FI73225C

FI73225C - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt aktiva derivat av angiotensin-ii, vilka innehaoller i 8-staellningen -hydroxikarboxylsyragrupp.

Info

Publication number: FI73225C
Application number: FI810123A
Authority: FI
Inventors: Laszlo Szporny; Egon Karpati; Lajos Kisfaludy; Olga Nyeki
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1980-01-18
Filing date: 1981-01-16
Publication date: 1987-09-10
Also published as: JPS56142251A; AU541000B2; CS219939B2; PH17196A; PL229223A1; SU993816A3; AU6627681A; NO151409B; ES498583A0; DK149777C; US4330532A; DE3160608D1; EP0034260B1; NO810149L; FI73225B; IL61922A; IL61922A0; EP0034260A1; ATE4197T1; NO151409C

Description

1 73225

Menetelmä terapeuttisesti aktiivisten angiotensiini-II:n johdannaisten valmistamiseksi, jotka sisältävät 8-asemassa pO-hydroksikarboksyylihapporyhmän 5 Keksinnön kohteena on menetelmä uusien peptidien val mistamiseksi, joilla on angiotensiini-II:n vaikutuksia.

Tällä menetelmällä keksinnön mukaisesti valmistetuilla uusilla yhdisteillä on yleinen kaava X - Arg - Vai - Tyr - Ile - His - Pro - Y - OA (I) jossa X on N-metyyliaminoalkaanikarboksyylihapon asyyliryhmä, edullisesti sarkosyyli-ryhmä, Y on alifaattisen -x-hydroksi-karboksyylihapon tähde, edullisesti maitohapon tai L-2-hydr-oksi-3-metyylivaleriaanahapon tähde, ja A on vety tai c^_4~ 15 alkyyliryhmä.

Myös edellä mainittujen peptidien happoadditiosuolojen valmistus kuuluu keksinnön piiriin.

Ensimmäisen angiotensiini-II:n kanssa analogisen yhdisteen, joka osoittautui olevan angiotensiini-II:n spesifi-20 nen kilpaileva jarruttaja sekä in vitro- että in vivo -olosuhteissa, selostettiin 1970 /G.R. Marshal et ai.: Proc. Natl. Acad. Sei. USA 67, 1624 (1970); P.A. Khairallah et ai.: J. Med. Chem. 13, 181 (1970L/. Tämä tietämys pani alulle laajan tutkimustyön angiotensiini-II:n kanssa analogisten 25 yhdisteiden tuottamiseksi, joilla oli antagonistisia vaikutuksia ja joita voidaan käyttää taudinmääritykseen tietyissä reniinistä riippuvissa hypertensioissa ja valinnaisesti myös 1 8 tällaisten tilojen hoitoon. (Sar , Ala )-angtiotensiini-II, eräs tähän asti valmistetuista monista analogisista yhdis-30 teistä, joilla on antagonistisia vaikutuksia, on jo saatettu markkinoille kauppanimellä Saralasin ,/D.T. Pals et ai.: Ciro. Res. 29, 673 (1971),/. Tällä yhdisteellä suoritetut kliiniset testit osoittivat, että aine on käyttökelpoinen taudinmääritykseen eri alkuperää olevissa hypertensioissa /£. Bönner 35 et ai.: Stsch. Med. Wschr. 104, 432 (1979).7, sekä myös tällaisten tilojen hoitoon /J.L. Marx: Science 194, 821 (1976)7/.

2 73225 Äskettäin keksittiin myös, että aineita, joilla on angio-tensiini-II:n vastustavia vaikutuksia, voidaan käyttää hoidettaessa munuaisverisuonien liikapaineen aiheuttamia sydämen toiminnan vajavuuksia /_H. Gavras et ai.: JAMA 238 , 880 5 (19171/.

Tutkimalla tähän asti valmistettujen angiotensiini-II:n kanssa analogisten yhdisteiden rakenteiden ja biologisten vaikutusten välisiä suhteita on saatu paljon tietoja agonististen ja antagonististen vaikutusten tulkintaan.

10 Nykyisin tutkimuksen päätavoitteena on valmistaa antagonisteja, joilla on pidentyneet biologiset puoliintumisajät, ja jotka ovat vapaita tietyistä ei-toivotuista sivuvaikutuksista, kuten agonistisista alkuvaikutuksista.

Nyt on keksitty, että korvattaessa fenyyli-alaniini-15 osa angiotensiini-II-molekyylin 8-asemassa alifaattisella 0<--hydroksikarboksyylihappotähteellä, ja tuomalla molekyyliin samanaikaisesti N-metyyliaminoalkaanikarboksyylihapon asyyliryhmä, edullisesti sarkosyyliryhmä, jota on kuvattu aikaisemmin ja joka on osoittautunut tehokkaaksi samaan tarkoitukseen 20 (ks. saksalaiset patenttihakemukset nro 28 31 271 ja 28 31 534), molekyylin asemaan 1, saadaan uusia angiotensiini-II:n kilpailevia inhibiittoreita, jotka vähentävät angiotensiini-II:n in vivo-olosuhteissa alullepanemaa hypertensiota huomattavasti ja jotka ovat aktiivisia ihonalaisestikin annettuina.

25 Yleisen kaavan (I) mukaisia uusia yhdisteitä X - Arg - Vai - Tyr - Ile - His - Pro - Y - OA (I), valmistetaan keksinnön mukaisesti siten, että a) kun on valmistettava yleisen kaavan (I) mukainen 30 yhdiste, jossa A on vety, suojatun oktapeptidi-johdannaisen, jolla on yleinen kaava (II): B-X-Arg (C) -Val--Tyr(D) -Ile-His (E) -Pro-Y-OF (II) jossa B on ryhmä, joka voidaan poistaa asidolyysillä tai ka-35 talyyttisesti hydraamalla, edullisesti bentsyylioksikarbo-nyyli- tai tert.-butoksikarbonyyliryhmä; C on ryhmä Arg-osan 3 73225 guanidiino-ryhmän tilapäisesti suojaamiseksi, edullisesti nitro- tai tosyyli-ryhmä; D on ryhmä Tyr-osan aromaattisen hydroksi-ryhmän tilapäiseksi suojaamiseksi, edullisesti bentsyyli- tai substituoitu bentsyyli-ryhmä; E on ryhmä His-5 osan imidatsoli-ryhmän tilapäisesti suojaamiseksi, edullisesti dinitrofenyyli-ryhmä; ja F on ryhmä päätekarboksiryh-män suojaamista varten, joka ryhmä on kestävä laimeiden happojen vaikutusta vastaan, mutta on poistettavissa katalyyt-tisesti hydraamalla tai käsittelemällä voimakkaammalla ha-10 polla, suojaryhmät poistetaan joko vaiheittain tai yhdessä ainoassa vaiheessa, tai b) kun on valmistettava yleisen kaavan (I) mukainen yhdiste, jossa A on C^_^-alkyyliryhmä, suojatun oktapepti-din, jolla on yleinen kaava (III): 15 B-X-Arg(C)-Val-Tyr(D)-Ile-His(E)-Pro-Y-OA' (III), jossa B, C, D ja E tarkoittavat samaa kuin edellä, ja A' on C^_4~alkyyliryhmä, suojaryhmät poistetaan joko vaiheittain tai yhdessä ainoassa vaiheessa.

Jos halutaan, muutetaan saadut yleisen kaavan (I) mu-20 kaiset yhdisteet happoadditiosuoloikseen.

Yleisten kaavojen (II) ja (III) mukaisia oktapeptidi-johdannaisia, joita käytetään lähtöaineina keksinnön menetelmässä, voidaan valmistaa jollakin peptidikemiassa tunnetulla menetelmällä, esim. menetelmällä, joka on kuvattu un-25 karilaisessa patentissa nro 168 431. Suojattuja oktapepti-deja valmistettaessa toiminnallisten sivuryhmien suojaamiseen tulisi käyttää suojaryhmiä, jotka ovat pysyviä asido-lyysiolosuhteissa, joita käytetään N-päätesuojaryhmän poistamiseksi liittymisreaktion jälkeen.

30 Keksinnön erään edullisen menetelmän mukaisesti yleis ten kaavojen (II) ja (III) mukaiset suojatut oktapeptidi-johdannaiset muodostetaan vaiheittain ja ryhmiä, jotka voidaan helposti asidolyysillä poistaa, esim. tert-butoksi-karbonyyliryhmää, käytetään suojaamaan tilapäisesti yksit- 4 73225 täisten aminohappojohdannaisten pääte-aminoryhmiä. Lähtöaineena käytetyn oktapeptidijohdannaisen suojaryhmät lohkaistaan pois edullisesti yhdessä ainoassa vaiheessa kata-lyyttisesti hydraamalla, dinitrofenyyliryhmän poistamisen 5 jälkeen tiolyysillä.

OL-hydroksikarboksyylihappotähde tuodaan molekyylin asemaan 8 edullisesti niin, että esteröity !·Χ -hydroksikarbok-syylihappo, jolla on yleinen kaava (IV): H - Y - OZ (IV), 10 jossa Y tarkoittaa samaa kuin edellä ja Z on alkyyli tai aralkyyli, saatetaan reagoimaan N-suojatun proliinin kanssa, jolloin suojaryhmä on edullisesti tert.-butoksikarbonyyli-ryhmä. Tässä reaktiossa muodostunut -CO-O-sidos on pysyvä eikä lohkea synteesin myöhemmissä vaiheissa.

15 Yleisen kaavan (I) mukaiset yhdisteet puhdistetaan sinänsä tunnetuin menetelmin, edullisesti käyttäen ioninvaih-tokromatografiaa karboksimetyyliselluloosalla. Lopputuote erotetaan poistovirtauksesta edullisesti pakastekuivaamalla jauhemaisen aineen saamiseksi, jota voidaan käyttää suoraan 20 eri farmaseuttisten yhdistelmien valmistukseen.

Yleisen kaavan (I) mukaisten uusien yhdisteiden antagonistiset vaikutukset tutkittiin nukutetuilla urospuolisilla kissoilla. Senjälkeen, kun eläimiä oli käsitelty hermosolun salpaavalla aineella ja kaulankiertäjähermot oli hal-25 kaistu kummallakin puolella, eläimiä käsiteltiin Hypertensin (CIBA)-ruiskeella määrällä 0,5 pg/kg/min. Kun eläinten verenpaine saavutti pysyvän, nousseen tason, annettiin testattavaa ainetta joko laskimonsisäisesti tai ihonalaisesti fysiologisessa suolaliuoksessa tai vesipitoisen liuoksena, joka sisäl-30 si myös kantimen. Verenpaineen alenema mitattiin mm Hg-yksi-köissä ja alentuman määrä ilmaistiin prosenteissa arvosta ennen käsittelyä. Tilastollinen arviointi suoritettiin verenpaine-erojen perusteella Student'in yhden näytteen "t"-tes-tillä. Tulokset on koottu taulukkoon 1. Käsite "vaikutuksen 35 kesto" tarkoittaa aikaa, joka kului viimeisen, vielä merkitsevän (p=5 %) verenpaine-eron havaitsemiseen.

5 73225

Huomatukset taulukkoon 1: d = annos, pg/kg i n = testien lukumäärä p = vaikutuksen kesto, minuutteja 5 phys.sal. = fysiologinen suolaliuos CMC = karboksimetyyliselluloosa 6 73225 h A σ' ca cm ^ tn o 0 jj K ^ N co ΙΆ

£ jj CM ΚΛ OJ CM

% I

c 0 1Λ 1Λ ΙΛ 4" 1 ·* -p · «d o o o o

:cö -k n tn o o O

>0) r-H OJ C\l :rö en +> X ft LA O IA O Q la o

<-* 2 0· 0\ 0· 0> O 4- CA

:<C -P κλ

Ui 3 ^ fcR LA CM H IA K\ 00

m 3 OJ CM CM d K\ CM OJ

m > § ^ ^ *. d to to ιλ tr\ ia la i>- 0 te · r~i > ~

* .2 ra -Ö O O O Q Q O Q

cc LA O O O O OO

d)Qj pHOJrH rH rH CM

t3 h φ 10 ι-n ft O o Q la O Ola P <0 CO CA CM 00 -3- fA LD-d·

CO +J CJ 1—I rH

•H +J · do; en σ> k\ o- la oo ca d

x: e p>> C\1 |C\ 0· H H OJ OJ

>1 -h ja rH (0 pj

Cft d LA IA LA LO LA VD LA

0 OJ e · X -PO) .

1 f s i " s; 8 § 8 8 88

go. H K H r-t rt OI

E-ι (C 00

S rt ft LA LA CM IA LA O LA

S H rH rH CM 0 CM rH

(0 Ui

Se ^ KN O' LNOfAOCM

βφ · CM OJ OJ-0-KN-0-KN

(0 en > x te · _

•H d LA IA LA CO LA VD LA

ö S

H jj >dOO 00000

1 ft rH CM rH CM rH CM H

•H £ -P

Gg QJ H

H f Φ H

•H rd -P I

tn -H tn bO

“ 3 £ H d C K.. 'O t—I <£

0) £ rC I ^ M

o I * S? 0

?! S ~ 8 S

s -i -rt ®„ ia 5 3 3 ^ a S3 3 sä «

i< » ·» ·> CD

rH rH rH rH

d d d co m en co d

OJ <Ä OJ OJ

7 73225

Taulukon 1 luvuista näkyy, että kaikilla angiotensii-ni-II:n kanssa analogisilla yhdisteillä, jotka sisältävät ^-hydroksikarboksyylihappotähteen asemassa 8 ja sarkosyyli-ryhmän asemassa 1, on merkittäviä verenpainetta alentavia 5 vaikutuksia. Tämä vaikutus on merkittävä jopa ihonalaisesti annettaessa; kun yhdisteet annetaan liuoksessa, joka sisältää myös kantimen, vaikutuksen kestoaika voi toisinaan nousta useisiin tunteihin.

Keksinnön mukaisesti valmistettujen yhdisteiden farma-10 kologista tehoa tutkittiin lisäksi seuraavassa esitetyillä kokeilla.

Koeselostuksissa käytettyjen koodien merkitykset:

Koodi Yhdisteen nimi Patenttihakemus, jossa yhdiste 15 _on esitetty_ 1270 (Amino-oksiasetyyli^,Leu8)-Angll RI-640 1 8 1275 (D-X-amino-oksipropionyyli,Leu)-Angll " 1393 (Amino-oksiase tyyli Ile8)-Angll_"_

*| Q

1229 (L-X-hydroksipropionyyli,Leu)-Angll RI-641 ^ 1273 (Hydroksiasetyyli^,Ile®)-Angll " 1377 (L-ot-hydroksipropionyyli1, Ile®) -Angll " 1383 (Hydroksiasetyyli^,Ile8)-Angll " 1406 (Hydroksiasetyyli^,Thr/Me/8) -Angll_"_ 1546 (Sar^,L-Lac®)-Angll Esillä oleva 25 1669 (Sar1,L-Lac-OEt8)-Angll 1716 (Sar1,HMW8)-Angll_"_

Koe I

Yhdisteiden vaikutus, kun niitä annettiin intravenöösis-30 ti narkoosissa oleville kissoille samanaikaisesti jatkuvan an-giotensiini II-infuusion kanssa.

Aktiiviaineita käytettiin liuotettuina fysiologiseen natriumkloridiliuokseen.

35 8 73225

Aktiiviaineen Verenpaineen aleneminen, mmHg - S.E.M, nimi tai koodi käytetyn annoksen funktiona_ _ 10 pg/kg_20 pg/kg_

Saralasin -41 +2,5 5 1220 -33 + 3,6 -42 + 4,2 1275 -30 + 3,4 -38 + 3,8 1393 -28 + 2,0 -40 + 5,7 1229 -32 + 3,7 -40 + 2,7 10 1237 -31 + 4,7 -42 + 2,8 1377 -31 + 3,3 -38 + 4,1 1383 -24 + 1,7 -30 + 2,3 1406 -33 + 5,3 -38 + 4,1 1546 -27 + 6,4 -34 + 6,9 15 1669 -38 + 5,0 -55 + 6,5 1716 -44 _+ 8,0 -55 _+ 5,5

Yhdisteillä 1669 ja 1716 on lähes sama aktiivisuus kuin saralasiinilla ja niillä on voimakkaampi vaikutus kuin patentti-20 hakemuksissa RI-640 ja RI-641 esitetyillä yhdisteillä.

Yhdisteen 1546 vaikutus on heikompi kuin saralasiinin ja eräiden hakemuksista RI-640 ja RI-641 tunnettujen yhdisteiden vaikutus.

Koe II

25 Anto nukutetuille kissoille subkutaanisti samanaikai sesti jatkuvan angiotensiini II-infuusion kanssa.

Aktiiviaineita käytettiin liuotettuina fysiologiseen natriumkloridiliuokseen 30 Aktiiviaineen Annos Verenpaineen aleneminen,mmHg + S.E.M nimi tai koodi pg/kg 15 30 60 120 -— minuuttia käsittelyn jälkeen

Saralasin 100 -33+ 2,8 -22 + 6,1 -9 + 3,9 -3,3.+ 3,1 _200 -24+8,0 -24+8,1 -12+6,0 -7,0+4,3 35 1270 100 -23+3,1 -16+4,4 -5+4,8 1275_100 -31 + 7,1 -27 + 8,0 -9 + 4,8 9 73225

Aktiiviaineen Annos Verenpaineen aleneminen, mmHg _+ S.E.M. nimi tai koodi pg/kg 15 30 60 120 _' _minuuttia käsittelyn jälkeen_ 1229 200 -27,9+1,9 -24,8+2,5 -8,7+2,3 5 1237 200 -27+1,0 -32+3,6 -25+6,9 1377 100 -24+3,6 -16+2,5 -3+4,2 1546 200 -49+9,4 -52+9,4 -43+9,0 -25+8,8 1669 100 -12+3,2 -12+3,0 -2,8+2,8 1716 100 -16 + 2,3 -14 + 5,3 -4_+3,8 10 ——-

Tavanomaisessa fysiologisessa suolaliuoksessa käytettynä yhdisteellä 1546 oli erittäin voimakas ja pitkäaineinen verenpainetta alentava vaikutus. Näissä olosuhteissa yhdisteiden 1669 ja 1716 vaikutus oli heikompi ja lyhytaikaisempi kuin 15 saralasiinin ja hakemuksista RI-640 ja RI-641 tunnettujen yhdisteiden vaikutus.

Koe III

Anto nukutetuille kissoille subkutaanisti samanaikaisesti jatkuvan angiotensiini II-infuusion kanssa.

20 Aktiiviaineita käytettiin liuotettuina natriumkloridi- liuokseen, joka sisälsi 17 % gelatiinia.

Aktiiviaineen Annos Verenpaineen aleneminen,

nimi tai koodi pg/kg mmHg + S.E.M

15 30 60 120 25 _minuuttia käsittelyn jälkeen_

Saralasine 200 -23+10 -24^10 -12+7,8 -1+2,3 1270 200 -23+2 -21+2,2 -10+2,8 -1+5,1 1275 200 -24+5,7 -21+5,6 -9+5,7 -3+8,8 30 1229 200 -24+3,5 -19+3,1 -7+3,1 -3+2,0 1377 200 -28+10 -28+7 -25+6 -5+7,3 1546 200 -22,5+2,0 -31+5,7 -32+9,2 -28+11,0 Näissä käyttöolosuhteissa yhdisteen 1546 alkuvaikutus 35 on suhteellisen vähäinen, mutta 30 minuutin kuluttua sen teho ylittää muiden kokeessa käytettyjen aktiiviaineiden tehon. On 10 7 32 25 merkillepantavaa, että tämä voimakas vaikutus säilyy lähes muuttumattomana jopa 120 minuutin ajan. Näin pitkän ajan kuluttua muiden tutkittujen yhdisteiden vaikutus oli käytännöllisesti katsoen merkityksetön.

5 Koe IV

Aktiiviaineita käytettiin liuotettuina fysiologiseen nat-riumkloridiliuokseen, joka sisälsi 1 % karboksimetyyliselluloosaa.

10

Aktiiviaineen Annos Verenpaineen aleneminen, nimi tai koodi ug/kg mmHg + S.E.M.

15 30 60 120 _minuuttia käsittelyn jälkeen_

Saralasin 100 -29+^4,9 -28 + 4,0 -10_+4,3 -5^+2,6 15 200 -22+3,6 -36+4,2 -28+5,1 -5+3,7 1270 200 -21+5,8 -26+7,2 -13+9,4 -5+7,8 1275 200 -21+6,7 -24+5,7 -16+5,1 -1+4,0 1229 200 -28+3,1 -38+2,4 -25+1,5 -5+1,8 20 1237 200 -17+4,9 -29+5,4 -22+7,0 -1+2,4 1377 200 -23+2,9 -24+3,9 -12+4,7 -4+2,8 1406 200 -2+3,9 -23+5,7 -8+7,8 +4+3,3 1546 100 -28+4,3 -27+3,8 -17+3,3 -10+4,9 1669 100 -51+5,2 -48+6,5 -22+8,1 -8,8+7,3 25 1716 100 -39+7,7 -39+7,2 -25+5,6 -8,2+1,8

Kun käytetään subkutaanisti koostumusta, jossa on karboksimetyyliselluloosaa, yhdisteillä 1669 ja 1716 on erittäin voimakas vaikutus. Kaikilla kolmella keksinnön mukaisesti val-30 luistetulla yhdisteellä havaitaan merkittävä vaikutusajan piteneminen. 120 minuutin kuluttua niiden vaikutus on lähes kaksin-kerainen saralasiiniin verrattuna (jopa silloin kun saralasii-nin annos on sama tai kaksinkertainen); samoin niiden vaikutus on lähes kaksinkertainen verrattuna hakemuksista RI-640 ja 35 RI-641 tunnettuihin yhdisteisiin silloinkin, kun viime mainit tuja annetaan kaksinkertainen annos.

11 73225

Vaikka yhdisteen 1546 alkuvaikutus on vähäisempi kuin muiden tutkittujen yhdisteiden alkuvaikutus, niin 60 ja 120 minuutin kuluttua mitattu vaikutus on voimakkaampi kuin sara-lasiinilla, ja 120 minuutin kuluttua tämän yhdisteen vaikutus 5 on tutkituista yhdisteistä voimakkain vaikutus. Verrattaessa 60 minuutin kuluttua mitattuja vaikutuksia hakemuksista RI-640 ja RI-641 tunnetut yhdisteet ovat siihen verrattavia ainoastaan niiden annosten ollessa kaksinkertaiset.

Koe V

10 Anto intravenöösisti rotille, jotka ovat renaalisesti hypertensiivisiä.

Rotille, jotka oli tehty hypertensiivisiksi sitomalla niiden munuaiset, annettiin aktiiviaineita intravenöösi-infuu-sioina ja mitattiin suurin verenpaineen alenema.

]_5 ..........

Aktiiviaineen Annos Verenpaineen maksimialenemn, nimi ja koodi_|ig/kq/min_mmHg ± S.E.M._

Saralasin 1,0 -27,8 _+ 6,7 1546 1,0 -54,2 + 11,6 20 1669 1,0 -32,6 + 6,7 1716 1,0 -35,6 + 6,8

Rotille keinotekoisesti munuaisten sitomisella aikaansaatu hypertonia vastaa tietyssä määrin ihmisen munuaispe-25 räistä hypertoniaa. Kummankin muodostumismekanismissa endo-geenisen angiotensiinin muodostumisen voimistumisella on tärkeä merkitys. Tässä tapauksessa keksinnön mukaisesti valmistetuilla yhdisteillä on merkittävästi voimakkaampi vaikutus kuin saralasiinilla (Tässä kokeessa ei tutkittu hakemuksista 30 RI-640 ja RI-641 tunnettuja yhdisteitä, koska niillä todet tiin jo esikokeissa olevan heikompi vaikutus).

Koe VI

Vaikutuksen tutkiminen in vitro eristettyyn lisämunuais-alueen glumeruloosiin.

35 Tässä kokeessa mitattiin yhdisteiden inhivoiva vaikutus 12 73225 aldosteronin tuotantoon, joka stimuloitiin lisämunuaisalueen glomeruloosissa angiotensiini 11:11a.

i- Aktiiviaineen Inhiboitumisaste nimi ja koodi pA2

Saralasine 9,63 _+ 0,03 1546 9,85 + 0,07 1669 9,28 + 0,13 10 - 1716 10,59 + 0,08

Koe VII

Vaikutuksen tutkiminen in vitro eristettyhin kaniinin 15 aorttanäytteisiin.

Eristettyjen kaniinin aorttanäytteiden supistuminen aikaansaatiin angiotensiini II:n avulla ja mitattiin, missä määrin supistumista voidaan inhiboida erilaisilla aktiiviai-neilla (antagonisteilla).

20 _

Aktiiviaineen Inhiboitumisaste nimi tai koodi pA2

Saralasine 10,7 1546 10,9 25 1669 9,4 1716 15,0

Koe VIII

30 Vaikutuksen tutkiminen in vitro eristettyihin rotan mahalaukun pohjukaisnäytteisiin.

Eristettyjen rotan mahalaukun pohjukaisnäytteisen supistuminen aikaansaatiin angiotensiini II:n avulla ja mitattiin, missä määrin supistumista voitiin inhiboida erilaisilla aktii-35 viaineilla (antagonisteilla).

13 73225

Aktiiviaineen Inhiboitumisaste nimi tai koodi pA2

Saralasine 11,56 5 1546 12,07 1669 13,47 1716 11,79

In vitro-kokeiden (kokeet VI, VII ja VIII) perusteella 10 voidaan todeta, että yhdisteet 1716 ja 1546 osoittautuivat saralasiinia tehokkaammiksi kaikissa kolmessa kokeessa ja yhdiste 1669 yhdessä kokeessa (mutta siinä teholtaan lähes satakertaiseksi) .

Käsite "farmaseuttisesti hyväksyttävä kompleksi" tarkoitin taa yleisen kaavan (I) mukaisen peptidin yhdisteitä, jotka on muodostettu tiettyjen orgaanisten tai epäorgaanisten aineiden kanssa, jotka antavat vaikuttavalle aineelle pitkitetyn vaikutuksen. Orgaanisista kompleksin muodostavista aineista mainit-takoot esim. tietyt hyytelötyypit, karboksimetyyliselluloosa, 20 alginaatit, polyfloretiinifosfaatit, aminohappopolymeerit ja -sekapolymeerit jne. Epäorgaanisia kompleksin muodostavina aineina voidaan käyttää esim. sinkkihydroksidia ja niukkaliukoi-sia sinkkisuoloja, kuten sinkkifosfaatteja.

Tällä menetelmällä keksinnön mukaisesti valmistettuja 25 uusia peptidejä, lisäksi niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja ja komplekseja, voidaan käyttää hoidossa tavallisten farmaseuttisten yhdistelmien muodossa. Nämä yhdistelmät sisältävät uusia keksinnön mukaisia yhdisteitä sekoitettuina orgaanisen tai epäorgaanisen kantimen kanssa, joka sopii annet-30 tavaksi enteraalisesti tai parenteraalisesti. Farmaseuttiset yhdistelmät voivat olla esim. pakastekuivattuja kiinteitä aineita, jotka sisältävät kantimia, jotka eivät reagoi peptidin kanssa, kuten hiilihydraatteja, edelleen väkevöityjä tai laimeita suspensioita ja emulsioita, jotka voivat sisältää 35 myös erilaisia säilöntä- ja stabiloimisaineita.

14 73225 Näitä farmaseuttisia yhdistelmiä voidaan käyttää eri alkuperää olevien hypertensioiden määrittämiseen ja eroittamiseen toisistaan ja terapiassa munuaisperäisten hypertensioiden vaimentamiseen hoidettaessa hyperten-5 siivisiä kipukohtaisia, sekundaarista sydämen toiminnanvajausta jne.

Farmaseuttisia yhdistelmiä annetaan edullisesti ruiskeiden muodossa, jotka sisältävät 1-10 mg vaikuttavaa ainetta. Keksinnön mukaisia vaikuttavia aineita voi-10 daan antaa 1-10 mg:n päivittäisinä annoksina aikuisten hoitoon. Tämä määrä annetaan edullisesti kerran päivässä laskimonsisäisen, ihonalaisen tai lihaksensisäisen ruiskeen muodossa tai hitaana laskimonsisäisenä nesteruis-keena.

15 Keksintöä selvitetään yksityiskohtaisesti seuraa- vien ei-rajoittavien esimerkkien avulla.

Esimerkeissä käytetyt lyhenteet vastaavat kirjallisuudessa yleensä käytettyjä lyhenteitä £j. Biol. Chem. 247, 977 (1972 )_7 - Muita lyhennyksiä ovat: 20 Las = L-maitohappo, HMV = L-2-hydroksi-3-metyylivaleri-aanahappo, Pfp = pentafluorifenyyli.

Yhdisteitä valmistettaessa haihduttaminen suoritettiin aina Böchi-tyyppisellä Rotavapor-laitteella. Ohut-levy-kromatogrammit otettiin "Kieselgel-6"-piihappogee-25 likerroksella, joka oli valmistettu Stahl'in mukaisesti, ja seuraavia liuotinseoksia käytettiin kromatogrammin kehittämiseen: (1) n-heksaani:etyyliasetaatti = 4:1 (2) etyyliasetaatti: (pyridiini:etikkahappo:vesi = 30 20:6:11) = 95:5 (3) etyyliasetaatti: (pyridiini:etikkahappo:vesi = 20:6:11) = 90:10 (4) etyyliasetaatti: pyridiini:etikkahappo:vesi = 20:6:11) = 80:20 15 73225 (5) etyyliasetaatti: (pyridiini:etikkahappo:vesi = 20:6:11) = 70:30 (6) n-butanoli:etikkahappo:vesi 4:1:5 (ylempi faasi) (7) n-butanoli:etikkahappo:pyridiini:vesi = 39:6:20:24 5 (8) n-butanoli:etyyliasetaatti:etikkahappo:vesi = 1:1:1:1

Ohutlevy-kromatogrammit tehtiin näkyviksi nin-hydriinillä tai klooritolidiini-kaliumjodidilla.

Lopputuotteiden puhdistamiseen käytettiin seulo raavaa yleistä menettelytapaa: 0,5 g vapaata peptidiä liuotetaan 4 ml:aan 0,01-moolista ammoniumasetaatti-liuosta ja liuos kerrostetaan 0,5 l:n karboksimetyyliselluloosapylvääseen (CMC-52), joka on sitä ennen tasapainotettu samalla 15 puskuriliuoksella. Gradientti-seosta, jossa on 1,5 1 0,01 moolista ammoniumasetaattiliuosta ja 1,5 1 0,4-moolista ammoniumasetaattiliuosta, käytetään eluoimis-aineena. Eluoimisainetta viedään kolonnin läpi nopeudella 25 ml/h ja poistovirtaus kootaan 10 ml:n jakeiksi.

20 Kolonnista poistuvan virtauksen koostumusta tarkkaillaan jatkuvasti LKB Uvicord-II-laitteella, pääfraktio erotetaan saadun käyrän perusteella ja pakastekuivataan sitten Leybold-Hereuspakastekuivurissa. Jos on tarpeen, tuote saatetaan toistuvasti kromatografiaan käyttäen 25 jälleen gradientti-eluointia.

Esimerkki 1 1 8 (Sarkosiini , L-maitohappo )-angiotensiini-II:n valmistus Vaihe 1

Boc-Pro-Lac-OBzl:n valmistus 30 2,4 g (15 mmoolia) karbonyylidi-imidiatsolia li sätään 0°C.ssa 10 minuutin aikana sekoituksenalaiseen liuokseen, jossa on 2,15 g (10 mmoolia) Boc-Pro-OH 10 ml:ssa kuivaa tetrahydrofuraania. Sen jälkeen reak-tioseokseen lisätään tiputtaen liuos, jossa on 1,8 g 16 73225 (10 mmoolia) bentsyyli-L-laktaattia 10 ml:ssa kuivaa tetrahydrofuraania, joka on jäähdytetty 0°C:seen, 0°C:ssa 15 minuutin aikana. Saatua seosta sekoitetaan 0°C:ssa 30 minuuttia ja sitten 20°C:ssa 2 tuntia, minkä 5 jälkeen seosta varastoidaan jääkaapissa. Seuraavana päivänä liuotin poistetaan, jäännös liuotetaan 30 ml:aan kloroformia ja liuos pestään peräkkäin 1 n kloorivety-hapolla (4 x 10 ml), vedellä, vesipitoisella natriumbikarbonaatti-liuoksella (2 x 15 ml) ja sitten jälleen 10 vedellä. Kloroformiliuos kuivataan ja haihdutetaan muuttumattomaan painoon, öljymäinen jäännös kuivataan eksik-kaattorissa fosforipentoksidilla antamaan 3,0 g (80 %) Boc-Pro-Lac-OBzl, kromatografisesti yhtenäinen tuote;

Rfi;L) = 0,32, Rf(2) = 0,57.

15 Vaihe 2 Z-Sar-Arg(NO2)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Lac-OBzl:n valmistus _

Liuoksen, jossa on 2,85 g (7,5 mmoolia) Boc-Pro-Lac-OBzl 15 mlrssa 8 n kloorivetyhappoliuosta dioksaa-20 nissa, annetaan seistä 15 minuuttia. Liuokseen lisätään 30 ml kuivaa eetteriä ja seos haihdutetaan kuiviin. Saatu vapaa dipeptolidi-hydrokloridi, Rf ^ = 0,37, liuotetaan 20 ml:aan dimetyyliformamidia, liuoksen pH asetetaan 8:aan trietyyliamiinilla ja sitten lisätään 2,9 g 25 (5 mmoolia) Boc-His(Dnp)-OPfp. Reaktioaseosta sekoitetaan yksi tunti ja seoksen pH pidetään 8:ssa. Sen jälkeen liuotin haihdutetaan, jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin ja tämä liuos pestään peräkkäin 10-%:sella vesipitoisella sitruunahappoliuoksella, 1 n vesipitoisella 30 kloorivetyhapolla, 5-%:sella vesipitoisella natriumbikarbonaatti-liuoksella ja sitten vedellä. Liuos kuivataan, liuotin poistetaan ja syntynyt raaka suojattu (2) tripeptidi, = 0,77, liuotetaan 10 ml:ssa 8 n kloo rivetyhappoliuosta dioksaanissa. 20 minuutin seisomisen 73225 jälkeen vapaa tripeptidi-hydrokloridi saostetaan kuivalla eetterillä ja sakka suodatetaan erilleen ja pestään (4) eetterillä. Saatu vapaa tripeptidi-hydrokloridi, = 0,10, liuotetaan 20 ml:aan dimetyyliformamidia, liuoksen 5 pH asetetaan arvoon 8 trietyyliamiinilla ja seokseen lisätään 2,78 g (7,5 mmoolia) Boc-Ile-OPfp. Reaktioseosta sekoitetaan yksi tunti ja seoksen pH pidetään alkuarvossaan. Senjälkeen liuotin haihdutetaan, jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin ja liuos pestään kuten edellä selostet-10 tiin. Liuos kuivataan, liuotin haihdutetaan, jäännös hierretään n-heksaanilla ja kiinteä aine suodatetaan (2) erilleen. Saatu suojattu tetrapeptidi, R^ = 0,67, liuotetaan 10 ml:aan 8 n kloorivetyhappoliuosta dioksaa-nissa, liuoksen annetaan seistä 15 minuuttia ja vapaa 15 tetrapeptidi-hydrokloridi, Rf^ = 0,52, saostetaan kuivalla eetterillä. Tämä yhdiste liuotetaan 20 ml:aan dimetyyliformamidia, liuoksen pH asetetaan 8:aan, lisätään 3,24 g (6 mmoolia) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp ja seosta sekoitetaan 30 minuuttia pitäen pH alkuvarvossa. Liuotin poistetaan, 20 jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin ja seokseen lisätään 0,22 ml Ν,Ν-dimetyyliaminoetyyliamiinia aktiivisen esterin ylimäärän poistamiseksi. 15 minuutin seisomisen jälkeen liuos pestään peräkkäin 10-%:sella vesipitoisella sitruunahappoliuoksella, 1 n vesipitoisella kloorivety-25 happoliuoksella, vedellä, 5-%:sella vesipitoisella nat-riumbikarbonaattiliuoksella ja sitten jälleen vedellä, kuivataan ja haihdutetaan. Jäännös hierretään n-heksaa- nin ja eetterin 8:2-seoksella ja erottunut kiinteä aine (3) suodatetaan pois. Saatu suojattu pentapeptidi, R^ = 30 0,72, liuotetaan 10 ml:aan 8 n kloorivetyhappoliuosta dioksaanissa, liuoksen annetaan seistä 15 minuuttia ja sitten vapaa pentapeptidi-hydrokloridi saostetaan kuivalla eetterillä. Saatu aine liuotetaan 20 ml:aan dimetyyliformamidia, liuoksen pH asetetaan arvoon 8 trietyy- 18 73225 liamiinilla ja lisätään 2,6 g (6,8 mmoolia) Boc-Val-OPfp. Liuosta sekoitetaan yksi tunti pitäen pH alkuarvossa, sitten liuotin haihdutetaan, jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin ja liuos pestään kuten edellä kuvattiin.

5 Pesty liuos kuivataan ja haidutetaan ja jäännös hierretään kuivalla eetterillä. Saatu suojattu heksapeptidi, Rf ^ = 0,83, suodatetaan erilleen, liuotetaan 10 ml:aan 8 n kloorivetyhappoliuosta dioksaanissa ja 15 minuutin seiso- (5) inisen jälkeen vapaa heksapeptidihydrokloridi, Rf = 10 0,65, saostetaan kuivalla eetterillä. Tämä tuote liuote taan 20 ml:aan dimetyyliformamidia, liuoksen pH asetetaan 8:aan trietyyliamiinilla ja lisätään 2,2 g (5 mmoolia) Boc-Arg(NO2)~0Pfp. Seosta sekoitetaan yksi tunti pitäen pH alkuarvossa, minkä jälkeen se laimennetaan 15 60 ml:11a kloroformia ja saatu seos pestään peräkkäin 10-%:sella vesipitoisella sitruunahappoliuoksella, 1 n vesipitoisella kloorivetyhapolla ja vedellä. Liuos kuivataan, haihdutetaan ja jäännös hierretään etanolin ja eetterin 1:1-seoksella. Saatu suojattu heptapeptidi, 20 Rf^ =0,65. liuotetaan 10 ml:aan 8 n kloorivetyhappoliuosta dioksaanissa ja 15 minuutin seisomisen jälkeen vapaa heptapeptidi-hydrokloridi, Rf ^ =0,40, saostetaan kuivalla eetterillä. Sakka suodatetaan erilleen, pestään, kuivataan ja liuotetaan sitten 15 ml:aan 25 dimetyyliformamidia. Liuoksen pH asetetaan 8:aan ja lisätään 1,8 g (5 mmoolia) Z-Sar-0Pfp. Liuosta sekoitetaan 30 minuuttia pitäen pH alkuarvossa, laimennetaan sitten 45 ml:11a kloroformia ja ravistellaan veden kanssa. Seos kuivataan, haihdutetaan, jäännös hierretään kuival-30 la eetterillä ja kiinteä aine suodatetaan erilleen. Saadaan 2,12 g (29,6 % laskettu His:lle, mikä vastaa 82 %:n saalista yksittäisissä vaiheissa) Z-Sar-Arg (NO->) -Val-Tyr (Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Lac-OBzl; Rf ' = 0,465, sp.:204-213°C.

19 73225

Vaihe 3

Suojaryhmien poistaminen 2,3 ml (30 rrmoolia) 2-merkaptoetanolia lisätään liuokseen, jossa on 1,45 g (1 mraoolia) suojattua okta-5 peptidiä, joka on saatu kuten vaiheessa 2 selostettiin, 5 ml:ssa dimetyyliformamidia. Yhden tunnin sekoittamisen jälkeen lisätään seokseen kuivaa eetteriä, syntynyt suojattu oktapeptidi, joka on nyt vapaa Dnp-ryhmästä, erotetaan ja puhdistetaan saostamalla metanolista ja iq eetteristä. Saadaan 1,14 g (89 %) osittain suojaukses- (4) ta vapautettua peptidiä; Rf = 0,60. Tämä aine liuotetaan 40 ml:aan metanolin, etikkahapon ja veden 5: lyseosta, lisätään 0,6 g 10-%:sta palladium/hiili-kata-lyyttiä ja seosta hydrataan 20 tuntia voimakkaasti se-15 koittaen. Sen jälkeen katalyytti suodatetaan pois, pestään edellä mainitulla liuotinseoksella ja suodos haih- 1 8 dutetaan kuiviin. Saadaan 0,7 g (84 %) (Sar , Lac )-Ang- II.

Vaihe 4 2o Raaka peptidi puhdistetaan edellä kuvatun yleisen menetelmän mukaisesti. Puhtaan tuotteen fysikaaliset vakiot ovat seuraavat: kromatografiset vakiot: R^ ^ = 0,17, Rf(7) = 0,40, Rf(8) = 0,21.

Aminohappoanalyysi: Pro 1,0 (1), Vai 1,0 (1), Ile 1,03 25 (1)/ Tyr 0,85 11), His 0,85 (1), Arg 0,96 (1), Sar 1,0 (1) .

Esimerkki 2 1 8 (Sarkosiini ,etyyli L-laktaatti )-angiotensiini-II:n valmistus____ 30 Vaihe 1

Boc-Pro-Lac-0Et:n valmistus 4,8 g (30 mmoolia) karbonyylidi-imidatsolia lisätään 0°C:ssa 10 minuutin aikana liuokseen, jossa on 4,3 g (20 nmoolia) Boc-Pro-0H 20 ml:ssa kuivaa tetra-35 hydrofuraania. Sen jälkeen lisätään seokseen tiputtaen samassa lämpötilassa kylmä liuos, jossa on 2,1 g (20 mmoo- 20 73225 lia) etyyli L-laktaattia tetrahydrofuraanissa. Seosta sekoitetaan vielä 30 minuuttia 0°C:ssa ja sitten 2 tuntia 20°C:ssa ja annetaan seistä jääkaapissa yli yön. Seuraa-vana päivänä tetrahydrofuraani tislataan pois, jäännös 5 liuotetaan 40 ml:aan etyyliasetaattia ja liuos pestään peräkkäin 1 n vesipitoisella kloorivetyhapolla (2 x 15 ml), vedellä, 5-%:sella vesipitoisella natrium-bikarbonaattiliuoksella (kahdesti) ja sitten jälleen vedellä. Liuos kuivataan, liuotin haihdutetaan ja öljy-10 mäinen jäännös kuivataan eksikkaattorissa muuttumattomaan painoon. Saadaan 2,22 g (36 %) Boc-Pro-Lac-DEt;

Rf (3) = 0,77, Rf(1) = 0,36.

Vaihe 2 Z-Sar-Arg(NC^)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Lac-DEt:n 15 valmistus_

Liuokseen, jossa on 1,8 g (6 mmoolia) Boc-Pro-

Lac-OEt 8 ml:ssa 7,5 n kloorivetyhappoliuosta dioksaanis- sa, annetaan seistä 15 minuuttia. Liuokseen lisätään 30 ml eetteriä ja seos haihdutetaan kuiviin. Syntynyt (4) 20 vapaa peptolidi-hydrokloridi, R^ ' = 0,31, liuotetaan 15 ml:aan dimetyyliformamidia, liuoksen pH asetetaan 8:aan trietyyliamiinilla ja lisätään 2,9 g (5 mmoolia) Boc-His (Dnp)-OPfp. Yhden tunnin kuluttua liuotin korvataan etyyliasetaatilla ja syntynyt liuos pestään peräk-25 käin 10-%:sella vesipitoisella sitruunahappoliuoksella, 1 n vesipitoisella kloorivetyhapolla, 5-%:sella vesipitoisella natriumbikarbonaatti-liuoksella ja sitten jälleen vedellä. Liuos kui\ataan, haihdutetaan ja synty- (2) nyt suojattu tripeptidi, R^ = 0,69, liuotetaan välit- 30 tömästi 20 ml:aan 7,5 n kloorivetyhappoliuosta dioksaanis- sa. 20 minuutin seisomisen jälkeenvapaa tripeptidi-hyd- (4) rokoloridi, R^ = 0,19, saostetaan kuivalla eetterillä, aine liuotetaan 15 ml:aan dimetyyliformamidia, liuoksen pH asetetaan 8:aan trietyyliamiinilla ja lisätään 3,0 g 35 (7,5 mmoolia) Boc-Ile-OPfp. Seoksen annetaan seistä 30 minuuttia pitäen pH alkuarvossa, sen jälkeen liuotin 21 73225 haihdutetaan, jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin ja syntynyt liuos pestään kuen edellä selostettiin. Liuos kuivataan, haihdutetaan, jäännös hierretään eetterin ja n-heksaanin 2:8-seoksella ja kiinteä aine suodatetaan (3) 5 pois. Saatu suojattu tetrapeptidi, =0,36, liuote taan 10 ml:aan 8 n kloorivetyhappoliuosta dioksaanissa ja 15 minuutin seisomisen jälkeen vapaa tetrapeptidi- (5) hydrokloridi , = 0,27, saostetaan kuivalla eette rillä. Tuote liuotetaan välittömästi 20 ml:aan dimetyyli-10 formamidia, liuoksen pH asetetaan 8:aan ja lisätään 3,24 g (6 mmoolia) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp. Liuoksen annetaan seistä 30 minuuttia pitäen pH alkuarvossa, minkä jälkeen liuotin haihdutetaan ja jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin. Liuokseen lisätään 0,22 ml N,N-dimetyyliamino-15 etyyliaminia, seoksen annetaan seistä 10 minuuttia, pestään sitten kuten edellä kuvattiin, kuivataan ja haihdutetaan. Jäännös hierretään n-heksaanilla ja suodatetaan. Syntynyt suojattu pentapeptidi, R^^ _ o,64, liuotetaan 10 ml:aan 8 n kloorivetyhappoliuosta dioksaanissa ja 20 . 15 minuutin seisomisen jälkeen vapaa pentapeptidi-hyd- (4) rokloridi, R^ =0,33, saostetaan kuivalla eetterillä. Tuote liuotetaan 15 ml:aan dimetyyliformamidia, liuoksen pH asetetaan 8:aan trietyyliamiinilla ja lisätään 2,1 g (5,5 mmoolia) Boc-Val-OPfp. Liuoksen annetaan seistä 25 30 minuuttia pitäen pH alkuarvossa, sitten se haihdute taan, jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin ja tämä liuos pestään kuten edellä selostettiin. Liuos kuivataan, haihdutetaan, jäännös hierretään n-heksaanilla ja suoda- (2) tetaan sitten. Syntynyt suojattu heksapeptidi, Rf ' = 30 0,76, liuotetaan välittömästi 10 ml:aan 8 n kloorivety happoliuosta dioksaanissa ja 15 minuutin seisomisen jäl-keen vapaa heksapeptidi-hydrokloridi, Rf ' = 0,34, saostetaan kuivalla eetterillä. Tämä aine liuotetaan 20 ml:aan dimetyyliformamidia, liuoksen pH asetetaan 8:aan ja lisä- 22 73225 tään 3,96 g (6 mmoolia) Boc-Arg(N02)-OPfp. Liuoksen annetaan seistä yksi tunti pitäen pH alkuarvossa, sitten laimennetaan 60 ml:lla kloroformia, pestään kuten edellä selostettiin, kuivataan ja haihdutetaan. Jäännös hierre- 5 tään kuivalla etanolilla ja suodatetaan. Saatu suojattu (3) heptapeptidi, Rf ' = 0,78, liuotetaan 10 ml:aan 8 n kloorivetyhappoliuosta dioksaanissa ja 15 minuutin seisomisen jälkeen tuote saostetaan kuivalla eetterillä.

(4)

Syntynyt vapaa heptapeptidi-hydrokloridi, Rf = 0,56, 20 liuotetaan välittömästi 20 ml:aan dimetyyliformamidia, liuoksen pH asetetaan 8:aan ja lisätään 2,12 g (5,5 mmoolia) Z-Sar-0Pfp. Liuoksen annetaan seistä 30 minuuttia pitäen pH alkuarvossa, laimennetaan sitten 60 ml:11a kloroformia ja pestään kuten edellä selostettiin. Liuos 15 kuivataan, haihdutetaan ja jäännös hierretään etanolilla ja kiinteä aine kiteytetään uudelleen etanolista. Saadaan 1,21 g (17,5 % laskettuna His:lle; tämä vastaa 75-%:n saalista yksittäisissä vaiheissa Z-Sar-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)Pro-Lac-OEts sp.:208-212°C, 20 Rf(3) = 0,5.

Vaihe 3

Suojaryhmien poistaminen 3 ml 2-merkaptoetanolia lisätään liuokseen, jossa on 1,21 g (0,88 mmoolia) suojattua oktapeptidiä, joka on 25 valmistettu kuten vaiheessa 2 selostettiin, 5 ml:ssa dimetyyliformamidia. Seosta sekoitetaan yksi tunti, sitten tuote saostetaan kuivalla eetterillä, suodatetaan ja pestään. Kiinteä aine liuotetaan metanoliin ja saostetaan uudelleen kuivalla eetterillä. Saadaan 0,94 g (81 %) 30 vastaavaa osittain suojauksesta vapautettua oktapeptidiä, (4) joka on vapaa dinitrofenyyli-suojaryhmästä; R^ = 0,59. Tämä aine liuotetaan 20 ml:aan metanolin, etikkahapon ja veden 5:1:1-seosta, lisätään 0,5 g 10-%:sta palladium/ hiili-katalyyttiä ja vetyä pulputetaan seoksen läpi 35 20 tuntia voimakkaasti sekoittaen. Reaktion edistymistä tarkkaillaan ohytlevykromatografiällä. Reaktion loputtua 23 73225 katalyytti suodatetaan pois, pestään edellä mainitulla liuotinseoksella, suodos ja pesuneste yhdistetään ja haihdutetaan kuiviin. Jäännös hierretään etanolin ja eetterin seoksella ja suodatetaan. Saadaan 0,72 g 5 (96 %) (Sar^Lac-OEt®) -Ang-II.

Vaihe 4

Edellisessä vaiheessa saatu raaka vapaa peptidi puhdistetaan edellä esitetyn yleisen menetelmän mukaisesti. Puhtaalla peptidillä on seuraavat fysikaaliset 10 vakiot: kromatografiset tunnusarvot: R ^ =0,24, R_^^ = (8) f r 0,53, R^ = 0,36. Aminohappoanalyysi: Pro 1,02 (i),

Vai 0,97, (1), Ile 1,08 (1), Tyr 0,91 (1), His 1,00 (1),

Arg 1,07 (1) , Sar 1,0 (1) .

Esimerkki 3 1 8 15 (Sarkosiini , L-2-hydroksi-3-metyylivaleriaanihappo )- angiotensiini-II:n valmistus_

Vaihe 1 H-HMV-QBzl:n valmistus 20 ml 4 n kloorivetyhappoliuosta etyyliasetaatis-20 sa lisätään suspensioon, jossa on 7,12 g (40 mmoolia) H-HMV-0Na 10 ml:ssa etyyliasetaattia. Seosta sekoitetaan 2 tuntia ja sitten seoksen pH asetetaan 3:een trietyyli-amiinilla. Erottunut sakka suodatetaan erilleen ja pestään kahdesti 20 ml:11a etyyliasetaattia. Suodoksen pH asete-25 taan 6:een trietyyliamiinilla ja sitten lisätään 8 ml (60 mmoolia) bentsyylibromidia ja 8,4 ml (60 mmoolia) trietyyliamiinia. Syntynyttä seosta kuumenentaan palautus-jäähdyttäen 8 tuntia, erottunut epäorgaaninen suola suodatetaan pois ja suodos pestään peräkkäin vedellä 1 n 30 vesipitoisella kloorivetyhapolla, 5-%:sella vesipitoisella natriumbikarbonaatti-liuoksella ja sitten jälleen vedellä. Liuos kuivataan, haihdutetaan ja saatu 5,6 g (63 %) H-HMV-0Bzl puhdistetaan tislaamalla tyhjössä. Tuote kiehuu 134-136 °C/5 mm Hg :ssa; -13,9°(c = 1 %, ase- 35 tonissa).

24 73225

Vaihe 2

Boc-Pro-HMV-OBzl:n valmistus 3,2 g (20 mmoolia) karbonyylidi-imidatsolia lisätään 0°C:ssa 10 minuutin aikana liuokseen, jossa on 2,7 g 5 (12,5 mmoolia) Boc-Pro-OH 15 ml:ssa kuivaa tetrahydrofu- raania. Lisätään 2,8 g:n (12,5 mmoolin) H-HMV-OBzl kylmää liuosta 10 ml:ssa tetrahydrofuraania seokseen samassa lämpötilassa ja saatua seosta sekoitetaan 0°C:ssa 30 minuuttia ja sitten 20°C.ssa 2 tuntia. Seoksen anne-10 taan seistä jääkaapissa yli yön. Seuraavana päivänä tetrahydrofuraani haihdutetaan, jäännös liuotetaan 40 ml:aan etyyliasetaattia ja liuos pestään peräkkäin 1 n vesipitoisella kloorivetyhapolla (2 x 15 ml), vedellä, 5-%:sella vesipitoisella natriumbikarbonaatti-liuok-15 sella ja sitten jälleen vedellä. Liuos kuivataan, haihdutetaan ja öljymäinen jäännös kuivataan muuttumattomaan painoon 25°C:ssa. Saadaan 3,19 g (65 %) Boc-Pro-HMV-OBzl; Rf(2) = 0,90, Rf(1) = 0,33.

Vaihe 3 20 Z-Sar-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-HMV-OBzl:n valmistus_ 2,52 g (6 mmoolia) Boc-Pro-HMV-OBzl liuotetaan 8 ml:aan 8 n kloorivetyhappoliuosta dioksaanissa, seoksen annetaan seistä 15 minuuttia, lisätään 30 ml kuivaa eet- 25 teriä ja seos haihdutetaan kuiviin. Jäännöksenä saatu (4) vapaa dipeptolidi-hydrokioridi, R^ =0,30, liuotetaan 15 ml:aan dimetyyliformamidia, seoksen pH asetetaan 8:aan trietyyliamiinilla ja lisätään 2,9 g (5 mnoolia) Boc-His (Dnp)-OPfp. Liuoksen annetaan seistä yksi tunti pitäen 30 pH alkuarvossa, haihdutetaan sitten ja jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin. Tämä liuos pestään peräkkäin 1 n vesipitoisella kloorivetyhapolla, vedellä ja 5-%:sella vesipitoisella natriumbikarbonaatti-liuoksella, kuivataan, haihdutetaan ja jäännöksenä saatu suojattu tripeptidi, (2) 35 R^ = 0,67, liuotetaan 10 ml:aan 8 n kloorivetyhappoliuosta dioksaanissa. 20 minuutin seisomisen jälkeen (4 ) 73225 vapaa tripeptidi-hydrokloridi, R^ = 0,18, saostetaan kuivalla eetterillä. Tämä aine liuotetaan 15 ml:aan dimetyyliformamidia, liuoksen pH asetetaan 8:aan trie-tyyliamiinilla ja lisätään 2,4 g (6 mmoolia) Boc-Ile-5 OPfp. Liuoksen annetaan seistä yksi tunti pitäen pH alkuarvossa, haihdutetaan sitten ja jäännös liuotetaan kloroformiin. Tämä liuos pestään peräkkäin vedellä, 1 n vesipitoisella kloorivetyhapolla ja 5-%:sella vesipitoisella natriumbikarbonaatti-liuoksella, kuivataan ja haihdute-10 taan. Jäännöksenä saatu suojattu tetrapeptidi hierretään n-heksaanilla, n-heksaani dekantoidaan, jäännös hierretään kuivalla eetterillä ja suodatetaan. Saatu suojattu (2) tetrapeptidi, = 0,65, liuotetaan 10 ml:aan 8 n kloorivetyhappoliuosta dioksaanissa ja 15 minuutin seiso- (4) 15 misen jälkeen vapaa tetrapeptidi-hydrokloridi, R^ = 0,27, saostetaan kuivalla eetterillä. Tämä aine liuotetaan 15 ml:aan dimetyyliformamidia, asetetaan liuoksen pH 8:aan ja lisätään 2,96 g Boc-Tyr(Bzl)-OPfp. Liuoksen annetaan seistä 30 minuuttia, pitäen pH alkuarvossa ja 20 haihdutetaan sitten. Jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin, lisätään liuokseen 0,22 ml N,N-dimetyyliamino-etyyliamii-nia ja 10 minuutin seisomisen jälkeen seos pestään peräkkäin 10-%: sella vesipitoisella sitruunahappoliuoksella, 1 n vesipitoisella kloorivetyhapolla ja 5-%:sella vesipi-25 toisella natriumbikarbonaatti-liuoksella. Liuos kuivataan, haihdutetaan, jäännös hierretään n-heksaanilla ja suodatetaan sitten. Saatu suojattu pentapeptidi, R^ ^ = 0,75, liuotetaan 10 ml:aan 8 n kloorivetyhappoliuosta dioksaanissa, liuoksen annetaan seistä 15 minuuttia ja sitten (4 ) 30 vapaa pentapeptidi-hydrokloridi, R^ =0,60, saoste taan kuivalla eetterillä. Saatu aine liuotetaan välittömästi 20 ml:aan dimetyyliformamidia, liuoksen pH asetetaan 8:aan ja lisätään 2,3 g (6 mmoolia) Boc-Val-OPfp. Saadun liuoksen annetaan seistä yksi tunti pitäen pH alku- 26 73225 arvossa, haihdutetaan sitten, liuotetaan jäännös kloroformiin ja kloroformi-liuos pestään peräkkäin 10-%:11a vesipitoisella sitruunahappoliuoksella, 1 n vesipitoisella kloorivetyhapolla, 5-%:sella vesipitoisella natrium-5 bikarbonaattiliuoksella ja vedellä. Liuos kuivataan, haihdutetaan ja jäännös hierretään n-heksaanilla ja suo- (3) jattu hepsapeptidi R^ = 0,71, suodatetaan erilleen.

Tämä aine liuotetaan 10 ml:aan 8 n kloorivetyhappoliuos- ta dioksaanissa, liuoksen annetaan seistä 15 minuuttia (4 ) 10 ja sitten vapaa heksapeptidi-hydrokloridi. = 0,34, saostetaan kuivalla eetterillä. Tämä aine liuotetaan välittömästi 20 ml:aan dimetyylidormamidia, liuoksen pH asetetaan 8:aan ja lisätään 2,64 g (6 mmoolia) Boc-Arg (NC^J-OPfp. Liuoksen annetaan seistä yksi tunti pitäen 15 pH alkuarvossa ja haihdutetaan sitten. Jäännös liuotetaan kloroformiin, liuos pestään peräkkäin 10-%:sella vesipitoisella sitruunahapolla, joka sisältää 10 % dimetyyli-formamidia, 1 n vesipitoisella kloorivetyhapolla, 5-%:lla vesipitoisella natriumbikarbonaatti-liuoksella ja vedel-20 lä, kuivataan ja haihdutetaan. Jäännös hierretään eetterin ja etanolin 8:2-seoksella ja suodatetaan erilleen.

(3)

Saatu suojattu heptapeptidi, R^ = 0,63, liuotetaan 10 ml:aan 8 n kloorivetyhappoliuosta dioksaanissa ja 15 minuutin seisomisen jälkeen vapaa heptapeptidi-hyd-25 rokporidi, Rf^ = 0,45, saostetaan kuivalla eetterillä. Tuote suodatetaan erilleen, pestään, kuivataan, liuotetaan 20 ml:aan dimetyyliformamidia, liuoksen pH asetetaan 8:aan ja lisätään 2,3 g (6 mmoolia) Z-Sar-0Pfp. Liuoksen annetaan seistä 30 minuuttia pitäen pH alkuarvossa, lai-30 mennetaan sitten 60 ml:11a kloroformia, pestään 1 n vesipitoisella kloorivetyhapolla ja vedellä, kuivataan ja haihdutetaan. Jäännös hierretään eetterin ja etanolin 8:2-seoksella, sakka suodatetaan erilleen ja pestään. Saadaan 2,36 g (30 % laskettuna His:lle, mikä vastaa 35 82 %:n saalista yksittäisissä vaiheissa) Z-Sar-Arg(N02)-

Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-HMV-OBzl; sp.:193-202°C, 27 73225

Rf ^ = 0,30, Rfi4) = 0,86.

Vaihe 4

Suojaryhmien poistaminen 5 2,8 ml 2-merkaptoetanolia lisätään liuokseen, jossa on 2,0 g (1,25 mmoolia) suojattua oktapeptidiä, joka on valmistettu kuten vaiheessa 3 selostettiin, 5 ml:ssa dimetyyliformamidia. Seosta sekoitetaan yksi 10 tunti, minkä jälkeen tuote saostetaan kuivalla eetterillä, pestään eetterillä, liuotetaan metanoliin ja saostetaan uudelleen eetterillä. Saadaan 1,44 g (80 %) osittain suojauksesta vapautettua oktapeptidiä, joka on va- (4) paa dinitrofenyyli-ryhmästä; = 0,41. Tämä aine liuo- 15 tetaan 30 ml:aan metanolin, etikkahapon ja veden 5:2:1-seosta, lisätään 0,7 g 10-%:sta palladium/hiilikatalyyt-tiä ja pulputetaan vetyä seoksen läpi 20 tuntia voimakkaasti sekoittaen. Reaktion loputtua katalyytti suodatetaan pois, pestään 20 ml:11a edellä mainittua liuotin-20 seosta, yhdistetään pesuneste ja suodos ja haihdutetaan kuiviin. Jäännös hierretään etanolin ja eetterin 1:1- seoksella ja suodatetaan sitten. Saadaan 0,65 g (67 %) 1 8 (sar.kosiini , L-2-hydroksi-3-metyylivaleriaanhappo )- angiotenssiini-II.

25 Vaihe 5

Raaka tuote, joka on saatu kuten vaiheessa 4 selostettiin,puhdistetaan edellä selostetun yleisen menetelmän mukaisesti. Puhtaalla tuotteella on seuraa-vat fysikaaliset vakiot: 30 Kromatografiset tunnusarvot: R, ^ ^ = 0,26, R_ ^ = 0,52, / s) £ R^ = 0,30.Aminohappoanalyysi: Pro 1,06 (1), Vai 1,03 (1), Ile 1,03 (1), Tyr 0,65 (1), His 0,99 (1), Arg 0,95 (1), Sar 1,9 (1).

Claims

28 73225 Patenttivaatimus Menetelmä terapeuttisesti aktiivisen angiotensiini-II:n oktapeptidin valmistamiseksi, jolla on yleinen kaava 5 (I) : X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y-OA (I) jossa X on N-metyyliaminoalkaanikarboksyylihapon asyyliryhmä, edullisesti sarkosyyliryhmä, Y on alifaattisen ot-hydroksi-10 karboksyylihapon tähde, edullisesti maitohapon tai L-2-hyd-roksi-3-metyylivaleriaanahapon tähde; ja A on vety tai C-|_4~ alkyyliryhmä, tai sen happoadditiosuolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) kun on valmistettava yleisen kaavan (I) mukainen 15 yhdiste, jossa A on vety, suojatun oktapeptidi-johdannaisen, jolla on yleinen kaava (II): B-X-Arg(C)-Val-Tyr(D)-Ile-His(E)-Pro-Y-OF (II), jossa B on ryhmä, joka voidaan poistaa asidolyysillä tai 20 katalyyttisesti hydraamalla, edullisesti bentsyylioksikar-bonyyli- tai tert.-butoksikarbonyyliryhmä; C on ryhmä Arg-osan guanidiino-ryhmän tilapäisesti suojaamiseksi, edullisesti nitro- tai tosyyli-ryhmä; D on ryhmä Tyr-osan aromaattisen hydroksi-ryhmän tilapäiseksi suojaamiseksi, edullises-25 ti bentsyyli- tai substituoitu bentsyyliryhmä; E on ryhmä His-osan imidatsoli-ryhmän tilapäiseksi suojaamiseksi, edullisesti dinitrofenyyli-ryhmä; ja F on ryhmä päätekarboksi-ryhmän suojaamista varten, joka ryhmä on kestävä laimeiden happojen vaikutusta vastaan mutta poistettavissa katalyytti-30 sesti hydraamalla tai käsittelemällä voimakkaammalla hapolla, suojaryhmät poistetaan joko vaiheittain tai yhdessä ainoassa vaiheessa, tai b) kun on valmistettava yleisen kaavan (I) mukainen yhdiste, jossa A on Ci_4-alkyyliryhmä, suojatun oktapepti- 35 din, jolla on yleinen kaava (III): B-X-Arg(C)-Val-Tyr(D)-Ile-His(E)-Pro-Y-OA' (III) , 29 732 2 5 jossa B, C, D ja E tarkoittavat samaa kuin edellä ja A' on C-|_4-alkyyliryhmä, suojaryhmät poistetaan joko vaiheittain tai yhdessä ainoassa vaiheessa, ja jos halutaan, muutetaan yleisen kaavan (I) mukainen yhdiste happoadditiosuolakseen. 30 73225 Förfarande för framställning av en terapeutiskt ak-tiv oktapeptid av angiotensin-II med den allmänna formeln 5 (I) : X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y-OA (I) där X star för acylgruppen av en N-metylaminoalkankarboxyl-syra, företrädesvis sarkosylgrupp, Y är resten av en ali-10 fatisk öi-hydroxikarboxylsyra, företrädesvis en rest av mjölksyra eller L-2-hydroxi-3-metylvaleriansyra; och A är väte eller en Ci_4~alkylgrupp; eller ett syraadditionssalt därav, kännetecknad därav, att a) da en förening med den allmänna formeln (I), där 15 A är väte, skall framställas, avlägsnas skyddsgrupperna av ett skyddat oktapeptid-derivat med den allmänna formeln (II): B-X-Arg(C)-Val-Tyr(D)-Ile-His(E)-Pro-Y-OF (II) där B är en grupp som kan avlägsnas genom acidolys eller 20 katalytisk hydrering, företrädesvis en bensyloxikarbonyl- eller tert.-butoxikarbonylgrupp; C är en grupp för temporärt skyddande av guanidinogruppen pä Arg-delen, företrädesvis en nitro- eller tosylgrupp; D är en grupp för temporärt skyddande av den aromatiska hydroxigruppen pä Tyr-delen, 25 företrädesvis en bensyl- eller en substituerad bensylgrupp; E är en grupp för temporärt skyddande av imidazol-gruppen pä His-delen, företrädesvis en dinitrofenylgrupp och F är en grupp för skyddandet av den terminala karboxigruppen, hällfast mot verkan av milda syror men kan avlägsnas medelst 30 katalytisk hydrering eller efter behandling med en starkare syre, antingen stegvis eller i ett enda steg, eller b) dä en förening med den allmänna formeln (I), där A är en C-| _4~alkylgrupp, skall framställas, avlägsnas skyddsgrupperna av en skyddad oktapeptid med den allmänna 35 formeln (III): B-X-Arg(C)-Val-Tyr(D)-Ile-His(E)-Pro-Y-OA' (III)