NO151409B

NO151409B - Analogifremgangsmaate ved fremstilling av nye terapeutisk aktive angiotensin-ii-analoger inneholdende en alfa-hydroxycarboxylsyrerest i 8-stilling

Info

Publication number: NO151409B
Application number: NO810149A
Authority: NO
Inventors: Olga Nyeki; Lajos Kisfaludy; Egon Kaerpati; Laszlo Szporny
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1980-01-18
Filing date: 1981-01-16
Publication date: 1984-12-27
Also published as: CS219939B2; PL130448B1; NO151409C; IN153279B; DE3160608D1; CA1149377A; FI73225B; NO810149L; YU9381A; DK149777C; ATE4197T1; FI810123L; EP0034260A1; JPS56142251A; ES8201129A1; IL61922A; PH17196A; SU993816A3; EP0034260B1; FI73225C

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive octapeptider av angiotensin-II med antagoniserende effekt og den generelle formel (I)

X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y-OA (1)

hvori

X betegner en acylgruppe av en N-methylaminosyre, fortrinnsvis en sarcosylgruppe, eller en acylgruppe av en alifatisk ct-aminooxy- eller a-hydroxycarboxylsyre,

Y er resten av en alifatisk a-hydroxycarboxylsyre, fortrinnsvis resten av melkesyre eller L-2-hydroxy-3-methyl-valerian-syre, og

A er hydrogen eller C1-5 alkyl,

eller syreaddisjonssalter eller farmasøytisk akseptabelt kompleks derav.

Fremstilling av syreaddisjonssaltene og komplekser av

de ovenfor angitte peptider omfattes også av oppfinnelsen.

Den første angiotensin-II-analog som viste seg å være en spesifikk konkurrerende inhibitor til angiotensin-II både under in vitro og in vivo betingelser, ble beskrevet i 1970 [G.R. Marshal et al.: Proe. Nati. Acad. Sei. USA 67, 1624

(1970) ; P.A. Khairallah et al.: J. Med. Chem. 13, 181 (1970)]. Denne erkjennelse gav støtet til et omfattende forskningsar-beide med henblikk på produksjon av angiotensin-II analoger med antagoniserende virkning som ville kunne anvendes for diagnose av visse renin-avhengige hypertensjoner, og eventuelt ved behandling av slike tilstander også. (Ser 1 , Ala 8)-angiotensin-II, en av de mange analoger med antagoniserende effekt fremstilt hitinntil, er allerede kommet på markedet under vare-merket "Saralasin" [D.T. Pals et al.: Circ. Res. 29, 673

(1971) ]. Kliniske tester utført med denne forbindelse viste at forbindelsen er anvendbar for diagnose av hypertensjoner av forskjellig opprinnelse [G. Bonner et al.: Dtsch. Med. Wschr. 104, 432 (1979)], såvel som ved behandling av slike betingelser [J.L. Marx: Science 194, 821 (1976)]. Mer nylig ble der også funnet at forbindelser med angiotensin-II antagoniserende effekt kan anvendes ved behandling av hjerteinsuffisiens forårsaket av renovaskulær hypertensjon også [H. Gavres et al.' JAMA 238,880 (1977)] . Ved å studere forholdet mellom strukturene og biologisk effekt av de hittil fremstilte angiotensin-II analoger, har man fått endel informasjon når det gjelder klarlegning av ago-nistisk og antagonistisk effekt. Hovedmålet ved senere tids forsøksarbeide er å produsere antagonistiske substanser med forlengede biologiske halveringstider, som er fri for visse uønskede bivirkninger, slik som agonistiske begynnelsesvirk-ninger. Der er nu funnet at når man erstatter fenylalanindelen i 8-s tilling i angiotensin-II molekylet med en alifatisk a-hydroxycarboxylsyrerest, og samtidig innfører en N-methylaminosyre, fortrinnsvis sarcosin eller en a-hydroxy- eller a-aminooxycarboxylsyregruppe som har vist seg å være effektiv for samme formål og som er beskrevet i norske patenter 148 031 og 148 070, i 1-stilling i molekylet, erholdes nye konkurrerende inhibitorer av angiotensin-II som nedsetter hypertensjon fremkalt av angiotensin-II under in vivo betingelser betydelig, og som er aktive selv ved subcutan administrering . Analogifremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjenne-tegnet ved at a) når en forbindelse av generell formel (I) hvori A er hydrogen fremstilles, at de beskyttende grupper i et

beskyttet octapeptidderivat av generell formel (II),

B-X-Arg(C)-Val-Tyr(D)-Ile-His(E)-Pro-Y-OF (II) hvori

B er en gruppe som er fjernbar ved acidolyse eller katalytisk hydrogenering, fortrinnsvis en benzyloxycarbonyl eller tertiær butoxycarbonylgruppe,

C er en gruppe for temporær beskyttelse av guanidgruppen på Arg-resten, fortrinnsvis en nitro eller en tosylgruppe,

D er en gruppe for temporær beskyttelse av den aromatiske hydroxygruppe på Tyr-resten, fortrinnsvis en benzyl eller en substituert benzylgruppe,

E er en gruppe for temporær beskyttelse av imidazolgruppen på His-resten, fortrinnsvis en dinitrofenylgruppe, og

F er en gruppe for beskyttelse av carboxy-endegruppen, som er resistent overfor effekten av milde syrer men er fjernbar ved katalytisk hydrogenolyse eller ved behandling med en sterkere syre,

fjernes enten trinnvis eller i et enkelt trinn, eller

b) når en forbindelse av generell formel (I)

hvori A er en C1-5 alkylgruppe fremstilles, at de beskyttende grupper i et beskyttet octapeptid av generell formel (III)

B-X-Arg(C)-Val-Tyr(D)-Ile-His(E)-Pro-Y-OA' (III) hvori B, C, D og E er som ovenfor angitt og A" er en C1, —5c alkylgruppe, fjernes enten trinnvis eller i et enkelt trinn, og om ønsket,

at en forbindelse av generell formel (I) eventuelt omdannes til dets syreaddisjonssalt eller farmasøytisk akseptabelt kompleks.

Om ønsket omdannes de resulterende forbindesler av den generelle formel (I) til sine syreaddisjonssalter eller komplekser .

Octapeptidderivatene av de generelle formler (II) og (III) anvendt som utgangsmaterialer ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved en hvilken som helst metode kjent innen peptidkjemien, f.eks. som beskrevet i det ungar-ske patentskrift nr. 168,431. Ved fremstilling av de beskyttede octapeptider skal beskyttende grupper som er stabile under acidolysebetingelsene anvendt for å fjerne den N-endebe-skyttende gruppe efter koblingsreaksjonen anvendes for å beskytte de funksjonelle sidegrupper.

Ifølge en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen bygges de beskyttede octapeptidderivater av de generelle formler (II) og (III) opp trinnvis, og grupper som lett kan fjernes ved acidolyse, f.eks. tert.-butoxycarbonylgruppe, anvendes for å beskytte temporært amino endegruppene i de individuelle amino-syrederivater. De beskyttende grupper bundet til octapeptid-utgangsderivatet splittes av fortrinnsvis i ett trinn ved katalytisk hyd-rolyse efter fjerning av dinitrofenylgruppen ved thiolyse.

a-hydroxycarboxylsyreresten innføres i 8-stilling i molekylet fortrinnsvis slik at en forestret a-hydroxycarboxylsyre av den generelle formel (IV)

hvori Y er som ovenfor definert, og Z er en alkyl- eller en aralkylgruppe, omsettes med et N-beskyttet prolin, hvor den beskyttende gruppe fortrinnsvis er en tert.-butoxycarbonylgruppe. -CO-0- bindingen som dannes ved denne reaksjon er stabil og splittes ikke i de etterfølgende trinn av syntesen.

Forbindelsene av den generelle formel (I) renses efter

i og for seg kjente metoder, fortrinnsvis ved ionebyttekroma-tografi på carboxymethylcellulose. Sluttproduktet separeres fra avløpet, fortrinnsvis ved frysetørring, under dannelse av et pulverformig materiale som kan anvendes direkte ved frem-stillingen av forskjellige farmasøytiske preparater.

De antagonistiske virkninger av de nye forbindelser av den generelle formel (I) ble undersøkt på narkotiserte hankat-ter. Efter behandling av dyrene med et ganglieblokkerende middel og gjennomskjæring av halsvagusnervene på begge sider, ble dyrene behandlet med en infusjon av Hypertensin (CIBA)

med en hastighet på 0,5 ywg/kg min. Når blodtrykket nådde et stabilt forøket nivå, ble den substans som skulle testes ad-ministrert enten intravenøst eller subcutant i fysiologisk saltvannoppløsning eller som en vandig oppløsning som også in-neholdt en bærer. Blodtrykksfallet ble målt i mm Hg, og ned-settelsesgraden ble uttrykt i prosent i forhold til verdien før behandling. Den statistiske bestemmelse ble utført på basis av blodtrykkforskjellene, ved Studenfs "t" test. Resul-tatene er oppført i tabell 1. Uttrykket "virkningens varighet" angir en periode som forløp inntil observasjonen av den siste, fremdeles signifikante (p = 5 %) blodtrykkforskjell.

Bemerkninger til tabell : d = dose, ^ug/kg

n = testantall

p = virkningens varighet, min. phys. sal. = fysiologisk saltvann-oppløsning CMC = carboxymethylcellulose

Det fremgår av dataene i tabellen at alle angiotensin-II analogene som inneholder en a-hydroxycarboxylsyrerest i 8-stilling og en sarcosylgruppe i 1-stilling utviser signifikante hypotensive virkninger. Denne virkning er tydelig selv efter subcutan administrering, og når forbindelsen admini-streres i en oppløsning som også inneholder en bærer, er virkningens varighet enkelte ganger oppgått til flere timer.

Uttrykket "farmasøytisk akseptabelt kompleks" angir forbindelser av peptidene av den generelle formel (I) dannet med visse organiske eller uorganiske substanser som gir en forlenget virkning av det aktive middel. Av organiske kom-pleksdannende midler kan eksempelvis nevnes visse gelatinty-per, carboxymethylcellulose, alginater, polyflorethinfosfater, aminosyrepolymerer og copolymerer. Som uorganiske kompleks-dannende midler kan f.eks. anvendes sinkhydroxyd og svakt oppløselige sinksalter slik som sinkfosfater.

De nye peptider fremstilt ifølge oppfinnelsen og deres farmasøytisk akseptable salter og komplekser kan anvendes innen terapien i form av konvensjonelle farmasøytiske preparater. Disse preparater inneholder de nye forbindelser ifølge oppfinnelsen i blanding med en organisk eller uorganisk bærer som er anvendbar for enteral eller parenteral administrering. De farmasøytiske preparater kan f.eks. være frysetørkede faste materialer inneholdende bærere som ikke reagerer med peptider, slik som carbohydrater, og ennvidere konsentrerte eller fortynnede suspensjoner og emulsjoner som også kan inne-holde forskjellige konserveringsmidler og stabiliseringsmid-ler.

De farmasøytiske preparater kan anvendes for å diagno-stisere og differensiere hypertensjoner av forskjellig opprinnelse, og kan anvendes i terapien til å undertrykke hyper-tens joner av renal opprinnelse, ved behandling av hypertensi-ve kriser, sekundær hjertesvikt etc.

De farmasøytiske preparater foreligger fortrinnsvis i form av injiseringsoppløsninger inneholdende 1-10 mg aktiv bestanddel. De aktive bestanddeler fremstilt ifølge oppfinnelsen kan anvendes i daglige doser på 1 - 10 mg for behandling av voksne pasienter. Denne mengde innføres fortrinnsvis én gang daglig i form av en intravenøs, subcutan eller intra-muskulær injeksjon, eller som en langsom intravenøs infusjon.

Oppfinnelsen belyses i de efterfølgende eksempler.

De forkortelser som anvendes i eksemplene tilsvarer dem som generelt anvendes i litteraturen [J. Biol. Chem. 2 47,

977 (1972)]. Ytterligere forkortelser er: Lac = L-melkesyre, HMV = L-2-hydroxy-3-methylvalerinsyre, Pfp = pentafluorfenyl.

Ved fremstilling av forbindelsene ble fordampningen

alltid utført på en Rotavapor apparatur av Buchi-typen. Tynnskiktskromatogrammene ble tatt på et "Kieselgel-6" silicagel-skikt fremstilt ifølge Stahl, og følgende oppløsningsmiddel-blandinger ble anvendt for å fremkalle kromatogrammene:

(1) N-hexan:ethylacetat = 4:1

(2) ethylacetst: (pyridin:eddiksyre:vann=20:6:11) = 95:5

(3) ethylacetat: (pyridin-.eddiksyre :vann=20: 6 :11) = 90:10 (4) ethylacetat: (pyridin:eddiksyre:vann=20:6:11) = 80:20 (5) ethylacetat: (pyridin:eddiksyre:vann=20:6:11) = 70:30

(6) n-butanol:eddiksyre:vann 4:1:5 (øvre fase)

(7) n-butanol:eddiksyre:pyridin:vann = 30:6:20:2 4

(8) n-butanol:ethylacetat:eddiksyre:vann =1:1:1:1

Tynnskiktskromatogrammene ble gjort synlige med ninhyd-rin eller med klortolidin - kaliumjodid.

De følgende generelle metoder ble anvendt for å rense sluttproduktene: 0,5 av det frie peptid ble oppløst i 4 ml av en 0,01 molar ammoniumacetatoppløsning, og oppløsningen ble helt over på en kolonne på 0,5 liter carboxymethylcellulose (CMC-52) ekvilibrert på forhånd med samme bufferoppløsning. En gradientblanding på 1,5 1 av en 0,01 molar ammoniumacetatoppløsning og 1,5 1 av en 0,4 axtiæniumacetatoppløsning ble anvendt som elueringsmiddel. Elueringsmid-let ble ført gjennom kolonnen med en hastighet på 25 ml/time, og avløpet ble oppsamlet i fraksjoner hver på 10 ml. Sammensetningen av avløpet som forlater kolonnen ble overvåket kontinuerlig med en LKB Uvicord-II apparatur, og hovedfraksjonen ble separert på basis av den erholdte kurve og derefter frysetørket i en Leybold-Hereus frysetørker. Om nødvendig ble produktet underkastet gjentagne ganger kromatografi ved anvendelse av gradiert eluering pånytt.

Eksempel 1

Fremstilling av ( sarcosine 1 , L- lactic syre 8)- angiotensin- II Trinn 1

Fremstilling av Boc- Pro- Lac- OBzl

2,4 g (15 mmol) carbonyldiimidazol ble tilsatt ved 0° C i løpet av 10 minutter til en omrørt løsning av 2,15 g (10 mmol) (Boc-Pro-OH i 10 ml tørr tetrahydrofuran. Deretter ble en løsning av 1,8 g (10 mmol) benzyl L-lactat i 10 ml tørr tetrahydrofuran, avkjølt til 0° C, dråpevis tilsatt til reaksjonsblåndingen ved 0° C og i løpet av 15 minutter.

Den resulterende blanding ble omrørt ved 0° C i 30 minutter og deretter ved 20° C i 2 timer, hvoretter blandingen ble lagret i et kjøleskap. Neste dag ble løsningsmidlet fjernet, residuet ble løst i 30 ml kloroform, og løsningen ble vasket suksessivt med 1 n saltsyre (4 x 10 ml), vann, vandig natriumhydrocarbonatløsning (2 x 30 ml) og deretter igjen med vann. Kloroformløsningen ble tørket og fordampet til konstant vekt ble oppnådd. Det oljeaktige residuum ble tør-ket i en eksikator over fosforpentoxyd under dannelse av 3,0 g (80 %) Boc-Pro-Lac-OBzl, et kromatografisk ensartet produkt,

R^<1>) = 0,32, R^<2>) = 0,57.

Trinn 2

Fremstilling av Z- Sar- Arg( NO2), Val- Tyr( Bzl)- Ile- His( Dnp)-Pro- Lac- OBzl

En løsning av 2,85 g (7,5 mmol) Boc-Pro-Lac-OBzl i 15 ml av en 8 n saltsyreløsning i dioxan fikk stå i 15 minutter. 30 ml tørr ether ble tilsatt til løsningen, og blandingen ble fordampet til tørrhet. Det resulterende dipepto-lidhydroklorid, R^<5>) = 0,37, ble løst i 20 ml dimethylformamid, pH på løsningen ble innstilt til 8 med triethylamin, og deretter ble 2,9 g (5 mmol) Boc-His(Dnp)-OPfp tilsatt. Reak-sjonsblandingen ble omrørt i 1 time og pH på blandingen ble holdt ved 8. Deretter ble løsningsmidlet fordampet, residuet ble løst i ethylacetat og denne løsning ble vasket suksessivt med 10 % vandig sitronsyreløsning, 1 n vandig saltsyre, 5 % vandig natriumhydrocarbonatløsning og deretter méd vann. Løsningen ble tørket, løsningsmidlet fjernet og det resul-

(2) terende urene beskyttede tripeptid = 0,77, ble løst i 10 ml av en 8 n saltsyreløsning i dioxan. Etter 20 minutters henstand ble det fri tripeptidhydroklorid utfelt med tørr ether, det faste materiale ble filtrert fra og vasket med ether. Det resulterende fri tripeptidhydroklorid,

R^ IA) = 0,10, ble løst i 20 ml dimethylformamid, pH på løs-ningen ble justert til 8 med triethylamin, og 2,78 g (7,5 mmol) Boc-Ile-POfp ble tilsatt til blandingen. Reaksjons-blandingen ble omrørt i 1 time og pH på blandingen ble holdt på den opprinnelige verdi. Deretter ble løsningsmidlet fordampet, residuet ble løst i ethylacetat og løsningen ble vasket som ovenfor beskrevet. Løsningen ble tørket, løsnings-midlet fordampet, residuet triturert med n-hexan og det faste materiale ble filtrert fra. Det resulterende beskyttede tetrapeptid, R^ (2) = 0,67, ble løst i 10 ml av en 8 n saltsyreløsning i dioxan, løsningen fikk stå i 15 minutter og det fri tetrapeptodhydroklorid, R^<5>^ = 0,52, ble utfelt med tørr ether. Denne forbindelse ble løst i 20 ml dimethylformamid, pH på løsningen ble justert til 8, 3,24 g (6 mmol) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp ble tilsatt, og blandingen ble omrørt i 30 minutter under opprettholdelse av pH ved startverdien. Løsningsmidlet ble fjernet, residuet ble løst i ethylacetat og 0,22 ml N,N-dimethylaminoethylamin ble tilsatt til blandingen for å fjerne overskudd av aktiv ester. Etter 15 minutters henstand ble løsningen vasket suksessivt med 10 % vandig sitronsyreløsning, 1 n vandig saltsyre, vann, 5 % vandig natriumhydrocarbonatløsning og deretter igjen med vann, ble tørket og fordampet. Residuet ble triturert med en 8:2-blanding av n-hexan og ether, og det fraskilte faste materiale ble filtrert fra. Det resulterende beskyttede

(3)

pentapeptid, R^ = 0,72, ble løst i 10 ml av en 8 n salt-syreløsning i dioxan, løsningen fikk stå i 15 minutter og deretter ble det fri pentapeptidhydrokloridutfelt med tørr ether. Det resulterende materiale ble løst i 20 ml dimethylformamid, pH på løsningen ble justert til 8 med triethylamin, og 2,6 g (6,8 mmol) Boc-Val-OPfp ble tilsatt. Løsningen ble omrørt i 1 time under opprettholdelse av pH ved startverdien, deretter ble løsningen fordampet, residuet ble løst i ethyl-

acetat og løsningen ble vasket som ovenfor beskrevet. Den vaskede løsning ble tørket og fordampet og residuet ble triturert med tørr ether. Det resulterende beskyttede hexa-(3)

peptid, = 0,83, ble filtrert fra, løst i 10 ml av en

8 n saltsyreløsning i dioxan, og etter 15 minutters henstand ble det fri hexapeptidhydroklorid, R^"^ = 0,65, utfelt med tørr ether. Dette produkt ble løst i 20 ml dimethylformamid og pH på løsningen ble justert til 8 med triethylamin, og 2,2 g (5 mmol) Boc-Arg(NO2)-OPfp ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 1 time under opprettholdelse av pH ved startverdien, hvoretter den ble fortynnet med 6 0 ml kloroform og den resulterende blanding ble vasket suksessivt med 10 % vandig sitronsyreløsning, 1 n vandig saltsyre og vann. Løs-ningen ble tørket, fordampet og residuet ble triturert med en 1:1 blanding av ethanol og ether. Det resulterende (3)

beskyttede heptapeptid, R^ =0,65, ble løst i 10 ml av en

8 n saltsyreløsning i dioxan, og etter 15 minutters henstand ble det fri heptapeptidhydroklorid, = 0,40, utfelt med tørr ether. Det faste materiale ble filtrert fra, vasket, tørket og deretter løst i 1<*>5 ml dimethylf ormamid. pH på løsningen ble justert til 8, og 1,8 g (5 mmol) Z-Sar-OPfp ble tilsatt. Løsningen ble omrørt i 30 minutter under opprettholdelse av pH ved startverdien, ble deretter fortynnet med 4 5 ml kloroform og ristet med vann. Blandingen ble tørket, fordampet, residuet ble triturert med tørr ether og det faste materiale ble filtrert fra. 2,12 g (29,6 % beregnet for His som svarer til et utbytte på 82 % i de individuelle trinn) av Z-sar-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Lac-OBzl ble erholdt; R^<3>) = 0,465, sm.p.: 204 - 213° C.

Trinn 3

Fjerning av de beskyttende grupper

2,3 ml (30 mmol) 2-mercaptoethanol ble tilsatt til en løsning av 1,4 5 g (1 mmol) av det beskyttede octapeptid fremstilt som beskrevet i trinn 2, i 5 ml dimethylformamid. Etter 1 times omrøring ble tørr ether tilsatt til blandingen, det resulterende beskyttede octapeptid som nå er fritt for Dnp-gruppen, ble fraskilt og renset ved utfelling fra methanol og ether. 1,14- g (89 %) av det delvis avbeskyttede

(4)

peptid ble erholdt, = 0,60. Denne substans ble løst i

40 ml av en 5:1:2 blanding av methanol, eddiksyre og vann,

og 0,6 g av en 10 %-ig palladium-på-carbonkatalysator ble tilsatt og blandingen ble hydrogenert i 20 timer under kraftig omrøring. Deretter ble katalysatoren filtrert fra, vasket med den ovenfor angitte løsningsmiddelblanding og filtratet ble fordampet til tørrhet. 0,7 g (84 %) (Sar 1 ,Lac° R)-Ang-II ble erholdt.

Trinn 4

Det urene peptid ble renset etter den ovenfor be-skrevne metode. De fysikalske konstanter for det rene produkt er som følger: Kromatografiske konstanter: Rj<6>) = 0ål7, R^<7>) = 0,40, R^<8>) = 0,21.

Aminosyreanalyse: Pro 1,0 (1), Val 1,0 (1), Ile 1,03 (1), Tyr 0,85 (1), His 0,85 (1), Arg 0,96 (1), Ber 1,0 (1) .

Eksempel 2

Fremstilling av ( sarcosine 1 , ethyl L- lactate8)- angiotensin- II Trinn 1

Fremstilling av Boc- Pro- Lac- OEt

4,8 g (30 mmol) carbonyldiimidazol ble tilsatt ved 0° C, i løpet av 10 minutter, til en løsning av 4,3 g (20 mmol) Boc-Pro-OH i 20 ml tørr tetrahydrofuran. Deretter ble en kald løsning av 2,1 g (20 mmol) ethyl-L-lactat i tetrahydrofuran dråpevis tilsatt til blandingen ved den samme temperatur. Blandingen ble omrørt i ytterligere 30 minutter ved 0° C og deretter i 2 timer ved 20° C og fikk stå i et kjøleskap over natten. Neste dag ble tetrahydrofuranet destillert fra, residuet ble løst i 40 ml ethylacetat og løsningen ble vasket suksessivt med 1 n vandig saltsyre (2 x 15 ml), vann, 5 % vandig natriumhydrocarbonatløsning (to ganger) og deretter igjen med vann. Løsningen ble tørket, løsningsmidlet ble fordampet og det oljeaktige residuum ble tørket i en eksikator inntil konstant vekt. 2,22 g (36 %) Boc-Pro-Lac-OEt ble erholdt, R^<3>) = 0,77, R^ = 0,36.

Trinn 2

Fremstilling av Z-Sar-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)Ile-His(Dnp)-Pro-Lac- OEt

En løsning av 1,8 g (6 mmol) Boc-Pro-Lac-OEt i

8 ml av en 7,5 n saltsyreløsning i dioxan fikk stå i 15 minutter. 30 ml ether ble tilsatt til løsningen og blandingen ble fordampet til tørrhet. Det resulterende fri peptolid-hydroklorid, R£ (4) = 0,31, ble løst i 15 ml dimethylformamid, pH på løsningen ble justert til 8 med triethylamin og 2,9 g

(5 mmol) Boc-His(Dnp)-OPfp ble tilsatt. Etter 1 time ble løsningsmidlet erstattet med ethylacetat, og den resulterende løsning ble vasket suksessivt med 10 % vandig sitronsyre-løsning, 1 n vandig saltsyre, 5 % vandig natriumhydrocarbo-natløsning og deretter igjen med vann. Løsningen ble tørket, fordampet og det resulterende beskyttede tripeptid, ( 2)' = 0,69, ble løst umiddelbart i 20 ml av en 7,5 n saltsyreløs-ning i dioxan. Etter 20 minutters henstand ble det fri tripeptidhydroklorid, R^ (4) = 0,19, utfelt med tørr ether, sub-stansen ble løst i 15 ml dimethylformamid og pH på løsningen ble justert til 8 med triethylamin, og 3,0 g (7,5 mmol) Boc-Ile-OPfp ble tilsatt. Blandingen fikk stå i 30 minutter og pH ble opprettholdt på startverdien, hvoretter løsningsmidlet ble fordampet, residuet ble løst i ethylacetat og den resulterende løsning vasket som ovenfor beskrevet. Løsningen ble tørket, fordampet, residuet ble triturert med en 2:8 blanding av ether og n-hexan og det faste materiale ble filtrert fra. Det resulterende beskyttede tetrapeptid, (3' ) = 0,36, ble løst i 10 ml av en 8 n saltsyreløsning i dioxan, og etter 15 minutters henstand ble det fri tetrapeptidhydroklorid,

(5)

Rj =0,27, utfelt med tørr ether. Produktet ble løst umiddelbart i 20 ml dimethylformamid, pH på løsningen ble justert til 8 og 3,24 g (6 mmol) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp ble tilsatt. Løs-ningen fikk stå i 30 minutter under opprettholdelse av pH på startverdien, deretter ble løsningsmidlet fordampet og residuet løst i ethylacetat. 0,22 ml N,N-dimethylamino-ethylamin ble tilsatt til løsningen, blandingen fikk stå i 10 minutter og ble deretter vasket som ovenfor beskrevet, tørket og fordampet. Residuet ble triturert med n-hexan og filtrert.

Det resulterende beskyttede pentapeptid, R^ (2) = 0,64, ble. løst i 10 ml av en 8 n saltsyreløsning i dioxan, og etter 15 minutters henstand ble det fri pentapeptidhydroklorid,

R^ (4) = 0,33, utfelt med tørr ether. Produktet ble løst i 15 ml diformamid og pH på løsningen justert til 8 med triethylamin, ot 2,1 g (5,5 mmol) Boc-Val-OPfp ble tilsatt. Løs-ningen fikk stå i 30 minutter under opprettholdelse av pH

på startverdien, deretter ble den fordampet, residuet ble løst i ethylacetat og denne løsning ble vasket som ovenfor beskrevet. Løsningen ble tørket, fordampet, residuet ble triturert med n-hexan og deretter filtrert. Det resulterende

(2)

beskyttede hexapeptid, Rl|' = 0,76, ble løst umiddelbart i

10 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan, og etter 15 minutters

(4)

henstand ble det fri hexapeptidhydroklorid, R^ =0,34, utfelt med tørr ether. Dette materiale ble løst i 20 ml dimethylformamid, pH på løsningen ble justert til 8 og 3,96 g (6 mmol) Boc-Arg(N02)-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå

i 1 time under opprettholdelse av pH på startverdien, ble deretter fortynnet med 60 ml kloroform, vasket som ovenfor beskrevet, tørket og fordampet. Residuet ble triturert med tørr ethanol og filtrert. Det resulterende beskyttede heptapeptid, R^3^ = 0,78, ble løst i 10 ml av en 8 n saltsyre-løsning i dioxan, og etter 15 minutters henstand ble produktet utfelt med tørr ether. Det resulterende fri heptapeptid-hydroklorid, R^ (4' ) = 0,56, ble løst umiddelbart i 20 ml dimethylformamid, pH på løsningen ble justert til 8 og 2,12 g (5,5 mmol) Z-Sar-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 30 minutter under opprettholdelse av pH på startverdien, ble deretter fortynnet med 60 ml kloroform og vasket som ovenfor beskrevet. Løsningen ble tørket, fordampet, residuet ble triturert med ethanol og det faste materiale ble omkrystal-lisert fra ethanol. 1,21 g (17,5 % beregnet for His: dette svarer til et utbytte på 75 % i de individuelle trinn) av Z-Sar-Arg (NO2J -Val-Tyr (BstLJ -Ile-His (-Dnp) -Pro^-Eacr-OEt ble erholdt, sm.p. 208 - 212° C, R^<3>) = 0,5.

Trinn 3

Fjerning av de beskyttende grupper

3 ml 2-mercaptoethanol ble tilsatt til en løsning av 1,21 g (0,88 mmol) av det beskyttede octapeptid, fremstilt som beskrevet i trinn 2, i 5 ml dimethylformamid. Blandingen ble omrørt i 1 time, deretter ble produktet utfelt med tørr ether, filtrert og vasket. Det faste materiale ble løst

i methanol og utfelt ijgen med tørr ether. 0,94 g (89 %)

av det tilsvarende partielt avbeskyttede octapeptid, som er fri for dinitrofenyl-beskyttende gruppe, ble erholdt;

(4)

R^ (4 ) = 0,59. Denne substans ble løst i 20 ml av en 5:1:1 blanding av methanol, eddiksyre og vann, 0,5 g av en 10 %-g palladium-på-carbonkatalysator ble tilsatt, og hydrogen ble boblet gjennom blandingen i 20 timer under kraftig omrøring. Reaksjonsforløpet ble overvåket ved tynnsjiktskromatografi. Etter endt reaksjon ble katalysatoren filtrert fra, vasket med den ovenfor angitte løsningsmiddelblanding, filtratet og vaskevannet ble kombinert og fordampet til tørrhet. Residuet ble triturert med en blanding av ethanol og ether

og filtrert. 0,72 g (96 %) (Sar<1>,Lac-OEt<8>)-Ang-II ble erholdt.

Trinn 4

Det urene fri peptid erholdt i det ovenfor angitte trinn ble renset etter den generelle prosedyre som er beskrevet tidligere. Det rene peptid hadde følgende fysikalske konstanter: Kromatografisk karakteristika: R.1^ = 0,24,

(7) l8)

Rj = 0,53, Rf = 0,36. Aminosyreanalyse: Pro 1,02 (1), Val 0,97 (1), Ile 1,08 (1), Tyr 0,91 (1), His 1,00 (1),

Arg 1,07 (1), Sar 1,0 (1).

Eksempel 3

Fremstilling av ( sarcosine 1 , L- 2- hydroxy- 3- methylvalerinsyre 8)-angiotensin- II

Trinn 1

Fremstilling av H- HMV- OBzl

20 ml av en 4 n saltsyreløsning i ethylacetat ble tilsatt til en suspensjon av 7,12 g (40 mmol) H-HMV-ONa i 10 ml ethylacetat. Blandingen ble omrørt i 2 timer og deretter ble pH på blandingen justert til 3 med triethylamin.

Det utskilte bunnfall ble filtrert fra og vasket to ganger med 20 ml ethylacetat hver gang. pH på filtratet ble justert til 6 med triethylamin og deretter ble 8 ml (60 mmol) benzyl-bromid og 8,4 ml (60 mmol) triethylamin tilsatt. Den resulterende blanding ble kokt under tilbakeløpskjøling i 8 timer, det utskilte uorganiske salt ble filtrert fra og filtratet ble vasket suksessivt med vann, 1 n vandig saltsyre, 5 % vandig natriumhydrocarbonatløsning og deretter igjen med vann. Løsningen ble tørket, fordampet og det resulterende 5,6 g (63 %) H-HMV-OBzl ble renset ved destillasjon i vakuum. Produktet koker ved 134 - 136°C/5 mm Hg; [a]2<5> = -13,9°

(c = 1 %, i aceton).

Trinn 2

Fremstilling av Boc- Pro- HMV- OBzl

3,2 g (20 mmol) carbonyldiimidazol ble tilsatt ved 0° C i løpet av 10 minutter, til en løsning av 2,7 g (12,5 mmol) Boc-Pro-OH i 15 ml tørr tetrahydrofuran. En kald løs-ning av 2,8 g (12,5 mmol) H-HMV-OBzl i 10 ml tetrahydrofuran ble tilsatt til blandingen ved den samme temperatur, og den resultereride blanding ble omrørt ved 0° C i 30 minutter og deretter ved 2 0° C i 2 timer. Blandingen fikk stå i et kjøleskap over natten. Neste dag ble tetrahydrofuran fordampet, residuet ble løst i 40 ml ethylacetat og løsningen ble vasket suksessivt med 1 n vandig saltsyre (2 x 15 ml), vann, 5 % vandig natriumhydrocarbonatløsning og deretter igjen med vann. Løsningen ble tørket, fordampet og det oljeaktige residuum ble tørket til konstant vekt ved 25° C. 3,19 g (65 %) Boc-Pro-HMV-OBzl ble erholdt, Rf<2>) = 0,90, R^<1>) = 0,33.

Trinn 3

Fremstilling av Z- Sar- Arg( N02)- Val- Tyr( Bzl)- Ile- His( Dnp)-Pro- HMV- OBzl

2,52 g (6 mmol) Boc-Pro-HMV-OBzl ble løst i 8 ml

av en 8 n saltsyreløsning i dioxan, blandingen fikk stå i 15 minutter, 3 0 ml tørr ether ble tilsatt og blandingen ble fordampet til tørrhet. Det fri dipeptolid-hydroklorid, Rf<4>^ = 0,30, erholdt som residuum, ble løst i 15 ml dimethylformamid, pH på blandingen ble justert til 8 med triethylamin og 2,9 g (5 mmol) Boc-His(Dnp)-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå 1 time under opprettholdelse av pH ved startverdien, ble deretter fordampet og residuet ble løst i ethylacetat. Denne løsning ble vasket suksessivt med 1 n vandig saltsyre, vann og 5 % vandig natriumhydrocarbonatløsning, tørket,

(2)

fordampet, og det beskyttede tripeptid, Rf = 0,67,

erholdt som residuum, ble løst i 10 ml av en 8 n løsning av saltsyre i dioxan. Etter 20 minutters henstand ble det fri

(4)

tripeptid-hydroklorid, R^ = 0,18, utfelt med tørr ether.

Dette materiale ble løst i 15 ml dimethylformamid, pH på løsningen ble justert til 8 med triethylamin, og 2,4 g

(6 mmol) Boc-Ile-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 1 time etter opprettholdelse av pH ved startverdien, ble deretter fordampet og residuet ble løst i kloroform. Denne løsning ble vasket suksessivt med vann, 1 n vandig saltsyre og 5 % vandig natriumhydrocarbonatløsning, tørket og fordampet. Det beskyttede tetrapeptid erholdt som residuum ble triturert med n-hexan, n-hexanet ble dekantert og residuet ble triturert med ether og filtrert. Det resulterende

(2)

beskyttede tetrapeptid, Ri (2) = 0,65, ble løst i 10 ml av en

8 n saltsyreløsning i dioxan, og etter 15 minutters henstand (4)

ble det fri tetrapeptid-hydroklorid, Rf = 0,27, utfelt med tørr ether. Dette materiale ble løst i 15 ml dimethylformamid og pH på løsningen ble justert til 8, og 2,9 6 g Boc-Tyr(Bzl)-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 30 minutter under opprettholdelse av pH ved startverdien og ble deretter fordampet. Residuet ble løst i ethylacetat, 0,22 ml N,N-dimethylamino-ethylamin ble tilsatt til løsningen, og etter 10 minutters henstand ble blandingen vasket suksessivt med

10 % vandig sitronsyreløsning, 1 n vandig saltsyre og 5 % vandig natriumhydrocarbonoppløsning. Løsningen ble tørket, fordampet og residuet ble triturert med n-hexan og deretter filtrert. Det resulterende beskyttede pentapeptid, Rf"^ = 0,75), løst i 10 ml av en 8 n saltsyreløsning i dioxan, løsningen fikk stå i 15 minutter, hvorpå det fri pentapeptidhydroklorid, Rf (4)' = 0,60, ble utfelt med tørr ether. Det resulterende materiale ble løst umiddelbart i 20 ml dimethylformamid, pH på løsningen ble justert til 8 og 2,3 g (6 mmol) Boc-Val-OPfp ble tilsatt. Den resulterende løsning fikk stå

i 1 time under opprettholdelse av pH ved startverdien, ble derpå fordampet og residuet ble løst i kloroform, og kloro-formløsningen ble vasket suksessivt med 10 % vandig sitronsyre-løsning, 1 n vandig saltsyre, 5 % vandig natrium-hydrocarbo-natløsning og vann. Løsningen ble tørket, fordampet, residuet ble triturert med n-hexan og det beskyttede hexapeptid,

(3)

Rf = 9,71, ble filtrert fra. Dette materiale ble løst i

10 ml aven 8 n saltsyreløsning i dioxan, løsningen fikk stå i 15 minutter og derpå ble det fri hexapeptid-hydroklorid, Rf4^ = 0,34, utfelt med tørr ether. Dette materiale ble løst umiddelbart i 20 ml dimethylformamid, pH på løsningen ble justert til 8 og 2,64 g (6 mmol) Boc-Arg(N02)-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 1 time under opprettholdelse av pH ved startverdien, og ble deretter fordampet. Resiudet ble løst i kloroform, løsningen ble vasket suksessivt med 10 % vandig sitronsyre inneholdende 10 % dimethylformamid,

1 n vandig saltsyre, 5 % vandig natriumhydrocarbonatløsning og vann, ble tørket og fordampet. Residuet ble triturert med en 8:2 blanding av ether og ethanol og filtrert fra. (3)

Det resulterende beskyttede heptapeptid, R^ =0,63, ble løst i 10 ml av en 8 n saltsyreløsning i dioxan, og etter 15 minutters henstand ble det fri heptapeptid-hydroklorid,

Rf5^ = 0,45, utfelt med tørr ether. Produktet ble filtrert fra, vasket, tørket, løst i 20 ml dimethylformamid, pH på løsningen ble justert til 8 og 2,3 g (6 mmol) Z-Sar-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 30 minutter under opprettholdelse av pH ved startverdien, ble deretter fortynnet med 6 0 ml kloroform, vasket med 1 n vandig saltsyre og vann, tørket og fordampet. Residuet ble triturert med en 8:2 blanding av ether og ethanol, det faste materiale ble filtrert fra og vasket. 2,3 6 g (30 % beregnet for His som svarer til et utbytte på 82 % i individuelle trinn) av Z-ar-Arg(N02)-Val-Tyr (Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-HMV-OBzl ble erholdt; sm.p. 193 - 202° C, Rf3) = 0,30, Ff<4>) = 0,86.

Trinn 4

Fjerning av de beskyttende grupper

2,8 ml 2-mercaptoethanol ble tilsatt til en løsning av 2,0 g (1,25 mmol) av det beskyttede octapeptid, fremstilt som beskrevet i trinn 3, i 5 ml dimethylformamid. Blandingen ble omrørt i 1 time, derpå ble produktet utfelt med tørr ether, vasket med ether, ble løst i methanol og utfelt på nytt med ether. 1,44 g (80 %) av det partielt avbeskyttede

(4)

octapeptod, fri for dinitrofenylgruppen, ble erholdt; R^ = 0,41. Denne forbindelse ble løst i 30 ml av en 5:2:1 blanding av methanol, eddiksyre og vann, 0,7 g 10 % palladium-på-carbonkatalysator ble tilsatt, og hydrogen ble

boblet gjennom blandingen i 20 timer under kraftig omrøring.

Etter endt reaksjon ble katalysatoren filtrert fra, vasket

med 20 ml av den ovenfor angitte løsningsmiddelblanding,

hvorpå vaskevannet og filtratet ble kombinert og fordampet til tørrhet. Residuet ble triturert med en 1:1 blanding av ethanol og ether og derpå filtrert. 0,65 g (67 %) (sarcosin<1>, L-2-hydroxy-3-methylvalerins<y>re°<Q>)-angiotensin-II) ble erholdt.

Trinn 5

Det urene produkt erholdt som beskrevet i trinn

4 ble renset etter den generelle prosedyre som beskrevet tidligere. Det rene produkt hadde følgende fysikalske kon-

stanter: Kromatografiske karakteristika: Rf^ = 0,26,

Rf ( 7' ) 0,52, Rf l R) = 0,30. Aminosyreanalyse: Pro 1,06 (1),

Val 1,03 (1), Ile 1,03 (1), Tyr 0,65 (1), His 0,99 (1),

Ar 0,95 (1), Sar 1,0 (1).

Claims

Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive octapeptider av angiotensin-II med antagoniserende effekt og den generelle formel (I) X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y-OA (1) hvori X betegner en acylgruppe av en N-methylaminosyre, fortrinnsvis

en sarcosylgruppe, eller en acylgruppe av en alifatisk a-aminooxy- eller a-hydroxycarboxylsyre, Y er resten av en alifatisk a-hydroxycarboxylsyre, fortrinnsvis resten av melkesyre eller L-2-hydroxy-3-methyl-valerian-syre, og A er hydrogen eller C-L_5 alkyl, eller syreaddisjonssalter eller farmasøytisk akseptabelt kompleks derav,karakterisert ved at a) når en forbindelse av generell formel (I) hvori A er hydrogen fremstilles, at de beskyttende grupper i et beskyttet octapeptidderivat av generell formel (II), B-X-Arg(C)-Val-Tyr(D)-Ile-His(E)-Pro-Y-OF (II) hvori B er en gruppe som er fjernbar ved acidolyse eller katalytisk hydrogenering, fortrinnsvis en benzyloxycarbonyl eller tertiær butoxycarbonylgruppe, C er en gruppe for temporær beskyttelse av guanidgruppen på Arg-resten, fortrinnsvis en nitro eller en tosylgruppe, D er en gruppe for temporær beskyttelse av den aromatiske hydroxygruppe på Tyr-resten, fortrinnsvis en benzyl eller en substituert benzylgruppe, E er en gruppe for temporær beskyttelse av imidazolgruppen på His-resten, fortrinnsvis en dinitrofenylgruppe, og F er en gruppe for beskyttelse av carboxy-endegruppen, som er resistent overfor effekten av milde syrer men er fjernbar ved katalytisk hydrogenolyse eller ved behandling med en sterkere syre, fjernes enten trinnvis eller i et enkelt trinn, eller b) når en forbindelse av generell formel (I) hvori A er en C^_,- alkylgruppe fremstilles, at de beskyttende grupper i et beskyttet octapeptid av generell formel (III) B-X-Arg(C)-Val-Tyr(D)-Ile-His(E)-Pro-Y-OA<1> (III) hvori B, C, D og E er som ovenfor angitt og A' er en C^_,-alkylgruppe, fjernes enten trinnvis eller i et enkelt trinn, og om ønsket, at en forbindelse av generell formel (I) eventuelt omdannes til dets syreaddisjonssalt eller farmasøytisk akseptabelt kompleks.