HU177133B

HU177133B - Process for preparing angiotensin ii analogues containing alpha- amino-oxy-acid in position 1 with angiotensin ii antagonist activity

Info

Publication number: HU177133B
Application number: HU77RI640A
Authority: HU
Inventors: Gyorgyne Nyeki; Lajos Kisfaludy; Laszlone Szirmai; Egon Karpati; Katalin Gidai; Laszlo Szporny
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1977-07-18
Filing date: 1977-07-18
Publication date: 1981-07-28
Also published as: BE869077A; IL55121A0; CS201014B2; PL111979B1; DK319478A; CA1108124A; PL208496A1; YU171378A; YU41431B; SE7807823L; SU845773A3; GB2001653B; AU3800878A; DE2831534C2; IN149489B; NO148031B; DE2831534A1; AT361143B; ES471793A1; FI64140B

Description

Eljárás 1-es helyzetben α-aminooxisavat tartalmazó, angiotenzin-II-antagonista hatású angiotenzin-Π analógok előállítására

A találmány tárgyát az

X—Arg—Val—Tyr—Ile—His—Pro—Y

I általános képletű angiotenzin-II-antagonista hatású új peptidek, azok előállítási eljárása, valamint az azokat tartalmazó gyógyászati készítmények képezik, ahol a képletben

X valamely α-helyzetben aminooxicsoportot tartalmazó 1—5 szénatomos alkánkarbonsav gyökét, előnyösen aminooxiacetil- vagy a-aminooxipropionil-csoportot és

Y L-leucil- vagy L-izoleucil-csoportot jelent.

A találmány oltalmi körébe tartozik a fenti peptideknek savakkal képezett addíciós sóinak az előállítása is.

Az angiotenzin-II vémyomásemelő hatású oktapeptid, amely a szervezetben oly módon keletkezik, hogy a máj által termelt α-globulinból a veséből felszabaduló enzim, a renin egy angíotenzin-I-nek nevezett dekapeptidet állít elő, és ez a szervezetben angiotenzin-II-vé alakul.

1970-ben írták le az első angiotenzin-II analógot, mely mind in vivő, mind in vitro körülmények között az angiotenzin-II specifikus kompetitív inhibitoraként viselkedett [G. R. Marshall és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sd. USA 67, 1624 (1970), P. A. Khairralah és munkatársai: J. Med.

Chem. 13, 181 (1970)] Ez a megfigyelés széles körű érdeklődést váltott ki és számos kutató-helyet ösztönzött olyan új antagonista hatású angiotenzin-II analógok szintézisére és vizsgálatára, amelyek 5 alkalmasak renin-függő hipertenziók diagnosztizálására és esetleges terápiás kezelésére. Mindjárt a kutatás kezdetén kiderült, hogy erre a célra azok az analógok felelnek meg legjobban, amelyekben a 8-as helyzetű Ph-t valamilyen alifás oldalláncú aminosawal helyettesítik az angiotenzin-II molekulában. Ez ugyanis az agonista hatás gyakorlati megszűntét jelenti jelentős antagonista hatás mellett [D. Gagnon és munkatársai: Br. J. Pharmacol. 43, 409 (1971), D. T. Pals és munkatársai: Circ. Rés., 29, 664 (1971)]. Az antagonista hatás nagymértékben fokozható, ha a 8-as pozíció fenti módosításai mellett az 1-es helyzetű Asp helyett Sar-t építenek a molekulába [D. T. Pals és munkatársai: Circ. Rés. 29, 673. (1971)]. Az így előállított (Sár¹, Ala^s)-angiotenzin-II analóg a későbbiek során Saralasin néven forgalomba is került. Előnyös tulajdonságait az in vivő bekövetkező enzimatíkus lebomlás csökkenésével és a receptor sejtekhez való nagy affinitásával magyarázzák.

Az elvégzett klinikai vizsgálatok [H. R. Brunner és munkatársai: Láncét 1045 (1973), A. J. M.

Donker és munkatársai: Láncét 1535 (1974), T.

Ogihara és munkatársai: Láncét, 219 (1974), J. H.

Laragh és munkatársai: New Engk^z J. Med. 292,

695 (1975), W. A. Pettinger ésmunkatársai: New

Engl. J. Med. 292, 1214 (1975), D. Η. B. Streeten és munkatársai: Circ. rés. 36 Suppl. 1. 125 (1975), H. R. Brunner és H. Gavras: Schweiz. Med. Wschr. 106, 1791 (1976)] igazolták a kutatás kezdeti feltételezését, miszerint az angiotenzin-II 5 antagonista hatású analógjai alkalmasak lesznek a renin-függő hipertenziók diagnosztizálásában és esetenként kezelésében [D. Ganton és F. Gross: Med. Kiin. 71, 2043 (1976), J. L. Marx: Science 194, 821 (1976), P. Needelman és GR. Marshall: 10 Fed. Proc. 35, 2486 (1976)].

Az eddig előállított angiotenzin-Π analógok szerkezetének és biológiai hatásának összevetése számos fontos információt szolgáltatott az agonista-antagonista hatás értelmezésében [M. C. Khosla és 15 munkatársai: „Handbook of Experimental Pharmacology” Vol. 37, I. H. Page és F. M. Bumpus es. 1974, G. R. Marshal: Fed. proc. 35, 2494 (1976)].

A jelenlegi kutatások homlokterében elsősorban a mellékhatásmentes, hosszabb biológiai felezési 20 idővel bíró antagonisták előállítása áll [M. C. Khosla és munkatáisai: J. Med. Chem. 19, 244 (1976), ibid. 20, 253 (1977)].

Azt találtuk, hogyha az angiotenzin-II molekulájában a 8-as helyzetű fenilalanint valamely alifás 25 α-aminokarbonsav gyökével helyettesítjük miközben az 1 -helyzetbe valamely α-helyzetben aminooxicsoportot tartalmazó karbonsav gyökét építjük be, olyan angiotenzin-II kompetitív inhibitorokhoz jutunk, amelyek az angiotenzin-II-vel kiváltott hiper- 30 tenziót in vivő jelentős mértékben csökkentik és ezt a hatást szubkutan adásmód mellett is mutatják.

A találmány értelmében úgy állítjuk elő az

X—Arg—Val—Tyr—He—His—Pro—Y I

I általános képletű vegyületeket, amely képletben X és Y jelentése a fenti, hogy valamely

H-Arg(A)-Val-Tyr(B)-Ile—His(E)-Pro—Y-OG II

II általános képletű reakcióképes heptapeptid-származékot, ahol

A jelentése az Arg guanidinocsoportjának átmeneti megvédésére alkalmas, előnyösen nitro-, vagy tozilcsoport

B jelentése a Tyr aromás hidroxilcsoportjának átmeneti megvédésére alkalmas csoport, előnyösen benzil- vagy szubsztituált benzilcsoport,

E jelentése a His imidazolcsoportjának átmeneti megvédésére alkalmas csoport, így például dinitrofenil-csoport,

G a C-terminális alifás aminosav kaiboxilcsoportjának védésére szolgáló olyan csoportot jelent, amely enyhe savas behatásoknak ellenáll, de katalitikus hidrogenolízissel vagy erősebb sav vagy lúg (vizes ásványi sav, illetőleg vizes alkoholos alkálifém-hidroxid-oldat) hatására eltávolítható, valamely

Z-X-M ΙΠ

III általános képletű reakcióképes származékkal reagáltatjuk, ahol

Z jelentése valamely acidolízissel vagy katalitikus hidrogenolizissel eltávolítható csoport, így például benziloxikarbonil, vagy t-butiloxikarbonil-csoport,

X a fenti jelentésű és

M jelentése hidroxilcsoport vagy valamely aktiváló csoport, előnyösen pivaloiloxi-, nitrofenoxi-, 2,3,5-triklórfenoxi-, pentaklórfenoxi-, pentafluorfenoxi·, N-szukcinimidoxi- vagy azidcsoport és a kapott

Z-X-Arg(A)—Val—Tyr(B)-Ue—His(E)—Pro-Y-OG

IV

IV általános képletű vegyület védő cső portjait szelektíven vagy egyszerre eltávolítjuk és kívánt esetben az I általános képletű vegyületet savaddíciós sójává alakítjuk.

A szintézishez felhasznált II általános* képletű reakcióképes heptapeptid-származékokat bármely, peptidkémiában használatos módszerrel előállíthatjuk, így például a 168 431 számú magyar szabadalmi leírásban ismertetett eljárás alkalmazásával. Az eljárásban az oldalfunkciós csoportok védésére olyan védőcsoportokat kell használni, amelyek a kapcsolás utáni védőcsoport eltávolításakor alkalmazott acidolízis körülményei közt stabilak.

A találmány szerinti eljárás egyik előnyös kiviteli módja szerint a C-terminális aminosav karboxilcsoportjának átmeneti védésére a p-nitrobenzilcsoportot (NB), a tirozin hidroxilcsoportjának védésére a benzilcsoportot használjuk, a hisztidin imidazol-gyűrűjét dinitrofenilcsoporttal és az arginin guanidinocsoportját tozilcsoporttal védjük. Ezek a védőcsoportok enyhe savakkal szemben stabilak, így a Boc-védőcsoport ezek károsodása nélkül eltávolítható. A dinitrofenilcsoport (Dnp) tiolízissel, míg a többi részben katalitikus hidrogenolizissel, részben cseppfolyós hidrogénfluoriddal távolítható el.

Az I általános képletű vegyületeket önmagában ismert módon, célszerűen kaboximetilcellulózos inocserélő krortiatográfiával tisztítjuk. Ennek során a vegyületeket többnyire liofilezett porok alakjában kapjuk, amelyek alkalmasak különböző sók, illetve komplexek képzésére.

Az l áltálános képletű vegyületek angiotenzin-II-antagonista hatását altatott hímnemű macskákon vizsgáltuk. A vérnyomás mérését a nyaki verőéren keresztül végeztük. A vizsgálatok úgy történtek, hogy az egyik oldali combvénába Hypertensi (CIBA) infúziót adtunk 0,5 /rg/kg/perc sebességgel. Miután a vémyomásemelkedés stabilizálódott, a kísérleti anyagokat egyszeri dózisban intravénásán vagy szubkutan adtuk vizes fiziológiás, illetve vivőanyagot tartalmazó oldatban és mértük a vérnyomás csökkenést.

Az 1. táblázat az intravénás adagolás hatására bekövetkező artériás vérnyomás csökkenést mutatja. A táblázat adatai közé felvettük a Saralasin hasonló körülmények közt mért hatását is. Az adatok 6 kísérlet átlagát és a középérték szórását mutatják.

1> Táblázat

Az 1-es helyzetben α-aminooxisavakat tartalmazó angiotenzin-II analógok hatása a vérnyomásra (Hgmm), angiotenzin-II infúzió alatt

Analógok	V érnyomáscsökkenés (Hgmm) 10 Mg/kg 20 Mg/kg ív. i.v. beadásakor
(Aminooxiacetil¹, Leu⁸ )-Ang-II	-33 + 3,6 -42 ±4,2
(D-a-aminooxipropionil¹, Leu⁸)-Ang-II	-30 ±3,4 -38 ±3,8
(Aminooxiacetil¹, Ile⁸)-Ang-II	-28 ±2,0 -40 ±5,7
Saralasin	-41 ±2,5

A táblázat adataiból látható, hogy valamennyi 1-helyzetben α-helyzetű aminooxicsoportot tartalmazó alifás karbonsavgyökkel helyettesített angiotenzin-II analóg jelentős vérnyomáscsökkentő hatás5 sál bír. A hatás nagysága a dózissal arányosan változik.

Vizsgálatainkat kiterjesztettük az irodalomban nem alkalmazott szubkutan felhasználási módra is. 0 Ez esetben a vizsgálandó anyagot tartalmazó fiziológiás konyhasó oldathoz még karboximetilcellulózt (CMC), illetve zselatint is tettünk. Az eredmények, amelyek 5-5 állaton végzett kísérletek átlagait és a középérték szórását mutatják, a 2. táblázatban 5 láthatók.

2. Táblázat

Az 1-helyzetben α-aminooxisavat tartalmazó angiotenzin-Π analógok hatása a vérnyomásra angiotenzin-II infúzió alatt s. c. adagolással

Vérnyomáscsökkenés (Hgmm)

Analógok	Dózis	Oldószer fiz. só +	15	30 perc	60 múlva	120
(Aminooxiacetil¹,
Leu⁸)-Ang-II	200	CMC	-21 ±5,8	-26 ±7,2	-13 ±9,4	-5 ±7,8
	200	zselatin	-23 ±2,0	-21 ± 2,2	-10 ±2,8	-1 ±5,1
(D-a-aminooxipropionil¹,
Leu⁸ )-Ang-II.	200	CMC	-21 ±6,7	-24 ±5,7	—16 ± 5,1	-1 ±4,0
	200	zselatin	-24 ±5,7	-21 ±5,6	—9 + 5,7	-3 ± 8,8

A táblázat adatai szerint új vegyületeink szubkutan alkalmazás mellett még 60 perc múlva is szignifikánsan csökkentik a kísérletesen előidézett magas vérnyomást.

A találmány szerinti peptideket, valamint azok sóit a szokásos gyógyszerkészítmények formájában használhatjuk fel a gyógyászatban. Az ilyen gyógyszerkészítmények a találmány szerinti vegyületeket enterális vagy parenterális beadásra alkalmas szervetlen vagy szerves vivőanyag kíséretében tartalmazzák. így a gyógyszerkészítmények lehetnek szilárd liofilizátumok, ekkor vivőanyagként peptidekkel nem reagáló vegyületek például szénhidrátok jöhetnek számításba, lehetnek híg vagy tömény szuszpenziók és emulziók, amelyek különböző tartósító és stabilizáló segédanyagokat is tartalmaznak.

A gyógyszerkészítmények felhasználhatók diagnosztikumként a renális eredetű hipertenziók differenciált megkülönböztetésére, továbbá a terápiásán is minden olyan szindrómánál, ahol a kóroki szerepet az emelt renin vérszint játssza.

A találmány szerinti eljárás foganatosítási módjait az alábbi példák szemléltetik.

A példákban alkalmazott rövidítések a szakirodalomban használt rövidítéseknek felelnek meg [J. Bil. Chem. 247, 977 (1972)]. Az a-aminooxisavak ból származó csoportok rövidítésére a megfelelő 40 aminosav szimbólum elé tett O-betűt használjuk.

így: OGly = aminooxiecetsav, OAla = a-aminooxipropionsav stb. További rövidítés: PFP = pentafluorfenil.

A vegyületek előállítása során a bepárlásokat 45 mindig Büchi-tele Rotavapor készülékben végeztük. Az olvadáspont meghatározások dr. Tottoli-féle (Büchi) készülékben történtek. A vékoriyréteg-kromatogramokat Stahl szerint készített Kieselgel G márkanevű szilikagél rétegen készítettük. A kroma50 togramok kifejlesztésére a következő oldószerelegyeket használtuk:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

etilacetát: (piridin —ecetsav—víz etilacetát: (piridin —ecetsav-víz etilacetát: (piridin—ecetsav—víz etilacetát: (piridin— —ecetsav—víz n-butanol: ecetsav : ví n-butanol: ecetsav :

= 20-6-11) = 95 :5 = 20-6-11) = 90 : 10 = 20-6-11) = 80:20 = 20-6-11) = 70 : 30 = 4:1:5 : piridin : víz = 30 : 6 :20 : 24 n-butanol: etilacetát :

: ecetsav : víz =1:1:1:1

A vékonyrétegkromatogramok előhívására egyrészt ninhidrin-oldatot használtunk, másrészt a szokásos klórozás után o-tolidin-kálium-jodid-oldattal hívtuk elő.

A papírelektroforetikus vizsgálatok EMIM középfeszültségű horizontális készülékben (a Labor Műszeripari Művek, Budapest, gyártmánya) történtek MN 214 papíron (Machery-Nagel Co., NSzK), pH = 1,9-es pufferben Glu mellett. A feszültség 450 V, az idő 3 óra volt.

A végtermékek tisztítása a következő általános módszer szerint történt: a szabad peptidek hidrogénfluoridos sóit először Sephacryl S-200 Superfine gyantán (a Pharmacia Fine Chemicals AB svédországi cég gyártmánya) gradiens elúcióval tisztítottuk 0,01 mól( pH = 4,5) és 0,4 mól (pH = 6,7) ammóniumacetát-oldatok segítségével. Az eluátum regisztrálását LKB Uvicord—II készüléken (az LKB—Produkier AB svédországi cég gyártmánya) automata frakciószedő segítségével végeztük. A főfrakció további tisztítása karboximetilcellulózon (CMC) a következőképpen történt: 0,5 liter CMC-t (CMC—52) az induló pufferrel oszlopon egyensúlyba hozíunk, majd az oszlopra 0,5 g 4 ml 0,01 mólos ammóniumacetátban oldott pepiidet rétegeztünk és megkezdtük a gradiens elúcióí a fenti puffer-keverékkel. Az áramlási sebesség 25 ml/óra volt és 10 ml-es frakciókat szedtünk, amelyeket LKB Uvicord-II készüléxen regisztráltunk. A kívánt terméket tartalmazó frakciót liofílizálva jutottunk a homogén végtermékekhez.

1. példa (Aminooxiacetil¹, Ile⁸)-angiotenzin-II előállítása

1. lépés

Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-ONB

4,5 g (15 mmól) Ile-ONB · HCl-t 50 ml kloroformban oldunk és hozzáadunk 2,1 ml trietilamint és 3,81 g (10 mmól) Boc-Pro-OPFP-t. 20 perces szobahőmérsékleten történő keverés után az oldatot vízzel és 10%-os vizes citromsav-oldattal kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett dipeptidet (R/ = 0,8) izolálás nélkül 20 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk, 10 perc múlva az oldatot 60 ml száraz éterrel hígítjuk és bepároljuk. A szabad dipeptid-hidrokloridot (R³ =0,44) 30 ml kloroformban feloldjuk, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk és hozzáadunk 8,8 g (15 mmól) Boc-His(Dnp)—OPFP-t. Másfél óra múlva az oldathoz 1,65 ml Ν,Ν-dimetilaminoetilamint adunk és 15 perc múlva 15-15 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal, n sósavval, vízzel és 5%-os nátriumhidrogénkarbonát-oldattal kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett tripeptidet (R| 0,50) izolálás nélkül 20 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk, majd 15 perc múlva a szabad tripeptidet (R* = 0,25) száraz éterrel kicsapjuk, szüljük és éterrel mossuk. Ezután azonnal feloldjuk 50 ml kloroform és 20 ml dimetilformamid elegyében, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk és hozzáadunk 6,0 g(l5 mmól) Boc-IleOPFP-t. 30 perc múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 70 ml etilacetátban oldjuk és 25—25 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal n sósavval és vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett tetrapeptider. R² = 0,65) 80 ml 1:9 térfogatarányú éter: : n-bexán elegy segítségével izoláljuk. Ezután 25 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk, majd 30 perc múlva a szabad tetrapeptidet (Rf=0,41) 120 mi száraz éter hozzáadásával kicsapjuk, szüljük 30-30 ml éterrel kétszer mossuk. Ezt követően azonnal feloldjuk dimetilformamid : kloroform = 1:1 elegyében 6/70 ml), az oldat pH-ját 8-ra állítjuk trierilaminnal és hozzáadunk 6,0 g (11,5 mmól) Boc-Tyr(Bzl)—OPFP-t. 15 perc múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 100 ml etilacetátban oldjuk, hozzáadunk 0,66 ml Ν,Ν-dimetilaminoetilamint és 15 perc múlva 30—30 ml 10%-os vizes citromsavoldattal, n sósavval és vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett pentapeptidet (Rj = 0,59) 100 ml éter hozzáadásával kicsapjuk, szüljük és 30-30 ml éterrel kétszer mossuk. Ezután 20 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk, 15 perc múlva a szabad pentapeptidet (Rf = 0,4) 120 ml száraz éterrel kicsapjuk, szüljük és 30—30 mi éterrel kétszer mossuk. Azonnal feloldjuk 50 ml dimetilformamidban, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk és hozzáadunk 4,62 g (12 mmól) Boc—Val-OPFP-t. Egy óra múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 100 ml kloroformban oldjuk és 30-30 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal, n sósavval, majd vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett hexapeptidet (R² = 0,56) éter segítségével izoláljuk, éterrel mossuk. Ezután 20 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk és a szabad hexapeptidet (Rj=0,47) 120 ml száraz éter hozzáadásával kicsapjuk, szűrjük, 30-30 ml éterrel kétszer mossuk. Azonnal feloldjuk 50 ml dimetilformamidban, az oldat pH-ját trietilaminnal 8-ra állítjuk és hozzáadunk 72 g (12 mmól) Boc—Arg(Tos)—OPFP-t. Egy órai keverés után az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 100 ml kloroformban oldjuk és az oldatot 30—30 ml 10%-os vizes citromsavoldattal, n sósavval és vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a maradékot 100 ml éterrel eldörzsöljük és leszűijük, így a cím szerinti védett heptapeptidet kapjuk. Súlya: 12,4 g (80% a kiindulási Boc—Pro—OPFP-re számolva).

Op.: 189—192 ^QC. R² =0,55.

2. lépés

Boc—OGLy—Arg(Tos)—Val-Tyr—He—His— -Pro—He—OH

3,1 g (2 mmól) Boc-Arg(Tos')-Val-Tyr(Bzl)·

-Ile-His(Dnp)-Pro—Ile-ONB-t 5 ml dimetilformamidban feloldunk és hozzáadunk 2,9 ml 2-merkaptoetanolt. Egy óra múlva a pepiidet 100 ml száraz éterrel kicsapjuk, szűrjük, mossuk éterrel, majd me177133 tanol-éter átcsapással tisztítjuk. így 2,0 g (74%) Boc—Arg(Tos)—Val—Tyr(Bzl)—Ile—His—Pro-Ile— -ONB-hez jutunk (Rf =0,1), amelyet 30 ml metanol : ecetsav : víz = 5 : 1 : 1 elegyben feloldunk és hozzáadunk 1,0 g 10%-os csontszenes palládiumot. Ezután 5 órán keresztül hidrogén gázt buborékoltatunk át oldaton, majd a katalizátor kiszűrése után az oldatot bepároljuk és 100 ml éterrel el dörzsölve és leszűrjük a Boc—Arg(Tos)-Val—Tyr—Ile—His-Pro—Ile—OH részlegesen védett heptapeptidet. Súlya: 1,22 g (75%). Rf=0,8. Ebből 0,6 g (0,5 mmól)-t oldunk 5 ml 8 n sósavas dioxánban, majd 20 perces kezelés után 50 ml száraz éterrel kicsapjuk a szabad heptapeptidet (R* = 0,1) szűrjük és 20—20 ml éterrel kétszer mossuk. Azonnal feloldjuk 15 ml dimetilformamidban, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk és hozzáadunk 0,45 g (1,2 mmól) Boc—OGly-OPFP-t. 30 perc múlva a reakcióelegyet bepároljuk, a maradékot feloldjuk 30ml 3:1 arányú kloroform : dimetilformamid elegyében, majd 15-15 ml 10%-os citromsavval és vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a maradékot 15 ml etilacetáttal eldörzsöljük, szüljük és 10 ml etilacetáttal mossuk. így 0,46 g (72%) Boc—OGly—Arg(Tos)—Val—Tyr—Ile—His—Pro—Ile-OH-t kapunk.

Rf = 0,23, Rf = 0,40.

3. lépés

Védőcsoport eltávolítása

0,46 g (0,35 mmól) Boc—OGly—Arg(Tos)—Val—Tyr—Ile—OH-t oldunk 2 ml cseppfolyós hidrogénfluoridban és hozzáadunk 0,5 ml tioanizolt. Az oldatot 1 órán keresztül 0 °C-on tartjuk, majd 100 ml éter hozzáadásával a pepiidet kicsapjuk, szüljük és 30—30 ml éterrel kétszer mossuk. Súlya 0,35 g (100%). Ezt a hidrogénfluoridos sót a megadott módon tisztítjuk. Az (aminooxiacetii¹, Ile⁸)-angiotenzin-Π analóg jellemzői: Rf=O,26, Rf=0,56, Rf = 0,57, E_g1u (a glutaminsavhoz viszonyított elektroforézises mozgékonyság) = 1,00, Aminosav-analízis: Pro: 1,02 (1), Val: 1,0 (1), Ile; 1,9« (2), Tyr: 0,65 (1), His: 1,0 (1), Arg: 1,03 (1).

2. példa (L-a-Aminooxipropioníl¹, Ile⁸ )-angiotenzin-II előállítása

1. lépés

Boc—OAla-Arg(Tos)-VaI-Tyr—Ile-His-Pro-Ile— —OH előállítása

0,6 g (0,5 mmól) Boc-Arg(Tos)—Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile—OH-t (lásd 1. példa 2. lépés) 5 ml 8 n sósavas dioxánban feloldunk, majd 20 perc múlva a szabad heptapeptidet (Rf=O,l) száraz éterrel kicsapjuk, szűrjük és mossuk. Azonnal feloldjuk 20 ml dimetilformamidban, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk és hozzáadunk 0,7 g (1,9 mmól) Boc—OAla-OPFP-t. 30 perc múlva az oldatot bepároljuk, a maradékot feloldjuk 30 ml kloroform : dimetilformamid = 3 : 1 elegyben és 15—15 ml 10%-os vizes citromsavoldattal és vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás 5 után a maradékot 15 ml etilacetáttal eldörzsölve szűgük, mossuk. Súlya: 0,55 g(84%), R* = 0,43, Rf = 0,80.

2. lépés

Védőcsoportok eltávolítása

0,52 g (0,42 mmól) Boc—OAla—Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile—His-Pro-Ile-OH-t 2 ml cseppfolyós 5 hidrogénfluoridban feloldunk és hozzáadunk 0,55 ml tioanizolt. Az oldatot 1 órán át 0 °C-on tartjuk, majd száraz éterrel kicsapjuk, szűrjük és éterrel mossuk. így 0,41 g (OAla¹, Ile⁸)-angiotenzin-II-t kapunk, amelyet a fentiekben megadott 0 módon tisztítunk. Rf =0,32, Rf=0,5S, Rf = Οβ9.

Eg iu = l)0, Aminosav-analízis: Pro: 1,0 (1), Val: 1,1 (1), Ile: 2,02 (2), His: 0,9 (1), Tyr: 0,95 (1), Arg: 1,05 (1).

3. példa (Aminooxiacetii¹, Leu⁸ )-angiotenzin-II előállítása

1. lépés

Boc—Arg(Tos)—Val—Tyr(Bzl)-Ile—His(Dnp)— -Pro—Leu-ONB

4,2 g (12 mmól) Leu-ONB · HBr-t 50 ml kloroformban oldunk és hozzáadunk 1,68 ml trietilamint és 3,81 g (10 mmól) Boc—Pro—OPFP-t, 20 perces szobahőmérsékleten történő keverés után az oldatot 30—30 ml 10%-os vizes citromsavoldattal kétszer, majd 30 ml vízzel egyszer kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után kapott védett dipeptidet (Rf = 0,8) izolálás nélkül 20 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk, és 10 perc múlva az oldatot 60 ml száraz éterrel hígítjuk és bepároljuk. A szabad dipeptidet (Rf = 0,56) izolálás nélkül 50 ml kloroformban felodljuk, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk és hozzáadunk 8,8 g (15 mmól) Boc-His(Dnp)-OPFP-t. 30 perc múlva az Oldathoz 1,65 ml Ν,Ν-dimetilaminoetilamint adunk, majd 10 perc múlva 30—30 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal, n sósav-oldattal, nátriumhidrogénkarbonát-oldattal és vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett tripeptidet (Rf =0,65) izolálás nélkül 25 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk, és a szabad tripeptidet (R* = 0,47) 120 ml száraz éténél kicsapva szűgük, mossuk. Azonnal feloldjuk 50 ml kloroform és 20 ml dimetilformamid elegyében, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk és hozzáadunk 6,0 g (15 mmól) Boc-Ile-OPFP-t. 30 perc múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 100 ml etilacetátban oldjuk és az oldatot 30-30 ml 10%-os vizes citromsavoldattal, n sósavval és vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett tetrapeptidet (R| = 0,65) 100 ml 7:3 arányú n-hexán : éter elegy segítségével izoláljuk. Ezt 25 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk, és 15 perc múlva a szabad tetrapeptidet (R⁴ =0,65) 150 ml száraz éterrel kicsapjuk, szüljük és 30-30 ml éterrel kétszer mossuk. Azonnal feloldjuk 50 ml kloroform : dimetilformamid = 1 :1 elegyben, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk és hozzáadunk 6,0 g (115 mmól) Boc-Tyr—OPFP-t. 15 perc múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 100 ml etilacetátban oldjuk, hozzáadunk 0,66 ml Ν,Ν-dimetilamino-etilamint, majd 15 perc múlva 30-30 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal, n sósavval és vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett pentapeptidet (R² =0,8) 100 ml éterrel eldörzsölve izoláljuk. Ezután 20 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk a szabad pentapeptidet (R⁴=0,8) 120 ml száraz éter hozzáadásával kicsapjuk, szüljük és 30—30 ml éterrel kétszer mossuk. Azonnal feloldjuk 50 ml dimetilformamidban, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk és hozzáadunk 3,85 g (10 mmól) Boc—Val-OPFP-t. Egy óra múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 50 ml kloroformban oldjuk, a szokásos módon kirázzuk és a védett hexapeptidet (R² = 0,82) 100 ml éterrel eldörzsölve izoláljuk. Ezt 20 ml 8n sósavas dioxánban feloldjuk és 15 perc múlva a szabad hexapeptidet (Rf =0,55) 150 ml száraz éterrel eldörzsölve izoláljuk. Az így kapott terméket azonnal feloldjuk 40 ml dimetilformaniidban, trietilaminnal a pH t 8-ra állítjuk és hozzáadunk 6,0 g (10 mmól) Boc-Arg(Tos)—OPFP-t. 30 perc múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot 50 ml kloroformban oldjuk és az elegyet 20-20 ml n sósavval és vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a védett heptapeptidet (R² =0,62) 70 ml etanollal eldörzsöljük és leszűrjük. Súlya: 7,5 g (50% a kiindulási Boc— -Pro-OPFP-re számítva).

Op.: 186-190 °C.

2. lépés

Boc-OGly-Arg(Tos)—Val—Tyr-Ile—His—Pro— -Leu-OH előállítása

3,45 g (2,26 mmól) Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)—Pro-Leu-ONB-t 10 ml dimetilformamidban feloldunk, hozzáadunk 6,6 ml 2-merkaptoetanolt és két óra múlva 150 ml száraz éter hozzáadásával kicsapjuk a részlegesen védett heptapeptidet, amelyet metanol-éter átcsapással tisztítunk. így 2,9g (93%) Boc-Arg(Tos)-Val— Tyr(Bzl)—lle—His—Pro—Leu—ONB-t kapunk. R² =0,12, Rf =0,26. Ezt 40 ml metanol : ecetsav : víz =5:1:1 elegyben feloldjuk, hozzáadunk 1,0 g 10%-os csontszenes palládiumot és 6 órán keresztül hidrogén gázt buborékoltatunk át az elegyen. A katalizátor kiszűrése után az oldatot bepároljuk és a maradékot 100 ml éterrel eldörzsöljük, szűrjük, 30 ml éterrel mossuk és megszánjuk. Az így kapott Boc—Arg(Tos)—V il—Tyr—lle—His—Pro— -Leu-OH súlya: 2,15 g (89%), R? =0,75, R⁴ = 0,20. 1,1 g(l mmól) Boc-Arg(Tos)—Val-Tyr —lle—His—Pro—Leu—OH-t 10 ml 8n sósavas dioxánban feloldunk, és 30 perc múlva a szabad heptapeptidet (R* = 0,08) 50 ml száraz éterrel kicsapjuk, szüljük és 30 ml éterrel mossuk. Azonnal oldjuk 10 ml dimetilformaniidban, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk, és hozzáadunk 054 g (1,5 mmól) Boc—OGly—OPFP-t. 30 perc múlva az oldatot 30 ml kloroformmal hígítjuk, és 20 ml vízzel kirázzuk, Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a maradékot 30 ml etilacetáttal eldörzsöljük és szűgük, majd 10 ml etilacetáttal mossuk. így 1,05 g (86%) Boc-OGly-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile—His-Pro-Leu-OH-t kapunk. Rf =0,23, R* =0,40.

3. lépés

Védőcsoportok eltávolítása

0,9 g (0,73 mmól) Boc-OGly-Arg(To5)-Val— —Tyr—lle—His—Pro—Leu—OH-t 5 ml cseppfolyós hidrogénfluoridban feloldunk, és hozzáadunk 1,5 ml tioanizolt. A reakcióelegyet 15 órán át 0°C-on tartjuk, majd 150 ml száraz éterrel a pepiidet kicsapjuk, 30—30 ml éténél kétszer mossuk és szűrjük. így 055 g (80%) (OGly¹, Leu⁸)-angiotenzin-II-t kapunk, amelyet a leírt módon tisztítunk. R® =0,33, R® =0,60, Rf⁷ =0,55, EGlu = 1,18, Aminosav-analízis: Pro: 1,0 (1), Val: 1,0 (1), lle: 1,0 (1), Leu: 1,1 (1), His: 0,95 (1), Arg: 1,0 (1), Tyr: 0,7 (1).

4. példa (D-a-Aminooxipropionil¹, Leu⁸ )-angiotenzin-II előállítása

1. lépés

Boc-D-OAla-Arg(Tos)-Val—Tyr-Ile—His— -Pro—Leu—OH előállítására

1,1 g (1 mmól) Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile· -His-Pro—Leu-OH-t 10 ml 8 n sósavas dioxánban feloldunk, és 30 perc múlva a szabad heptapeptidet 70 ml száraz éténél kicsapjuk, szüljük és 20 ml éterrel mossuk. Azonnal feloldjuk 10 ml dimetilformamidban, trietilaminnal a pH-t 8-ra állítjuk, és hozzáadunk 056 g (15 mmól) Boc—D—OAla-OPFP-t. 30 perc múlva az oldatot 30 ml kloroformmal hígítjuk és 20 ml vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a maradékot 50 ml etilacetáttal eldörzsöljük és szüljük és 20 ml etilacetáttal mossuk. így 0,95 g (77%) Boc-D-OAla-Arg(Tos)_Val-Tyr—Ile-His-Pro-Leu-OH-t kapunk. R⁴ =0,29.

2. lépés

Védőcsoportok eltávolítása

0,95 g (0,77 mmól) Boc-D-OAla-Arg(Tos)—Val—Tyr—lle—His—Pro-Leu—OH-t 4 ml cseppfolyós hidrogénfluoridban feloldunk, és hozzáadunk

1,2 ml a tioanizolt. Az oldatot 1,5 órán át 0 °C-on tartjuk, majd az anyagot 150 ml száraz éterrel kicsapjuk, szüljük és 30—30 ml éterrel kétszer mossuk. így 0,6 g (90%) (D-OAla¹, Leu⁸)-angiotenzin-II-t kapunk, amelyet a megadott módon tisztítunk. R* =0,33, Rf = 0,61, R/ =0,56, E_Gi_u ⁼ 1,10, Aminosav-analízis: Pro: 1,02 (1), Val: 1,0 (1), Leu: 1,02 (1), Ile: 1,03 (1), His: 1,01 (1), Arg: 0,92 (1), Tyr: 0,8 (1).

5. példa (Aminooxiacetil¹, Ile⁸)-angiotenzin-II-diacetát előállítása

100 mg (aminooxiacetil¹, Ile⁸)-angiotenzin-II oktapeptidet - amelyet az 1. példában leírt módon állítottunk elő - 20 ml 05 mólos vizes ecetsavoldatban oldunk és az oldatot liofilizáljuk. Ily módon az oktapeptid diacetát-sóját kapjuk, amelyben a peptidtartalom az ibolyántúli spektrum alapján meghatározva 89%, op.: 228-232 °C.

Claims

Szabadalmi igénypontok:

1. Eljárás az

X-Arg-Val-Tyr—Ile—His-Pro-Y I

I általános képletű peptidek — e képletben az aminosavak L-konfigurációjúak,

X valamely,, α-helyzetben aminooxicsoportot tartalmazó 2—5 szénatomos alkánkarbonsav gyökét, előnyösen aminooxiacetil- vagy L-a-aminooxipropionilcsoportot és

Y L-leucil- vagy L-izoleucil-csoportot jelent valamint savaddíciós sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely

H—Arg(A)—Val-Tyr(B)-Ile-His(E)-Pro-Y-OG II

II általános képletű reakcióképes heptapeptid-származékot, ahol

A jelentése az Arg guanidinocsoportjának átmeneti megvédésére alkalmas, előnyösen nitro- vagy tozilcsoport,

B jelentése a Tyr aromás hidroxilcsoportjának átmeneti megvédésére alkalmas csoport, előnyösen benzil- vagy szubsztituált benzilcsoport,

E jelentése a His imidazolcsoportjának átmeneti megvédésére alkalmas csoport, előnyösen dinitrofenil-csoport és

G a C-terminális alifás aminosav karboxilcsoportjának védésére szolgáló olyan csoportot jelent, amely enyhe savas behatásoknak ellenáll, de katalitikus

15 hidrogenolízissel vagy vizes ásványi sav, illetve vizes vagy alkoholos alkálifémhidroxid-oldat hatására eltávolítható, valamely

Z-X-M III

III általános képletű vegyülettel reagáltatunk, ahol

25 Z jelentése valamely acidolízissel vagy katalitikus hidrogenolízissel vagy katalitikus hidrogenolízissel eltávolítható csoport, előnyösen benziloxikarbonil- vagy t-butiloxikarbonilcsoport,

X a fenti jelentésű és

30 M jelentése hidroxilcsoport vagy valamely aktiváló csoport, előnyösen pivaloiloxi-, nitrofenoxi-, 2,3,5-triklórfenoxi-, pentaklórfenoxi-, pentafluorfenoxi-, N-szukcinimidoxi- vagy azidcsoport, és a kapott

Z—X—Arg(A)-Val—Tyr(B)—Ile-His(E)-Pro-Y-OG IV

IV általános képletű védett tripeptid védőcsoport40 jait szelektíven vagy egyszerre eltávolítjuk és kívánt esetben a kapott vegyületet savaddíciós sójává alakítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás továbbfejlesztése gyógyászati készítmények előállítására, azzal 45 jellemezve, hogy valamely I általános képletű pepiidet - ahol X és Y jelentése megegyezik az 1. igénypontban megadottal — vagy annak valamely gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sóját a gyógyszerkészítésben szokásos módon hordozó50 és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk.