RU2001918C1 - Пептиды или их фармацевтически приемлемые соли, обладающие антагонистической активностью в отношение бомбезина - Google Patents

Abstract

Использование, медицина, в качестве антагониста бомбезина Сущность изобретени  пептиды общей формулы A-b-c-D-Gtu-Trp-Ala- Va - X - Y - Т - W. где А-водврод, ВОС и ацетильна  группа. Lys - Gly, Lys (Boc) - Gly или проста  св зь; mMel или Leu - Gly, причем один из В или С представл ет р - Met или mMet или проста  св зь, X « Gly или проста  св зь, у dPhe, His, ), T«heu или пропан св зь. . MetNH2 или NHJCH CH или их фармацевтически приемлемые сопи. 3 табл.

Description

Изобретение относитс  к пептидам или их фармацевтически приемлемым сол м - новым биологически активным соединени м , обладающим биологической активностью в отношении бомбеэина, которые могут найти применение в биологии и медицине .

Известны пептиды - антагонисты бом- безина, однако эти пептиды обладают слабой аффинностью по отношению к бомбезиновым рецепторам.

Цель изобретени  - поиск новых производных в р ду пептидов, малотоксичных и обладающих более высокой активностью в отношении бомбезина.

Поставленна  цель достигаетс  описываемыми пептидами общей формулы I:

A-B-C-D-Gln-Trp-Ala-Val-X-Y-T-W, где А - водород, Вое и ацетильна  группа

В m-Met, Lys-Gly, Lys (Вос) или проста  св зь.

С - p-Met. m-Met, или Leu-Gly,

причем один из В или С представл ет собой p-Met или m-Met

D - Thr или проста  св зь

X Gly или проста  св зь, Y DPhe, His. His (Dnp)

Т - Leu или проста  со зь

W - ОН, MetNH2, МН(СН2)4СНз. или их фармацевтически приемлемые соли. обладающие антагонистической активностью в отношении бомбезина.

В описании использованы сокращени :

Трехбуквенные символы аминокислот обозначают L - конфигурацию хиральных аминокислот. D - аминокислоты обозначены маленькими буквами, например, ala - D-Ala. Другие использованные символы и сокращени : АА - аминокислота. AcOEt - этилацетат; АсОН - уксусна  кислота, Bzl - бензил; BBS - бомбезин; Вое - т-бутилокси- карбонил; ВиОН - бутиловый спирт. CCD - распределение против направлени . DCC - N.N-дициклогексилкарбодиимид; разл. разложение; D MAP - 4-метиламинопири- дин; ДМФ - диметилформамид; Dnp 2,4- динитрофенил; ЕСС - эгилхлоркарбонат; Ei20 - дизтиловый эфир; Glp - L-пироглутз- минова  кислота; h-GRP(win p-GRP)- человеческий (или свиной) пептид, выдел ющийс  в желудочно-кишечном тракте; НС /АсОН - сухой HCI е безводной уксусной кислоте; HOBt - 1-гидроксибен- зотриазол; i.d.v. - внутрицереброжелудоч- ковый; МеОН - метиловый спирт; т.пл. - температура плавлени ; mMet м-бис (2- хлорэтил/амино-Ьфенилаланин; н.о - не определ ли); NMM - N-метилморфолин; pMeL- п-бис(2-хлорэтил)амино-Ьфенипалэнин; ЖХВД - жидкостна  хроматографи  высокого давлени ; OSu - N-гидроксисукци- нимидил; ТФК - трифторуксусна  кислота; ТГФ - тетрагидрофуран; ТСХ - тонкослойна  хроматографи ; ToS - п-толуолсульфо- нил; TSOH - п-толуолсульфокислота; Z - бензилоксикарбонил. Хими . Синтез пептидов по изобретению мож0 но проводить классическими способами в растворе. Синтез включает в основном последовательную конденсацию замещенных аминокислот или пептидов. Конденсацию провод т до получени  результирующего

5 пептида, имеющего нужную последовательность аминокислотных остатков.

Аминокислоты и пептиды, которые можно конденсировать способами, известными в пептидной химии, имеют аминогруппы и

0 карбоксильные группы, не участвующие в образовании пептидной св зи, блокирован- име подход щими защитными группами. способными удал тьс  кислотной или щелочной обработкой либо гидрогенолизом.

5 Дл  защиты аминогруппы можно использовать , например, следующие защитные группы; бензилоксикарбонил, т-бутоксикэрбонил. тритил, формил, трифто- рацетил, с-нитрофенилсульфенил. 4-меток0 сибензилоксикарбонил, 9-фторфе- нилметоксикзрбонил, 3,5-диметокси-«- 7 - диметилбензилоксикарбонил или метил- сульфонилэтоксикарбонил.

Дл  защиты карбоксильной группы

5 можно использовать, например, следующие защитные группы: метил, этил, т-бутил, бензил , п-нитробензил или фторфенилметил. амид, гидразид, т-бутоксикарбонилгидра- зид или бензилоксикарбонилгидразид.

0 Гидрокси-группы гидрокси-аминокис- лот и иминогруппы гистидина можно защитить подход щими защитными группами (в ходе всего синтеза или только на некоторых стади х) или их можно оставить незащищен5 ными. Дл  защиты гидрокси-группы можно использовать, например, следующие защитные группы: т-бутил. бензил, ацетил. Дл  защиты имидазольной иминогруппы можно использовать, например, следующие груп0 пы: 2.4-динитрофенил, тозил, бензил. Реакции сн ти  защиты провод т способами, известными в химии пептидов.

Конденсацию аминогруппы одной молекулы с карбоксильной группой другой моле5 кулы можно проводить с использованием активированных ацильных производных, таких , как смешанный ангидрид, азид, или ак- тивированный эфир, либо пр мой конденсацией карбоксильной группы с аминогруппой е присутствии конденсирующего

агента, такого, как дициклогексилкарбодии- мид, используемый индивидуально или вместе с агентом, предотвращающим рацемизацию, таким, как М-гидроксисукци- нимид или 1-гидроксибензотриазол, либо вместе с активирующим агентом, таким, как 4-диметиламинопиридин. Конденсацию можно проводить в растворителе, таком, как диметилформамид, диметилацетамид, пиридин, ацетонитрил, тетрагидрофуран или М-метил-2-пирролидин.

Реакционна  температура может лежать в интервале от - 30°С до комнатной температуры. Врем  проведени  реакции составл ет, как правило, от 1 до 120 ч.

Схему синтеза, защитные группы и конденсирующие агенты выбирают таким образом , чтобы избежать риска рацемизации.

Значеги  Rf определ ют на покрытых пластинках с силикагелем 60 F254 (Merck), толщина сло  0,25 мм, длина 20 см, с использованием следующих про вл ющих систем:

Система А: этилацетат/бензол/уксус- на  кислота/вода 500/500/100/50 по обь- ему (верхн   фаза).

Система В; этилацетат/бензол/уксус- на  кислота/вода - 500/500/200/75 по объему (верхн   фаза).

Система С: н-бутанол/уксусна  кисло- та/вода 600/150/150 по объему

Система D хлороформ/мета- нол/МН-ЮН 30% 488/338/150 по объему.

Система Е: хлороформ/метанол - 90/10 по объему.

Система G: толуол/этилацетат/уксус- на  кислота/вода 100/100/20/10 по объему ,

ТСХ-Анализ проводили при температуре 18-25°С, изменени  значени  Rf состав- л ли±5%.

Жидкостную хроматографию высокого давлени  (ЖХВД) проводили с использованием хроматографа Hewlett-Packard 1084B с УФ-детектором, работающим на 210 нм. Пептиды раздел ли на колонке Llchrosorb RP 18 5 мкм размером 4 х 250 мм. Использовали следующие растворители:

A)0,02 М КН2РСМ, доведенный до рН 3,53% НзРСм/СНзСЫ 9/1 по объему.

B)0,02 М КН2РСМ. доведенный до рН 3.53% НзРСм/CHaCN - 3/7 по объему.

Элюирование проводили по программе с линейным градиентом от 60 до 90% В в течение 20 мин (система А) или от 30 до 70% В в течение 15 мин (система В) и затем в течение 15 мин при скорости потока 1 мл/мин.

Пептиды характеризуют по времени удерживани  (RT).

Аминокислотный анализ провод т с использованием кислотных гидролизатов (либо при 110°С в течение 22 ч в 6 н HCI + 0.1% фенола, либо при 100°С в течение 16 ч в 3 н. меркаптоэтансульфокицлоте. во всех случа х в атмосфере азота).

Определ ют остатки лишь природных аминокислот из-за разложени  в нормальных услови х гидролиза, триптофил опреде- л ют лишь в гидролизатах с сульфокислотой.

Пример 1. Boc-pMet-Glu-Trp-Ala- Val-Gly-OH (III)

Стади  1. BOC-pMetOH (I)

0,684 г (1,85 ммолъ) HpMet OSt.HCI и 0.485 г (2,2 ммоль)(ВОС)20 раствор ют в 40 мл воды и 8 мл т-бутэнола. Раствор довод т до рН 10 1 н. NaOH, перемешивают 15 мин, затем прибавл ют 40 мл воды и 110 мл МеОН и рН довод т до 13,5 с помощью 1 н. NaOH. Реакционную смесь перемешивают 1 ч при комнатной температуре, затем довод т до рН 8.5 с помощью 1 н. HCI и концентрируют под вакуумом. Водный раствор промывают н-гексаном (4 х 30 мл), затем охлаждают до - 5°С. подкисл ют до рН 2 с помощью 1 н. HCI при перемешивании и экстрагируют охлажденным этилацетатом (4 х 30 мл).

Органические слои объедин ют, промывают до нейтральной реакции насыщенным раствором хлорида натри , сушат над безводным сульфатом натри . Фильтруют и вы- паривают под вакуумом. Остаток раствор ют е смеси хлористый метилен/уксусна  кислота 99/1 и очищают хроматографией на силикагеле, элюиру  той же смесью растворителей. В виде масла получают 0,7 г (выход 77,8%) продукта I, RFA - 0.70.

Стади  2. BocpMet-Glu-Trp-Ala-Val- Gly-OBzl(ll)

В 10 мл безводного тетрагидрофурана раствор ют0.6 г ВосрМеЮН(1)(1,48ммоль). Раствор охлаждают до - 20°С и последовательно прибавл ют 0,16 мл (1,48 ммоль) NMM и 0,15 мл (1,48 ммоль) ЕСС. После 2 мин перемешивани  при этой температуре прибавл ют холодный раствор 1,02 г (1,48 ммоль) H-Glu-Trp-Ala-Val-Gly.OBzl.HCI, 0,16 мл (1.48 ммоль) (МММ в 10 мл безводного диметилформамида . Реакционную смесь перемешивают 2 ч при температуре от - 10°С до - 15°С, фильтруют выпаривают под вакуумом.

Остаток раствор ют в 20 мл диметилформамида и по капл м выливают в 40 мл 10%-ного раствора лимонной кислоты при 5°С. Смесь перемешивают 1 ч при температуре ниже 10°С, фильтруют и промывают

водой до нейтральной реакции. Получают 1.4 г (выход 91.5% продукта II; Rfe - 0.48).

Стади  3. BocpMet-Glu-Trp-Ala-Val- GlyOH (III)

0,44 г 10%-ного паллади  на угле и 24 мл теплого раствора, полученного из 1,2 мл НСООН. 3,3 мл NMM и 100 мл МеОН прибавл ют к раствору 1,2 г (1,16 ммоль) Вос- pMet-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-OBzl (II) в 24 мл безводного ДМФ. Реакционную смесь пе- ремешивают 15 мин при 40°С, затем охлаждают до комнатной температуры. фильтруют и выпаривают под вакуумом. Остаток раствор ют в ДМФ и осаждают этилэ- цетатом. получа  1,1 г сырого продукта. Продукт очищают противоточным распределением в следующей системе растворителей: вода ДМФ (н-бутанол)этилацетата 40/3/20/80. Фракции, содержащие чистый продукт, соедин ют и выпаривают под закуумом. Остаток растирают в ДМФ, МеОН и этилацетате, получа  0,680 г (выход 63%) продукта III: RfD - 0,54; ВТд - 8,4; АА - отношени ; Glu 0.93 (I). Gly 0.99 (I); Ala 0,99 (I). Val (Trp и pMet не определ ют).

Пример 2. Boc-pMet-Glu-Trp-AlaVal-Gly-Hls (Dnp)-Leu-MetNH2 ()V)К раствору 0,330 г (0,35 ммоль) BocpMet-Glu-Trp-Afa-Val-GlyOH (It) в 3 мл безводного ДМФ, последовательно прибав- л ют 0,053 г (0,39 ммоль) безаодного HOBt, 0.081 г(0,39 ммоль) DCC, 0.235 г (0,39 ммоль) H-His (Dnp}-Leu-Met-NH2 HCI и 0.043 мл (0.39 ммоль) NMM. Реакционную смесь перемешивают 1 ч при 0°С и 30 ч при комнат ной температуре, затем фильтруют и выпаривают под вакуумом. Остаток раствор ют в 3 мл безводного ДМФ и по капл м при температуре ниже 10°С прибавл ют к 30 мл водного раствора б г хлорида натри  и 3 г лимонной кислоты. После перемешивани  а течение 1 ч при температуре ниже 10°С суспензию фильтруют и продукт промывают до нейтральной реакции. Сырой продукт дважды выпаривают из 10 мл без- водного ДМФ, раствор ют в 3 мл безводного ДМФ и по капл м прибавл ют к водному раствору 1,5 г NaHCOa и б г NaCI при температуре ниже 10°С. Смесь перемешивают 1 ч, фильтруют, промывают водой до нейт- ральности и получают 0.5 г (выход 95.6%) продукта IV; Rfo - 0.84; RTA - 21,2; АА - отношени : Trp 0,97 (I), Glu 1,00 (I), Gly I, Ala 1,00 (I), Val 1,00 (I), Met 1.10(1), Leu 1,04 (I) (pMet, His (Dop) не определ ли).

Пример 3. HpMet-Glu-Trp--Ala-Val- Gly-Hls (Dnp)-Leu-Met14H2 HCI (V)

0,100 г (0,067 ммоль) BoC-pMet-Glu- Trp-Ala-Val-Gly-His (Dnp)-Leu-MetNH2 (IV) ввод т в реакцию с 1 мл 1-.33 н. HCI/уксусна  кислота, содержащим 0,2 мл 2-меркап- тоэтанола и 0,1 мл анизола. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при комнатной температуре и выпаривают под вакуумом, Остаток растирают с эфиром и получают 0.080 г (выход 83.5%) продукта Y: Rfc - 0.57; RTA 9,3; АА - отношени : Glu 0,99 (I). Gly 0,98 (О, Ala 1,04 (I). Val 1.10 (I), Met 0,82 (I), Leu 0.81 (I), (Trp, pMet и His (Dnp) не определ ли).

Пример 4. Boc-pMet-Glu-Ala-Val- Gly-Hls-Leu-MetNH2 (VI)

0,4 r (0,27 ммоль) Boc-pMet-Glu-Trp- Ala-Val-Gly-Hls (Dnp)-Leu-Met NH2 (IV) раствор ют в 400 мл безводного ДМФ и затем прибавл ют 5,36 мл 0,1 М КН2Р04 (с рН. доведенным до 8,1 с помощью 1Н КОН) и 20 мл 2-меркаптоэтанола. Реакционную смесь перемешивают 2 ч при комнатной температуре и концентрируют под вакуумом . Остаток очищают противоточной экстракцией в следующей системе растворителей: вода/н-бутанол/уксусна  кислота 40/35/1. Фракции, содержащие чистый продукт, собирают и выпаривают под вакуумом, получа  0.35 г (теоретический выход) продукта VI: Rfc 0.63; Rfo - 0,82; РТд 14,2, АА - отношени : Glu 1, Gly 1,00 (I): Ala 1.04 (I), VaM .04 (I): Met 0,94 (I), Leu 1,02 (I). His 0.95(1), Trp 0,88 (I)(pMet не определ ли ).

Пример 5. H-pMet-Glu-Trp-Ala-Val- Gly-Hls-Leu-Met-NH2 2HCI (VII)

С 0.1 г (0,075 ммоль) Вос-pMet-Glu- Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NHa (VI) снимают защиту аналогично примеру 3 и получают 0.089 г (выход 91%) продукта VII: Rfc 0,45, RTB 11,3; АА - отношени : Glu 1,06 (I), Gly 1,00 (I), Ala 0.99 (I), Val, Met 0,94 (I), Leu 0.96 (I). His 0,94 (I) (Trp и pMet не определ ли).

Пример 6. Boc-pMet.Glu-Trp-Ala- Val-Gly-Phe-Leu-MetNHz (VIII)

0,15 г (0,16 ммоль) Boc-pMet-Glu-Trp- Ala-Val-Gly-OH (III) раствор ют в 12 мл безводного ДМФ и прибавл ют 0,023 г (0,169 ммоль) безводного HOBt. К раствору, охлажденному до 0°С. последовательно прибавл ют 0.041 г (0.177 ммоль) DCC. 0,085 г (0,192 ммоль) H-Phe Leu-Met-NH2 HCI и 0,022 мл NMM (0.192 ммоль).

После перемешивани  15 мин при 0°С прибавл ют 0,02 г (0,016 ммоль) ОМАР. Реакционную смесь перемешивают 1 ч приО°С и ночь при комнатной температуре, затем фильтруют и выпаривают под вакуумом. Остаток раствор ют в 3 мл безводного ДМФ и по капл м прибавл ют в 30 мл водного раствора 3 г лимонной кислоты и 6 г хлорида натри  при температуре ниже 10°С. После перемешивани  в течение 1 ч осадок отфильтоовывают и промывают водой до нейтральной реакции. Затем продукт раствор ют в 10 мл безводного ДМФ и выпаривают под вакуумом Остаток растирают с эфиром и получают 0,190 г (88,8%) сырого продукта VIII. Образец очищают обрэщенно-фазовой полупрепарэтивной ЖХВД с линейной градиентной системой 0.05% УФК (А) и 0,05% ТФК (СНзГ N 3/7 (В) от 70 до 90% В: Rfc - -0,85, 18,4; АА-отчошени , Glu 0,90(1), Gly 1,14 (I), Ala 1.02 (I), Val 0.99 (I); Met 0. (I), Leu 1,08 (I). PHe 0,96 (I), Trp 0 96 (I) (pMet не определ ли).

Пример 7, Boc-mMet Glu-Trp-Ala- Val-GlyOH (IX)

Целевое соединение получают аналогично примеру 1, исход  из Boc-mMet-OH, полученного из H-mMet-OH1 Kfo 0.56. RTA. 0,5о, АА-отношенич Clu 0 93 () Gly 0,95 (I), Ala 0 95 (I), Val (Ttp и mMet не определи ти).

Пример 8 BocmMet Leu Gly Thr Giu-Trp Ala-Val Gly Leu MetNl ь (XIV) Стади  1 Вое Leu Gly OBzl (X) 2,33мл (20,7 ммоль) NMM и 7 91 мл (20 7 ммоль) изобутилхлоркарбоната последовательно прибавл ют к раствору охл.чжденно- му до -25°С,4.8г(207ммоль) Вое leu ОН в 70 мл безводного ТГФ Погле перемешивани  реакционной смеси 3 мин при температуре около 12°С прибавл ют олодныи раствор 6,98 г (20,7 ммопь) Н Gly OB TsOH и 2.33 мл (20,7 ммоль) ГШМ в 50 мл безводного ДМФ. Реакционную смесь перемешивают 45 мин при температуре около - 12°С и 90 мин при 0°С фильтруют и выпаривают под вакуумом Остаток раствор ют в этилацетате и несколько раз тщательно последовательно промывают 10%-ным водным раствором лимонной кислоты , раствором соли, 5%-ным раствором №НСОз и снова раствором соли. Органический слой сушат над безводным сульфатом натри , растворитель удал ют под вакуумом и получают 7,8 г (выход 100%) соединени  X в виде масла; Rfr - 0.83. 13 6. Стади  2. HLeu-Gly-OBzl HCI (XI) С 7.4 г (19,6 ммоль) Boc-Leu-Gly-OBzl (X) снимают защиту так как описано в примере 3. Остаток в виде масла несколько раз растирают с петролейным эфиром и получают 3,94 г (выход 63,8%) соединени  XI- Rfc 0,59

Стади  3. Boc-mMet-Leu -Gly-OBz (XII) 5,7 г (12,51 ммоль) Вое и 3.94 г(12.51 ммоль) H-Leu-Gly-OBzl,HCI (XI) конденсируют так, как описано в примере 1 (стади  2). Остаток раствор ют в этилэцета- те и несколько раз последовательно промыва юг 10%-ным раствором лимонной

кислоты, раствором соли, 5%-ным раствором ЫаНСОз и снова раствором соли. Органический слой сушат над безводным сульфатом натри  и растворитель удал ют под вакуумом. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле. элюиру  смесью этилацетат/серный эфир 1/7. В виде пены получают 6.25 г (выход 75%) продукта XII; RTF-0,80.

0Стади  4. Boc-mMet-Leu- Gly-OH (XIII).

6,0 г (9,0 ммоль) Boc-mMet-Leu-GlyOBzl (XII) обрабатывают так, как описано в

стадии 3 примера 1. Остаток растирают в

смеси этилацетат/серный эфир/петролей5 ный эфир и получают 4,3 г (выход 83%) соединени  XIII, Rfi - 0,43.

Стади  5 Вое mMet-Leu-Gly-Thr-Glu- Trp-Ata-Val-Gly-l.eu-Met NH2 (XIV).

О 092 г (0 16 ммоль) Boc-mMet-Leu-Gly0 ОН (XIII) и 0,105 г (0 16 ммоль) HThr-Glu- Tip Ala Val Gly Leu MetNH2HCI конденсируют аналогично примеру 2. После выпз- ривлни  растворител  остаток раствор ют в 10 мл ДМФ. по капл м прибавл ют к 100 мл

5 10%-ного раствора лимонной кислоты, перемешивают 15 мин, фильтруют и промывают до нейтральной реакции. Сырой продукт раствор ют в 30 мл ДМФ и выпаривают под вакуумом Остаток растирают со смесью

0 ДМФ/МеОН (этилацетат/серный эфир) и получают 0.17 г (выход 72,7%) сырого соединени  XIV Образец очищают полупрепаративной ЖХВД. как описано в примере 6, Rfc - 0.84: RTA - 16,5; АА-отношени : Thr

5 0 94 (1), Glu 1,06 (I), Gly 2,12 (2), Ala 0,94 (1). Val 0.94 (1), Met 1,00 (1). Leu 2, Trp 0.87 (1) (mMet и.о.).

Аналогичным образом синтезируют также следующие пептиды.

0 XV - H-pMet-Glu-Trp-Ala-Val-Gly- Phe-Leu-Met-NH2HCI Rfc 0,72; RTA 9,6.

XVI- Boc-mMet-Glu-Trp-Ala-Val-Gly- Hls(Dnp)-Leu-MetNH2

5RfoO.86; RTA 21,5; АА-отношени : Glu 1;

Gly 0,99 (1); Ala 1,03 (1). Val 0,99 (1), Met 1,03 (1). Leu 1.04 (1), Trp 1,05 (1) (mMet и His (Dnp)

H 0 )

XVIIHmMet-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His 0 (DnpH eu-MetNH2 HCI

Rfc 0,74; RTA 9,4; АА-отношени : Glu 0,99 (1), Gly 1,04 (1), Ala 1,02 (1). Val (1), Met 0.96 (1), Leu 0,96 (1) (His (Dnp) Trp и mMet но).

5XVIII Boc-mMet-Glu-Trp-Ala-Val-GlyHis-Leu-MetNH2CF3COOH

Rfc 0,55; Rfo 0.80; RTA 14,4; АА-отношени . Glu (1), Gly 0,99 (1), Ala 0.99 (1), Val 1,06 (1), Met 1,05 (1), Leu 0,97 (1). His 0,90 (1), Trp 1 03(1) (mMet и.о.).

XIXHmMet-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-Hls- Leu-Met14H22HCI

Rfc 0,44; RTe 11,3; АА-отношени ; Glu 1.00 (1), Gly 1,00 (1), Ala 1,05 (1), Val (1), Met 0,91 (1). Leu 0.89 (1), His 0,99 (1). (mMet и Trp и.о.)

XXBoc-mMet-Glu-Trp-Ala-Val-Gly- Leu-MetNH2

Rfc 0,74; RTA 15,4, АА-ртношени : Glu 1,03 (1). Gly 1, Ala 1,04 (1), Val 0,96 (1), Met 0.93 (1), Leu 1,02 (1), Trp 0.94 (1) (mMet и.о.).

XXIHmMet-Glu-Trp-Ala-Val-Giv-Leu- MetNHzHCI

Rfc 0,65; RTA 5,7

XXIIHmMet-Leu-Gly-Thr-Glu-Trp-Ala- Val-Gly-LeuNH2 HCI

Rfc 0.52; RTA 6,6

XXIIIH-pMet-Leu-Thr-Glu-Trp-Ala- Val-Gly-Leu-Met-NH2 HCt

XXIVH-pMet-Trp-Ala-Val-ala-H/S- Leu-Met-NH22HCI

XXVH-pMet-Asn-Glu-Trp-Ala-Val- Gly-Leu-Nle- NH2 HCI

XXVIH-pMet-Asn-Glu-Trp-Ala-Val Gly-Leu-NH(CH2)4CH3 HCI

XXVIIH-pMet-Arg-Leu-Gly-Asn -Glu- Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Met- NH2 HCI

XXVIIIH-pMetH3lu-Arg-Leu-G y- Asn- Glu-Trp-AIa-Val-Gly-Leu-Met- NH2 2HCI

XXIXH-pMet-Clu-Arg-Leu-Gly Asn Trp-Ala-Val-ala-Leu-Nle- NH2 HC

XXXH-Glp-Arg-Gly-pMet-Asn-Gin Ala-Val-Gfy-Leu-Nle-NH2 HCI

XXXIH-Leu-Gly-pMet-Gln-Trp- /Ma Val-Gly-phe-Leu-Nfe-NHz HCI

XXXIIH-Leu-Gly-pMet-Glu-Trp-Ala- Val-Gly-ala-Leu-IMIe-NH2 HCI

XXXIfl H-pMet-Asn-Glu-Trp Ala-Val Gly-Leu-Leu-NH-NH2 HCI

XXXIVBoc-pMet-Clu-Trp-Ala-Val Gly Leu-Met-NH2

Rfc 0.86: RTA 15,3; АА-отиошени  Glu 1,02 (1), Gly 1,07 (1), Ala 1.10 (1), Val (1), Met 0,92 (1). Leu 0,98 (1) (Trp и pMet и.о.).

XXXVH-pMet-Glu- Trp-Ala-Val Gly- Leu-Met-NH2 HCI

Rfc 0,57; RTe 16,8; АА-отношени - Glu 1,08 (1), Gly 1,01 (1), Ala 0,98 (1). Val (1), Met 0,90 (1). Leu 0,94 (1) (Trp и pMet и.о.)

XXXVIBoc-Lys (Boc)-Gly-pMet Gin- Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Met-NH2

Rfc 0.73; RTA 18,7; АА-отношени  Glu 1.07 (1), Gly 2,02 (2), Ala 1,18 (1), Va (1), Met 0,88 (1), Leu 0.95 (1). Lys 1,08 (1) (Trp и pMet и.о.).

XXXVIIH-Lys-Gly-pMet-Glu-Trp- Ala- Val-Gly-Leu-Met-NH2 2СРзСООН

RfE 0,71; RTe 15,4, АА-отношени : Glu 0,99 (1). Gly 2,02 (2), Ala 1.00 (1). Val (1)- Met

0.88(1); Leu 0.91 (1), Lys 1,15(1), Trp 0,91 (1) (pMet H.O.).

Соединение XXXVIII: Ac-Lys (Boc}-Gly- n-Met-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Met-NH2

Rfc 0,77: RTA 11.9;

отношени  аминокислот. Glu 1,05 (1); Gly 1,97 (2), Ala 0,98 (1), Val (1), Met 0,98 (1), Leu 0,92 (1), Lys 0,92 (1), Trp 0,88 (1), n-Met не определ лось.

0 Соедичение XXXIX: Ac-Lys-Gly-n-Met- Glu-Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Met-NH2 COOH, RfD 0,78; RTB 16,2; отношени  АК: Glu (1). Gly 2.11 (2), Ala 0,99 (1), Val 0,89 (1), Met 0,91 (1), Leu 0,92 (1), Lys 1,1 (1). Trp и n-Met не onpe5 деп лись.

Соединение XL: Вос-м-Met-Leu-Gly- Tht-G u Ггр-Ala-Val-His (Dnp)-Leu- MH(aj)4CH3, Rfc 0,88; ЯТд 24,2; отношени  Ai- - Thr 1.04 (1), Glu 0.96 (1). Gly (2), Ala 1,03

0 n; /al 0,95 (1). Leu 1,92 (2), His (Dnp). Trp и м Met не определ лись.

Соединение XLI: Н-м-Met-Leu-Gly- r Glu-Trp-Ala-Val-Hls (Dnp)-Leu- NH(CH2)4CH3HCI, Rfc 0,5; RTA 18.7;

5 отношени  АК: Thr 0,92 (1), Glu 0,97 (1), Gly 2.04 (2). Ala 1,04 (П, Val (1), Leu 1,88 (2). His (Dnp), Trp и м-Met не определ лись.

Соединение XLII: Ac-Lys (Boc)-Gly-n- Met-Glu- Trp-Ala-Val-Gly-Leu-Met- NH2,

0 Rfr 0.77, RTA 11,9, отношени  аминокислот: Glu 1,05 (1). Gly 1,97 (2), Ala 0,98 (1). Val (1), Met 0,98 (1), I eu 0.92 (1), Lys 0.92 (1): Trp 0,88 (1) n-Met HЈ определ лось.

Соединение XLIII: Ac-Lys Gly-n-Met5 Glu--Trp- Ala- Val-Gly- Leu-Met-NH2x хСРзСООН Rfo 0,78. RTe 16,2, отношени  АК: Glu (1), Gly 2,11 (2). Ala 0,99 (1). Val 0,89 (1). Met 0,91 (1). Leu 0.92(1), Lys 1.1 (1), Trp и n -Met не определ лись.

0Соединение XLIV: Boc M-Met-Leu GlyThr Glu-Trp-Ala-Val-Hls (Dnp)-Leu- NH(CH2)4CHi, Rfo 0,88. RTA 24,2, отношени  AK Thr 1.04 (1), Glu 0,96 (1), Gly (2), Ala 1,03 (1). Val 0,95 (1), Leu 1,92 (2). His (Dnp), Trp и

5 м Met не определ лись.

Соединение XLV: Н-м-Met- Leu-Gly- Thr Glu-Trp-Afa-Val-Hls (Dnp)-Leu- NH(CH2)4C43HCI. Rfc 0,5. RTA 18,7, отношени  АК, Thr 0,92 (1), Glu 0,97 (1), Gly

0 2.04 (2) Ala 1,04 (1), Val (1), Leu 1,88(2), His (Dnp) Trp и м-Met не определ лись.

Соединение XLVI: Boc-n-Met-Leu-Gly- Thr Gin-Trp-Ala-Val-Gly-Hls (Dnp)-Leu- NH(CH2)4CHj Rfo 0,83; RTa 26,41; отношени 

5 AK Thr 1,02 (1), Glu (1), Gly 2,04 (2), Ala 0,99 (1), Val 0,95 (1), Leu 1.91 (2), His (Dnp), Trp и n-Met не определ лись. Биологи .

Св зывающую аффинную активность соединений по изобретению по отношеник

к бомбесиновым рецепторам определ ют с использованием фибробластов мышей SWISS 3T3 (табл.1).

Вли ние на митогенез определ ют на спокойных и сливающихс  клетках SWISS ЗТЗ в свободной от сыворотки среде. В первой серии экспериментов использовали только аналоги или в сочетании с бомбеси- ном. Во второй серии экспериментов клетки предварительно обрабатывают алкилиро- ванными пептидами, промывают, выдерживают 24 ч при 37°С и затем обрабатывают бомбесином. В обоих случа х оценивают синтез ДНК по введению (ЗН)-тимидина (табл.2).

Митогенное действие бомбесина и его аналогов оценивают также по активации протеинтирозиновой киназы. фосфорилиру- ющей 115 кД-белок (р115) св занный с бомбесиновым рецепторным комплексом

Кроме того, действие этих пептидов в концентрации 0,1-50 мкМ вызывает существенное замедление роста клеток линии SCLC (таких, как NCI-H345. NCI-N592 и NCI- Н128), а также клеточных линий карциномы простаты (таких, как DU 145 и РСЗ).

Парэнтеральное введение этих пептидов в дозах от 10 нг/кг до 10 мг/кг голым мышам вызывает заметное снижение роста указанной трансплантированной человеческой SCLC и клеточных линий карциномы простаты.

Периферийное и центральное действие оценивали дл  крыс, соответственно In vitro, как сокращение мочевого пузыр  и In vivo при I.с.v.-введении как брачное поведение в обоих случа х как в присутствии, так при отсутствии бомбесина.

Результаты испытаний приведены в табл. 1-3.

Пептиды сравнени :

BBS

Спантид

(pro2) Спандит

п л..3 , /oil

Leu1J + (CH2-NH)Leu

10 Пептиды сравнени : BBS Спантид

3 10000

Из приведенных таблиц вытекает, что

при введении алкильного радикала в структуру агониста (соединени  VI, VII. XVIII, XIX) результирующие алкилированные аналоги повышают введение тимидина при их индивидуальном исполнении,  вл ютс  слабыми

антагонистами при использовании вместе с

BBS и  вл ютс  сильными антагонистами

при введении за 24 ч до прибавлени  BBS.

Если алкильный фрагмент ввод т в

BBS-аналог, который сам по себе неактивен

(соединени  III и IV) или  вл етс  слабым антагонистом (соединени  IV. V, VIH. XIV, XVII. XX), то результирующее алкилирован- ное соединение не усиливает введение тимидина и обычно ведет себ  как сильный

антагонист как при одновременном введении с BBS. так и при введении через 24 ч после обработки BBS.

(56) Патент США fxfc 4207311, кл С 07 С 103/52,опубл. 1980.

Патент СШ AN 4331661, кл С 07 С 103/52. опубл. 1982.

Таблица 1

Аффинное св зывание бомбесиновых алкилировзнных аналогов на фибробластах мышей ЗТЗ

Введение Н -тимидина в фибробласты мышей Swiss 3T3

Продолжение табл. 1

Таблица 2

Примечани :

А - аналоги ввод т в сочетании с BBS;

В - клетки предварительно обрабатывают аналогами, отмывают, выдерживают 24 ч при

37 С и затем обрабатывают BBS

Фосфорилирование р115-белка, св занного с бомбесино- вым рецептором

Продолжение iобл. 2

Таблица 3

19

Формуле изобретени 

Пептиды общей формулы А - В - С - D - Gin - Тгр - Ala - Val - X - Y - Т - W, где А - водород, Вое и ацетильна  группа: В - m-Met, Lys - Gly, Lys (Boc) - Gly или

проста  св зь

С - p-Met, или Leu - Gly, причем один из. В или С - p-Met или m-Met;

200191820

Продолжение тэбл 3

D - Thr или проста  св зь.

X - Gly или проста  св зь:

у - D - Phe. HIS. His (Dup):

Т - leu или проста  св зь;

W - ОН. MetNHa или 1МН(СНг)1СНз, или их фармацевтически приемлемые соли, обладающие антагонистической активностью в отношение бомбезина.