Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych analogów angioteneyny II, aw szcze¬ gólnosci wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania nowych peptydów o dzialaniu antagonietycznym w stosunku do angioteneyny II.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie zwiazki o wzorze ogólnym X-Arg-Val-Tyr-IIe-His-Pro- Y-OA, w którym X oznacza grupe sarkozylowa, Y oznacza rodnik kwasu mlekowego lub L-2-hydroksy-3- metylowalerianowego, a A oznacza atom wodoru lub grupe Cj^-alkilowa* Kwas mlekowy lub L-2-hydro- ksy-3-metylowalerianowy, którego rodnik stanowi fragment Y zwiazku wytwarzanego sposobem wedlug wynalazku, tworzy poprzez swoja grupe hydroksylowa zajmujaca pozycje karboksylowa poprzedzajacego go aminokwasu* Wynalazek obejmuje swym zakresem takze sposób wytwarzania soli addycyjnych powyzszych pepty¬ dów z kwasami.Pierwszy analog angiotensyny II, który okazal sie specyficznym inhibitorem angioteneyny II, tak w warunkach in vitro jak i in vivo, zostal opisany w roku 1970 przez G*R*Marshala i wsp* w Proc* Hatl*Acad.SodL* USA, 67, 1624 /1970/, oraz P.A.Khairallaha i wsp* w J*Med.Chem.t 13. 181 /1970/* Od poznania tego faktu rozpoczely, sie ekstensywne prace badawcze nad wytwarzaniem analo¬ gów angiotensyny II o dzialaniu ontagonistycznym, które mozna zastosowac do rozpoznawania pewnych postaci nadcisnienia, zaleznych od reniny, a takze, ewentualnie, w leczeniu tego rodzaju etanów* 1 fi /Sar ., Ala / - angiotensyna II, jeden z wielu analogów o dzialaniu antagonistycznym zostal juz wypuszczony na rynek pod nazwa fabryczna Saralasin /D.T.Pals i wsp*, Ciro, Res*, 29» 673 /1971A Testy kliniczne wykonane przy uzyciu tego zwiazku dowodza, ze substancje te mozna stosowac w rozpoznaniu nadcisnienia rozmaitego pochodzenia /G. Boenner i wsp., Dtsch.Med. Wschr*, 104, 432 /1979/ jak równiez w leczeniu tych stanów /J,L.Marx, Science, 194, 821 /1976//. Bardziej wspól¬ czesnie stwierdzono takze, ze substancje dzialajace antagonietycznie w stosunku do angiotensyny II mozna stosowac w leczeniu niewydolnosci serca spowodowanej nadcisnieniem naozyniowonerkowym /H.Graves i wsp*, JAMA, 238, 880 /1977//*z 130 448 Przy badaniu zaleznosci miedzy struktura a wplywam biologicznym dotychczas wytwarzanych analogów angiotensyny II wozna uzyskac szereg jednostkowych informacji za pomoca interpretacji wplywu agoniatycznego i aiutagonistycznego* Glównym celem ostatnich prac badawczych jest wytwo¬ rzenie substancji antagoniatycznych z przedluzonym biologicznym okresem póltrwania, wolnych od pewnych niepozadanych dzialan ubocznych, takich jak poczatkowy wplyw agonis tyczny • Stwierdzono, ze w przypadku zastapienia ugrupowania fenyloalaniny w pozycji 8 czasteczki angiotensyny II reszta alifatycznego kwasu ck-hydroksykarboksylowego z jednoczesnych wprowadze¬ niem N-metyloaminokwaeu, korzystnie ugrupowania earkozyny lub kwasu d.-hydroksy- lub ^t-amino- oksykarboksylowego, jak poprzednio opisano przez zglaszajacych, które okazaly sie skuteczne w tym samym zastosowaniu /patrz opisy zgloszen patentowych RFN nr nr 28 31 271 i 28 31 534/ w po¬ zycje 1 czasteczki, otrzymuje sie nowe konkurencyjne inhibitory angiotensyny II, obnizajace znacznie nadcisnienie spowodowane px*zez angiotensyne II i aktywne równiez przy podawaniu pod¬ skórnym* # Sposób wytwarzania nowych zwiazków o wzorze ogólnym X-Arg-Val-Tyr-ile-His-Fro-Y-OA, w któ¬ rym X oznacza grupe sarkozylowa, Y oznacza rodnik kwasu mlekowego lub L-2-hydroksy-3-nietylówa- lerianowego i A oznacza atom wodoru lub grupe C-| ^alkilowa polega wedlug wynalazku na tym, ze z peptydu o wzorze ogólnym B-X-Arg/C/-Val-X,yr/D/~Ile-His-/E/-Pro-Y-QF,w którym B oznacza grupe dajaca sie usunac przez acydolize lub uwodornienie katalityczne, korzystnie grupe benzyloksy- karbonylowa lub III*rzed. bu toksykarbonyIowa, G oznacza grupe przeinaczona do tymczasowego za¬ bezpieczenia grupy guanidynowej w ugrupowaniu Arg, korzystnie grupe nitrowa lub tosylowa, D oznacza grupe przeznaczona do tymczasowego zabezpieczenia aromatycznej grupy hydroksylowej w ugrupowaniu Tyr, korzystnie grupe benzylowa lub podstawiona grupe benzylowa, E oznacza grupe przeznaczona do tymczasowego zabezpieczenia grupy imidazolowej w ugrupowaniu His, korzystnie grupe dwunitrofenylowa, a F oznacza grupe przeznaczona do zabezpieczenia koncowej grupy karbo¬ ksylowej, oporna na dzialanie slabych kwasów, ale dajaca sie usunac przez hydrogenolize kata¬ lityczna lub przez dzialanie silniejszym kwasem, albo oznacza grupe C-,--alkilowa, usuwa sie grupy zabezpieczajace, po czym ewentualnie przeksztalca sie zwiazki o wzorze ogólnym X-Arg- Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y~OAw ich kwasne sole addycyjne• Pochodna peptydu o wzorze ogólnym B-X-Arg/C/-Val-Tyr/D/-Lie-His/E/-Pro-Y~OF stosowana w sposobie wedlug wynalazku jako zwiazek wyjsciowy, mozna wytwarzac jakakolwiek metoda znana w chemii peptydów, np* taka, jaka opisano w wegierskim opisie patentowym nr 168 431* W przy¬ padku wytwarzania zabezpieczonych peptydów, do zabezpieczenia bocznych grup funkcyjnych nalezy uzywac grup zabezpieczajacych stabilnych w warunkach acydolizy prowadzonej w celu usuniecia N-konoowej grupy zabezpieczajacej po reakcji sprzegania* Korzystny wariant sposobu wedlug wynalazku polega na tym, ze zabezpieczona pochpdna pep¬ tydu o wzorze ogólnym B-X-Arg/C/-Val-Tyr/I)/-Ile-His/E/~Pro-Y-OP syntetyzuje sie stopniowo, a do tymczasowego zabezpieczenia koncowych grup aminowych poszczególnych pochodnych aminokwa¬ sów uzywa sie grup, które mozna latwo usunac za pomoca acydolizy, takich jak grupa III-rzed* -butoksykarbonylowa* Grupy zabezpieczajace zwiazane z wyjsciowa pochodna poptydu korzystnie od- ezczepia sie w jednym etapie przez hydrogenolize katalityczna po usunieciu grupy dwunitrofeny- lowej za pomoca tiolizy* Korzystnie rodnik kwasu oG-hydrokaykarboksylowego wprowadza sie w pozycje 8 czasteczki za pomoca poddania zestryfikowanego kwasu <*-hydroksykarbokaylowego o wzorze ogólnym H-Y-OZ, w którym Y ma wyzej podane znaczenie, a Z oznacza grupe alkilowa lub aralkiIowa, reakcji z N- zabezpieczona prolina, przy czym grupe zabezpieczajaca korzystnie stanowi grupa III-rzed.-bu¬ toksykarbonyIowa. Utworzone w tej reakcji wiazanie-CO-0- jest stabilne i nie rozszczepia sie w dalszych stadiach syntezy.Zwiazki o wzorze ogólnym X-Arg-Val-!Eyr-Iie-His-Pro-Y-OAoczyszcza sie metodami znanymi, korzystnie metoda chromatografii jonowymiennej na karboksymetylocelulozie* Korzystnie) produkt* koncowy wydziela sie z wycieku za pomoca liofilizacji, w wyniku czego otrzymuje sie substancje w postaci proszku, który mozna uzyc bezposrednio do wytwarzania róznych kompozycji farmaceu¬ tycznych* ,130448 3 i Dzialanie antagonistyczne zwiazków o wzorze ogólnym K-Arg-Yal-Tyr-Ile-His-lro-Y-OA wytwa- - rzanych sposobem wedlug wynalazku badano na kotach samcach, poddanych dzialaniu narkotyków* Po podzialaniu na zwierzeta czynnikiem blokujacym zwoje nerwowe i obustronnym przepolowieniu szyj¬ nych nerwów blednych, zwierzetom podawano Hypertensyne /produkt firmy CIBA/ w infuzji, w dawce 0,5 ug/kg/min. Gdy cisnienie krwi zwierzat osiagnelo staly, podwyzszony poziom, podawano badana substancje albo dozylnie, albo podskórnie w fizjologieznym roztworze soli lub w roztworze wod¬ nym zawierajacym dodatkowo nosnik.Spadek cisnienia krwi mierzono w kPa, a jego postep wykazano w procentach wartosci przed podaniem. Ocene statystyczna prowadzono w oparciu o test t-Studenta dla prób niepowiazanych.Otrzymane wyniki podsumowano w ponizszej tablicy 1. Termin "czas trwania dzialania" oznacza okres czasu uplywajacy do momentu zaobserwowania ostatniej jeszcze znaczacej /p = 5ft/ róznicy w cisnieniu krwi.Tablica 1 Wplyw nowych analogów angiotensyny II zawierajacych reszte kwasu cA/-hydroksykarboksylowego w pozycji 8 na obnizenie cisnienia krwi I Analogi KSar^L-Lao^Ang 11 KSar1,L-Lac-0Et8/Ang II par1,HMV8/Ang II Baralaain dozylnie d n % 10 5 2'J 20 5 29 10 5 27 20 8 40 10 5 33 20 6 40 10 5 32 podskórnie Xiz.1ol.roztw.soli p d n % 15 50 5 29 15 100 5 33 200 5 47 12 100 6 15 25 45 100 5 18 20 15 100 6 29 200 5 24 podskórnie CMC p d n % 90 50 6 25 120 100 6 27 180 200 5 22 45 100 5 41 30 100 5 35 60 100 5 23 45 200 7 28 podskórnie,zelatyna p d n % p 45 50 5 24 90 90 100 5 32 90 45 200 5 28 120 90 300 45 200 4 23 0 90 W powyzszej tablicy uzyto nastepujacych oznaczeni d « dawka /Ag/kg, n « ilosc badan, p « czas trwania dzialania w minutach, fizjl* roztw. soli = fizjologiczny roztwór soli, CMC - karboksyroetyloceluloza. Z danych zamieszczonych w powyzszej tablicy okazuje sie, ze wszystkie analogi angiotensyny II zawierajace reszte kwasu et-hydroksykarboksy1owego w pozycji 8 i grupe sarkozyIowa w pozycji 1 wywieraja dzialanie polegajace na znacznym obnizeniu cisnie- bia krwi. Wplyw ten jest znaczny równiez po podaniu podskórnym, a po podaniu tych zwiazków w roztworze zawierajacym dodatkowo nosnik, czas dzialania moze siegac niekiedy kilku godzin.Nowe peptydy wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, oraz ich farmaceutycznie dozwolone sole mozna stosowac w lecznictwie w postaci zwyklych srodków farmaceutycznych. Srodki te zawieraja nowe zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalazku wraz z domieszka nosnika organicznego lub nieorganicznego, nadajacego sie do uzycia przy podawaniu jelitowym lub pozajelitowym. Srodki farmaceutyczne moga wiec miec postac substancji stalych powstajacych w wyniku liofilizacji i zawierac nosniki nie reagujace z peptydem, takie jak weglowodany, a dalej moga one stanowic stezone lub rozcienczone zawiesiny lub emulsje, ktcre równiez moga zawierac rózne czynniki konserwujace i stabilizatory.Srodki farmaceutyczne mozna zastosowac do rozpoznania i zróznicowania nadcisnienia rozma¬ itego pochodzenia, oraz w leczeniu zmierzajacym do zmniejszenia nadcisnienia pochodzenia ner¬ kowego, w leozeniu przelomów cisnienia, wtórnej niewydolnosci serca itp. Korzystnie srodki ¥4 130 448 farmaceutyczne wytwarza «ie w postaci przeznaczonej do wstrzykiwali o zawartosci 1-10 ing sklad¬ nika czynnego. Skladnik czynny wytworzony sposobem wedlug wynalazku, przy leczeniu doroslych moze byc podawany w dawkach dziennych 1-10 mg* Ilosc te wprowadza sie korzystnie 1 raz dzien¬ nie w postaci wstrzykniecia dozylnego, podskórnego lub domiesniowego, albo powoli w postaci dozylnej infuzji* Wynalazek objasniaja szczególowo nastepujace przyklady. Uzyte w przypadkach skróty odpo¬ wiadaja skrótom ogólnie przyjetym w pismiennictwie /J.Biol*Chem., 247, 977 /1972//. ltelszymi skrótami sa: Lac » kwas L-mlekowy$ HMV * kwas L-2-hydroksy-3-metylowalerianowy, Pfp » piecio- fluorofenyl* W trakcie wytwarzania zwiazków sposobem wedlug wynalazku, odparowania dokonuje sie zawsze w wyparce obrotowej typu Buechi. Chromatogramy wykonuje sie na plytkach do chrom*tografii cienkowarstwowej pokrytych warstwa zelu krzemionkowego "Kieselgel-6" wedlug Stahla, przy czym do rozwijania chromatografów uzywa'sie nastepujaoych ukladów rozpuszczalnikowi n-heksan : octan etylu * 4*11 octan etylut /pirydyna: kwas octowy: woda » 20*6*11/«95*5» octan etylu + /pirydyna: kwaa octowy? woda « 20:6:11/^90:10, octan etylu: /pirydyna:kwas octowy:woda « 20:6:11/«80:20, octan etylu:/pirydyna:kwas octowy:woda«20i6:11/»70:30, n-butanol:kwas octowy* woda»4:1*5 /faza górna/, n-butano1:octan etylu:pirydyna*woda=«30:6:20:24, n-butanol:octan etylu:kwas octowyswoda~1:1:1*1* Chromatogramy cienkowarstwowe wywoluje sie przy usyciu ninhy- dryny lub mieszaniny chlorotoluidyny i jodku potasowego. lrodukty koncowe oczyszcza sie nastepujaca metoda ogólna, 0,5 g wolnego peptydu rozpusz¬ cza sie w 4 ml 0,01 molowego roztworu octanu amonowego i otrzymany roztwór nanosi sie w war¬ stwie na kolumne zawierajaca 0,5 litra karboksymetylocelulozy /CMC-52/ uprzednio zrównowazo¬ nej tym samym roztworem buforowym* Jako czynnik eluujacy stosuje sie mieszanine gradientowa 1,5 litra 0,01 molowego roztworu octanu amonowego i 1,5 litra 0,4 molowego roztworu octanu amonowego* Czynnik eluujacy przepuszcza sie przez kolumne z szybkoscia 25 ml/godzine, a wy¬ ciek zbiera sie we frakcjach po 10 ml kazda* Sklad wycieku opuszczajacego kolumne kontroluje sie w sposób* ciagly przy uzyciu aparatu 1KB Uvicord II, przy czym frakcje zasadnicze oddziela sie na podstawie uzyskanej krzywej, po czym poddaje liofilizacji w liofilizatorze Leybold- Hereue. Jesli jest to konieczne, produkt ponownie poddaje sie chromatografii, znów stosujac elucje w gradiencie* 1 8 Przyklad I* Otrzymywanie /sarkozyna , kwas Ir-mlekowyv -angiotensyny II* Etap 1* Otrzymanie Boc-Pro-Lac-OBzl.Do roztworu 2,15 g/10 milimoli/ Boc-Pro-OH w 10 ml suchego czterowodorofuranu dodaje sie przy mieszaniu, w temperaturze 0°C, w ciagu 10 minut, 2,4 g /15 milimoli/ karbonylodwuimida- zolu. Nastepnie do otrzymanej mieszaniny reakcyjnej wkrapla sie w temperaturze 0°C, w ciagu 15 minut, roztwór 1,8 g /10 milimoli/ L-mleczanu benzynu w 10 ml suchego czterowodorofuranu, oziebiony do 0°C. Otrzymana mieszanine miesza sie w temperaturze 0°C w ciagu 30 minut, a nastepnie w temperaturze 20°C w ciagu 2 godzin, po czym wstawia do chlodni* Nastepnego dnia usuwa sie rozpuszczalnik, a pozostalosc rozpuszcza w 30 ml chloroformu i otrzymany roztwór przemywa kolejno 4 razy po 10 mlln kwasu solnego, woda, 2 razy po 15 al wodnym roztworem wodoroweglanu sodowego i ponownie woda* Otrzymany roztwór chloroformowy osusza sie i odparowuje do stalej wagi, a oleista pozostalosc suszy sie w eksykatorze nad pieciotlenkiem fosforu, w wyniku czego otrzymuje sie 3»0 g /BQ#/ Boo-Pro-Lac-OBzl, który jest produktem jednolitym pod wzgledem chromatograficznym* RJ '« 0,32, JlJ ' » 0,57* Etap 2* Otrzymywanie Z-Sar-Arg/N02/-Val-Tyr/Bzl/-Ile-His/Dnp/-Pro-Lac-OBzl* Roztwór 2,85 g /7,5 milimola/ Boc-Pro-Lac-OBzl w 15 ml 8 n roztworu kwasu chlorowodoro¬ wego w dioksanie odstawia sie na 15 minut, po czym dodaje 30 ml suchego eteru i otrzymana mieszanine odparowuje do sucha. Otrzymany chlorowodorek wolnego dipeptolidu o Rf'*' = 0,37 rozpuszcza sie w 20 ml dwumetyloformamidu, po czym pH otrzymanego roztworu doprowadza sie130 448 5 do wartosci 8 przy uzyciu trójetyloaminy, a nastepnie dodaje 2,9 g /5 milimoli/ Boc-His /Unp/-OPfp. Otrzymana mieszanine reakcyjna miesza aie w ciagu 1 godziny, utrzymujac w tym czasie wartosc pH 8 mieszaniny. Nastepnie rozpuszczalnik odparowuje sie, a pozostalosc roz¬ puszcza w octanie etylu i otrzymany roztwór przemywa kolejno 10# wodnym roztworem kwasu cytry¬ nowego, In roztworem kwasu solnego, 5% wodnym roztworem wodoroweglanu sodowego i woda. Otrzy¬ many roztwór osusza sie, po czym usuwa rozpuszczalnik i otrzymany surowy zabezpieczony tripe- ptyd o R'2' =* 0,77 rozpuszcza w 10 ml 8 n roztworu kwasu chlorowodorowego w dioksanie.Po uplywie 20 minut odstawania, chlorowodorek wolnego tripeptydu wytraca sie suchym ete¬ rem, wydzielone cialo stale odsacza sie i przemywa eterem. Otrzymany chlorowodorek wolnego tri¬ peptydu o Rf' » 0,10 rozpuszcza sie w 20 ml dwumetyloformamidu, po czym pH otrzymanego roz¬ tworu doprowadza sie do 8 przy uzyciu trójetyloaminy i do otrzymanej mieszaniny dodaje sie 2,78 g /7,5 milimola/ Boc-lle-OPfp.Nastepnie otrzymana mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu 1 godziny utrzymujac w tym czasie wartosc pH na poziomie wyjsciowym, po czym rozpuszczalnik odparowuje sie i pozostalosc rozpuszcza w octanie etylu. Otrzymany roztwór przemywa sie w sposób jak wyzej opisano, po czym suszy i rozpuszczalnik odparowuje sie, a pozostalosc rozciera z n-heksanem i utworzone /2/ cialo stale odsacza sie. Otrzymany zabezpieczony tetrapeptyd o Rf' ' » 0,67 rozpuszcza sie w 10 ml 8 n roztworu kwasu chlorowodorowego w dioksanie i odstawia na 15 minut.Nastepnie wytraca sie suchym eterem chlorowodorek wolnego tetrapeptydu o R^' ¦ 0,52.Otrzymany zwiazek rozpuszcza sie w 20 ml dwumetyloformamidu, po czym pH otrzymanego roztworu doprowadza sie do wartosoi 8 i dodaje 3,24 g /6 milimoli/ Boc-Tyr/Bzl/-OPfp. Otrzymana mie¬ szanine miesza sie w ciagu 30 minut utrzymujac w tym cza#^ wartosc pH na poziomie wyjsciowym.Nastepnie usuwa sie rozpuszczalnik, a pozostalosc rozpuszcza sie w octanie etylu i do otrzy¬ manej mieszaniny dodaje sie 0,22 ml N,N-dwumetyloaminoetyloaminy w celu usuniecia nadmiaru aktywnego estru. Po uplywie 15 minut odstawania roztwór przemywa sie kolejno 10$ wodnym roztworem kwasu cytrynowego, 1 n wodnym roztworem kwasu solnego, woda, 5% wodnym roztworem wodoroweglanu sodowego i powtórnie woda, po czym suszy i odparowuje.Otrzymana pozostalosc rozciera sie z mieszanina n-heksanu i eteru 8:2, po czym wydzielone cialo stale odsacza sie. Otrzymany zabezpieczony pentapeptyd o R^' «. 0,72, rozpuszcza sie w 10 ml 8 n roztworu kwasu chlorowodorowego, po czym otrzymany roztwór odstawia sie na 15 mi¬ nut, a nastepnie wytraca sie suchym eterem chlorowodorek wolnego pentapeptydu* Otrzymany zwia¬ zek rozpuszcza sie w 20 ml dwumetyloformamidu, po czym pil otrzymanego roztworu doprowadza sie do wartosci 8 przy uzyciu trójetyloaminy i dodaje 2,6 g /6,8 milimola/ Boc-Val-OPfp. Otrzymany roztwór miesza sie w ciagu 1 godziny, utrzymujac w tym czasie wartosc pH na poziomie wyjscio¬ wym, po czym odparowuje sie rozpuszczalnik i pozostalosc rozpuszcza sie w octanie etylu, a nastepnie otrzymany roztwór przemywa sie w sposób jak wyzej opisano. Przemyty roztwór osusza sie i odparowuje, po czym otrzymana pozostalosc rozciera sie z suchym eterem. Otrzymany za¬ bezpieczony heksapeptyd o R^**' ¦ 0,83, odsacza sie, rozpuszcza w 10 ml 8 n roztworu kwasu chlorowodorowego w dioksanie i po uplywie 15 minut odstawania wytraca sie suchym eterem chlorowodorek wolnego hekeapeptydu o Rf = 0,65.Otrzymany zwiazek rozpuszcza sie w 20 ml dwumetyloformamidu, po czym pH otrzymanego roz¬ tworu doprowadza sie do wartosci 8 przy uzyciu trójetyloaminy, a nastepnie dodaje sie 2,2 g /5 milimoli/ Boc-Arg/N02/-OPfp. Otrzymana mieszanine miesza sie w ciagu 1 godziny, utrzyimijac w tym czasie wartosc pH na poziomie Tvyjsciowym, po czym mieszanine rozciencza sie 60 ml chloroformu i otrzymana mieszanine przemywa sie kolejno 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowe¬ go," 1 n wodnym roztworem kwasu solnego i wode. Otrzymany roztwór osusza sie, odparowuje i otrzymana pozostalosc rozciera z mieszanina etanolu i eteru 1:1• Otrzymany zabezpieczony hep- /3/ tapeptyd o Rf' ' = 0,65. rozpuszcza sie w 10 ml 8 n roztworu kwasu chlorowodorowego w dioksa¬ nie.6 130 448 / Po uplywie 15 minut odstawania wytraca sie suchym eterem chiorowodorek wolnego heptape- /5/ ptydu o Rf' " m 0,40. Otrzymane cialo stale odsacza siet przemywa, suszy i nastepnie rozpusz¬ cza w 15 ml dwumetyloformamidu, pil otrzymanego roztworu doprowadza sie do wartosci 8 i dodaje sie 1,8g/5 milimoli/ Z-Sar-OPfp, po czym otrzymany roztwór miesza sie w ciagu 30 minut, utrzymujac w tyra czasie wartosc pil na poziomie wyjsciowym* Nastepnie roztwór rozciencza sie 45 ml chloroformu i wytrzasa z woda.Otrzymana mieszanine osusza sie, odparowuje i pozostalosc rozciera z suchym eterem, po czym odsacza wydzielone cialo stale, w wyniku czego otrzymuje sie 2,12 g /29»6 % wyd., wyli¬ czonej w odniesieniu dla His, co odpowiada 82% wydajnosci w pojedynczych stadiach/ Z-Sar-Arg/ N02/-Yal-Tyr/Bzl/-Ile-His/Unp/rro-Lac-0Bzl,o Rf^ » 0,465. Temperatura topnienia 204-213°C.Etap 3. Usuwanie grup zabezpieczajacych Do roztworu 1,45 g /1 milimola/ zabezpieczonego oktapeptydu, wytworzonego w sposób jak wyzej podano w etapie 2, w 5 ml dwumetyloformamidu, dodaje sie 2,3 ml /30 milimoli/ 2-rcerka- ptoetanolu, po czym miesza w ciagu 1 godziny i do otrzymanej mieszaniny dodaje sie suchy eter.Utworzony zabezpieczony oktapeptyd, który obecnie jest pozbawiony grupy Dnp wydziela sie i oczyszcza przez wytracenie z metanolu i eteru, w wyniku czego otrzymuje sie 1,14% /89%/ czes¬ ciowo odblokowanego peptydu, o R/*' - 0,60. Otrzymany zwiazek rozpuszcza sie w 40 ml mieszaniny metanolu, kwasu octowego i wody 5:1:2, po czym dodaje sie 0,6 g 10% katalizatora palladowego na weglu i mieszanine podaje uwodornianiu w ciagu 20 godzin przy energicznym mieszaniu. Nastepnie katalizator odsacza sie i przemywa wyzej opisana mieszanina rozpuszczalników i przesacz odpa- 1 8 rowuje do sucha, w wyniku czego otrzymuje sie 0,7 g /84%/ Sar , Lac /- Ang II.Etap 4. Surowy peptyd oczyszcza sie zgodnie z wyzej opisanym ogólnym sposobem oczysz¬ czania. Stale fizyczne czystego zwiazku: Stale chromatograficznet r/6/ - 0,17, Rf/7/« 0,40, Rf/8/ • 0,21.Wspólczynnik refrakcji C cC J^A .-87,65°, /c«0,25, n-CH^COOH/. Czystosc /okreslona metoda HPLC/i99,7*.Analiza skladu aminokwasowegoi Pro 1,0/1/, Val 1,0 /1/, Ile 1,03 /1/» Tyr 0,85 /V, His 0,85 /V, Arg 0,96 /1/, Sar 1,0 /1/. 1 8 Przyklad II. Otrzymywanie /sarkozyna , L-mleczan etylu /-angiotensyny II.Js t a p 1. Otrzymywanie Boc-Pro-Lac-OCpHc Do roztworu 4,3 g /20 milimoli/ Boc-Pro-OH w 20 ml suchego czterowodorofuranu dodaje sie w temperaturze 0°C, w ciagu 10 minut, 4,8 g /30 milimoli/ karbonylodwuimidazolu, po czym do otrzymanej mieszaniny wkrapla sie w wyzej wspomnianej temperaturze zimny roztwór 2,1 g /20 mi¬ limoli/ I-mleczanu etylu w ozterowodorofuranie. Nastepnie mieszanine miesza sie jeszcze w cia¬ gu 30 minut w temperaturze 0°C, a nastepnie w ciagu 2 godzin w temperaturze 20°C, po czym zos¬ tawia przez noc w chlodni.Nastepnego dnia oddestylowuje sie czterowodoroiuran, pozostalosc rozpuszcza sie w 40 ml octanu etylu i otrzymany roztwór przemywa kolejno 2 razy po 15 ml 1 n wodnego roztworu kwasu solnego, woda, 2 razy 5% wodnym roztworem wodoroweglanu sodowego i powtórnie woda. Otrzymany roztwór suszy sie, po czym odparowuje sie rozpuszczalnik i pozostalosc o konsystencji oleju suszy sie w oksykatorze do stalej wagi, w wyniku czego otrzymuje sie 2,22 g /&%/ Boc-Pro-Lac- OC2H5, o Rf/3/ « 0,77, Rf/1/« 0,36% Etap 2. Otrzymywanie Z-Sar-Arg/N02/-Val-Tyr/Bzl/-Ile--His/I)np/-Pro-Lac-C02H5.Roztwór 1,8 g /6 milimoli/ Boc-Pro-Lac-OCgHc w 8 ml 7,5 n roztworu kwasu chlorowodoro¬ wego w dioksanie odstawia sie na 15 minut, po czym dodaje 30 ml eteru i otrzymana mieszanine odparowuje do sucha. Otrzymany chlorowodorek wolnego peptolidu o R^' ¦ 0,31, rozpuszcza sie w 15 ml dwumetyloiormamidu, po czym pH otrzymanego roztworu doprowadza sie do wartosci 8 przy uzyciu trójetyloaminy, a nastepnie dodaje sie 2,9 g /5 milimoli/ Boo-His/Dnp/-OPfp. Po uplywie 1 godziny rozpuszczalnik zastepuje sie octanem etylu i otrzymany roztwór przemywa kolejno ^0% wodnym roztworem kwasu cytrynowego, 1 n wodnym roztworem kwasu solnego, 5# wodnym roztworem wodoroweglanu sodowego i powtórnie woda. Otrzymany roztwór osusza sie, odparowuje i pozosta-130 448 7 losc stanowiaca zabezpieczony tripeptyd o R^^ » 0,69, bezzwlocznie rozpuszcza sie w 20 ml 7,5 n roztworu kwasu chlorowodorowego w dioksanie* Po uplywie 20 minut odstawania, wytraca sie suchym eterem chlorowodorek wolnego tripep- tydu o rJ^ c 0,19. Otrzymany zwiazek rozpuszcza sie w 15 ml dwumetyloformamidu i pil otrzyma¬ nego roztworu doprowadza sie do wartosci 8 przy uzyciu trójetyloaminy, a nastepnie dodaje sie 3t0 g /7,5 milimola/ Boc-Ile-OPfp. Otrzymana mieszanine odstawia sie na 30 minut utrzymujac w tym cza&ia wartosc pH na poziomie wyjsciowym, po czym odparowuje sie rozpuszczalnik i po¬ zostalosc rozpuszcza sie w ostanie etylu. Otrzymany roztwór przemywa sie w sposób jak wyzej opisano, po czym osusza sie, odparowuje i pozostalosc rozciera z mieszanina eteru i n-hek- sanu 2:8.Otrzymane cialo stale odsacza sie, w wyniku czego otrzymuje sie zabezpieczony tetrapeptyd o Rf ' =-0,36, który rozpuszcza sie w 10 ml 8 n roztworu kwasu chlorowodorowego w dioksanie i po uplywie 15 minut odstawiania wytraca sie suchym eterem chlorowodorek wolnego tetrapeptydu /5/ o RJ-^/m 0,27. Otrzymany zwiazek rozpuszcza sie bezzwlocznie w 20 ml dwumetyloformamidu, po czym pH otrzymanego roztworu doprowadza sie do wartosci 8 i dodaje 3t24g/6 milimoli/ Boc-Tyr /Bzl/-0Pfp. Otrzymany roztwór odstawia sie na 30 minut, utrzymujac w tym czasie wartosc pH na poziomie wyjsciowym, po czym rozpuszczalnik odparowuje si? i pozostalosc rozpuszcza w octanie etylu.Nastepnie do otrzymanego roztworu dodaje sie 0,22 ml W,N-dwumetyloaminoetyloaminy i mie¬ szanine odstawia sie na 10 minut, po czym przemywa w sposób jak wyzej opisano, a nastepnie osusza i odparowuje* Pozostalosc rozciera sie z n-hek^anem i saczy, w wyniku czego otrzymuje sie zabezpieczony pentapeptyd o R^'2' ¦ 0,64, który rozpuer-cza «ie w 10 ml 8 n roztworu kwasu chlorowodorowego w dioksanie i po uplywie 15 minut odstawania wytraca sie suchym eterem chloro¬ wodorek wolnego pentapeptydu o R^' ' - 0,33. Otrzymany zwiazek rozpuszcza sie w 15 ml dwumety- loformamidu, po czym pH roztworu doprowadza sie do wartosci 8 przy uzyciu trójetyloaminy i do¬ daje 2,1 g /5,5 milimola/ Boc-Val-OPfp. Otrzymany roztwór odstawia sie na 30 minut, utrzymujac w tym czasie wartosc pH na poziomie wyjsciowym, a nastepnie odparowuje i pozostalosc rozpuszcza w octanie etylu, po czym otrzymany roztwór przemywa w sposób jak wyzej opisano, a nastepnie osusza, odparowuje i pozostalosc rozciera z n-heksanem i saczy, w wyniku czego otrzymuje sie zabezpieczony heksapeptyd o rJ ' * 0,76, który rozpuszcza sie bezzwlocznie w 10 ml 8 n roz¬ tworu kwasu chlorowodorowego w dioksanie i po uplywie 15 minut odstawania wytraca sie suchym eterem chlorowodorek wolnego heksapeptydu o Rf * 0,34.Otrzymany zwiazek rozpuszcza sie w 20 ml dwumetyloformamidu, po czym pH otrzymanego roz¬ tworu doprowadza sie do wartosci 8 i dodaje 3,96 g /6 milimoli/ Boc-Arg/N02/-OPfp. Otrzymany roztwór odstawia sie na 1 godzine, otrzymujac w tym czasie wartosc pH na poziomie wyjsciowym, po czym rozciencza 60 ml chloroformu, przemywa w sposób jak wyzej opisano, osusza i saczy.Otrzymana pozostalosc, która stanowi zabezpieczony heptapeptyd o R^' » 0,78, rozpuszcza sie w 10 ml 8 n roztworu kwasu chlorowodorowego w dioksanie i po uplywie 15 minut odstawania wy¬ traca sie suchym eterem chlorowodorek wolnego heptapeptydu o rJ*'» 0,56, który rozpuszcza sie bezzwlocznie w 20 ml dwumetyloformamidu.Nastepnie pH otrzymanego roztworu doprowadza sie do wartosci 8, po czym dodaje sie 2,12 g /5,5 milimola/ Z-Sar-OPfp. Otrzymany roztwór odstawia sie na 30 minut, utrzymujac w tym czasie wartosc pH na poziomie wyjsciowym, a nastepnie rozciencza sie 60 ml chloroformu i przemywa w sposób jak wyzej opisano. Otrzymany roztwór osusza sie, odparowuje i pozostalosc rozciera z etanolem. Otrzymane cialo stale poddaje sie krystalizacji z etanolu, w wyniku czego otrzy¬ muje sie 1,21 g /17,5 % wydajnosci w odniesieniu do Hos, co odpowiada wydajnosci 75% w poje¬ dynczych stadiach/ Z-Sar-Arg/N02/-Val-Tyr-/Bzl/-Ile-His/Dnp/-Pro-Lac-0^2H5.Temperatura top¬ nienia 208-212°C, Rf/3/ » 0,5.Etap 3« Usuwanie grup zabezpieczajacych Do roztworu 1,21 g /O,88 milimola/ zabezpieczonego oktapeptydu, wytworzonego w sposób jak wyzej opisano w Etapie 2, w 5 ml dwumetyloformamidu, dodaje sie 3 ml 2 merkaptoetanolu i otrzymana mieszanine miesza sie w ciagu 1 godziny, po czym wytraca sie suchym eterem cialo8 130 448 stale, które odsacza sie i przemywa. Po rozpuszczeniu w metanolu i ponownym wytraceniu suchym eterem otrzyaruje sie 0,94 g /89*/ odpowiedniego, czesciowo odblokowanego oktapeptydut nie za¬ wierajacego dwunitrofenylowej grupy zabezpieczajacej o Rf/4/ - 0,59* Zwiazek ten rozpuszcza sie w 20 ml mieszaniny metanolu, kwasu octowego i wody 5t1s19 po czym dodaje sic 0,5 g 10# katalizatora palladowego na weglu i przez otrzymana mieszanine przepuszcza sie wodór w ciagu 20 godzin przy energicznym mieszaniu. Postep reakcji kontroluje sie metoda chromatografii cienkowarstwowej• Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza eie, przemywa wyzej opisana mieszanina roz¬ puszczalników, po czym przesacz i przemywaki laczy nie i odparowuje do sucha. Pozostalosc rozciera sie z mieszanina etanolu i eteru i saczy, z wyniku czego otrzymuje sie 0,72 g /96/V /Sar1, Lac-OC^8/ Ang II. £ t a p 4« Surowy wolny peptyd wytworzony w sposób jak wyzej opisano w stadium 3 poddaje sie oczyszczaniu zgodnie z wyzej opisana metoda ogólna. Oczyszczony peptyd wykazuje nastepuja¬ ce stale fizycznet Rf/6/ - 0,24i Rf/7/ - 0,53, R/8/» 0,36. foCj^* - -62,5° /C-0,4, n-CH3 COOH/. Czystosc /okreslona metoda HPLC/ t 98,9% Analiza skladu aminokwasowegoi Pro 1,02 /1/, Val 0,97 /V, Ile 1,08 /1/, Tyr 0,91 /1/» His 1,00 /1/, Arg 1,07 /1/, Sar 1,0 /1/. 1 8 Przyklad III. Otrzymywanie /sarkozyna , kwas L-2-hydroksy-3-metylowalerianowy /- angiotensyny II. £ t a p 1. Otrzymywanie H-HMV-0Bzl Do zawiesiny 7,12 g /40 milimoli/ H-HMV-0NA w 10 ml octanu etylu dodaje sie 20 ml 4 n roztworu kwasu chlorowodorowego w octanie etylu. Otrzymana mieszanine miesza sie w ciagu 2 godzin, po ozym pH mieszaniny doprowadza sie do wartosci 3 przy uzyciu trójetyloaminy. Wy¬ dzielony osad odsaoza sie i przemywa dwukrotnie 20 ml ootanu etylu, po czym pH otrzymanego przesaczu doprowadza sie do wartosci 6 przy uzyciu trójetyloaminy, po ozym dodaje sie 8 ml /60 milimoli/ bromku benzylu i 8,4 ml /60 milimoli/ trójetyloaminy.Otrzymana mieszanine ogrzewa sie pod chlodnica zwrotna w ciagu 8 godzin, po czym wydzie¬ lona sól nieorganiczna odsaoza sie i przesaoz przemywa kolejno woda, 1 n wodnym roztworem kwa¬ su solnego, 5% wodnym roztworem wodoroweglanu sodowego i powtórnie woda. Otrzymany roztwór osusza sie i odparowuje, w wyniku czego otrzymuje sie 5,6 g /63%/ H-HMV-0Bzl, który oozyszoza sie przez poddanie destylacji pod zmniejszonym olsnieniem. Temperatura wrzenia tytulowego zwiazkui 134-136°G /5 mm Hg/. £oC y^ « -13.9° /c - 1%, w acetonie/. £ t a p 2. Otrzymywanie Boo-Pro-HtfV-0Bzl Do roztworu 2,7 g /12,5 milimola/ Boc-Pro-OH w 15 ml suchego ozterowodorofuranu dodaje sie w temperaturze 0°C, w ciagu 10 minut, 3t2 g /20 milimoli/ karbonylodwuimidazolu. Nastep¬ nie do otrzymanej mieszaniny dodaje sie w tej samej oo wyzej podano temperaturze zimny roztwór 2*8 g /12,5 milimola/ H-HMY-OBzl w 10 ml ozterowodorofuranu, po ozym otrzymana mieszanine miesza sie w temperaturze 0°C w ciagu 30 minut, a nastepnie w temperaturze 20°G w ciagu 2 go¬ dzin.Otrzymana mieszanine pozostawia sie przez nio w ohlodni, a nastepnego dnia odparowuje sie czterowodorofuran i otrzymana pozostalosó rozpuszcza w 40 ml ootanu etylu, po ozym otrzy¬ many roztwór przemywa kolejno 2 razy po 15 ml 1 n wodnego roztworu kwasu solnego, woda, 5% wodnym roztworem wodoroweglanu sodowego i powtórnie woda." Otrzymany roztwór suszy sie, odparowuje i oleista pozostalosó suszy do stalej wagi w tem¬ peraturze 25°0, w wyniku czego otrzymuje sie 3$19 g /65#/ Boo-Pro-HMV-OBzl, o Rf'2' « 0,90, Rf/1/ - 0,33. £ t a p 3. Otrzymywanie Z-Sar-Arg/N02/-Val-Tyr/Bzl/-Ile-His/Dnp/-Pro-HEV-0Bzl.W 8 ml 8 n roztworu kwasu chlorowodorowego w dioksanie rozpuszcza sie 2,52 g /6 milimoli/ Boo-HUV-0Bzl, po ozym otrzymana mieszanine odstawia sie na 15 minut i dodaje 30 ml suchego eteru, po czym odparowuje do sucha, w wyniku ozego otrzymuje sie pozostalosó stanowiaca chlo¬ rowodorek wolnego dipeptolidu o Rf'4' » 0,30. Otrzymany zwiazek rozpuszcza sie w 15 ml dwume-130 448 9 tyloformamidu i pH otrzymanej mieszaniny doprowadza sie do wartosoi 8 przy uzyciu trójetyloa- miny, a nastepnie dodaje sie 2,9 g /5 milimoli/ Boc-His/Bnp/-OPfp* Otrzymany roztwór odstawia sie na 1 godzine, utrzymujac w tym ozasie wartosc pH na poziomie wyjsciowym, a nastepnie od.- parowuje i pozostalosc rozpuszoza w octanie etylu. \ Otrzymany roztwór przemywa sie kolejno In wodnym roztworem lcwasu solnego, woda, i 5% wodnym roztworem wodoroweglanu sodowego, po czym suszy i odparowuje, w wyniku ozego otrzymuje sie pozostalosc stanowiaca zabezpieczony tripeptyd, o Rf/2/ - 0,67. Pozostalosc te rozpuszoza sie w 10 ml 8 n roztworu kwasu chlorowodorowego w dioksanie* Po uplywie 20 minut odstawania wytraca sie suchym eterem chlorowodorek wolnego tripeptydu o Rf'4' - 0,18. Otrzymany zwiazek rozpuszoza sie w 15 ml dwumatyloformamidu, po czym pH otrzymanego roztworu doprowadza sie do wartosoi 8 przy uzyoiu trójetyloaminy i dodaje 2,4 g /6 milimoli/ Boc-lle-OPfp. Otrzymany roz¬ twór odstawia sie na 1 godzine, utrzymujac w tym czasie wartosc pH na pozioicie wyjsciowym, po czym odparowuje i pozostalosc rozpuszcza w chloroformie• Otrzymany roztwór prsemywa sie kolejno woda, 1 n wodnym roztworem kwaem solnego, i 5% wodnym roztworem wodoroweglanu sodowego, po czym osusza i odparowuje. Otrzymana pozostalosc, stanowiaca zabezpieczony tetrapeptyd, rozciera sie % n-heksanem, po czym n-heksan dekantuje sie, a pozostalosc rozciera sie z suchym eterem i saczy. Otrzymany zabezpieczony tetrspeptyd o Rj ' ¦ 0,65, rozpuszoza sie w 10 ml 8 n roztworu kwasu ohlorowodorowego w dioksanie i po uplywie 15 minut odstawania wytraca sie suchym eterem chlorowodorek wolnego tetrapeptydu o Rf'4'- 0,27. Zwiazek ten rozpuszcza sie w 15 ml dwumetyloformamidu, po czym pH otrzymanego roztworu doprowadza sie do wartosoi 8 1 dodaje sie 2,96 g .Boc~Tyr/Bzl/-OPfp* Otrzymany roz¬ twór odstawia sie na 30 minut, utrzymujac w tym czasi? wartosc pH na poziomie wyjsciowym, po czym odparowuje* Pozostalosc rozpuszcza sie w octanie etylu 1 do otrzymanego roztworu dodaje sie 0,22 ml N,N-dwumetyloaminoetyloaminy» Po uplywie 10 minut odstawania, mieszanine przemywa sie kolej¬ no 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego, 1 n wodnym roztworem kwasu solnego i 5% wodnym roztworem wodoroweglanu sodowego* Otrzymany roztwór osusza sie, odparowuje i pozostalosc rozciera z n-heksanem a nastepnie saczy*, Otrzymany zabezpieczony pentapeptyd o VL£^' m 0,75, rozpuszcza sie w 10 ml 8 n roztworu kwasu ohlorowodorowego w dioksanie i otrzymany roztwór odstawia na 15 minut, po czym suchym eterem wytraca sie chlorowodorek wolnego pentapeptydu o %/*/ « 0,60, Otrzymany zwiazek rozpuszoza sie bezzwlocznie w 20 ml dwumetyloformamidu, po czym pH otrzymanego roztworu doprowadza sie do wartosoi 8 i dodaje 2,3 g /6 milimoli/ Boc-Val-0Pfp* Otrzymany roztwór odstawia sie na 1 godzine, utrasymujao w tym ozasie wartosc pU na poziomie wyjsciowym, a nastepnie odparowuje i pozostalosc rozpuszcza w chloroformie* Otrzymany roztwór chloroformowy przemywa sie kolejno 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego, 1 n wodnym roztwo¬ rem kwasu solnego, 5% wodnym roztworem wodoroweglanu sodowego i woda* Otrzymany roztwór osu¬ sza sie, odparowuje i pozostalosc rozciera z n-heksanem, po czym odsaoza zabezpieczony heksa- peptyd o TL^ ' m 0»71» Otrzymany zwiazek rozpuszoza sie w 10 ml 8 n roztworu kwasu chlorowo¬ dorowego w dioksanie, po czym otrzymany roztwór odstawia sie na 15 minut i wytraca suchym eterem chlorowodorek wolnego heksapeptydu, o R+ a 0,34« Otrzymany zwiazek rozpuszoza sie bezzwlocznie w 20 ml dwumetyloformamidu, pH roztworu doprowadza sie do wartosoi 8 i dodaje 2,64 g /6 milimoli/ Boc-Arg/N02/-0Pfp* Otrzymany roztwór odstawia sie na 1 godzine, utrzymujac w tym ozasie wartosc pH na poziomie wyjsciowym, po czym odparowuje* Otrzymana pozostalosc rozpuszoza sie w chloroformie, po ozym otrzymany roztwór przemywa sie kolejno 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego zawierajacego 10% dwumetyloforma¬ midu, 1 n wodnym roztworem kwasu solnego, 5% wodnym roztworem wodoroweglanu sodowego i woda, a nastepnie osusza i odparowuje* Otrzymana pozostalosc rozciera sie z mieszanina eteru 1 eta¬ nolu 8:2, po ozym odsacza, w wyniku ozego otrzymuje sie zabezpieczony heptapeptyd o R^'^sl ¦ 0,63* który rozpuszoza sie w 10 ml 8 n-roztworu kwasu ohlorowodorowego w dioksanie* Po uplywie 15 minut odstawania wytraca sie suchym eterem chlorowodorek wolnego heptapep- tydu o Rj/ ¦ 0,45« Otrzymany zwiazek odsacza sie, przemywa, suszy i rozpuszcza w 20 ml dwu¬ metyloformamidu, po czym pH otrzymanego roztworu doprowadza do wartosci 8 1 dodaje 2,3 g10 UO 448 /6 milimoli/ Z-Sar-OPfp. Otrzymany roztwór odstawia sie na 30 minut, utrzymuja* w tym czasie wartosc pH na poziomie wyjsciowym, po czym rozoiencza 60 ml chloroformu, przemywa 1 U wodnym roztworem kwasu solnego i woda, osusza i odparowuje« Pozostalosc rozoiera sie z mieszanina eteru i etanolu 8:2, oialo stale odsacza sie i prsemywa, w wyniku czego otrzymuje sie 2,36 g /30% wydajnosci wyliczonej w odniesieniu do His, oo odpowiada 82* wydajnosci w pojedynczych stadiach/ S-Sar-Arg/NO /-Val-Tyr/Bzl/-Ile-His/»np/ -Pro-HMV-OBzl. Temperatura topnienia! 193-202°C. Rf/3/ = 0,30, r/4/ - 0,86* Etap 4» Usuwanie grup zabezpieczajacych.Do roztworu 2,0 g /1,25 milimola/ zabezpieczonego oktapeptydu, wytworzonego w sposób jak wyzej opisano w etapie 3, w 5 ml dwumetyloformamidu dodaje sie 2,8 ml 2-merkaptoetanolu.Otrzymana mieszanine miesza sie w oiagu 1 godziny, po czym wytraca sie suchym eterem cialo stale, które odsacza sie i prremywn eterem, rozpuszcza w metanolu i ponownie wytraca eterom, w wyniku czego otrzymuje sie 1,44 g /80%/ czesciowo odblokowanego oktapeptydu, nie zawieraja¬ cego grupy dwunitrofenylowej, o Rf' - 0,41• Otrzymany zwiazek rozpuszcza sie w 30 ml mieszaniny metanolu, kwasu octowego i wody 5:2x1, po czym dodaje sie 0,7 g 10$ katalizatora palladowego na weglu* Nastepnie przez mieszanine prze¬ puszcza sie wodór w ciagu 20 minut przy energicznym mieszaniu. Po zakonczeniu reakcji kataliza¬ tor odsacza sie, przemywa 20 ml wyzej opisanej mieszaniny rozpuszczalników, po czym przemywki i przesacz laczy sie i odparowuje do sucha* Pozostalosc rozciera sie z mieszanina etanolu i eteru 1t1 i saczy, w wyniku ozego otrzymuje sie 0,65 g /&!%/ sarkozyna , kwas L-2-hydroksy-3-ine- o tylowalerianowy /-angiotensyny II.Etap 5» Surowy produkt wytworzony w sposób jak wyzej opisano w etapie 4 poddaje sie oczyszczaniu zgodnie z wyzej opisana ogólna metoda oczyszczania. Produkt czysty wykazuje naste¬ pujace stale fizycznet Charakterystyka chromatograficzna! Rf' '» 0,26, Rf/7/ » 0,52, Rf'8'- 0,30 Analiza skladu aminokwasowego i Pro 1,06 /1/, Val 1,03 /1/f He 1f03 /1/f Tyr 0,65 /V, His 0,99 /1/t Arg 0,95 /1/, Sar 1,0/1/.Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania nowyoh analogów angiotensyny II o wzorze ogólnym X-Arg-Val~Tyr-Ile-His- Pro-Y-OA, w którym X oznacza grupe sarkozylowa, Y oznaoza rodnik kwasu mlekowego lub L-2-hydro- ksy-3-metylowalerianowego, a A oznaoza atom wodoru lub grupe C-j ^-alkilowa, albo ich soli addy¬ cyjnych z kwasami, znamienny tym, ze z peptydu o wzorze ogólnym B-X-Arg/C/-Val-Tyr /D/-Ile-His/E/-Pro-Y-OP, w którym B oznaoza grupe dajasa sie usunac przez acydolize lub uwodor¬ nienie katalityczne, korzystnie grupe benzyliksykarbonylowa lub IH-rzed-butoksykarbonylewa^ C oznacza grupe przeznaozona do tymczasowego zabezpieczenia grupy guanidynowej,w ugrupowaniu Arg, korzystnie grupe nitrowa lub tosylowa, D oznaoza grupe przeznaczona do tymczasowego zabez¬ pieczenia aromatycznej grupy hydroksylowej w ugrupowaniu Tyr, korzystnie grupe benzylowa lub podstawiona grupe benzylowa, E oznacza grupe przeznaczona do tymczasowego zabezpieczania grupy imidazolowej w ugrupowaniu His, korzystnie grupe dwunitrofenylowa, F oznaoza grupe przeznaozona do zabezpieczania koncowej grupy karboksylowej, oporna na dzialanie slabyoh kwasów, ale dajaca sie usunac przez hydrogenollze katalityczna lub przez dzialanie silniejszych kwasów, albo ozna¬ oza grupe C-jcalkilowa, usuwa sie grupy zabezpieczajaoe oraz ewentualnie przeksztalca sie wy¬ tworzony zwiazek o wzorze ogólnym X~Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y-OA w jego sól addyoyjna z kwasem.Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklad 100 egz.Cena 130 zl PL PL