Vynález se týká způsobu výroby nových peptidů, které mají antagonistický účinek vůči angiotensinu II.

Tyto nov^é sloučenm^ ^kter^é se v^yr^áběj^í způsobem podle vynálezu, mají obecný vzorec I

X—Arg—Val—Tyr—Ile—His—Pro—Y—OA dive kterém

X znamená N-methylglycinovou nebo sarkosylovou skupinu,

Y znamená zb^yte^k mlecím ^kyselin^y nebo L-2-^^ydrox^y-3-^i^á^]hylvalerové kyseliny a

A znamená atom vodíku nebo methylovou nebo ethylovou skupinu.

Rozsah vynálezu zahrnuje i způsob výroby kyselých adičních solí a komplexů výše uvedených peptidů.

První analogy angiotensinu II s jeho antagonistickým účinkem, prokázaným jak in vitro, tak i in vivo, byly popsány v roce 1970 [G. R. Marshal et al.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 67. 1624 (1970); P. A. Khairallah et. al.: J. Med. Chem. 13, 181 (1970) ]. To podnítilo intenzívní výzkum vedoucí k přípravě dalších analogů angiotensinu II, které by vy^kazoval^y anta^gonistic^ký ^účme^k vůči an^giotensinu II a které by mohly být použity k ^dia^gos^tice ^hypertenz^í ledvinov^ého ^půvo^du a případně k léčení těchto hypertenzí; (Sar¹, ^Ala⁸) an^giotensín IL ^který .. je . je^drnm z mnoha ^dosu^d pn^pravenýc^h analogů angiotensinu II a který vykazuje antagonistický ^účine^k vů^či angiotensinu I^ . b^yl již uveden na trh pod obchodním označením. Saralasin [D. T. Pals et al.: Círc.. Res. 29 ' 673 (1971)]. ^Klinⁱc^ké test^{y p}roveden^é s touto sloučeninou prokázaly, . že tato látka . může být použita pro diagnostiku hypertenzí rozličného ^půvo^du [^G. . BOnner .et al.: . Dtsch, Med, Wschr, 104, 43i2 (19'7'9) ], . jakož i pro tečení t^ěchto h^ypertenzí ^[J. L. Marx: Science 194, 821 (976)]. Nedávno bylo. rovněž zjištěno, že látky s antagonistickým účinkem vůči angiotensinu II, mohou být použity při léčení srdečních insufienrí zp^ůso^benýc^h rcnovaskulárm h^ypertenzí [H. Gavras et at.: JAMA 328, 880 (1977)].

Studiem vztahu mezi strukturou dosud vyro^bených analo^gů an^giotensinu II a . jejich ^bio^lo^gic^kým^{i ú}ěin^{ky byly} z^ískán^y určité in^formace pro interpreta^ a^gonistick^ého a antagonistického účinku. Hlavním cílem dosavadního výzkumu je připravit produkty s antagonisticlkým účinkem^, kter^é b^y měl^y prolongovaný biologický poločas a které by nevykazovaly některé nežádoucí vedlejší ú činky, například agonistický účinek.

Nyní bylo zjištěno, že jestliže se fenylalaninový zb^yte^k v ^poloze 8 , an^giotensinové molekuly nahradí zbytkem alifatické alfa-h^ydrox^ykar^box^ylov^{é ky}seHn^y a . současně se do polohy 1 uvedené moleículy zavede N-methylaminokyselina, s výhodou sarkosin nebo kyselina alfa-hydroxy- nebo alfa-amlnoox^ykar^box^ylová^, (viz uveřejněn n^ěmec^ké ^při^hláš^ky v^ynátezu rns. 2 ⁸³¹ 27¹ a rns. 2 831 534), potom se získají nové produkty s antagonistickým účinkem vůči angiotensinu II, které významně snižují hypertenzi a jsou ^účinn^{é d}okonce pn suhkutónrn aplikaci.

Podstata výroby shora uvedených oktapeptidů způsobem podle vynálezu je v tom, že se ochranné skupiny chráněného oktape^pti^dov^ého ^deriv^átu o^becného vzorce ¹¹

Β—X—Arg (C) -Val—Tyr (D)—I le—His (E) — —Pro—Y—OF (I)), ve .kterém

B znamená ochrannou sku^pmu odštépitetoou kyselou hydrolýzou nebo katalytickou hydrogenací, s výhodou benzyloxykarbonylovou skupinu nebo terc.butoxykarbonylovou skupinu,

C znamená ochrannou skupinu pro dočasnou ochranu guanidinové skupiny na argininovém zbytku, s výhodou nitroskupinu nebo tosylovou skupinu,

D znamen^á ochrannou skupinu pro do^č.asnou ochranu aromaUc^ho ^hydrox^ysku^pin^y na t^yrosinovém zbýt^ s výhodou benzylovou skupinu nebo substituovanou benz^ylovou skupinu,

E znamená ochrannou slku^pinu pro do^časnou ochranu imidazolové skupiny na histidinovém zbytku, s výhodou dinitrofenylovou skupinu . a

F znamen^á met^hylovou nebo ethylovou skupinu nebo ochrannou skupinu pro oc^hranu koncov^é ^rboxytově sku^n^ odolnou vůči účinku slabých kyselin, ale odštěpiteínou katalytickou hydrogenolýzou nebo působením silnějších kyselin a

X a Y mají shora uvedený význam, odštěpí ^postupně nebo v je^din^ém stupm a popřípadě se sloučenina vzorce I převede na její adiční sůl s kyselinou nebo její farmaceuticky přijatelný koplex.

Okta^peptidové deriváty obecn^ého vzorce II používané při způsobu podle vynálezu jako výchozí látky lze připravovat libovolnou vhodnou methodou známou v chemii peptldů, například methodou popsanou v maďarském patentu č. 168 431. Při přípravě chrá něných oktapeptidů mohou být ochranné sltu^n^ které jsou stabilní za podmrnek kysel^é hydro^lýzy^{, p}oužit^é к odstraněn ^N-koncových skupin po kopulační reakci, použity ^k oc^hran^ě fun-Mntoh ^bočrnch sku^pin.

Při výhodném provedení způsobu podle vynálezu se chráněné oktapeptidové deriváty obecného vzorce II sestavují postupně a s^ku^pilty^{, k}teré mo^hou být snadno. odšt^ěpeny kyselou hydrolýzou, například terc.butoxykarbonylová skupina, se používají pro dočasnou ochranu koncových aminoslkupin rndMduátomh aminokyselinových derivátíi. Ochranné skupiny vázané na výchozí oktapeptidový derivát se odštěpí s výhodou v jediném stupni katalytickou hydrogenací po odstranění dmitrofen^ylově skupiny thiolýzou.

Zbytek kyselrn^y a^lfa-^hydrox^ykarbox^ylov^é se zavede do polohy 8 molekuly s výhodou tak, že se esterifikovaná kyselina alfa-hydroxykarboxylová obecného vzorce IV

Η—Y—OZ, (IV), ve kterém Y má výše uvedený význam a Z znamená alkylovou nebo aralkylovou skupinu, uvede v reakci s N-chráněným prolinem, přičemž achrannou skupinou je s výhodou terc.butoxykarbonylová skupina. Vazba —CO—O— vytvořená při této reakci je stabilní a neodštěpí se při . následujících stupních syntézy.

Sloučeniny obecného vzorce I se čistí obvyklými methodami, s výhodou iontoměničovou chromatografií na karboxymethylcelulóze. Finálm produkt se od elutčmho rnnidto odděK s vý^hodou lyofillzam ^k zís^kám práškovitého produktu, který může být přímo použit při přípravě rozličných farmaceutic^kých ^příprav^ků.

Antagonistický ^účine^k novýc^h slourénin pnpravených z^působem ^pod^le vynátezu ^byl zkoumán na anestetiizovaných kocourech. Těmto pokusným zvířatům bylo. aplikováno mnidto blokující ^gan^ghon a moz^kov^é Woudívá nervy (vagus) na obou stranách, načež jim byl aplikován infuzní Hypertensin (CIBA) v dávce 0,5 ^g/kg/min. Když dosáhl krevní tlak pokusných zvířat trvalé zvýšené hodnoty, byla zvířatům podána . testovaná látka intravenózně nebo· subkutánně ve fysiologickém roztoku ne^bo jatožto. vodný roztok který rovněž o^bsa^huje nosm. ^po^kles krevního tla^ku se změn (v ^pa) a vyjad^řuj^í v ^procentecR vztaženým na původtá ^ho^dnotu krevního Ha^ku ^pře^d ajgl^arn ^účinn^é látky. Potom se provede statisUcfó vyho^dnocení na z^ákla^dě zfe^kanýc^h rozdíto Zevního tlaku ^před a ^po a^plikaci. 2as^kan^é výsledk^y jsou uveden^y d^ále v tahutoe I. ^pod ^pojmem „trvání ú^čin^ku“ se rozum^í doha ú^čirilku testované slou^čenin^y až do o^kam^ži^ku ^kd^{y l}ze ještě pozorovat .^posledm ještě významný (^p=5 %) rozdH v krevrtm tla^ku.

Poznámky k tabulce I: d = dáv^ka v ^g/kg n = počet: testů p — trvání účinku v minutách fys. r. — fysiologický roztok KMC — karboxymethylcelulóza

Tab lulka I

Hypotenzívní účinek analogu angiotensinu II obsahujících zbytek kyseliny alfa-hydroxykarboxylové v poloze 8

Analogy	d	i. n
(Sar1, L—Lac8)Ang—H	10	5
- ~	20	5
Ί (S^ir1, L—Lac—OEt8)Ang—II	10	5
	20	8
(Sar\ HMV8)Ang—II	10	5
	20	6
Saralasin	10	5
		s. c.,
	d	n
(Sar1 L—Lac8)Ang—II	50	6
	100	6
	200	5
^ar1, L—Lac—OEt8)Ang—II	100	5
(Sar\ HMV8)Ang—H	100	5
Saralasin	100	5
	200	7

v. %	H	s. c., fys. r.
d	n	%	H
23	15	50	5	29	90
29	15	100	5	33	120
		200	5	47	180
27	12	100	5	18	30
40	25
33	45	100	6	15	45
40	20
32	15	100	6	29	60
		200	5	24	45
KMC			s. c.	želatina
%	H	d	n	%	P
25	45	50	5	24	90
27	90	100	5	32	90
22	45	200	5	28	120
41	90
35	300
23	45	200	4	23
28	90

Z ta'^bulky ^I je zřejmý že všechny analogy angiotensinu, které obsahují zbytek kyseliny alfa-hydroxykar.boxylové v poloze 8 a sarkosylovou skupinu v poloze 1, mají významný hypoftenzívní účinek. Tento účinek je výrazný i v ^případě subkutenrn aphbace. V případě, že se tyto sloučeniny aplikují v roztoku, který rovněž obsahuje nosič, může trvání účinku někdy dosáhnout i několik hodin.

Pod pojmem „farmaceuticky přijatelný komptex“ se rozumí kom^plex pe^ptidov^é sloučeniny obecného vzorce I s organickou nebo anorganickou látkou, s jejíž pomocí se dosáhne protrahovaného účinku sloučeniny obecného vzorce I. Jakožto příklady uvedené organické komplexotvorné látky je možné uvést některé typy želatiny, karboxymethylcelulózu, algináty, polyflorenthinfosfáty, polymery aminokyselin a kopolymery aminokyselin. Jakožto příklady anorganické komplexotvorné látky je možné uvést hydroxid zinečnatý a málo rozpustné zinečnaté soli, například fosforečnany zinečnaté.

Nové peptidy obecného vzorce I, připravené z^působem ^po(He v^ález^ jako^ž i jejich farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinami a koplexy, mohou být terapeuticky použity ve formě obvklých farmaceutických prostředků. Tyto prostředky obsahují nové sloučeniny obecného· vzorce I, přípravné způsobem podle vynálezu, ve směsi s organickým nebo anorganickým nosičem, použitelným pro enterální a parenterální aplikaci. Těmito farmaceutickými prostředky mohou být například lyofilizované pevné látk^ obsahující nosič^{, k}terý nereaguje s peptidem, jakým je například kar bohydrát, nebo koncentrované nebo zředěné suspenze a emulze, které mohou rovněž obsahovat rozličné konzervační a stabilizační prostředky.

Tyto farmaceutické prostředky mohou být použity k diagnostice a rozlišení hypertenzí rozličného původu, k potlačení hypertenzí ledvinového· původu a pro léčení hypertenzních krizí, sekundárních srdečních insuficiencí atd..

Uvedené farmaceutické prostředky jsou s výhodou ve formě injekcí obsahujících 1 až 10 mg účinné lát^ky. Účinná tetka ^připravená způsobem podle vynálezu může být podávána v denní dávce 1 až 10 mg v případě léčení dospělých jedinců. Toto množství se s výhodou aplikuje jednou denně ve formě intravenózní, subkutánní nebo· intramuskutárm inje^kce^, nebo ve ^formě pomalé intravenózní infuze.

Z^působ ^pod^le v^ynálezu ^bu^de v následujcí části popisu blíže objasněn několika příklady provedení tohoto způsobu.

Zkratky, kterých se v těchto příkladech používá, jsou v souladu se zkratkami, kterých se obecně používá v odborné literatuře [J. Biol. Chem. 247, 977 (1972)]. Další zkratky znamenají: Lac = kyselina L-mléčná^, H^MW = ^kyselina ^L-2-^hydroxy-3-met^hylvalerová, Pfp = pentafluorfenyl.

Při přípravě sloučenin se odpařování vždy provádí v rotační odparce. Chrornatografie na tenké vrstvě se provádí na vrstvě silikagelu („Kⁱlese^lge^l-6-“) ^připravené ^po^dle Stáhla, přičemž se k vyvíjení používá těchto soustav:

1) n-hexan : ethylacetát — 4:1 .

2) ethylacetát : (pyridin : kyselina octová : : voda = 20 : 6 : 11) = 95 : 5

3) ethylacetát : (pyridin : k^yselina octová : : voda = 20 : 6 : 11) = 90 : 10

4) ethytácetát : (^pyr^idin : ^kyselina octová:

: voda = 20 : 6 : 11) = 80 : 20

4) et^hylacet^át : (^pyridin : ^kyselina octová : : voda = 20 : 6 : 11) = 70 : 30

6) n-butanol : kyselina octová : voda 4:1: : 5 (horní fáze) ⁷) n-hutano^l : k^yselina octov^á : ^pyridin : : voda = 30 : 6 : 20 : 24

8) n-^butanol : eth^ylacetát : ^kyselina octová : voda = 1:1:1:1

Slívrny rozdělených látek se při chromatografii na tenké vrstvě zviditelňují použitím ninhydrinu nebo směsí chlortolidínu a jodidu draselného.

K čištění finálních produktů se používá této obecné metody:

0,5 g volného peptidu se rozpustí ve 4 ml 0,0¹ M roztoku octanu amonn^ého a rezutíující roztok se nalije na sloupec 0,5 litru karboxymethylceluló.zy (CMC—52), který ^byl předtím v rovnováze se stejn^ým o^bjemem roztoku pufru. Jakožto elučního činidla se použije gradientově směsi 1,5 litru 0,01 M roztoku octanu amonného a 1,5 litru ^{0,4 M} roztoku octanu amonného. Elu^ční roztok se nech^á protékat sloupcem rychlostí 2⁵ mililitrů/hodinu a eluát se jímá do frakcí po 10 ml.

^Slo^žení elu^átu opouštéjídho sloupec je kontinuálně sledováno, přičemž hlavní frakce se separuje podle získané křivky a lyofilizuje. V případě potřeby se produkt znovu chromatografuje za použití gradientově eluce.

P říkl ad 1

Př^íprava (sarkos^ kyselina L-mlé^čná⁸)angiotensinu II

Stupeň 1

Příprava Boc—Pro—Lac—OBzl ^2,4 g (¹⁵ mihmoté) kar ^bon^y ténmidazoté se ^přidá při tepfoté 0 °C během 1.0 minut к míchanému roztoku 2,15 g (10 milimolů) Boc—Pro—OH v 10 ml bezvodého tetrahydrofuranu. K této reakční směsí se potom během 15 minut přidá roztok 1,8 g (10 miiimol^ů) benzyl-L-laktátu v 10 m^l tetrahydrofuranu, ochlazený na teplotu 0 °C. Přidání se provádí po kapkách a při teplotě 0 °C. Re.zultující směs se potom míchá při teplotě 0 °C po dobu 30 minut a potom ještě dv^ě hodⁱn^y při teptétě ²⁰ °C načež se uté^ží do ledn^ičky.

Následujmfoo· dne se roz^pou^št^ědlo odstran^í . a zh^yte^k se rozpustí ve 3⁰ ml chloroformu, načež se roztok postupně promyje 1 N ^kysehnou cfoorovod&ovou (⁴ x W ml), vovo^dným roztokem hydrogenuhlmitanu sodného (2 x 15 ml) a nakonec zase vodou. Chloroformový roztok se vysuší a odpaří do konstantní hmotnosti. Olejovitý zbytek se vysuší v eksikátoru nad kysličníkem fosforečným ^k zísltání 3 ^g (80 %) Boc— —Pro—Lac—OBzl, který je chromatograficky jednotným produktem.

R_f ⁽¹⁾ = 0^,3^2, R/2) = 0^,57.

Stupeň 2

Příprava Z—Sar—Arg(NO₂)—Vel— —Tyr (Bzl )—Ile—His (Dnp)—Pro—Lac— —OBzl

Roztok 2,85 g (7,5 milimolů) Boc—Pro— —Lac—OBzl v 15 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu se nechá stát po dobu 15 minut. K tomuto, roztoku se potom přidá 30 ml bezvodého etheru a získaná směs se odpaří k suchu. Rezutíující volný ^hydrochlorid ^dipeptolidu^, R_f ^(5> = 0^ se rozpustí ve 20 ml dimethylformamidu, pH roztoku se nastaví na hodnotu 8 přidáním triethylaminu a k roztoku se přidá 2,9 g (⁵ milimolů) Boc—His(Dnp)—^Opfp.

Realkční směs se míchá po dobu jedné ho^din^y, pněemž se ^pH sm^ěsi udr^žuje na hodnotě 8. Rozpouštědlo se potom odpaří, zbytek se rozpustí v ethylacetátu a .získaný rozfo^k se ^postupn^{ě p}rom^yje 10% rozto^kem ^kyseliny citrónové, 1 N vodným · roztokem kyseliny chlor ovodíkové^{, 5}% vo^dným rozto^kem ^hydrogenuhličitanu. so^dného a potom vodou. Roztok se vysuší, rozpouštědlo se odstraní a rezul-tující surový chráněný tripept^ R_f ^<2) = 0^ se roz^pustí v ¹⁰ ml 8 ^N kyseliny chlorovodíkové v dioxanu.

Po, 20 minutách stání · se volný tripeptid vysráží bezvodým etherem a vyloučená sraženina se odfiltruje a promyje etherem. Rezultující volný tripeptídh^ydrochlorⁱd^{, Rf(4)} = = 0,10, se rozpustí ve 20 ml dimethylformamid^ pH rozto^ku se nasta^yí na ^ho^dnotu 8 pndáním Methylam^^ načež se ^ke sm^ěsi ^přidá ^2,78 ^,g (^7,5 mihmoté) Boc—He-OTfp. Realkční směs se potom míchá po dobu jedné hodiny, přičemž se pH směs udržuje na ^původní hodnoté. Rozpouštédfo se odpaří zbytek se rozpustí , v ethylacetátu a získaný roztok se prom^yje výše uvedeným způsobem. Rozto^k se ^potom vysuší^, rozpouštědlo se odpaří, .zbytek se rozetře · s n-hexanem a pevný podíl se odfiltruje. R^:^l^ltující chrán^ěný te^ape^^ Rf⁽²⁾ . — 0,6^7, se rozpustí v 10 ml 8 N roztoku k^yselin^y c^hlorovod^íkov^é v dioxanu, roztok se nechá stát po dobu 15 . minut · a volný tetrapeptidhydrochlorid, Rf<s> = 0^,521 se v^ysrá^ží bezvodým efoerem. Tato sloučenina se rozpustí ve 20 ml dimeth^ylformalm^du^{, pH} rozto^ku se nastaví na hodnotu 8, k roztoku · se ' přidá 3,24 g (6 milimolů) Boc—Ty^Bzzj—OPfp a reakční směs se míc^há po do^bu ³⁰ mmut, ^přⁱčem^ž se pH udržuje na původní hodnotě. Roz^poušt^ědlo se odstram, z^byte^k se rozpustí v

219930 ethylacetátu a ke směsi se přidá 0,22 ml N,N-dimethylaminoethyla.mmu za účelem odstranění přebytku aktivního esteru. Po 15 minutách stání se roztok promyje postupně 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, 1N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové, vodou, 5% vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a potom opět vodou, vysuší a odpaří. Zbytek se rozetře se směsí n-hexanu a etheru (8 : 2) a vyloučený pevný podíl se odfiltruje. Rezultující chráněný penÍapeptld, R_f ⁽³⁾ = 0,72, se rozpustí v 10 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, získaný roztok se nechá stát po> dobu 15 minut, načež se volný pentapeptidhydrochlorid vyloučí přidáním etheru.

Rezultující produkt se rozpustí ve 20 ml dimethylformamidu, pH roztoku se nastaví na hodnotu 8 přidáním triethylaminu а к roztoku se přidá 2,6 g (6,8 milimolů) Boc— —Val—OPfp. Roztok se míchá po dobu jedné hodiny, přičemž se pH roztoku udržuje na původní hodnotě, načež se rozpouštědlo odpaří, zbytek se rozpustí v ethylacetátu a roztok se promyje výše popsaným způsobem. Promytý roztok se vysuší a odpaří, načež se zbytek rozetře s bezvodým etherem. Relzultující chráněný hexapeptid, R_f ⁽³⁾ = = 0,83, se odfiltruje a rozpustí v 10 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, načež se po 15 minutách stání volný hexapeptidhydrochlorid, Rý⁵⁾ = o,65, vysráží bezvodým etherem.

Tento produkt se rozpustí ve 20 ml dimethylformamidu, pH roztoku se nastaví na hodnotu 8 přídavkem triethylaminu а к roztoku se přidá 2,2 g (5 milimolů) Boc— —Arg(NO₂)—OPfp. Získaná směs se míchá po dobu jedné hodiny, přičemž se udržuje pH na původní hodnotě, načež se směs zředí 60 ml chloroformu a rezultující směs se postupně promyje 10% vodným roztokem kyseliny citrónové. 1 N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové a vodou. Roztok se vysuší, odpaří a zbytek se rozetře se směsí ethanolu a etheru (1:1).

Rezultující chráněný heptapeptid, R_ř ⁽³⁾ — — 0,65, se rozpustí v 10 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu a po 15 minutách stání se volný heptapeptidhydrochlorid, Rf⁽⁵⁾ = 0,40, vysráží bezvodým etherem. Pevný podíl se odfiltruje, promyje, vysuší a potom rozpustí v 15 ml dimethylformamidu; pH roztoku se nastaví na 8 a к roztoku se přidá 1,8 g (5 milimolů) Z— —Sar—OPfp. Roztok se míchá po dobu 30 minut, přičemž se udržuje pH na původní hodnotě, načež se roztok zředí 45 ml chloroformu a protřepe s vodou. Směs se potom vysuší a odpaří a zbytek se rozetře s bezvodým etherem, načež se pevný podíl odfiltruje. Získá se 2,12 g [29,6 %, počítáno pro His, což odpovídá výtěžku 82 % v individuálních stupních) Z—Sar—Arg(NO2) — —V al—Туг (Bzl) —119—His [ Dnp) —Pro— —Lac—OBzl.

R_ř ^í3) — 0,465; teplota tání: 204 až 213 °C.

Stupeň 3

Odštěpení ochraných skupin

2,3 ml (30 milimolů) 2--merkaptoethanolu se přidá к roztoku 1.45 g (1 milimol) chráněného oktapeptidu, připraveného v předcházejícím stupni 2, v dimethylformamidu. Po jednohodinovém míchání se ke směsi přidá ether, načež se rezultující chráněný oktapeptid, který je nyní prostý Dpp-skupiny, separuje a vyčistí vysrážením z methanolu a etheru. Získá se 1,14 g (89 %) peptidu částečně zbaveného ochrany; R_f ⁽⁴⁾ = = 0,60. Tato látka so rozpustí ve 40 ml směsi methanolu, kyseliny octové a vody (5 : 1 : 2), к roztoku se přidá 0,6 g 10% paládia na uhlí, jakožto katalyzátoru a směs se hydrogenuje po dobu 20 hodin za intenzivního míchání. Katalyzátor se potom odfiltruje, promyje výše uvedenou směsí rozpouštědel a filtrát se odpaří к suchu. Získá •see 0.7 g (84 %) produktu (Sar¹, Lac⁸)Ang— —II.

Stupeň 4

Surový peptid se vyčistí výše popsanou obecnou metodou. Čistý produkt má tyto fyz/kální konstanty: chromatograf^:oké veličiny: = 0/17, Rf^í7) = 0,4*0, Rř⁽⁸⁾ =- 0,21.

Analýza aminokyselin:

Pro 1,0 (1), Val 1,0 (1), Ile 1,03 (1), Tyr 0,85 (1), His 0,85 (1), Arg 0,96 (1), Sar 1,0 (1).

Příklad 2

Příprava (sarcosin¹, ethyl-L-laktát⁸)angiotensinu—II

Stupeň 1

Příprava Boc — Pro—Lac—OEt

4,8 g (30 milimolů) karbonyldimidazolu se přidá při teplotě 0 °C během 10 minut к roztoku 4,3 g (20 milimolů) Boc—Pro— —OH ve 20 ml bezvodého tetrahydro-furanu. К této směsi se potom po kapkách při téže teplotě přidá chladný roztok 2,1 g (20 milimolů) ethyl-L-laktátu v tetrahydrofuranu. Reakční směs se míchá po dobu 30 minut při teplotě 0 °C a potom ještě po dobu dvou hodin při teplotě 20 °C, načež se nechá stát v ledničce přes noc. Následujícího dne se tetrahydrofuran oddestiluje, zbytek se rozpustí ve 40 ml ethylacetátu a získaný roztok se postupně promyje 1 N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové (2 x 15 ml), vodou, 5% vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (dvakrát) a potom opět vodou. Roztok se vysuší, rozpouštědlo se od219939 paří a olejovitý zbytek se vysuší v eksikátoru do konstantní hmotnosti. Získá se 2,22 gramu (36 %) Boc—Pro—Lac—OEt; R^{f(3) -}= = 0,77, R^{f( -í)} = 0,36.

Stupeň 2

Příprava Z—Sar—Arg(NO2) — Val— —Tyr (Bzl) — Ile—His (Dnp j —Pro—Lac—OEt

Roztok 1,8 - g - {6 milimolůj Boc—Lac— —Pro—OEt v 8 ml 7,5 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu se nechá stát po do^bu ^{- 15} mrnut. К rozto^ku se ^potom ^přid^{á 30} m¹ e^eru a směs se o'^dpaří ^k suchu. ^Rezultující vo¹ný ^jDtohdhydrochlorid, R^f(Z) = = 0,31, se rozpustí v 15 ml dimethylformamidu, načež -se pH nastaví na hodnotu 8 přídavkem triethylaminu a k roztoku se pnidá ²,9 ^g (⁵ mihmolůj ^Boc—His(^Dnp)—°P^fp.

Po je^dne ho^din.^ě se roz^poušt^ědlo nahradí ethylacetátem a rezultující roztok se promyje ^pos^tu^pn^ě 1% vodným roztokem kyseliny citrónové, 1 N vodným roztokem kyseliny c^hl°rovodí^kove₎ 5% vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a potom opět vodou.

Promytý roztok se vysuší, odpaří ' a rezultojím chráněný trpe^^ ^Rf(2) = ^0,6^9, se ^bezprostředn^ě roz^pustí ve ²⁰ m^l . ^{7,5 N} roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Po< 20 minutách stání se volný tripeptidhydroch¹orid^{, Rf(Z1)} — ⁰Д^9, vysr^áží hezvodým etherem, sraženina se oddělí a rozpustí v 15 ml dimethylformamidu, načež se pH roztoku nastaví na hodnotu 8 přidáním triethylaminu a k roztoku se přidají 3 g (7,5 milimolůj Boc—Ile—OPfp. Reakční směs se nechá -stát ^po ^do^bu ³⁰ minu^ ^přičem^ž se u^držuje ^původní hodnota pH, .zbytek se rozpustí v ethylacetátu a rezultující roztok se promyje výše uvedeným způsobem. Roztok se vysuší, odpaří a zbytek se rozetře se směsí etheru a n-hexanu (2 : 8j, načež se pevný podíl odfiltruje. Rezultující chráněný tetrapeptid, R_f ⁽³⁾ = 0,^ se roz^pustí v ¹⁹ ml. ^{8 N} roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu a ^po ¹⁵ minutách stém se vohiý totoape^té^hydгoch¹or^{id, Rf(5)} = ^0,2^7, se v^ysr^áží hezvodým etherem.

Oddělená sraženina se bezprostředně rozpustí ve 20 ml dimethylformamidu, hodnota pH roztoku se .nastaví na 8 a k roztoku se přidá 3,24 g (6 milimolůj Boc— —Tyr(Bzl)—OPfp. Roztok se potom nechá stát po- dobu 30 minut, přičemž se udržuje původní hodnota pH, načež se rozpouštědlo odpaří a zbytek se rozpustí v ethylacetátu. К roztoku se potom přidá 0,22 ml N,N-dimeth^ylaminoeth^ylaminu a reakční směs se nechá stát po dobu 10 minut, načež se promyje výše popsaným způsobem, vysuší a odpaří.

Zbytek se rozetře s n-hexenem a zfiltruje. Rezuhujto chráněný ^nté^^^ ^Rf,2) — = 0,64, se rozpustí v 10 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu a po 15 mintách stání se volný pentapeptidhydroc^hlorⁱd^{, Rf(ZJ} = ^0,3^3, _ roz^pust^í v ^bezvodém etheru. Získaný produkt se rozpustí v 15 mililitrech dimethylformamidu, pH roztoku se nastaví na 8 přidáním triethylaminu a ^k roztok se potom podá ^{2,1 g} (^5,5 mlhmolů) Boo—Val—OPfp. ' Rez^í^ící roztok se nechá stát po dobu 30 minut, přičemž se pH udržuje na hodnotě nastavené původně, nače^ž se rozto^k oí^a^ zhytek' se roz^pustí v ethylacetátu a získaný roztok . se promyje výše ^po^psaným z^půsohem. ^- Roztok se vysuší odpaří a zbytek se rozetře s n-hexanem a ^zfilti?u;e. KezuRujmí bráněný hexa^·^^ ^Rf(2) — ОД^6, se bez^proistředně ro.z^pustí v 10 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu a po 15 minutách stání se volný hexajjejptéhydrΌchlorid^, R^f(z,) = ОД^4, v^ysráží bezvodým . etherem. Tato látka se potom rozpustí ve 20 ml dimethylformamidu, pH roztoku se nastaví na hodnotu Sak roztoku se přidá 3,96 g (6 milimolůj Boc— -Arg(NO₂)-OP^fp.

Roztok se nechá stát po dobu jedné hodiny, přičemž se udržuje pH na hodnotě nastavené původně, načež se roztok zředí 60 mililitry chloroformu, promyje výše popsaným způsobem, vysuší a odpaří. Zbytek se rozetře s -ethanolem a zfiltruje. Rozumující chráněný heptapeptid, R_f — 0,78, - se rozpustí v 10 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovo^díkov^é v choxanu a ^po· 15 mmutéch stání se produkt vysráží bezvodým etherem. Rezultující volný he^ptape^pttdhydrochlorid, ^RfZ) — ^0,5^6, se ^bezprost^ředn^ě roz^pust^í ve 20 ml dimethylformamidu, · pH roztoku se nastaví na hodnotu 8 . a k roztoku se přidá 2,12 g (5,5 milimolůj Z—Sar—OPfp. Roztok se · nec^há st^{át p}o doM ^{30 -} miiuι^{t, p}nčem^ž se udržuje původní hodnota pH, načež se roztok zředí 60 ml chloroformu a promyje výše · popsaným způsobem. Roztok se vysuší, odpaří, zbytek se rozetře s ethanolem a pevních) Z—Sar—Arg [ NO₂ )—Val—Tyr (Bzl) — ný ^podn se re^ystanzuje z ethanoto.’ ^Získ^á se ^{1,21 g} (1^7,5 0% ^poč^ítáno ^pro ^{- Hi}s^, což od^pov^ídá výtěž^ku ⁷⁵ % v jednothvých stu^p—Ile—His ( Dn^p) —Pro—Lac—OEt; teplota tárn: 208 až 212°^ R^f(3) = 0,5.

Stupeň 3

Odštěpení ochranných skupin

К roztoku chráněného oktape^ptidu (1,21 gramu; 0,88 milimolu), připraveného v předcházejícím -stupni 2, v dimethylformamidu se přidají ³ ml 2-merkaptoethanolu. Získaná •směs se potom míchá po dobu jedné hodiny, načež se produkt vysráží bezvodým etherem, zfiltruje a promyje.

Pevný produkt - se potom rozpustí v meHianoté a o^pětovn^ě v^ysr^{áží b}ezvodým ethedem. ^Získá se ^0,9^{4- g} (⁸⁹ %) o^ovídajmn ho oktapeptidu, který je částečně zbaven ochrany a který je prost dinitrofenylové

213339 ochranné skupiny; ^R _ř ⁽⁴⁾ = 0,59. Tato látka se rozpustí ve 20 ml směsi methanolu, kyseliny octové a vody [5 : 1 : 1), k roztoku se . přidá 0^ ^{g 10}% ’ ^pa^ládia na u^hlí a směs^í se ^probublává vodík ^po. dobu ^{20 h}o^din za intenzivního míchání. Průběh reakce se sleduje chronatograficky na tenké vrstvě. Po ukončení hydrogenační reakce se katalyzátor odfiltruje, promyje výše uvedeným roz^poušt^ědlem a ^filtrát a ^promývac^í roztok se sloučí a -odpaří k suchu. Zbytek se rozetře se směsí ethanolu a etheru a pevný podíl se odfUtruje. ^Získá se ^0,72 g (⁹θ %) (Sar·^ Lac—OEt⁸)An^g—II.

Stupeň 4

Surový · volný peptid, získaný v předcházejícím stupni 3, -se vyčistí výše uvedeným obecným postupem. Získaný čistý peptid má tyto fyzikální konstanty: chromatografické charakteristiky: R_f ⁽⁶⁾ = ^0,24 _? ^Rf(7) = ^-0,53, Rf⁽⁸⁾ = 0^,36.

Analýza aminokyselin:

Pro 1,02 · (1), Val 0,97 (1), Ile 1,08 (1), Tyr 0,91 (j, His 1,00 (1), Arg 1,07 (1), Sar 1,0 (1).

P říkl ad 3 ^příprava (saakosin¹, ^L-2-h^ydrox^y-3-met^hylvalerová kyselma⁸jan^glotensmu ¹¹

Stupeň 1

Příprava H—HMV—OBzl . ml· 4 N · roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethylacetátu se přidá k suspenzi 7,12 gramu · (⁴⁰ · nihrnoto) H—HIW—ÓlMa . ^- v · ¹⁰ mililitrech et^hylacet^átu. ^-Směs ·· se míchá. ^po dobu 2 hodin a pH směsi se nastaví na 3 přidáním triethylamrnu. ^Odděiená sraženina se odfiltruje a . promyje dvakrát · 20 · ml ethylacetátu; pH filtrátu .se nastaví na . hodnotu 6 přidáním tríethylaminu a k filtrátu se.potom přidá 8 ml (60 milimolů) benzylbro-midu a 8,4 ml (60 milimolů) tríethylaminu. Rezultující směs se zahřívá k varu pod zpětným chladičem po dobu 8 hodin, načež .se vyloučená anorganice sůl o^dfi^ltruje^, fHIrát se postupně promyje vodou, 1 N vodným roztokem kyseliny cMorovodkové ⁵% vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a potom ’ opět vodou. Roztok se vysuší, odpaří a rezultupcdch 5^,6 ^g (63 %) H—HMV—OBzl se vyčistí destilací za vakua. Produkt vře při teplotě 134 až 136 °C/665 Pa.

[«?]d²⁵ = —^13,9° (c — 1 % v acetonu).

Stupeň 2

Příprava Boc—Pro— HMV—OBzl

3,2 g (20 milimolů) karbonyldimldazolu sé při teplotě 0 °C a během 10 minut přidá k roztoku 2,7 g (12,5 milimolů) Boc—Pro— —^OH v ¹⁵ ш^{1 b}e:zvo^dého tetratydrofuranu. K této směsi se při téže teplotě přidá chladný roztok 2,8 g (12,5 milimolů) H—HMV— —OB-zl v 10 ml tetrahydrofuranu a rezultuj^ící směs se míc^há při teptotě 0°C po do^bu 30 minut a potom ještě při teplotě 20 'C po dobu 2 hodin.

Směs se nechá přes noc stót v tochimce. Následujícího . dne se tetrahydrofuran odpaří z^byte^k se rozpustí ve ⁴⁰ ш¹ etoytecetotu a roztok se postupně promyje 1 N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové (2 x 15 mШlitr^u)^, vo^do^ 5% vodným roztolkem h^ydrogenuhličitanu sodného. a potom opět vodou. Roztok se vysuší, odpaří a olejovitý zbytek se vysuší do konstantní hmotnosti při teplotě 25 °C. Získá se 3,19 g (65 %) Boc— —Pro—HMV—OBzl; R_f(2) = 0,90, R/b = = 0,33.

Stupeň 3

Příprava Z—Sar—Arg(NO₂) —Val— —Tyr (Bzl )—Ile—His— (Dnp) —Pro—HMV— —OBzl

2,52 g (6 milimolů) Boc—Pro—HMV— —^OBzl se rozpustí v ⁸ nti ^{8 N} roztoku ^kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, směs se nechá stát po dobu 15 ninut, přidá se k ní 30 nl bezvodého etheru, načež se odpaří k suchu. Volný dipeptolidhydrochlorid, ^Rf(4) = ^0,30 získaný ja^ko z^byte^k, se rozpustí v 15 nl dinethylformanidu, pH směsi se nastaví na 8 přidáním tríethylaninu a ^ke sn^ěsi se ^potom pridá ^2,9 g (5 mihnoh) Boc—His(Dnp)—OPfp. Roztok se nechá stát po dobu jedné hodiny, přičemž se udržuje původní hodnota . pH, načež se odpaří a zbytek se rozpustí v ethylacetátu. Tento roztok se postupně promyje 1 N vodným roztokem ^kyselmy c^hlorovod^íkové^, vodou a 5% vodným rozto^kem ^hydrogenuhličitanu sodného^ vysu^ odpari a chr.ánMý tripeptíd Rf⁽²⁾ — = 0,67, získaný jako zbytek, se rozpustí v ¹⁰ n^{1 8 N} rozto^ku ^kyselmy ch^lorovod^íkov^é v dioxanu. Po 20 minutách. stání . se volný ^tripeptidh^ydrochlorid^{, R}f⁽⁴⁾ — ^0,18 vysr^áží bezvodým eUierem. ^Zís^kaná sraženina se rozpustí v 15 nl dinethylfornanidu, pH roztoku se nastaví na hodnotu 8 přidáním triethylaninu a k roztoku se přidá 2,4 g (6 nilimolů) Ile——OPfp. Roztok se nechá stát po dobu jedné hodiny, přičenž se udržuje původní hodnota pH, načež se odpaří a zbytek se rozpustí v chloroformu.

Tento· roztok se pronyje postupně vodou, 1 N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové a 5% vodným rozto^kem ^hydro^genuhličitanu sodného, vysuší a odpaří. Chráněný tetrapeptid získaný jako zbytek se rozetře s n-hexanen, n-hexan se dekantuje, zbytek se rozetře s bezvodým etherem a z^ltru!). Rezzntu-n^ chMněný ^tetrapept^{id, R} _f ⁽²⁾ = = 0,65, se rozpustí v 10 nl 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ^dioxanu a po I⁵ mi219939 nutách stání se volný tetrapeptidhydrochlorid, R_f ^í4) — 0,27, vysr^áží bezvodým etherem. Tato ^látka se roz^pust^í v 15 ml dimeth^ylformamidu, pH roztoku se nastaví na hodnotu 8 a k roztoku se přidá 2,96 g produktu Boc— —T^yr(BzI)—OPfp.

^Rozítok se nec^há stát po· dobu 3⁰ minu^ přičemž se ^pH udržuje na ^původní hodnotě načež se odpaří. Zbytek se rozpustí v ethylacetetu, ^k roztoku se ^přidá 0^,22 ml N,N-dimethylaminoethylaminu a po 10 minutách stem se směs postupně ^prom^yje 10% vodným rozto^kem k^yselin^y citrónové, 1 N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové a 5% vo^dným roztokem ^hydrogenuhli'č.itanu sodného.

Roztok se vysuší, odpaří, zbytek se roze^tře s n-hexanem a , ^potom se o^t^iltruje ^pevný podtí. Rezultující chr^án^ěný ^penia^pe^ptid^, R_f — l^0,75, se roz^pustí v 10 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok se nechá stát po dobu 15 minut a potom se voteý ^pen'ta^pe^ptid^hydroc^hlorⁱd^{, R}í^í4) = 0,6^0, vysráží etherem. Rezuhující oddělená sraženina se bezprostředně rozpustí ve 20 ml dimethylformamidu, pH roztoku· se nastaví na hodnotu 8 a k roztoku se přidá 2,3 g (6 milimolů) produktu Boc—Val—OPfp. Rezultující roztok se nechá stát po dobu jedné hodiny, přičemž se pH udržuje na původní hodnotě, potom se odpaří, zbytek · se rozpustí v chloroformu a chloroformový roztok se post:u^pn^ě prom^yje 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, 1N vodným roztokem kyselrn^y cWorovodíkové 5% rozto^kem hydrogenuhllčitanu sodn^ého ve vod^ě a potom vodou.

Roztok se vysuší, odpaří, zbytek se rozetře s n-hexanem a chráněný hexapeptid, ^R _f ⁽³⁾ = ^0,7ů se odfiltruje.

Tato látka se rozpustí v 10 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, rozto^k se nechá stát po do^bu 15 minut a potom se volný hexa^pe^ptídh^ydrochlorⁱd^{, R} _f ⁽⁴⁾ = = 0,34, vysráží bezvodým etherem.

Tato tetoa se · bezprostředn^ě rozpustí ve ²0 mililitrech dimethylformamidu, pH roztoku se nastaví na hodnotu 8 a k roztoku se přidá ^2,6^{4 g} (6 milimolů} ^Boc—Ar^g(^NO2) — —OPfp. Roztok se nechá stát po dobu jedné hodiny, přičemž se udržuje původní hodnota pH, načež se roztok odpaří. Zbytek se rozpustí v chloroformu, roztok se promyje postu^pně 10% vodným rozto^kem kyseliny cⁱ.trónové^, oteahujíCm 10 % ^dimethyl^formamidu, 1 N vodným roztokem kyseliny chlorovoCkovů 5% vodným roztokem ^hydrogenuhličitanu sodného a vodový vysu^ší a od^paří. •Zb^ytek se rozetře se směs^í etheru a ethanolu (8 : 2) a zfiltruje se. RezuHující chráněný he^pta^pe^ptíd^, R_f ⁽³⁾ — ^0,63 se rozpustí v 10 ml 8 N roztoku kyseliny chloro voCkové v ^dioxanu a ^po· 15 minutách stání se vohiý he^pta^ρe^ppid^hy^drochlorid^, Rť⁽⁵⁾ — = O,^45, v^ysr^áží bezvo^dým etoerem. Produkt se odfiltruje, promyje, vysuší, rozpustí ve ²⁰ m^l dilnet^hylfOI'mamidu^{, p}H roztoku se nastaví na hodnotu 8 a k roztoku se přidá 2,3 (6 milimolů) Z—Sar—OPfp. Roztok se nechá stát po dobu 30 minut, přičemž se u^dr^žuje ^původní ^hodnota ^pH potom se zře^{dí 60} m^l c^hloro^foιrmu^{, p}rom^yje 1 N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové a vodou, vysuší a odpaří. Zbytek se rozetře se směsí e^theru a ethanoto (8 : 2^ ^pevný · ^podíl· se odfiltíuje a ^prom^yje. ^Zís^ká se ^2,36 ^g (30 po^číteno^pro His^, což od^povídá výtěžku 82 proč, v jednotlivých stupních) Z—Sar— —Arg(NO2)—Val—T^yr(Bzl)—Ile— —His(Dnp)—^Pro—^ν—^ζζ te^plota tání: 193 až 202 °C, Rf⁽³> = 0^ Rf⁽⁴⁾ = 0^6.

Stupeň 4

Odštopern oc^hrannýc^h s^ku^pin

2,8 ml 2-merka.p.toethanolu se přidá ^k roz^to^ku 2 ^g (1^,25 milimolů) bráněného ^oktapept^idu^, ^praveného v přecházejte^ stu^pnⁱ 3, v 5 ml dímeth^ylformamidu. Získaná směs se míchá po dobu jedné hodiny, · načež se produkt vysráží bezvodým etherem, · promyje etherem, rozpustí v methanolu a opět v^ysrá^ží etherem. Získá se 1^,44 ^g (80 %) oktapeptidu, který je částečně zbaven . ochrany a který je prost dinitrofenylové skupiny ^R _f ⁽⁴⁾ = ^0,41. Tato tetka se roz^pustí ve ³⁰ m^l sm^ěsi methanoh^ ^kyselin^y octové ·· a vod^y (5 : ² : 1), k roztoku se ^pridá 0^,7 ^{g 10}% ^paládia .na uhtí jako^žto katalyzátoru a reakční směsí se · probublává vodík po · · dobu 20 hodin za intenzivního míchání. Po ukončení hydrogenační reakce se katalyzátor odfiltruje, promyje 20 ml výše · uvedené směsi· rozcuštědeh filtrát a ^promývac^í roztok · se sloučí a odpaří k . suchu. Zbytek se rozetře se směsí ethanolu a etheru· (1 : · 1) a pevný ^podíl se odtíltíuje. ^Zís^ká se 0^,65 ^g ' (67 %) (sarkosln¹, L-2-^hydrox^y-3-meth^ylvaterová ^kyselina⁸ jan^giotensinu I¹.

Stupeň 5

Surový produkt, získaný v předcházejícím stupni 4, se vyčistí výše popsanou obecnou čistící metodou. Získaný čistý produkt má tyto fyzikální konstanty: chromatograíické c^hara^keristi^ky: R^/61 = R^{26, R}(⁽⁷⁾ — = 0,52, Rf⁽8) = 0,30.

Analýza aminokyselin:

Pro 1,06 (1), Val 1,03 (1), Ile 1,03 (1), Tyr 0,65 (1), His 0,99 (1), Arg 0,95 (1), Ser 1^,0 (1).