HU177132B - Eljárás ACTH hatású, terc-butilezett triptofánt tartalmazó peptidek előállítására - Google Patents

Description

Eljárás ACTH hatású, terc-butilezett triptofánt tartalmazó peptidek előállítására

A találmány tárgyát a

H-Ser-Tyr-Ser—Met-Glu-His-Phe—Arg—X—Gly— —Lys—Pro—Val—Gly-Lys—Lys-Arg—Arg— —Pro—NH₂ I

I általános képletű, új ACTH-hatású polipeptidek savaddíciós sóinak és komplexeinek az előállítási eljárása valamint az azokat tartalmazó gyógyászati készítmények képezik, ahol a képletben

X -Trp(r-tBu)-csoportot vagy —Trp(2’,5’,7’,-tri—tBu)-csoportot jelent.

Ismeretes, hogy a triptofán számos biológiailag aktív pepiid, így az ACTH molekula ún. aktív centrumában is megtalálható. Amíg azonban az ACTH-t képező csaknem valamennyi aminosav vele szerkezeti rokonságot felmutató más aminosawal a biológiai hatást nem lényegesen csökkentő módon helyettesíthető, addig a triptofán helyettesítése a 9. helyzetben a biológiai aktivitás drámai csökkenését eredményezi. E tétel igazolására az irodalomban számos -példát lehet találni. így például a [Gin⁵ J»he⁹]-ACTH(l-20)-NH₂-ról már 1970-ben kimutatták [K. Hofmann és munkatársai: J. Med. Chem. 13,, 339 (1970)], hogy aktivitása az analóg szerkezetű, helyettesítetlen ÁCTH-fragmenshez viszonyítva mindössze 2%. Ezt akkoriban a receptorhoz váló gyengébb kötődéssel magyarázták.

Későbbi vizsgálataik [K. Hofmann és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78 71 '80 (1974)] azonban egyértelműen kimutatták a triptofán molekula funkcionális szerepét a biológiai aktivitásban. Még nagyobb hatáscsökkenés volt megfigyelhető, ha a triptofán alfa-amino csoportját helyettesítették például egy metilcsoporttal. így az [N^alfa-metil-Trp⁹]—ACTH-(1—24)-OH már csak 0,05—1% aktivitást mutatott [M. Fujino és munkatársai: Chem.

Pharm. Bull. 19 1075 (1971)]. A triptofán molekula módosítását úgy is végre lehet hajtani, ha a kész, triptofánt tartalmazó pepiidet olyan reagenssel reagáltatják, mely szelektíven csak a triptofán résszel lép reakcióba. Ilyen reagens az o-nitro-fenil5 -szulfenil-klorid, amely az indol gyűrű 2’-helyzetén levő hidrogént szubsztituálja. így állították elő a [Trp(2’-NPS)⁹]-ACTH(l—24)-t, valamint az [Trp(2’-NPS)’]-ACTH(l-39)-t [S. Seelig és munkatársai: Proc. Soc. Exp. Bioi. Med. 139., 1217 í (1972), Moyle és munkatársai: J. Bioi. Chem. 248., 2409. (1973)]. Mindkét vegyület biológiai aktivitása 1-1,5% volt. Amennyiben a Trp-t valamilyen alifás aminosawal helyettesítik, ez a biológiai hatás teljes elvesztését eredményezi. Az [Ile⁹]-ACTH(l-24) in vitro 3,4 · 10^-5 mól/ml dózisban sem a kortikoszteron, sem az adenozin-3’5’-foszfát termelést nem fokozta [S. Kumar: Biochem. Biophys. Rés. Comm. 66 1063 (1975)]. További érdekes adatokat szolgáltatott a [béta) -(1-naftil)—Alá⁹ ]—ACTH(1-19) és a [Trp(l-For)]⁹177132 —ACTH(1—19) vizsgálata. [J. Blake és C. H. Li: J. Med. Chem: 18 423 (1975)]. Ezek az analógok 0,7%, illetve 1,8% biológiai aktivitást mutattak és az utóbbi adatból az a következtetés volt levonható, hogy a triptofán indolgyűrűjének NH-csoportja vagy mint donor, vagy mint akceptor szerepet játszhat egy hidrogénkötés kialakításában. A triptofánnak, mint töltés-átvivő donornak a szerepét volt hivatott tisztázni a [pentametil—Phe⁹ ]—ACTH(l—24) előállítása, amelynek asszociációs konstansa gyakorlatilag azonos volt a megfelelő természetes szekvenciáéval [J. W. van Nispen és G. I. Tesser: Int. J. Peptide Protein Rés. 7., 57. (1975) és J, W. van Nispen és munkatársai: Acta Endocrinologica 84., 470. (1977)], viszont aktivitása mindössze 0,1% volt.

A fenti adatokkal merőben ellentétben azt találtuk, hogy ha az ACTH molekulában a 9-es helyzetű triptofánt H—Trp(l’—tBu)—OH-val vagy H—Trp(2’,5’,7’—tri—tBu)-OH-val helyettesítjük, ez a biológiai hatást csak kis mértékben csökkenti. Vizsgálataink szerint a [Trp(l’-tBu)]⁹-ACTH(1--19)-NH2 aktivitása 60%-osnak, míg a [Trp(2’,5’,7’—tri—tBu)]⁹—ACTH(1—19)—NH2 aktivitása 40%-osnak adódott, hatásuk azonban tartósabb, mint a természetes aminosav sorrendű fragmenseké.

A találmány értelmében úgy állítjuk elő a

H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-X-Gly-Lys-Pro—Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-NH₂ I

I általános képletű vegyületek savaddiciós sóit és komplexeit, ahol az egyes aminosavgyökök a glicin kivételével L-konfigurációjúak, hogy valamely

Q-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OR)-His-Phe-Arg(Q’)—X-Gly-Lys(Q)—Pro—VaI—Gly— -Lys(Q)—Lys(Q)—Arg(Q’)-Arg(Q’)—Pro—NH₂ II

II általános képletű polipeptidről — ahol

X -Trp(l’-terc-butil)-csoportot vagy -Trp(2’,5’,7’-tri-terc-butil)-csoportot jelent,

Q azonos vagy eltérő, a peptidkémiában alkalmazott amino-védő csoportokat,

Q’ hidrogénatomot vagy azonos vagy eltérő, a peptidkémiában alkalmazott guanidino-védőcsoportot, előnyösen nitro-csoportot jelent és

R a peptidkémiában alkalmazott karboxil-védőcsoportot képvisel - a védőcsoportokat erős savval lehasítjuk és kívánt esetben a kapott savaddíciós sót más, gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sóvá vagy komplexszé alakítjuk.

A Q. amino-védőcsoport valamely acidolízissel könnyen eltávolítható csoport, így például tritil-, formil-, ο-nitro-szulfenil-, benziloxikarbonil-, p-klór-benziloxikarbonilcsoport, különösen terc-butiloxikarbonilcsoport vagy pedig tozil-, trifluoracetil- vagy ftalií-csoport, míg az R karboxilvédőcsoport előnyösen metil-, etil-, terc-butil·, benzilvagy p-klór-benzilcsoport lehet.

A védőcsoportokat ismert módon, valamilyen erős savval hasítjuk le, ahol a sav bármilyen, az adott védőcsoport lehasítására alkalmas, erős szerves vagy szervetlen sav lehet. Példaképpen megnevezzük a hidrogénfluoridot, hidrogénbromidot, trifluorecetsavat, metánszulfonsavat.

Az új vegyületeket sók formájában kapjuk, amelyek kívánt esetben más, gyógyászatilag elfogadható savaddiciós sókká alakíthatók. Erre a célra savként mind szervetlen savakat, így sósavat, kénsavat és foszforsavakat, mind szerves savakat, így hangyasavat, ecetsavat, hosszabb szénláncú zsírsavakat, tejsavat, borkősavat, citromsavat és hasonlókat alkalmazhatunk.

A reakcióban kiindulási anyagként felhasznált II általános képletű új peptideket önmagában ismert módon, fragmenskondenzációval vagy aminosavankénli lánchosszabbítással állíthatjuk elő. Egy előnyös előállítási mód szerint úgy járunk el, hogy valamely

Q-X-B III

III általános képletű reakcióképes származékot, ahol Q és X jelentése a fenti és

B hidroxilcsoportot, vagy valamely aktiváló csoportot, így halogénatomot, előnyösen klóratomot, pivaloiloxicsoportot, nitro-fenoxi-csoportot,

2,3,5-triklórfenoxi-, pentaklór- vagy pentaíluorfenoxicsoportot, N-szukcinimidoxicsoportot vagy azidocsoportot jelent

H-Gly-OR ÍV

IV általános képletű származékkal reagáltatjuk, ahol

R jelentése a fenti, amennyiben B jelentése hidroxil-csoport, akkor az acilezést előnyösen diciklohexilkarbodiimiddel végezzük és a kapott

Q-X-Gly-OR V

V általános képletű származékból acidolízissel vagy katalitikus hidrogénezéssel nyert

H-X-Gly-OR VI

VI általános képletű. származékot Q—Arg(Q’)-B általános képletű vegyülettel, ahol Q és B jelentése a fenti, acilezzük. A kapott

Q-Arg(Q’)-X—Gly-OR VII

VII általános képletű védett tripeptid származék alkalmas arra, hogy akár a Q csoport ismert módon történő eltávolításával nyert N-terminálison a szabad vegyületet további acilezésnek vessük alá, akár az —R csoport ismert módon történő eltávolításával vele acilezzünk.

Eljárhatunk úgy is, hogy a VII általános képletű vegyületről mind a Q, mind az. R védőcsoportot eltávolítjuk és az így kapott

H—Arg(Q’)—X—Gly—OH VIII

VIII általános képletű, szabad tripeptidet acilezzük. így a

Q—Ser—Tyr—Ser—Met-Glu(OR)-His—Phe—B IX

IX általános képletű vegyülettel, ahol Q, R és B jelentése a fenti, acilezve a

Q-Ser—Tyr—Set-Met-Glu(OR)-His—Phe— —Arg(Q’)—X-Gly—OH X

X általános képletű védett dekapeptidhez jutunk, amellyel a

H—Lys(Q)—Pro—Val-Gly-Lys(Q)—Lys(Q)— —Arg(Q)—Ajg(Q’)—Pro—NH₂

XI általános képletű nonapeptidet — ahol Q jelentése előnyösen t-butiloxikarbonil-, benziloxi-karbonil-, p-klór-benziloxi-karbonil-csoport — acilezve jutunk a

Q-Ser -Tyr -Ser-Met-Glu(OR)-His-Phe—Arg(Q’)—X—Gly—Lys(Q)—Pro—Val—Gly— -Lys(Q)-Lys(Q)-Arg(Q’)-Arg(Q’)-^pr°-NH₂

XII

XII általános képletű vegyülethez, ebből a védőcsoportoknak ismert módon történő eltávolításával jutunk az I általános képletű vegyülethez, melyet önmagában ismert módon tisztítunk.

Az eljárás egy különösen előnyös foganatosítási módja szerint a III általános képletű triptofán származékkal célszerűen glicin-metilésztert acilezünk és a kapott védett dipeptidből Z-védőcsoport alkalmazása esetén katalitikus hidrogenolízissel, míg BOC-védőcsoport esetén ecetsavas sósav-oldattal kezelve jutunk az N-terminálisán szabad dipeptidhez. Ennek acilezése célszerűen Z-Arg(HCl)-OH-val valósítható meg akár a vegyes anhidrides, akár a DCC-s módszerrel. E kulcsvegyületnek számító Z—Arg(HCl)—X—Gly—OMe védett tripeptid ismert módon alakítható át akár az N-terminálison, akár a C-terminálison, akár mindkét végen szabad tripeptiddé.

A szintézis során felhasznált IX és XI intermediereket szintén a peptidkémiában használatos módszerek segítségével építjük fel, önmagában ismert módon fragmens kondenzációval vagy lépésenként! lánchosszabbítással. Kapcsolási módszerként az aktív észteres, diciklohexilkarbodhmides, azidos vagy vegyes anhidrides módszert használjuk.

A reakcióban részt nem vevő funkciós csoportokat szükség esetén védjük, különösen hidrolízissel, acidolízissel vagy katalitikus hidrogénezéssel, esetleg folyékony hidrogénfiuorid alkalmazásával eltávolítható csoportokkal. A karboxilcsoportot például benzilalkohollal, terc-butanollal vagy halogénezett benzilalkohollal észterezve védhetjük. Az oldalláncon levő amíno-, illetve -guanidinocsoport védésére a benziloxikarbonil-, terc-butiloxikarbonil-, klór -benziloxikarbonil-, nitro-, tozil-csoportokat használhatjuk. Az arginin guanidinocsoportját egyszerű protonálással is védhetjük.

A védőcsoportok megfelelő kombinációjával el tudjuk érni, hogy ezek önmagukban ismert módszerek (például acidolízis, hidrolízis, katalitikus hidrogenolízis stb.) segítségével szelektíven vagy egyidejűleg eltávolíthatók legyenek.

A IH általános képletű vegyületek egyik előnyös előállítási módja szerint a triptofánt közvetlenül trifluorecetsav és terc-butanol eleggyel terc-butilezzük, majd a kristályos H—Trp(2’,5’,7’-tri—tBu)-OH-t először a Q védőcsoport bevitelével védjük, majd karboxilcsoportját megfelelő módon aktiváljuk, előnyösen úgy, hogy például szukcinimid-észtert képezünk. így juthatunk el például a BOC—Trp(2’,5’,7’-tri-tBu)—OSu-hoz, amellyel kitűnő termelési hányaddal végezhetjük az acilezést. A Q—X—B aktív' származékhoz eljuthatunk úgy is, hogy például Z—Trp—OMe-t izobutilén és cc. kénsav elegyével terc-butilezünk, az így kapott Z-Trp(l’—tBu)-OMe-t lúgos elszappanosításnak vetjük alá, majd a kapott Z—Trp(l’—tBu)-OH-ból szukcinimid-észtert képezünk.

Az I általános képletű végtermékeket célszerűen karboximetil-cellulózos ioncserélő kromatográfiával tisztítjuk.

Az új vegyületeket az előállítás során alkalmazott módszerektől függően többnyire mint Iiofílezett porokat kapjuk, amelyek alkalmasak különböző szerves vagy szervetlen savakkal alkotott sók vagy fémkomplexek képzésére.

A találmány szerinti új vegyületek biológiai aktivitását Sayers és munkatársai által leírt [SAYERS, M. A., SAYERS, G. és WOODBURY, L. A. ENDOCRINOLÖGY 42 , 379 (1948)], a mellékvese ascorbinsav szint csökkenésén alapuló módszerrel vizsgáltuk s. c, adagolás után. A vizsgálathoz hím Wistar patkányokat használtunk, amelyeknek hipofízisét 9a-fi uor-ll/J, 17, 21-trihidroxi-16a-metil-pregna-l,4-dién-3,20-dionnal blokkoltuk. Összehasonlításra a Világegészségügyi Szervezet (WHO) által forgalomba hozott kortikotropin munkastandard szolgált. [Bangham, D. R., Μ. V. Mussett, M. P. Stock—Dunne.· Bull. WHO, 27, 395 (1962)]

Paralel mérésekből az alábbi biológiai értékeket kaptuk: H -Ser—Tyr—Ser-Met-Glu-His—Phe -Arg-Trp( 1 ’-terc-butil)-Gly-Lys—Pro-Val—Gly—Lys-Lys-Arg—Arg—Pro-NH₂ esetén az aktivitás 56,0 E/mg és H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His—Phe—Arg—Trp(2’,5’,7’-tri-terc-butil)—Gly-Lys—Pro— -Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-NH₂ esetén

39,6 E/mg.

Gyógyászatilag elfogadható komplexen a találmány szerinti eljárással készült peptidek oly vegyületei értendők, amelyek bizonyos szerves vagy szervetlen anyagok hozzáadására keletkeznek és a peptideknek nyújtott hatást biztosítanak. Ilyen szerves vegyületek lehetnek bizonyos zselatinok, karboximetilcellulózok, algin savészterek, poli(floretin-foszfát), aminosav-polimerek vagy egyéb polimerek és kopolimerek. A szervetlen vegyületek közül bizonyos fémek, például a cink hidroxidja és nehezen oldódó sói, így foszfátjai és pirofoszfátjai jöhetnek számításba.

A találmány szerinti peptideket, valamint azok sóit és komplexeit a szokásos gyógyszerkészítmények formájában használhatjuk fel a gyógyászat3 bán. Az ilyen gyógyszerkészítmények a találmány szerinti vegyületeket enterális vagy parenterális beadásra alkalmas szervetlen vagy szerves vivőanyag kíséretében tartalmazzák. így a gyógyszerkészítmények lehetnek szilárd liofilizátumok, ekkor vivő- 5 anyagként peptidekkel nem reagáló vegyületek - például szénhidrátok - jöhetnek számításba, lehetnek híg vagy tömény szuszpenziók és emulziók, amelyek különböző tartósító és stabilizáló segédanyagokat is tartalmaznak. 10

A gyógyszerkészítmények felhasználhatók diagnosztikumként a mellékvesekéreg funkcionális állapotának megállapítására. Terápiásán valamennyi csökkent ACTH termeléssel járó szindróma esetében alkalmazhatók. 15

A találmány szerinti eljárás foganatosítási módjait az alábbi példákkal szemléltetjük,

A példákban az aminosav és peptidszármazékok jelölésére a IUPAC-IUB által ajánlott rövidítéseket használtuk [J. Bioi. Chem. 247 977 (1972)]. 20 Egyéb rövidítések: BOC = terc-butiloxikarbonil-, tBu = terc-butil-, NSu = Ν-szukcinimidil-, PFP = pentafluorfenil-, Z = benziloxikarbonilcsoport, DCC = diciklohexil-karbodiimid, DCU = diciklohexilkarbamid, DCHA = diciklohexilamin, H—Trp( 1 tBu)—OH = 25 = Nj„-terc-butil-triptofán, H-Trpf2’,5’,7’-tri—tBu)— -OH = 2’,5’,7’-tri-terc-butil-triptofán.

Az olvadáspont meghatározások dr. Tottoli-féle készülékben (Büchi, Schweiz) történik. A vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatokat kovasavgél (Silica- 30 gél nach Stahl) adszorbensen végeztük az alábbi oldószer-elegy ekben:

1. etilacetát:

(piridin : ecetsav; víz = 20 : 6 :11) = 99 :1

2. etilacetát;

(piridin : ecetsav : víz = 20:6:11) = 9:1

3. etilacetát:

(piridin : ecetsav : víz =20:6:11)= 8:2

4. etilacetát:

(piridin : ecetsav : víz =20:6:11)= 6:4

5. n-butanol: piridin :

ecetsav : víz = 30 :20 : 6 :24

A peptidek ioncserélő kromatográfiás tisztítása- 45 nál UVICORD III (LKB, Svédország) átfolyó küvettás ultraibolya extinkcióméteren 280 nm-en folyamatosan regisztráltuk az eluátum fényelnyelését.

ml-es frakciókat gyűjtöttük, a terméket tartalmazó frakciókat az elnyelési görbe alapján válasz- ₅₀ tottuk ki.

1. példa

H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp(l’—tBu)-Gly-Lys—Pro-Val-Gly-Lys—

-Lys—Arg—Arg-Pro-NH₂ -hexaacetát

1,12 g (0,33 mmól) BOC—Ser-Tyr—Ser-Met— -Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Trp(l’-tBu)-Gly-Lys(BOC)-Pro- Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-NH₂-tritozilátot 7,7 ml trifluorecetsav és 33 ml víz elegyében oldunk. Az oldatot 3 óra után 110 ml éterrel hígítjuk és a kivált csapa- ¢5 dákot leszűrjük. A nyers nonadekapeptidamid-trifluor-acetátot 5x50cm-es karboximetilcellulóz (Whatman CM 52) oszlopon 2 liter 0,3 mól (pH 6,7) és 2 liter 0,6 mól (pH 6,7) .ammóniumacetát pufferből készített lineáris puffergradienssel kromatografáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. 0,435 g (41) nonadekapeptidamid-hexaacetátot kapunk. Rf = 0,38, pepiid tartalom = 75%, aminosav analízis: Lys 2,8 (3), His 1,0 (1), Arg 3,1 (3), Ser 1,8 (2), Glu 1,1 (1), Pro 2,1 (2), Gly 13 (2), Val 1,0 (1), Met 0,8 (1), Tyr 1,0 (1), Phe 1,1 (1),

A kiindulási anyagként alkalmazott védett polipeptidet az alábbi módon állíthatjuk elő.

Z—Trp(l’—tBu)—OH · DCHA ml metanolban oldott 49,8 g (147 mmól) Z-Trp-OH-t éteres diazometán oldattal észterezünk, majd az oldószert ledesztilláljuk és a visszamaradó Z—Trp—OCH₃-t 300 ml metilénkloridban oldjuk. Az oldatot —10 °C-ra hűtjük, 900 ml izobutílént (103 mól), 4,5 ml (164 mmól) tömény kénsavat adunk hozzá és nyomásálló edényben 8 napig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután 45 ml piridint adunk a reakcióelegyhez és bepároljuk. A maradékot 500 ml etílacetátban oldjuk, az oldatot 200 ml n sósavval, kétszer 200 ml 8%-os nátriumhidrogénkarbonát oldattal, végül 200 ml vízzel kirázzuk és szárítjuk. Az etilacetát ledesztillálása után visszamaradó Z-Trp(l’-tBu)—OCH₃-t (50,25 g, 84%) további tisztítás nélkül 500 ml etanoiban oldjuk és 100 ml 2 n nátriumhidroxiddal 1 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd az oldatot tömény sósavval semlegesítjük, bepároljuk és a maradékot 200 ml éter és 1200 ml 3%-os nátriumhidrogénkarbonát-oldat hozzáadásával feloldjuk. A vizes fázist még háromszor 200 ml éterrel mossuk, majd 500 ml étert öntünk hozzá és keverés közben tömény sósavval pH 3-ig savanyítjuk. A vizes réteget kétszer 200 ml éterrel mossuk. Az egyesített éteres oldatot szárítás után kb. 250 ml-re bepároljuk és diciklohexilaminnal meglúgosítjuk. A kikristályosodó sót leszűqük, acetonból átkristályosítjuk. 26,15 g (31%) Z—Trp(l’-tBu)—OH. DCHA sót kapunk. Op.: 146—147 °C, Rf = 0,65.

Elemzés a ¢35^9^04 összegképlet alapján:

számított: C =73,01%, H =8,5%,

N = 7,30%, talált: C =72,86%, H =8,65%,

N = 7,25%.

Z-Trp(l’-tBu)-ONSu

8,6 g (143 mmól) Z-Trp(l’-tBu)-OH· DCHA sót 150 ml éténél és 60 ml n kénsavval addig rázunk, amíg feloldódik. Az éteres oldatot 20 ml vízzel mossuk és szárítás után bepároljuk. A visszamaradó Z—Trp(l’—tBu)—OH-t 20 ml dioxánban oldjuk, 1,8 g (15,7 mmól) N-hidroxiszukcinimidet és 3,15 g(15,0 mmól) DCC-t adunk hozzá. 3 óra után a kivált DCU-t leszűrjük, az oldatot bepároljuk. A maradék éter alatt megkristályosodik 6,8 g (93%) Z—Trp(l’—tBu)—ONSu-t kapunk. Op.:

90-92 °C.

Z—Trp(l tBu)-Gly—OCH₃ ml kloroformban 1,6 g (12,8 mmól) H-Gly-OCH₃ · HCl-ot szuszpendálunk, 1,61 ml (11,7 mmól) trietilamint és 5,77 g (11,7 mmól) Z—Trp(l tBu)—ONSu-t adunk hozzá. 4 óra keverés után a kloroformot ledesztilláljuk és a nyers terméket 1-20 ml etilacetátban oldva vízzel, n sósavval és 8%-os nátriumhidrogénkarbonát oldattal mossuk. Szárítás után az oldatot bepároljuk. 4,4 g (81%) Z—Trp(l’-~tBu)—Gly—OCH₃ marad vissza sárgás amorf por formájában. R} =0,68.

Z—Arg—Trp(l ’-tBu)-Gly-OH

4,4 g (945 mmól) Z-Trp(l’-tBu)-Gly-OCH₃-t 100 ml metanolban oldunk, 1,09 g (12,1 mmól) vízmentes oxálsavat adunk hozzá és 0,5 g 10%-os csontszenes palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. A reakció befejeződése után a katalizátort kiszűrjük és az oldatot bepároíjuk. A maradékhoz 100 ml étert és 20 ml 8%-os nátriumhidrogénkarbonát oldatot adunk, összerázás után a vizes részt háromszor 30 ml éterrel mossuk, az egyesített éteres oldatot szárítjuk és bepároíjuk. Az így nyert H—Trp(ltBu)—Gly—OCH₃-t 15 ml dimetilformamidban oldjuk, 3,03 g (8,8 mmól) Z-Arg(HCl)-OH-t, 1,19 g(8,8 mmól) N-hidroxibenztriazolt és 1,85 g (9,0 mmól) DCC-t adunk hozzá. Másnap a kivált DCU-t leszűqük, a dimetilformamídot ledesztilláljuk és a nyers terméket 100 ml kloroform, 20 ml n-butanol és 35 ml víz elegyében oldjuk. A szerves fázist kétszer 30 ml n sósavval mossuk, szárítás után bepároljuk. Az olajos maradék éter alatt megszilárdul. A nyers Z-Arg(HCl)-Trp(l'-tBu)—Gly-OCH₃-t 120 ml metanol és 50 ml víz elegyében oldjuk és 4,8 ml 4 n nátriumhidroxidot adunk hozzá. Egy óra múlva a reakcióelegyet ecetsavval semlegesítjük és a metanolt ledesztilláljuk. A Z-Arg-Trp(l ’-tBu)-Gly-0H kristályosán kiválik. 50%-os etanolból kétszer átkristályosítjuk. 3,43 g (64%) benziíoxikarbonil-tripeptidet kapunk.

Op.: 163-165 °C, R* =0,27,

Elemzés a C₃₁H₄₁N7O₆ összegképlet alapján:

számított: N =16,14%, talált: N =15,92%

BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe—OCH₃

9,15 g (14,4 mól) Z-Glu(OtBu> His-Phe-OCH₃-t [L. Kisfaludy, M. Löw, O. Nyéki, T. Szirtes, I. Schön: Ann. 1973,, 1421} 230 ml metanolban oldunk és 1,5 g 10%-os csontszenes palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. A reakció befejeződése után a katalizátort kiszűrjük és az oldatot bepároljuk. Az így kapott tripeptid észtert 20 ml dimetilformamidban oldjuk és 62 ml (36 mmól) diizopropiletilamint adunk hozzá.

7,2 g (12,0 mmól) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met—N₂H₃-ot (B. Isclin, R. Schwyzer: Helv. 44., 169.

(1961)] 20 ml dimetilformamidban oldunk. Az oldatot —20°C-ra hűtjük és keverés közben 14,8 ml (48 mmól) 3,24 n etilacetátos sósavoldatot, majd 1,86ml (15,6mmól) terc-butilnitritet csepegtetünk hozzá. A reakcióelegyet 5 percig ~10°C-on keverjük, majd újra -20°C-ra hutjük, hozzáadjuk a H-Glu(OtBu)-Hís~Phe~OCH₃ diízopropiletilaminnal meglúgosított oldatát és 1 órán át -5 és 0 °C közötti hőmérsékleten, majd 20 órán át 0°C-on tartjuk. Ezután a dimetilformamidot ledesztilláljuk, a maradékot éterrel eldörzsöljük, szűqük, vízzel és éterrel mossuk. 11,55 g (90%) BOC-Ser—Tyr—Ser-Met—Glu(OtBu)—His-Phe—OCH₃-t kapunk. Op.: 195-199 °C. Rf =0,52.

B OC - S e r—Ty r - S e r - M e t-Glu(OtBu)- His-Phe-n₂h₃

11,55 g (10,75 mmól) BOC-Ser-Tyr-Scr-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-OCH₃-t 115 ml dimetilformamidban oldunk, és 2,62 ml (53,8 mmól) hidrazinliidrátot adunk hozzá. Az oldatot 20 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd a dimetilformamidot ledesztilláljuk és a maradékot vízzel eldörzsöljük. Szűrés, szárítás után a nyers terméket 90 ml etanolban szuszpendáljuk, forrásig melegítjük, majd lehűlés után leszűrjük. 8.3 g (72%) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu )-His-Phe-N₂H₃-t kapunk. Op.: 210-214°C, R?=0,39.

BOC-Ser-Tyr-Ser~Met-Glu(OtBu)~His-Phe-Arg-Trp(l’-tBu) -Gly-OH

1,09 g (1,8 mmól) Z-Arg--Trp( 1 ’-tBu) -Gyl —OH-t 30 ml 80%-os ecetsavban oldunk és 0,15 g 10%-os csontszenes palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. A reakció befejeződése után a katalizátort kiszűqük, az oldatot bepároljuk és a maradékot éterrel megszilárdítjuk. Az így nyert H-Arg-Trp(l ’-tBu) -Gly-OH diacetátot ml dimetilformamidban oldjuk és az oldatot 1,08 ml (6,3 mmól) diizopropiletilaminnal meglúgosítjuk.

1,6 g (1,5 mmól) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe~N₂N₃ ot 16 ml dimetilformamidban oldunk az oldatot -20 °C-ra hűq'ük, 2,4 ml (6,0 mmól) 2,5 n etil-acetátos sósavoldatot és 0,23 ml (1,93 mmól) terc-butUnitritet adunk hozzá, majd 5 percig -10°C-on tartjuk. Ezután újra -20 °C-ra hűljük és hozzáadjuk a H-Arg-Trp(l -tBu)~Gly- OH diizopropiletilaminnal meglúgosított oldatát. A reakcióelegyet 1 órán át -5 és 0 °C közötti hőmérsékleten keverjük, majd másnapié 0 °C-on állni hagyjuk. Ekkor a dimetilformamidot ledesztilláljuk es a maradékot vízzel eldörzsöljük. A nyers terméket terc-butanol-víz 2:1 elegyből kétszer átkristályositjuk. 1,35 g (60%) védett dekapeptidet kapunk.

Op.: 216-224 °C. R?=020.

BOC - Arg(N0₂)-Pro-NH₂

5,12 g (34 mmól) Η-Pro—NH₂ · HCl-ot 40 ml kloroform és 60 ml dimetilformamid elegyében oldunk, 4,76 ml (34 mmól) trietilamint, 15,0 g (30,9 mmól) BOC-Arg(NO₂ )-OPFP-t adunk hozzá és a reakcióelegyet trietilamin adagolással 30 percig pH 8-on tartjuk. Az oldószer bepárlása után a maradékot 400 ml kloroformban oldjuk, háromszor 60 ml sósavval kirázzuk. Szárítás után az oldószert ledesztilláljuk, a maradékot éterrel eldörzsöljük, majd a nyers terméket kloroform-éter-ből átcsapjuk. 6,35 g (49%) BOC—Arg(NO₂ )-Pro—NH₂-ot kapunk. R² =0,14.

BOC—Arg(NO₂ )—Arg(NO₂ )-Pro-NH₂

6,35 g (15,3 mmól) BOC—Arg(NO₂)-Pro-NH₂-ot 65 ml dioxánban oldunk és 65 ml 8 n dioxános sósavoldatot adunk hozzá, 30 perc múlva a dioxánt ledesztilláljuk, a maradékot éterrel eldörzsöljük és leszűrjük. Az így kapott dipepiidamid-hidrokloridot 40 ml dimetilformamidban oldjuk, trietilaminnal pH 8-ra lúgosítjuk 'és 8,16 g (16,8 mmól) BOC-Arg(NO₂)-OPFP-t adunk hozzá. A reakcióelegyet ezután 30 percig trietilamin adagolással pH 8-on tartjuk, majd az oldószert ledesztilláljuk, a maradékot éterrel eldörzsöljük, szűrjük és 150 g szilikagélből készített oszlopon etilacetát: (piridin : ecetsav: víz = 20 : 6 :11) = 75 :25 eleggyel kiomatografáljuk. A kívánt anyagot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, bepároljuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük. 5,05 g (53,6%) BOC-Arg(NO₂)-Arg(NO₂)-Pro—NH₂-ot kapunk. R?=0,18.

Z—Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)—Lys(BOC)—Arg(NO₂)—Pro—NH₂

5,05 g (8,2 mmól) BOC-Arg(NQ₂)-Arg(NO₂)~ —Pro—NH₂-ot 50 ml trifluorecetsavban oldunk. Az oldatot 30 perc múlva bepároljuk, a maradékot éterrel eldörzsöljük. Szűrés, szárítás után a tripeptidamid-trifluoracetátot 25 ml dimetilformamidban oldjuk, az oldatot diizopropiletilaminnal pH 8-ig lúgosítjuk és ezután még 3,44 ml (22,35 mmól) diizopropiletilamint adunk hozzá.

8,3 g (7,45 mmól) Z-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-N₂H3-ot [K. Sturm, R. Geiger, W, Siedel: Bér., 96., 609. (1963) K. Hofmann, I. Rosenthaler, R. P. Wells, H. Yajima: I. Am. Chem. Soc. 86., 4991. (1964)] 40 ml dimetilformamidban oldunk. Az oldatot —20 °C-ra hűtjük, 9,3 ml (29,8 mmól) 3,2 n etilacetátos sósavoldatot, majd 1,27 ml (10,7 mmól) terc-butilnitritet csepegtetünk bele. A reakcióelegyet 5 percig -10 °C-on tartjuk, majd újra -20°C-ra hűtjük és hozzáadjuk a H—Arg(NO₂)—Arg(NO₂)—Pro—NH₂ diizopropiletilaminnal meglúgosított oldatát. 1 órán át -5 és 0 C közötti hőmérsékleten keverjük, majd másnapig 0 °C-on állni hagyjuk. A dimetilformamid ledesztillálása után a maradékot 300 ml kloroformban oldjuk, háromszor 50 ml n sósavval és háromszor 50 ml 8%-os nátriumhidrogénkarbonát oldattal mossuk. A kloroformos oldatot szárítás után bepároljuk, a maradék éter alatt megszilárdul, leszűrjük, majd kloroform-éterből átcsapjuk. 93 g (79%) védett nonapeptid-amidot kapunk. Op: 134-144 °C, Rj =0,72.

H—Lys(BQC)—Pro—Val-Gly—Lys(BOC)—Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-NH₂ -tritozilát

9,3 g (5,85 mmól) Z-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Ly s (BOC)—Lys(BOC)—Arg(NO₂ )-Arg(NO₂ )-Pro-NH₂ -ot 268 ml 80%-os ecetsavban oldunk és

2,6 g 10%-os csontszenes palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. Amikor a reakció befejeződik a katalizátort kiszűrjük és az oldatot bepároljuk. A maradékot 160g szilikagélből készített oszlopon etilacetát: (piridin : ecetsav : víz = = 20 : 6 :11) = 6 :4 arányú elegyével kromatografáljuk. A tiszta nonapeptidamidot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, az oldószert ledesztilláljuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük. Az így kapott 4,85 g nonapeptidamid-triacetátot 50 ml piridinben oldjuk, 2,15 g (11,3 mmól) p-toluolszulfonsav-monohidrátot adunk hozzá, majd az oldatot bepároljuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük. Szűrés, szárítás után 4,90 g (44%) nonapeptidamid-tritozilátot kapunk. Rf =0,13.

BOC—Ser—Tyr—Ser—Met—Glu(OtBu)-His—Phe—

- Arg-Trp( 1 ’-tBu)-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly—Lys(BOC)—Lys(BOC)—Aig—Arg—Pro—NH₂ — —tritozilát

0,908 g (0,6 mmól) BOC—Ser—Tyr—Ser—Met-Glu(OtBu)—His—Phe-Arg-Trp( 1 ’-tBu)-Gly-OH-t és 1,13 g (0,6 mmól) H—Lys(BOC)—Pro—Val—Gly—Lys(BOC)-Lys(BOC)— Arg-Arg-Pro-NH₂ tritozilátot 8 ml dimetilformamidban oldunk, 0,084 ml (0,6 mmól) trietilamint és 0,68 g (0,9 mmól) pentafluorfenol-DCC-3:l-komplexet adunk hozzá. 20 óra múlva a kivált DCU-t leszűrjük és a terméket éterrel kicsapjuk a szűrletből.

1.8 g (89%) védett nonadekapeptid-amid-tritozilátot kapunk. Rf =0,09.

2. példa

H—Ser—Tyr-Ser—Met—Glu—His—Phe—Arg— —Trp(2 ’,5 ’,7 ’-tri-tBu)-Gly-Lys-Pro-Val-Gly~Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-NH₂—hexaacetát

1,15 g (0,33 mmól) BOC—Ser—Tyr—Ser—Met-Glu(OtBu)-His-Phe~Arg-Trp(2\5’,7’-tri—tBu)-Gly-Lys(BOC)—Pro-Val—Gly—Lys(BOC)— —Lys(BOC)-Arg-Arg—Pro-NH₂ -tritozilátot

8.8 ml trifluorecetsav 1,1 ml anizol és 1,1 ml víz elegyében oldunk. Az oldatot lóra után’110ml éterrel hígítjuk és a kivált csapadékot leszűgük. A nyers nonadekapeptidamid-trifluoracetátot 5 x 50 cm-es karboximetilcellulóz (Whatman CM 52) oszlopon 2 liter 0,3 mól (pH 6,7) és 2 liter 0,6 mól (pH 6,7) ammóniumacetát pufferből készített lineáris puffergradienssel kromatografáljuk. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. 0,405 g (38%) nonadekapeptidamid-hexaacetátot kapunk. Rf = 0,44, peptidtartalom = 78%, aminosav analízis: Lys: 3,0 (3), His: 1,0 (1), Arg 2,7 (3), Ser 1,8 (2), Glu: 1,0 .(1), Pro (1,9 (2), Gly 2,0 (2), Val 1,1 (1), Met OS (D. Tyr OS (1), Phe: 1,0 (1).

A kiindulási anyagként alkalmazott pepiidet az alábbi módon állíthatjuk elő.

H—Trp(2’,5 ’,7 ’-tri-tBu)-OH g (98 mmól) H-Trp-OH-t 100 ml (1,05 mól) terc-butanol és 300 ml trifluorecetsav elegyében oldunk és az oldatot szobahőmérsékleten állni hagyjuk. 20 óra múlva bepároljuk. Az olajos maradékot a visszamaradt trifluorecetsav eltávolítására vízzel összerázzuk. A savanyú oldat leöntése után a sűrű maradékhoz ismét vizet adunk és annyi nátriumhidrogénkarbonátot, hogy a kioldódó trifluorecetsavat éppen semlegesítse. A termék ekkor kristályossá válik. Leszűrjük és 50%-os etanolból átkristályosítjuk. 12,6 g (34,5%) H—Trp(2’,5’,7’—tri— -tBu)—OH-t kapunk. Op.: 221-223 °C, R? =0,47.

Elemzés a C₂₃H_3SN₂O₂ összegképlet alapján:

számított: C =74,15%, H =9,74%,

N = 7,52%, talált: C =73,92%, H =9,81%,

N = 7,44%

BOC —Trp(2 ’,5 ’,7 ’-tri-tBu)-OH

10,0 g (26,9 mmól) H-Trp(2’,5’,7’-tri-tBu)—OH-t 20 ml díoxán, 20 ml víz és 7 ml 4 n nátriumhidroxid elegyében oldunk. 5 g (35 mmól) terc-butiloxikarbonilazidot adunk a reakcióelegyhez és szobahőmérsékleten keveqük, közben a pH-t 4 n nátriumhidroxid adagolásával 95 és 10 között tartjuk. 5 óra múlva a terc-butiloxikarbonilazid fölöslegét éterrel kirázzuk, a vizes oldathoz újra étert öntünk és keverés közben tömény sósavval óvatosan pH 3-ra savanyítjuk. Szárítás után az étert ledesztilláljuk és a maradékot petroléterrel kristályosítjuk. 9,5 g (75%) BOC—Trp(2’,5’,7’—tri—tBu)— -OH-t kapunk. Op.: 184-186 °C (etilacetát-hexánból átkristályosítva).

Elemzés a C₂₈H₄₄N₂O₄ összegképlet alapján:

számított: C =71,15%, H =9,38%,

N = 5,93%, talált: C =71,38%, H =9,30%,

N = 6,01%.

BOC—Trp(2 ’,5 ’,7 ’-tri-tBu)-ONSu

12,0g (25,4 mmól) BOC-Tip(2’,5’,7’-tBu)—OH-t és 2,95 g (25,7 mmól) N-hidroxiszukcinimidet oldunk 40 ml dioxánban, majd 5,3 (25,7 mmól) DCC-t adunk az oldathoz. 3 óra múlva a kivált DCU-t leszűq’ük, az oldatot bepároljuk, a maradékot petroléterrel kristályosítjuk. Izopropilalkoholból átkristályosítva 11,4 g (79%) BOC—Trp(2’,5’,7’—tri—tBu)—ONSu-t kapunk. Op.: 204-206 C.

Elemzés a C₃₂H4₇N₃06 összegképlet alapján:

számított: C =67,46%, H =832%,

N = 7,38%, talált: C =67,65%, H =830%,

N = 7,46%.

BOC—Trp(2 ’,5 ’,7 ’-tri-tBu)-Gly-OCH₃

0,85 g (6,8 mmól) H-Gly-OCH₃ · HCl-ot 10 ml dimetilformamidban szuszpendálunk, 0,95 ml (6,8 mmól) trietilamint, majd 10 perc keverés után

3,9 g (6,8 mmól) BOC-Trp(2’,5’,7’-tri-tBu)-ONSu-t adunk hozzá. A reakcióelegyet 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük, másnap a dimetilformamidot ledesztilláljuk, a maradékot éterben oldjuk, n sósavval és 8%-os nátriumhidrogénkarbonát oldattal kirázzuk. Szárítás után az étert ledesztilláljuk és a maradékot vízzel eldörzsöljük. 3,5 g (95%) BOC—Trp(2’,5 ’,7’-tri-tBu)-Gly-OCH₃ -t kapunk. Op.: 75—76 °C, =0,77.

Z—Arg—Trp(2»5 ’,7 ’-tri-tBu)-Gly-OH

2,65 g (4,9 mmól) BOC-Trp(2’,5’,7’-tBu)-Gly-OCH₃ -t 8 ml ecetsav és 0,8 ml tömény sósav elegyében oldunk, 20 perc múlva az oldatot bepároljuk, a maradékhoz 50 ml étert és 30 ml 8%-os nátriumhidrogénkarbonát oldatot adunk. Összerázás után a vizes réteget 20 ml éterrel mossuk, az egyesített éteres oldatot szárítjuk és bepároljuk. Az így nyert H-Trp(2’,5’,7’—tri—tBu)—Gly-OCH₃-t 10 ml dimetilformamidban oldjuk, 1,65 g (4,8 mmól) Z—Arg(HCl)—OH-ot, 0,65 g (4,8 mmól) N-hidroxibenztriazolt és 1,0 g (4,8 mmól) DCC-t adunk hozzá. Másnap a kivált DCU-t leszűqük és az oldatot bepároljuk. A nyers termékhez 50 ml etilacetátot és 20 ml vizet adunk, összerázás után az etilacetátos oldatot négyszer 20 ml 8%-os nátriumhidrogénkarbonát oldattal, majd 20 ml vízzel mossuk. Szárítás után az etilacetátot ledeszíilláljuk és a maradékot petroléter hozzáadásával megszilárdítjuk. A Z—Arg—Trp(2’,5’,7’—tri—tBu)—Gly—OCH₃-t 30 ml etanolban oldj ide, 4,5 ml n nátriumhidroxidot adunk hozzá és szobahőmérsékleten állni hagyjuk.

óra múlva a reakcióelegyet sósavval semlegesítjük, az etanolt ledesztilláljuk és a kristályos maradékot vízzel eldörzsöljük. 50%-os etanolból átkristályosítva 1,62 g (47%) Z-Arg-Trp(2’,5’,7’-tri-tBu)-Gly-OH-t kapunk. Op.: 211-214 °C, r£=0,39.

BOC-Ser—Tyr—Ser—Met-Glu(OtBu)-His—Phe—

Arg—Trp(2’,5’,7’—tri—tBu)—Gly—OH

1,3 g (1,8 mmól) Z-Arg-Trp(2’,5’,7’—tri-tBu)~Gly-OH-t 30 ml 80%-os ecetsavban oldunk és 0,20 g 10%-os csontszenes palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. Miután a reakció befejeződik a katalizátort kiszűrjük és az oldatot bepároljuk. A maradékot éter hozzáadásával megszilárdítjuk és leszűqük. Az így nyert H—Arg—Trp(2’,5’,7’-tri-tBu)-Gly-OH-diacetátot 10 ml dimetilformamidban oldjuk és az oldatot 1,08 ml (6,3 mmól) diizopropiletilaminnal meglúgosítjuk.

1,6 g (1,5 mmól) BOC-Ser—Tyr—Ser—Met—Glu—(OtBu)—His-Phe-N₂H₃-ot 16 ml dimetilformamidban oldunk. Az oldatot —20 °C-ra hűtjük,

2,4 ml (6,0 mmól) 2,5 n etilacetátos sósavoldatot és 0,23 ml (1,93 mmól) terc-butilnitritet adunk hozzá, 5 percig —10 °C-on tartjuk, majd újra -20 °C-ra hűtjük és hozzáadjuk a H—Arg—Trp(2’,5’,7’—tri— —tBu)—Gly—OH diizopropiletilaminnal meglúgosí7 tott oldatát. A reakcióelegyet 1 órán át -5 és 0°C közötti hőmérsékleten keverjük, majd másnapig 0°C-on állni hagyjuk. Ekkor az oldatot bepároljuk, a maradékot vízzel eldörzsöljük, a nyers terméket terc-butanol-víz 4 :1 elegyből átkristályosítjuk. 1,78 g (73%) védett dekapeptidet kapunk. Op.: 207-209°C, R⁴ =0,31.

BOC—Ser-Tyr—Ser-Met—Glu(OtBu)—His—Phe—Arg—Trp(2’,5’,7’—tri—tBu)—Gly—Lys(BOC)—Pro-Val-Gly—Lys(BOC)-Lys-(BOC)— -Arg-Arg-Pro—NH₂ -tritoziját

0,974 g (0,6 mmól) BOC—Ser—Tyr—Ser-Met -Glu(OtBu)-His-Phe- - Arg-T rp(2 ’ ,5 *,7 ’-tri-tBu)-Gly-OH-t és 1,13 g (0,6 mmól) H—Lys(BOC)—Pro—Val—Gly-Lys(BOC)—Lys(BOC)—Lys(BOC)— -Arg-Arg-Pro-NH₂ -tritozilátot 8 ml dimetilformamidban oldunk, 0,084 ml (0,6 mmól) trietilamint és 0,68 g (0,9 mmól) pentafluorfenol—DCC—3 : : 1 -komplexet adunk hozzá. 20 óra múlva a kivált DCU-t kiszűrjük és a szűrletből a terméket éterrel kicsapjuk. 1,9 g (91%) védett nonadekapeptidamid-tritozilátot kapunk. Rf =0,12, feloldást és liofilizálást még kétszer megismételjük, végül a száraz maradékot 5 ml vízben feloldva 2 x 100 cm-es gélszűrő (Sephadex G 25) oszlopra visszük és desztillált vízzel eluáljuk. A termeket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. 102 mg nonadekapeptidamid-hexahidrokloridot kapunk. R| = 0,38, peptid-tartalom: 81%, Cl’-tartalom: számított: 7,1%, talált: 7,0%.

Claims (2)

1. Szabadalmi igénypontok:

   1. Eljárás a

   15 H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-X-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg—Arg—Pro—NH₂ j

   I általános képletű peptidek — ahol ^2l) X -Trp(l’-terc-butil)· vagy -Trp(2’,5’,7’-tri-terc-butil)-csoportot jelent — savaddíciós sóinak és komplexeinek az előállítására, ahol az egyes aminosavgyökök a glicin kivételével L-konfigurációjúak, azzal jellemezve, hogy valamely

   3. példa [TrpO’-tBu)⁹]—ACTH(1 -19)-NH₂ vegyes foszfát-cink komplexe

   1,00 mg [Trpfl’-tBu)⁹]-ACTH(l-19)-NH₂-t,

   8,10 mg cinkkloridot. 1,65 mg dinátriumhidrogénfoszfát-víz (l/12)-t és 10,00 mg benzilalkoholt 0,8 ml desztillált vízben feloldunk, majd pH-jál ³⁵ 0,6 n nátriumhidroxid-oldattal 8,6 pH-értékre beállítjuk és az oldat térfogatát desztillált vízzel l,00ml-re kiegészítjük. Ily módon csapadékos szuszpenziót kapunk. A csapadékban, amely vegyes peptid-foszfát-cink komplex, a peptid, a cink-, ⁴⁰ a foszfát- és a hidroxidion 1 :144 :11 :255 mólarányban van jelen.

   4. példa

   H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp(l’-tBu)-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys—Lys—Arg—Arg—Pro-NH₃ —hexahidroklorid

   128 mg (4ű_Mmol) H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu- 50 -His—Phe—Arg—Trp(l’-tBu)-Gly—Lys—Pro—Val—Gly—Lys—Lys-Arg—Arg—NH₂-hexaacetátot (amelyet az 1. példa szerinti módon állítottunk elő) és 42 mg (0,5 mmól) ammóniumkloridot 10 ml vízben feloldunk, az oldatot liofilizáljuk, majd a 55

   Q—Ser—Tyr—Ser—Met—Glu(OR)—His—Phe— Arg(Q’)—X-Gly—Lys(Q)-Pro—Val—Gly—Lys(Q)— -Lys(Q)-Arg(Q’)-Arg(Q’)~Pro-NH₂

   II

   II általános képletű pepiidről — ahol

   X -Irp(l -terc-butíl)-esoportot vagy -Trp(2’,5',7’-tri-terc-butilcsoportot jelent,

   Q azonos vagy eltérő, a peptidkémiában alkalmazott amino védőcsoportokat,

   Q' hidrogénatomot vagy azonos vagy eltérő, a peptidkémiában alkalmazott guanidino védőcsoportokat és

   R a peptidkémiában alkalmazott karboxil védőcsoportot képvisel — a védőcsoportokat erős savval lehasítjuk és a kapott savaddíciós sőt kívánt esetben más, gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sóvá vagy komplexszé alakítjuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás továbbfejlesztése gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a kapott I általános képletű vegyület gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sóját vagy komplexét - ahol a képletben X az 1. igénypontban megadott jelentésű — a gyógy szerkeszítésben szokásos módon, egy vagy több segédanyaggal összekeverjük és gyógyászati készítménnyé elkészítjük.