasa mieszanine ze 100% wodnym roztworem kwasu cytrynowego, 1 M wodnym roztworem kwasu solnego i woda. Wy¬ suszenie i odparowanie ongandoznego roztworu da¬ je ochroniony czteropaptyd (Rff = 0,65), który wyodrebnia sie za pomoca mieszaniny 1:0 eteru z n^heksanem. Z kolei rozpuszcza sie go w 25 ml 8 M roztworu kwasu solnego i po 30 minutach suchym eterem wytraca wolny tetrapeptyd (R4f = 0,41). Osad odsacza sie i przemywa eterem, po czym natychmiast rozpuszcza w mieszaninie 1:1 formamidu z chloroformem (70 ml). Trójetylloa- mina doprowadza sie roztwór do pH 8 i dodaje 6,0 g (11,5 mmoli) Boc-Tyir(Bzl)^OPFP. Roztwór pozostawia sie w ciagu 15 miinut w spoczyn¬ ku, po czym wymienia rozpuszczalnik na octan etylu. Podaje sie 0,66 ml NjN-dwumetyloamino- etyloamdny i po 15 minutach wytrzasav roztwór kolejno z 10*/t wodnym roztworem kwasu cy¬ trynowego, 1 M wodnym roztworem kwasu sol¬ nego i woda.Po wysuszeniu i odparowaniu otrzymanego pro¬ duktu otrzymuje sie ochroniony pentapeptyd (Rr* = 0,59), który wytraca sie eterem, odsacza i prze¬ mywa eterem. Z kolei rozpuszcza sie go w 20 ml 8 M roztworu (kwasu solnego w dioksanie i po¬ zostawia w spoczynku w ciagu 15 minut. Wol¬ ny pentapeptyd (R4f -= 0,4) wytraca sie suchym eterem, odsacza a przemywa eterem, po czym ^natychmiast rozpuszcza w 60 ml dwmmetylofor- mamidiu. Za pomoca trójetyloaminy doprowadza sie roztwór do pH 8 i dodaje 4,62 g (Ii2 mmoli) Boc-Val-OPFP. Po godzinie rozpuszczalnik wy¬ mienia sie na chloroform, a roztwór wytrzasa kolejno z 10Vt wodnym roztworem kwasu cy¬ trynowego, 1 M wodnym roztworem kwasu sol¬ nego i woda. Wysuszenie i odparowanie mie- szaoiny daje ochroniony szesciopeptyd (R*f = 0,56), który wytraca sie eterem i przemywa ete¬ rem. Produkt rozpuszcza sie w 20 ml 8 M roz¬ tworu kwasu solnego w dioksanie i suchym ete¬ rem wyjcaca wolny szesciopeptyd (R4f = 0,47).Osad odsacza sie i przemywa eterem, po czym natychmiast rozpuszcza w 50 ml dwumetylojfor- mamidu. Trójetyiloamina doprowadza sie roz¬ twór do pH 8, dodaje 7,2 g (12 mmoli) Boc- -Arig(Tos)-QPFP, miesza w ciagu godziny d wy¬ mienia rozpuszczalnik na chloroform. Otrzymany roztwór wytrzasa sie z 10*A wodnym roztworem kwasu cytrynowego, 1 N wodnym roztworem kwa¬ su solnego i woda. Po wysuszeniu i odparowa¬ niu, pozostalosc rozciera sie z eterem, otrzymu¬ jac 12,4 g odpowiedniego ochronionego siedmio- paptydu (80f/t wydajnosci teoretycznej). Tempe¬ ratura topndenia: 189 do 192°C, R*f = 0,55.Etap 2. Boc-OGly-Aire(Tos)-Val-Tyir-Jle-HisnPro- -Ile-OH 3,1 g <2 mmole) Boc-Arg dwumetyloformaimidu i dodaje 2,9 ma 2-merkap- toetamolu. "Po godizdnie peptyd wytraca sie su¬ chym eterem, odsacza, przemywa eterem i oczy¬ szcza przez rozpuszczenie w metanolu i wytra¬ cenie eterem. Otrzymuje sie 2,0 g (74*/t) Boc- -Arg(Tos)-Val-Tyir(Bzl)-ne-His-Pro-Ile-ONB(R*f = 0,1). Produkt rozpuszcza isie w 30 mil mieszaniny 5:1:1 metanolu, kwasu octowego i wody i do¬ daje 1,0 g 10*/o palladu na weglu. W ciagu ó godzin przepuszcza sie przez roztwór wodór, od¬ sacza katalizator, roztwór odparowuje, a pozo¬ stalosc (rozciera z eterem. Otrzymuje sie 1,22 g (75°/o) czesciowo ochronionego siedmiopeptydu o wzorze Boc-Arig(Tofi)-Val-Tyo:-Ile-HiSnPro-ire-OH, R8f = 0,8. * 0,6 ^g (0,5 mmoila) otrzymanego produktu roz¬ puszcza sie w 5 ml 8 M roztworu kwasu solne¬ go w dioksanie, a po 20 minutach mieszanina odsacza wolny siedmiopeptyd (R4f = 0,1) i prze¬ mywa eterem, po czym natychmiast rozpusz¬ cza w 15 ml dwumetylofoimamidu. Trójetylo- amina doprowadza sie roztwór-do pH 8 i do¬ daje 0,45 g (1,2 mmola) Boc-OGay-OPFP. Po 30 minutach odparowuje sie mieszanine reakcyjna, pozostalosc rozpuszcza w 30 ml mieszaniny 3:1 chloroformu z dwumetyiloforimamidem, a roztwór wytrzasa kolejno z 10f/t wodnym roztworem kwa¬ su cytrynowego i woda. Ekstrakt suszy sie i od¬ parowuje, a pozostalosc rozciera z octanem^ ety- Ju. Po odsaczeniu i przemyciu eterem otrzymu¬ je sie 0,46 g <72M) Boc-OGly-Arg(Tos)-Val-Ile- -His-Pro-Ile-OH. R»f = 0,23, R4f = 0,40.Etap 3. Odszczepianie grup ochronnych- 0,46 g (0,35 mmotla) Boc-Ar©fros)-Val-Tyir-I'le- -HisnPro-Ile-OH rozpuszcza sie w 2 ml ciekle¬ go fluorowodoru i dodaje 0,5 ml tioanizolu. Roz¬ twór utorzymuje sie w ciagu godziny w 0°C, wy¬ traca peptyd eterem i przemywa eterem. Otrzy¬ muje sie 0,35 g (100*/o) produktu. Otrzymany flu- orowodorek oczyszcza sie jak wyzej opisano. O- trzymana (aminooksyacetyilo^Ile8) an^giotensyna II ma nastepujace wlasciwosci: R5f = 0,26, Rff = 0,56, R7f = 0,57, EGiu = 1,00.Sklad amrinokwasowy: Pro: 1,02 (1), Val: 1,0 (1), Ile: 1,93 (2), Tyr: 0,65 (1), His: 1,0 (1), Arg: 1,03(1).Przyklad II. Wytwarzanie (L-«-aminooksy- propionyilo1,Ilea) angiotensyny II Etap 1. Boc-OAla-Airg(To(s)-Val-T?yir-Ile-His-Plro- -Ile-OH 0,6 g (0,5 mmola) Boc-Arg -Pro-Ile-OH (otrzymanej w etapie 2 z przykla¬ du I)- rozpuszcza sie w 5 md 0,8 M roztworu kwasu solnego w dioksanie. Roztwór podsta¬ wia sie w ciagu 20 minut w spoczynku i su¬ chym eterem wytraca wolny siedmiopeptyd (R4* = 0,1), odtsacza i przemywa eterem, pe czym na- tychmdaisit rozpuszcza w 20 ml dwumetylofanma- midu. Tirójetyloamiaia doprowadza sie roztwór do pHBi dodaje 0,7 g (1,0 mmola) Boc-OAla-OPFP.Po 30 minutach roztwór odparowuje sie, a po¬ zostalosc rozpuszcza w 30 ml mieszaniny 3:1 chloroformu z dwumetylloformamidem. Roztwór [979 wytrzasa sie z 10°/t wodnym roztworem kwa¬ su cytrynowego i woda. Po wysuszeniu i od¬ parowaniu pozostalosc rozciera sie z octanem etylu, odsacza i przemywa, otrzymujac 0,55 g 5 (84M) zwiazku tytulowego. R4f = 0,43, R5f = 0,80.Etap 2. Odszczepiende grup ochronnych 0,52 g (0,42 mmole) Boc-OAJa-Argi(Tois)-Val-Tyr- -Ile-His-Pro-Ile-OH rozpuszcza sie w <2. ml cie¬ klego fluorowodoru i dodaje 0,55 mlv tioanizolu.Roztwór utrzymuje sie w ciagu godziny w 0°C, produkt wytraca suchym eterem, odisaaza i prze¬ mywa eterem. Otrzymuje sie 0,41 g (OAla^Ite1) 15 angiotensyny II. Po oczyszczeniu jak wyzej opi¬ sano, otrzymuje sie produkt o nastepujacych wla¬ sciwosciach: R5f = 0,32, Rff = 0,58, R7f = 0,59, EGiu = 1,0.Sklad aminpkwaisowy: Pro: 1,0 (1), Val: 1,1 . ,o(l), Ile: 2,02 (2), Hdis: 0,9 (1), Tyr: 0,95 (1), Arg: 1,05 (1).Przyklad III. Wytwarzanie (aminoksyacety- lo1,Leu,)ansiotensyny II Etap' 1. Boc-Ang 25 -Pro-Leu-ONB 4,2 g (12 mmoli) Leu-ONB •"' HBr rozpuszcza sie w 50 md chloroformu, a do roztworu do¬ daje 1,68 ml trójetyiloamkiy i 3,81 g (10 mmoli) Boc^Pro-OPFP. Roztwór miesza sie w tempera¬ turze pokojowej w ciagu 20 minut, a nastepnie ' wytrzasa z 10f/t wodnym roztworem kwasu cy¬ trynowego i woda.Ochroniony dwupeptyd (R*f = 0,8) otrzymany M po wysuszeniu i odparowaniu roztworu .rozpu¬ szcza sie w 20 ml 8 M troa&wuru Jowasu solnego w dioksanie, a po 10 minutach roztwór rozciencza sie suchym eterem i odparowuje. Wolny dwu- ^peptyd (R4f = 0,56) rozpuszcza sie w 50 mi ctolo- ^ roformu, bez wyotfrejbiniania, trójetyloamina do¬ prowadza roztwór do pH 8 i dodaje 8,6 g (15 mmoli) Boc-His(Dn(p)-OPFP. Po 30 mkiutadh do (roztworu dodaje sie il,65 mil N,N-dwumetyloami- noetyloammy i pozostawia go w ciagu' 10 minut 45 w spoczynku. Nastepnie wytrzasa sie go z 10*/t wodnym roztworem kwasu cytrynowego, 1 N wod¬ nym roztworem kwasu solnego, wodnym roztwo¬ rem wodoroweglanu sodu i woda. Ekstrakt su¬ szy sie i odparowuje, a otrzymany ochroniony m trójpepftyd KJRh = 0,65) rozpuszcza w 25 ml 8 M roztworu kwasu solnego w dioksanie, bez wy¬ odrebniania.Wodny trójpepltyid wytraca sie suchym eterenr (R4f = 0,47) odsacza i przemywa, po czym na- w tychmdast rozpuszcza w mieszaninie 50 ml chlo¬ roformu i 80 ml dwumetyitafaimamftdu. Trójety¬ loamina doprowadza sie roztwór do pH 8 i do¬ daje. 6,0 g (15, mmoli) Boc-ne-OPFP. Po 30 mi¬ nutach roopuseczaTndk zastepuje sie octanem ety- •• lu i wyitrzasa roztwór z Uff/% wodnym roztworem kwasu cytrynowego i woda. Po wysuszeniu i od¬ parowaniu, ochroniony czteropeptyd wyodrebnia sie za pomoca mieszaniny 7:3 n-hek- sanu z eterem. Z koflei irozpusftcza, sie go w 25 mi * 8M roztworu kwasu solnego w dioksanie i po 1511 111 979 12 minutach wytraca wolny czteroipeptyd (Rf4 = 0,65) za pomoca suchego eteru, odsacza i przemywa ete¬ rem. Natychmiast rozpuszcza sie go w 50 ml mie¬ szaniny 1 :1 chloroformu z dwuimetyloiforimaimiidem, trójetyloamina doprowadza roztwór do pH 8 i do¬ daje 6,0 g Ulfi. mmoli) Boc-Tyr^OPEFP.(Po 15 mi¬ nutach rozpuszczalnik wymienia sie na odtan ety¬ lu, dodaje 0,66 ml N,NHdwumetyloetyiloaiminy i po¬ zostawia roztwór w spoczynku w ciagu 15 minut.Z kolei wytrzasa sie go z lO°/o wodinyan [roztworem kwasu cytrynowego, IN- wodnym roztworem kwa¬ su solnego i woda; Po wysuszeniu i odparowaniu, ochroniony pie- ciopeptyd (Rf* = 0,8) wyodrebnia sie eterem. O- trzymany produkt (Rf4 = 0,8) rozpuszcza sie w 20 ml 8 M roztworu kwaisu solnego w dioksanie, wytraca suchym eterem, odsacza i przemywa ete¬ rem., Natychmiast rozpuszcza sie go w 50 ml dwunne- tyloformamidu, a roztwór trójetyloamina dopro¬ wadza sie do pH 8, po czyim dodaje 3,85 • g (10 mmoli) Boc-Val-OPFP. Po godiziniie rozpuszczalnik zastepuje sie chloroformem, wytrzasa w konwen¬ cjonalny sposób i. za pomoca eteru wyodrebnia ochroniony szesciopeptyd (Rf2 = 0,82).- Z kolei roz¬ puszcza sie peptyd w 20 ml 8 M roztworu kwasu solnego w dioksanie i po 15 minuitach za pomoca suchego eteru wyodrebnia wolny szesciopeptyd (Rf8 = 0,55), który natychmiast rozpuszcza sie w 40 ml dwaimleftyloiormaimadu. Trójetyloamina do¬ prowadza sie roztwór do pH 8 i dodaje 6,0 g (10 mmoli) Boc-Arg(Tos)-OPEP.Po 30 minutach rozpuszczalnik zastepuje sie chloroformem, a'roztwór wytrzasa z 1 N wodnym roztworem kwasu solnego i z woda. Ekstrakt su¬ szy sie i odparowuje, otrzymujac ochroniony sie- dmiopeptyd (Rf2 = 0,62), który wyodrebnia sie za pomoca etanolu. Wydajno.sc: 7,5 g (50*/t w sto¬ sunku do wyjsciowego peptydu Boc-Pro-OPFP).Temperatura toipnienia: 18(f do 190°C.Etap 2. Boc-OGly-Ang(Tos)-Val-Tyir(BZl)-Ile-His- -Pro-Leu-OH 3,45 g (2,28 mmola) Boc-Arg(Tos)-Vail-Tyr(Bzl)- -Iie-His{Dnp)-ProHLeu^GNB rozpuszcza sie w 10 ml diwumetyfloformamiidiu, dodaje 6,6 mil 2-mer- kaptoetanolai i po 2 godzinach -stania suchym eterem wytraca czesciowo ochroniony siedmio- peptyd. iFrodukt oczyszcza sie wytraceniem me¬ tanol/eter. Otanzymiuge sie 2,9 g (93Vo) Boc-Arg (Tos)-Val-Tyr = 0,12, Rf2 = 0,26. Produkt rozpuszcza sie w 40 ml mieszaniny 5:1:1 metanolu, kwasu octowego i wódy, dodaje 1,0 g KP/t {palladu na weglu i w ciagu 6 godzin przepuszcza przez mieszanine wo¬ dór. Katalizator odsacza sie, a roztwór odparo¬ wuje.Pozostalosc rozciera sie z eterem, otrzymujac 2,5 g <88Vt) produktu. Rf* = 0,75, Rf* = 0#). 1,1 g (1 mmol) Boc-Arg -Rro-Leu-OH rozpuszcza sie w 10 ml 8 M roztwo¬ ru kwasu solnego w dioksanie. Po 30 minutach wolny siedmiopeptyd (Rf4 =. 0,08) wytraca sie su-* cnym eterem, odsacza i przemywa eterem, po czym natychmiast rozpuszcza w 10 ml dwumetyló- formamidu, trójetyloamina doprowadza roztwór do pH 8 i dodaje 0,54 g (1,5 mmola) Boc-OGly- -OPFP. Po 30 (minutach roztwór rozciencza sie 39 ml chloroformu i wytrzasa z woda. Ekstrakt su¬ szy sie i odparowuje, a pozostalosc rozciera z oc¬ tanem etylu, odsacza i przemywa octanem etylu.Otrzymuje sie 1,05 g (86^/a) Boc-OGly-Arg{Tos)- -Val-Tyr-Ile-His-Pro-LeuX)H." Rf2 - 0,23, Rf* = = 0,40. 10 Etap 3. Odszczepienie grup ochronnych 0,9 g (0,73 mmola) Boc-OGly-Arg -Ile-His-Pro-Leu^OH rozpuszcza sie w 5 md cie¬ klego fluorowodoru i dodaje 1,5 ml tioanizolu.Mieszanine reakcyjna utrzymuje sie w ciagu 1,5 godziny w 0°C po czym zadaje suchym eterem, a wytracony peptyd odsacza i przemywa eterem.Otrzymuje sie 0,5*5 g (00°/o) syny II, która oczyszcza sie w wyzej opisany spo¬ sób. Rf5 = 0,33, Rf« = 0,60, R7f = 0,55, EGiu = m = 1,18.Sklad aminokwasowy: Pro: 1,0 (1), Val: 1,0 (1), Ile 1,0 (1), Leu 1,1 (1), His: 0,95 (1), Arg: 1,0 (1), Tyr: 0,7 (1).Przyklad IV. Wytwarzanie (D-«^umiirjoksy- 85 ;propionylo1,Leu8)angiotensynyII .Etap 1. Boc-D-OAla-ArgKTos)-Val-Tyir-Ile-His- ^Pro-Leu-OH 1,1 _g (1 mimol) Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His- -Pro-Leu-OH rozpuszcza sie w 10 ml 8 M roztwo- 30 ru kwasu solnego w dioksanie. Po 30 minuitach suchym eterem wytraca sie woflny sietimiopeptyd, odsacza i prziemywa eterem, po czym natychmiast rozpuszcza w 10 .ml dwumetyloformamodu. Trój¬ etyloamina doprowadza sie roztwór do pH 8 i do- 35 daje 0,56 g (1,5 mmola) Boc-D^OAlUHaPFP. Po 30 minutach roztwór rozciencza sie chloroformem i wytrzasa z woda. Po wysinszeniu i odparowaniu, pozostalosc rozciera sie z octanem etylu, odsacza i przemywa octanem etylu. Otrzymuje sie 0,95 g 40 (77%) Boc-D-OAla-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His-Pro- -Leu-OH Rf4 = 0,29.. Etap 2. Odszczepienie grup ochronnych- 0,95 g (0,71 mmola) Boc^D^OAla-Arg(Tos)-Val- -Tyr-Ile-His-Pro-Lieu-OH rozpuszcza sie w 4 ml cieklego fluorowodoru i dodaje 1,2 ml tioanizolu.Roztwór utrzymuje sie w 0°C, substancje wytraca suchym eterem, odsacza i przemywa eterem. O- trzymuje sie 0,6 g (9KM) iCD^OAla1, Deu8) angioten- syny II, która mozna oczyscic w konwencjonalny 50 Rf5 = 0,33, Rf« = 0,61, Rf7 = 0,56, RGiu = 1,10. sposób.Sklad aminokwasowy: Pro: 1,02 (1), Val: 1,0 (1), Leu: 1,02 (1), Ile: 1,03 (1), His: 1,011 (1), Arg: 0,92 (1), Hyr: 0,8 (1). 55 Zastrzezenia patentowe 1. S|posób wytwarzania nowych peptydów o wzo¬ rze X-Arg-Vail-Tyr-Ile-Hiis-Fro-Y, w którym X o- 60 znacza rodnik alifatycznego kwasu a-aminoksykar- boksylowego, a Y oznacza irodnik alifatycznego kwasu «-a»minokanboiksyilowego oraz addycyjnych soli z kwasami i kompleksów tych zwiazków, zna¬ mienny tym, ze na reaktywna pochodna siedmio- «• peptydu o wzorze H-Ang(A)-Val-Tyir -Pro-Y-ÓG, w którym A oznacza grugpe odjpowied- nia do przejsciowej ochrony grupy guanidynowiej argkiiny, B oznacza grupe odpowiednia do przej¬ sciowej ochrony aromatycznej grupy hydroksylo¬ wej tyroniny, E oznacza grupe odpowiednia do przejsciowej ochrony imidazolowej grupy hiisity- dyny, G oznacza atom wodoru lub grupe odpo¬ wiednia do ochrony grupy karboksylowej C-(kon- cowego alifatycznego aminokwasu, (trwala w srodo¬ wisku slabo kwasnym, a odszczepiajaea sie w sro¬ dowisku mocnego kwasu lub zasady, a Y ma wy¬ zej podane znaczenie, dziala sie reaktywna po¬ chodna kwasu aminaksyikarboksylowego o wzo¬ rze W-X-M, w którym X ima wyzej podane zna¬ czenie, W oznacza grupe ochronna, odszczepialna w warunikach hydrolizy kwasowej, a M oznacza grupe hydroksylowa lub ogólnie znana grupe ak- 14. tywujaca, odszczepia grupy ochronne z otrzyma¬ nych zwiazków o wzorze W-X-Arg(A)-Val-Tyr(B)- -Ile-His(E)^Pro-Y-OG, w którym W, X, Y, A, B, E i G maja wyzej podane znaczenie, wybiórczo, 5 jedna po drugiej lub równoczesnie w jednej ope¬ racji i, jezeli to jest pozadane, przeprowadza sie otrzymany zwiazek o wzorze X-Arg-Val-Tyir-Ile- HisnPro-Y w addycyjna ,sól z kwasem lub w kom¬ pleks. 10 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako siedimioipeptyd stosuje sie zwiazek o ogólnym wzorze H-Arg(A)-Val-Tyji(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG, w którym Y oznacza grupe leucylowa, izoleucylo- * wa, alanyilowa lub treonyilowa, a jako pochodna 15 kwasu amindksykarboiksylowago o wzorze W-X^M zwiazek, w którym X oiznacza grupe aminoiksyac ?- tylowa lub a-aminoksypropionylowa. * PL PL PL PL