DK149777B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af et octapeptid med angiotensin-ii-antagoniserende virkninger - Google Patents

Description

o i 149777

Opfindelsen angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt octapeptid med angio-tensin-II-antagoniserende virkninger eller et farma-5 ceutisk acceptabelt syreadditionssalt eller kompleks deraf.

Det omhandlede, hidtil ukendte octapeptid har den almene formel H - X - Arg - Val - Tyr - Ile - His - Pro - Y - OA (I) hvori 10 X står for resten af en aliphatisk N-methyl-aH^..^- -aminosyre, fortrinsvis en sarcosylgruppe, Y er resten af en aliphatisk a-hydroxycarboxylsyre med 3-6 carbonatoraer, fortrinsvis en mælkesyre- eller L-2-hydroxy-3-methylvalerianesyrerest, og 15 A er hydrogen eller en C^_5-alkylgruppe.

Den første angiotensin-II-analoge, som viste sig at være en specifik konkurrencedygtig inhibitor af angioten-sin-II under både in vitro og in vivo forhold, blev beskrevet i 1970 [G.R. Marshal et al.: Proc. Natl. Acad. Sci.

20 USA 67, 1624 (1970); P.A. Khairallah et al.: J. Med. Chem.

13, 181 (1970)]. Denne erkendelse startede et omfattende undersøgelsesarbejde efter produktionen af angiotensin-II- -analoge med antagoniserende virkninger, som kan anvendes til diagnosticering af visse reninafhængige hypertensioner 25 n og eventuelt også i behandlingen af sådanne forhold. (Sar ,

O

Ala7-angiotensin-II, en af de mange analoge med antagoni-serende virkninger, som er fremstillet hidtil, er allerede sendt på markedet under handelsnavnet "Saralasin" [D.T.

30 Pals et al.: Circ. Res. 29_, 673 (1973)].

Kliniske forsøg udført med denne forbindelse viser, at .stoffet er anvendeligt til diagnosticering af hypertensioner af forskellig oprindelse [G. Bonner et al.: Dtsch.

Med. Wschr. 104, 432 (1979)], så vel som i behandlingen af sådanne forhold [J.L. Marx: Science 194, 821 (1976)]. Senere 35 — o 2 149777 har man fundet, at stoffer med angiotensin-II-antagoni-serende virkninger også kan anvendes i behandlingen af hjerteinsufficienser forårsaget af renovasculær hypertension [H. Gavras et al.:· JAMA 238, 880 (1977)].

5 Ved at betragte forholdene mellem strukturerne og de biologiske virkninger af angiotensin-II-analoge, der er fremstillet indtil nu, har man fået adskillige informationer om fortolkningen af agonistiske og antagonistiske virkninger. Hovedformålet med det seneste undersø-10 gelsesarbejd’e er at fremstille antagonistiske stoffer med forlængede biologiske halveringstider, som er fri for visse uønskede bivirkninger, såsom indledende agonistiske virkninger.

Det har nu vist sig, at hvis man erstatter phenyl-15 alanin-delen i stilling 8 i angiotensin-II-molekylet med en aliphatisk a-hydroxycarboxylsyrerest og samtidigt indfører en aliphatisk N-methylaminosyredel, fortrinsvis en sarcosylgruppe, i stilling 1 i molekylet, opnås hidtil ukendte, konkurrencedygtige inhibitorer for angioten-20 sin-II, som væsentligt formindsker hypertensionen frem kaldt af angiotensin-II under in vivo forhold, og som er virksomme selv efter subkutan indgivelse, og som tillige har længerevarende virkning end det kendte "Saralasin", jfr. nedenstående tabel I med tilhørende forklaring.

25 Analogifremgangsmåden til fremstilling af det om handlede octapeptid med formel (I) er karakteriseret ved, at man fjerner de beskyttende grupper i et beskyttet octapeptidderivat med den almene formel (II) B-X-Arg(C)-Val-Tyr(D)-Ile-His(E)-Pro-Y-OF (II) 30 hvori B er en gruppe, der kan omdannes til et hydrogenatom ved acidolyse eller katalytisk hydrogenering, fortrinsvis en benzyloxycarbonyl- eller tert.-butoxycarbonyl-gruppe, 35 C er en gruppe til den midlertidige beskyttelse af guanidinogruppe på Arg-delen, fortrinsvis en nitro-eller tosylgruppe, o 3 149777 D er en gruppe til den midlertidige beskyttelse af den aromatiske hydroxygruppe på Tyr-delen, fortrinsvis en benzyl- eller en substitueret benzylgruppe, E er en gruppe til den midlertidige beskyttelse af imida-5 zolgruppen på His-delen, fortrinsvis en dinitrophenyl- gruppe, og F er en C1_p--alkylgruppe eller en gruppe til beskyttelse af den endestillede carboxygruppe, hvilken gruppe er modstandsdygtig mod virkningen af milde syrer, men kan fjer-10 nes ved katalytisk hydrogenolyse eller ved behandling med en stærkere syre, enten trinvis eller ved et enkelt trin, og om ønsket omdanner en forbindelse med den almene formel (I) til et farmaceutisk acceptabelt syreaddi-15 tionssalt eller kompleks.

Octapeptidderivaterne med den almene formel (II), anvendt som udgangsstoffer ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan fremstilles ved enhver metode kendt i peptidkemien, f.eks. som beskrevet i HD-PS nr. 168.431.

20 Når de beskyttede octapeptider fremstilles, bør der til beskyttelse af de funktionelle sidegrupper anvendes beskyttende grupper, som er stabile under de acidolysebetingelser, som anvendes til fjernelse af den N-endestillede beskyttende gruppe ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

25 I henhold til en foretrukket metode opbygges det beskyttede octapeptidderivat med den almene formel (II) trinvis, og grupper, som let kan fjernes ved acidolyse, f.eks. en tert.-butoxycarbonylgruppe, anvendes til midlertidig beskyttelse af de N-endestillede aminogrupper 30 i de individuelle aminosyrederivater. De beskyttende grupper, der er knyttet til udgangsoctapeptidderivatet, fraspaltes, trinvist eller ved et enkelt trin, ved katalytisk hydrogenering efter fjernelse af en eventuel dinitrophenylgruppe ved thiolyse.

35 a-Hydroxycarboxylsyreresten i stilling 8 i mole kylet indføres fortrinsvis ved, at en esterificeret a-hy-

O

149777 4 droxycarboxylsyre med den almene formel (IV) H-Y-OZ (IV) 5 hvori Y er som defineret ovenfor, og Z er en alkyl- eller en aralkylgruppe, omsættes med en N-beskyttet prolin, idet den beskyttende gruppe fortrinsvis er en tert.-butoxycar-bonylgruppe. Den -CO-O-binding, der dannes ved denne omsætning, er stabil og spaltes ikke i syntesens efterfølgende 10 trin.

Forbindelserne med den almene formel (I) renses ved kendte metoder, fortrinsvis ved ionbytningschromatografi på carboxymethylcellulose. Slutproduktet skilles fra afgangsstrømmen , fortrinsvis ved frysetørring, til opnåelse af 15 et pulveragtigt stof, som kan anvendes direkte ved fremstillingen af forskellige farmaceutiske præparater.

De antagonistiske virkninger af de hidtil ukendte forbindelser med den almene formel (I) blev undersøgt på bedøvede hankatte. Efter at dyrene var blevet behandlet med et 20 ganglieblokerende middel og efter gennemskæring af nervus vagus cervicalis på begge sider, blev dyrene behandlet med en infusion af Hypertensin (CIBA) i en mængde på 0,5 ^g/kg/min.

Når dyrenes blodtryk nåede et jævnt, forhøjet niveau, blev det stof, der skulle undersøges, indgivet enten intravenøst 25 eller subcutant i en fysiologisk saltopløsning eller som en vandig opløsning, som også indeholdt et bærestof. Faldet i blodtrykket blev målt i mm Hg enheder, og omfanget af formindskelsen blev udtrykt i procent i forhold til værdien før behandlingen. Den statistiske vurdering blev udført på basis 30 af forskellene i blodtrykket ved hjælp af Student's enkeltprøve "t" forsøg. Resultaterne er opsummeret i tabel I.

Udtrykket "virkningsvarighed" betegner den forløbne tid indtil observationen af den sidste, stadig signifikante (p = 5%) difference i blodtrykket.

35 o 5 149777

Bemærkninger til tabel I: d = dosis,yUg/kg n = antal forsøg p = virkningens varighed i minutter 5 phys. sal. = fysiologisk saltopløsning CMC = carboxymethylcellulose 6 149777

CO

Di

C

•«-i r—1

H

Ά tø 'h* o o o m 4j ft σι σι cm η tn ή <ΰ α>

U C

0) ή ^ cm co rn p +J o'? cm m CM cm >i · ' id

W H

H <D _ >i oi fi in in m h

X

0

Λ O

M Ο Ο Ο O

<d μ t3 in ο ο o

u H CM CM

>1 0 inoinooino M ft ^ σι σι ο Μ1 σι Ό m >1 1 in r~ cm h in n co g Οικ1 oi n η m cm cm s u q ·. io vo in in m int*-

0) · S

u 0) · oooo o oo Ό ιηΌ ιηοοο o oo q h cm .-i h H cm

H <LI

Ό Η H H ooom o om <1)0 <d ft (!) IN ID ro lO^f

Si SS to H H

Ό 0) Β Ό tn „ q >, Oi nr'in CD σι»#

-rl <a> CM 00 H i—1 N IN

ft 0) tsi - m m in io m com 0 · c ι-t o

Hi . oooo o oo q μό ιηοοο o oo

ItJ i—1 03 r-1 i—l r-1 CM

H

h min cNininom

1 ft HH HCN'd’CMH

a

H

in m σι c-oooocn q · o\° cm cm cm "d1 n m <D >

•P

0 hp! mm in co m io m

•H

D»

C OO OOOOO

(tf Ό rl Μ Η (Ν Η CM r-| *Η «s

U

φ Οι Η α η •r-i i C Dl

-¾ H G

μ η <a Η I Η > O' οο Η C +J i <D id H O' > — O g h co i <d M O o ^ =

q 0) cd Cd CD C

O) θ' t-3 i-3 C* H

P O I I S Bl OH 1-0 H IB Id

ft cd - ' ' H

>, q H H H cd as < M £ a cd cd cd cd m m w w 149777

O

7

Det fremgår af data i tabel I, at alle angiotensin-II--analoge, som indeholder en α-hydroxycarboxylsyrerest i stilling 8 og en sarcosylgruppe i stilling 1, har signifikante hypotensive virkninger. Denne virkning er signifi-5 kant selv efter subcutan indgivelse. Når forbindelserne indgives i en opløsning, som også indeholder et bærestof, kan virkningens varighed sommetider komme op på adskillige timer.

Af data i tabel I fremgår endvidere, at angiotensin-II-10 -antagonister fremstillet ifølge opfindelsen har en virkning af længere varighed end "Saralasin". Det antages, at dette skyldes, at molekylet ved indføringen af den aliphatiske α-hydroxysyre i 8-stillingen er blevet gjort resistent overfor angiotensinase C (carboxypeptidase). Den forøgede virk-15 ning og den længere virkningsvarighed gør det muligt, at antagonister fremstillet ifølge opfindelsen kan indgives subcutant, hvorved den terapeutiske anvendelse af oc-tapeptiderne med formel (I) gøres væsentlig simplere.

I modsætning hertil indgives kendte angiotensin-II-20 -antagonister, herunder også "Saralasin", sædvanligvis i form af en infusion til patienten, jfr. T. Hata et.al.,

Eur. J. Chem. Pharm. 23, 7-10 (1982).

En yderligere fordel ved de omhandlede octapeptider med formlen (I) er, at de udover den forøgede antagonist-25 virkning også har en agonistvirkning, som er praktisk den samme som for antagonister indeholdende analoge aminosyrer i 8-stilling. Dette fremgår af nedenstående tabel II.

8 149777 o

Tabel II

Virkningen af angiotensin-II-antagonister på gennem- snitsblodtrykket hos rotter, som er ved bevidsthed.

5 Antagonist Dosis, Maksimal forø- Virknings- ug/kg, gelse i gennem- varighed, ' i.v. snitsblodtryk, minutter _mm Hg_' "Saralasin" 1 5,8-1,1 1,1 3 6,7 - 1,6 1,6 10 10 10,7 - 2,5 1,0 (Sar^-L-Lac8)- 1 3,8 - 1,4 1,3 -ang-II 3 7,0-2,3 2,3 10 8,8 - 3,9 2,5 15

Udtrykket "farmaceutisk acceptabelt kompleks" betegner forbindelser af peptiderne med den almene formel (I), der er dannet med visse organiske eller mineralske stoffer, som giver en forlænget virkning for det aktive middel. Af de 20 organiske komplekseringsmidler skal f.eks. nævnes visse gelatinetyper, carboxymethylcellulose, alginater, poly-florethin-phosphater, aminosyrepolymere og -copolymere, etc.

Som mineralske komplekseringsmidler kan f.eks. anvendes zinkhydroxid og dårligt opløselige zinksalte, såsom zink-25 phosphater.

De hidtil ukendte peptider ifølge opfindelsen samt deres farmaceutisk acceptable salte og komplekser kan anvendes i terapien i form af konventionelle farmaceutiske præparater. Disse præparater indeholder de hidtil ukendte 30 forbindelser ifølge opfindelsen i blanding med et organisk eller mineralsk bærestof, som er anvendeligt til enteral eller paranteral indgivelse. De farmaceutiske præparater kan f.eks. være frysetørrede faststoffer indeholdende bærestoffer, som ikke reagerer med peptidet, såsom carbonhydra-35 ter, endvidere koncentrerede eller fortyndede suspensioner og emulsioner, som også kan indeholde forskellige konserveringsmidler og stabilisatorer.

O

9 1-49777

De farmaceutiske præparater kan anvendes i terapien til undertrykkelse af hypertensioner, der stammer fra nyrerne, i behandlingen af hypertensive kriser, sekundær hjerteinsufficiens, etc.

5 De farmaceutiske præparater foreligger fortrinsvis i form af injektioner indeholdende 1 til 10 mg aktivt middel.

De aktive forbindelser fremstillet ifølge opfindelsen kan anvendes i en daglig dosis på 1 til 10 mg til behandling af voksne. Denne mængde anvendes fortrinsvis én gang dagligt i 10 form af en intravenøs, subcutan eller intramuskulær injektion eller som en langsom intravenøs infusion.

Den foreliggende opfindelse belyses i detaljer ved hjælp af de følgende eksempler.

De forkortelser, der anvendes i eksemplerne, svarer 15 til dem, der normalt anvendes i litteraturen [J. Biol. Chem.

247, 977 (1972)]. Yderligere forkortelser er: Lac = L-mælke-syre, HMV = L-2-hydroxy-3-methylvalerianesyre, Pfp = penta-fluorphenyl.

Ved fremstilling af forbindelserne blev fordampning 20 altid foretaget på et Rotavapor-apparat af Buehi-typen. Tyndtlagschromatografi blev taget på et "Kieselgel-6" silicagellag, der er fremstillet i henhold til Stahl, og de følgende opløsningsmiddelblandinger blev anvendt til fremkaldelse af chromatogrammerne: 25 (1) n-hexan:ethylacetat = 4:1 (2) ethylacetat:(pyridin:eddikesyre:vand = 20:6:11) = 95:5 (3) ethylacetat:(pyridin:eddikesyre:vand = 20:6:11) = 90:10 (4) ethylacetat:(pyridin:eddikesyre:vand = 20:6:11) = 80:20 (5) ethylacetat:(pyridin:eddikesyre:vand = 20:6:11) = 70:30 30 (6) n-butanol:eddikesyre:vand=4:1:5 (øvre fase) (7) n-butanol:eddikesyre:pyridin:vand = 30:6:20:24 (8) n-butanol:ethylacetat:eddikesyre:vand = 1:1:1:1

Tyndtlagschromatogrammerne blev gjort synlige med ninhydrin eller med chlortolidinkalciumiodid.

35 Den følgende almindelige metode blev anvendt til rens ning af slutprodukterne: o 10 149777 0,5 g frit peptid opløses i 4 ml af en 0,01 molær ammoniumacetatopløsning, og opløsningen anbringes på en kolonne af 0,5 liter carboxymethylcellulose (CMC-52), der tidligere er bragt i ligevægt med den samme pufferopløsning.

5 En gradientblanding af 1,5 liter af en 0,01 molær ammonlum-acetatopløsning og 1,5 liter af en 0,4 molær ammoniumace-tatopløsning anvendes som elueringsmiddel. Elueringsmidlet passerer gennem kolonnen i en mængde på 25 ml/time, og afgangsstrømmen opsamles i fraktioner på hver 10 ml. Sammen-10 sætningen af den afgangsstrøm, der forlader kolonnen kontrolleres konstant af et LKB Uvicord-II-apparat, hovedfraktionen fraskilles på basis af den opnåede kurve, og frysetørres derefter i en Leybold-Hereus-frysetørrer. Om ønsket underkastes produktet igen chromatografi ved fornyet anven-15 delse af gradienteluering.

Eksempel 1

~ 1 8 Fremstilling af (sarcosin ,L-mælkesyre )-angiotensin-II

Trin 1

Fremstilling af Boc-Pro-Lac-OBzl 20 2,4 g (15 mmol) carbonyldiimidazol sættes ved 0°C i løbet af 10 minutter til en omrørt opløsning af 2,15 g (10 mmol) Boc-Pro-OH i 10 ml tørt tetrahydrofuran. Derefter tilsættes dråbevist en opløsning af 1,8 g (10 mmol) benzyl--L-lactat i 10 ml tørt tetrahydrofuran, afkølet til 0°C, til reaktionsblandingen ved 0 C i løbet af 15 minutter. Den resulterende blanding omrøres ved 0°C i 30 minutter og derefter ved 20°C i 2 timer, derefter opbevares blandingen i et køleskab. Næste dag fjernes opløsningsmidlet, remanensen opløses i 30 ml chloroform, og opløsningen vaskes successivt med 1 30 N saltsyre (4x10 ml), vand, en vandig natriumhydrogencar- bonatopløsning (2x15 ml) og derefter igen med vand. Chloro- formopløsningen tørres og inddampes indtil konstant vægt. Den olieagtige remanens tørres i en ekssikkator over phosphor- pentoxid til opnåelse af 3,0 g (80%) Boc-Pro-Lac-OBzl, et 35 chromatografisk ensartet produkt;

RfI) = 0,32, R^2) = 0,57.

n 149777 o t

Trin 2

Fremstilling af Z-Sar-Arg(NO,.,)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His (Dnp)--Pro-Lac-OBzl

En opløsning af 2,85 g (7,5 mmol) Boc-Pro-Lac-OBzl 5 i 15 ml af en 8 N saltsyreopløsning i dioxan får lov til at stå i 15 minutter. 30 ml tør ether sættes til opløsningen, og blandingen inddampes til tørhed. Det resulterende fri dipeptid-hydrochlorid, R^5^ 0,37, opløses i 20 ml dimethyl- formamid, opløsningens pH-værdi indstilles på 8 med triethyl- 10 amin, og derefter tilsættes 2,9 g (5 mmol) Boc-His(Dnp)- -OPfp. Reaktionsblandingen omrøres i 1 time, og blandingens pH-værdi holdes på 8. Derefter afdampes opløsningsmidlet, remanensen opløses i ethylacetat, og denne opløsning vaskes successivt med 10%'s vandig citronsyreopløsning, 1 N vandig 15 saltsyre, 5%*s vandig natriumhydrogencarbonatopløsning og derefter igen med vand. Opløsningen tørres, opløsningsmidlet fjernes, og det resulterende rå beskyttede tripeptid, (2)

Rf = 0,77, opløses i 10 ml af en 8 K saltsyreopløsning i dioxan. Efter at have stået i 20 minutter bundfældes det 20 fri tripeptid-hydrochlorid med tør ether, fasstoffet filtreres fra og vaskes med ether. Det resulterende fri tripeptid-(4¾ -hydrochlorid, R^ - 0,10, opløses i 20 ml dimethylformamid, opløsningens pH-værdi indstilles på 8 med triethylamin, og der tilsættes 2,78 g (7,5 mmol) Boc-Ile-OPfp til blandingen.

25 Reaktionsblandingen omrøres i 1 time, og blandingens pH-værdi holdes på begyndelsesværdien. Derefter afdampes opløsningsmidlet, remanensen opløses i ethylacetat, og opløsningen vaskes som beskrevet ovenfor. Opløsningen tørres, opløsningsmidlet afdampes, remanensen tritureres med n-hexan, og fast- 30 stoffet filtreres fra. Det resulterende beskyttede tetra- (2) peptid, - 0,67, opløses i 10 ml af en 8 N saltsyreopløsning i dioxan, opløsningen får lov at stå i 15 minutter, (5) det fri tetrapeptid-hydrochlorid, R^ = 0,52, bundfældes med tør ether. Denne forbindelse opløses i 20 ml dimethylformamid, 35 opløsningens pH-værdi indstilles på 8, der tilsættes 3,24 g (6 mmol) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp, og blandingen omrøres i 30 minutter, medens pH-værdien holdes på begyndelsesværdien. Op- o 12 149777 løsningsmidlet fjernes, remanensen opløses i ethylacetat, og der tilsættes 0,22 ml Ν,Ν-dimethylaminoethylamin til blandingen for at fjerne overskuddet af aktiv ester. Efter at have stået i 15 minutter vaskes opløsningen successivt med 5 en 10%'s vandig citronsyreopløsning, 1 N vandig saltsyre, vand, en 5%'s vandig natriumhydrogencarbonatopløsning og derefter igen med vand, tørres og inddampes. Remanensen tritureres med en 8:2-blanding af n-hexan og ether, og det fraskilte faststof filtreres fra. Det resulterende beskyttede 10 pentapeptid, R^= 0,72, opløses i 10 ml af en 8 N saltsyreopløsning i dioxan, opløsningen får lov at stå i 15 minutter, og derefter bundfældes det fri pentapeptid-hydrochlorid med tør ether. Det resulterende stof opløses i 20 ml dimethylfor-mamid, opløsningens pH-værdi indstilles på 8 med triethylamin, 15 og der tilsættes 2,6 g (6,8 mmol) Boc-Val-OPfp. Opløsningen omrøres i 1 time, medens pH-værdien holdes på begyndelsesværdien, derefter afdampes .opløsningsmidlet, remanensen opløses i ethylacetat,·og opløsningen vaskes som beskrevet ovenfor. Den vaskede opløsning tørres og inddampes, og re- 20 manensen tritureres med tør ether. Det resulterende beskyt- (3) tede hexapeptid, - 0,83, filtreres fra, opløses i 10 ml af en 8 N saltsyreopløsning i dioxan, og efter at det har stået i 15 minutter, bundfældes det fri hexapeptid-hydro-chlorid, R^"^. = 0,65, med tør ether. Dette produkt opløses 25 i 20 ml dimethylformamid, opløsningens pH-værdi indstilles på 8 med triethylamin, og 2,2 g (5 mmol) Boc-Arg(N02)-OPfp tilsættes. Blandingen omrøres i 1 time, medens pH-værdien holdes på begyndelsesværdien, derefter fortyndes den med 60 ml chloroform,, og den resulterende blanding vaskes succes-30 sivt med en 10%'s vandig citronsyreopløsning, 1 N vandig saltsyre og vand. Opløsningen tørres, inddampes, og remanensen tritureres med en l:l-blanding af ethanol og ether. Det (3) resulterende beskyttede he.ptapeptid, R^ = 0,65, opløses i 10 ml af en 8 N saltsyreopløsning i dioxan, og efter at have 35 stået i 15 minutter bundfældes det fri heptapeptid-hydro-chlorid, R^= 0,40, med tør ether. Faststoffet filtreres fra, vaskes og tørres og opløses derefter i 15 ml dimethyl-

O

13 149777 formamid. Opløsningens pH-værdi indstilles på 8, og der tilsættes 1,8 g (5 mmol) Z-Sar-OPfp. Opløsningen omrøres i 30 minutter, medens pH-værdien holdes på begyndelsesværdien, derefter fortyndes med 45 ml chloroform og omrystes 5 med vand. Blandingen tørres, inddampes, remanensen tritu- reres med tør ether, og faststoffet filtreres fra. Der opnås 2,12 g (29,6% af det beregnede for His, hvilket svarer til et udbytte på 82% på det individuelle trin) af Z-Sar-Arg(NO-)- (3) ^ -Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Lac-OBzl; ' = 0,465, 10 smp.: 204-213°C.

Trin 3

Fjernelse af beskyttelsesgrupperne 2,3 ml (39 mmol) 2-mercaptoethanol tilsættes en opløsning af 1,45 g (1 mmol) af det beskyttede octapeptid, frem-15 . stillet som beskrevet på trin 2, i 5 ml dimethylformamid.

Efter 1 times omrøring sættes tør ether til blandingen, det resulterende beskyttede octapeptid, som nu er frit for Dnp-gruppen, fraskilles og renses ved udfældning fra methanol og ether. Der opnås 1,14 g (89%) af det delvist afbeskytteae (4) 20 peptid, - 0,60. Dette stof opløses i 40 ml af en 5:1*2 -blanding af methanol, eddikesyre og vand, der tilsættes 0,6 g af en 10%'s palladium-på-carbon-katalysator, og blandingen hydrogeneres i 20 minutter under kraftig omrøring. Derefter filtreres katalysatoren fra, vaskes med ovennævnte 25 opløsningsblanding, og filtratet inddampes til tørhed. Der opnås 0,7 g (84%) af (Sar^Lac8)-Ang-II.

Trin 4

Det rå peptid renses i henhold til den almindelige metode beskrevet ovenfor. Det rene produkts fysiske konstan- (6) 30 ter er som følger: Chromatografiske konstanter: RI '= 0,17,

Rf7)= 0,40, R^8)= 0,21.

Aminosyreanalyse: Pro 1,0 (1), Val 1,0 (1), Ile 1,03 (1),

Tyr 0,85 (1), His 0,85 (1), Arg 0,96 (1), Sar 1,0 (1).

35

O

14 149777

Eksempel 2 1 8

Fremstilling af (sarcosin,ethyl-L-lactat )-angiotensin-II Trin 1

Fremstilling 'af Boc-Pro-Lac-OEt 5 4,8 g (30 mmol) carbonyldiimidazol sættes ved 0°C, i løbet af 10 minutter, til en blanding af 4,3 g (20 mmol)

Boc-Pro-OH i 20 ml tørt tetrahydrofuran. Derefter tilsættes dråbevist en kold opløsning af 2,1 g (20 mmol) ethyl-L--lactat i tetrahydrofuran til blandingen ved samme tempera-^ tur. Blandingen omrøres i yderligere 30 minutter ved 0°C

og derefter i 2 timer ved 20°C og får lov til at stå natten over i et køleskab. Næste dag afdestilleres tetrahydrofuran, remanensen opløses i 40 ml ethylacetat, og opløsningen vaskes successivt med 1 N vandig saltsyre (2x15 ml), vand, en 5%'s 15 vandig natriumhydrogencarbonatopløsning (to gange) og derefter igen med vand. Opløsningen tørres, opløsningsmidlet afdampes, og den olieagtige remanens tørres i en ekksikkator indtil konstant vægt. Der opnås 2,22 g (36%) Boc-Pro-Lac-OEt; rI3)= 0,77, R^= 0,36.

20

Trin 2

Fremstilling af Z-Sar-Arg(NO^)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)--Pro-Lac-OEt

En opløsning af 1,8 g (6 mmol) Boc-Pro-Lac-OEt i 8 ml 25 af en 7,5 N saltsyreopløsning i dioxan får lov til at stå:; i 15 minutter. Der sættes 30 ml ether til opløsningen, og blandingen inddampes til tørhed. Det resulterende fri pep- tid-hydrochlorid, '= 0,31, opløses i 15 ml dimethylform- amid, opløsningens pH-værdi indstilles på 8 med triethyl- 50 amin, og 2,9 g (5 .mol) Boc-His(Dnp)-OPfp tilsættes. Efter en time erstattes opløsningsmidlet med ethylacetat, og den resulterende opløsning vaskes successivt med en 10%'s vandig citronsyreopløsning, 1 N vandig saltsyre, en 5%'s vandig natriumhydrogencarbonatopløsning og igen med vand. Opløsningen 55 tørres, inddampes, og det resulterende beskyttede tripeptid, (2) &£ = 0/69, opløses omgående i 20 ml af en 7,5 N saltsyre opløsning i dioxan. Efter at det har stået i 20 minutter, 149777

O

15 ί 4) bundfældes det fri tripeptid-hydrochlorid, R^ = 0,19, med tør ether, stoffet opløses i 15 ml dimethylformamid, opløsningens pH-værdi indstilles på 8 med triethylamin, og der tilsættes 3,0 g (7,5 mmol) Boc-Ile-OPfp. Blandingen får 5 lov at stå i 30 minutter, medens pH-værdien holdes på begyndelsesværdien, derefter afdampes opløsningsmidlet, remanensen opløses i ethylacetat, og den resulterende opløsning vaskes som beskrevet ovenfor. Opløsningen tørres, inddampes, remanensen tritureres med 2:8-blanding af ether og n-hexan, 10 og faststoffet filtreres fra. Det resulterende beskyttede (3) tetrapeptid, R^ = 0,36, opløses i 10 ml af en 8 N saltsyreopløsning i dioxan, og efter at det har stået i 15 minutter, (5) bundfældes det fri tetrapeptid-hydrochlorid, R^ = 0,27, med tør ether. Produktet opløses omgående i 20 ml dimethyl- 15 formamid, opløsningens pH-værdi indstilles på 8, og der tilsættes 3,24 g (6 mmol) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp. Opløsningen får lov at stå i 30 minutter, medens pH-værdien holdes på begyndelsesværdien, derefter afdampes opløsningsmidlet, og remanensen opløses i ethylacetat. Der sættes 0,22 ml N,N- 20 -dimethylamino-ethylamin til opløsningen, blandingen får lov at stå i 10 minutter, derefter vaskes den som beskrevet ovenfor, tørres og inddampes. Remanensen tritureres med n-hexan og filtreres. Det resulterende beskyttede pentapep- tid, - 0,64, opløses i 10 ml af en 8 N saltsyreopløsning 25 i dioxan, og efter at have stået i 15 minutter bundfældes (4) det fri pentapeptid-hydrochlorid, R^ '= 0,33, med tør ether. Produktet opløses i 15 ml dimethylformamid, opløsningens pH-værdi indstilles på 8 med triethylamin, og'der tilsættes 2,1 g (5,5 mmol) Boc-Val-OPfp. Opløsningen får lov at stå 30 i 30 minutter, medens pH-værdien holdes på begyndelsesværdien, derefter inddampes den, remanensen opløses i ethylacetat, og opløsningen vaskes som beskrevet ovenfor. Opløsningen tørres, inddampes, remanensen tritureres med n-hexan og filtreres derefter. Det resulterende beskyttede hexapep-35 tid, - 0,76, opløses omgående i 10 ml af en 8 N saltsyreopløsning i dioxan, og efter at det har stået i 15 minutter, (4) 149777

O

16 bundfældes det fri hexapeptid-hydrochlorid, = 0,34, med tør ether. Dette stof opløses i 20 ml dimethylformamid, opløsningens pH-værdi indstilles på 8, og der tilsættes 3,96 g (6 mmol) Boc-ArgiNC^-OPfp. Opløsningen får lov at stå 5 il time, medens pH-værdien holdes på begyndelsesværdien, derefter fortyndes det med 60 ml chloroform, vaskes som beskrevet ovenfor, tørres og inddampes. Remanensen triture- res med tør ethanol og filtreres. Det resulterende beskyttede (3) heptapeptid, R^ = 0,78, opløses i 10 ml af en 8 N saltsyre-10 opløsning i dioxan, og efter at have stået i 15 minutter, bundfældes produktet med tør ether. Det resulterende fri heptapeptid-hydrochlorid, R^^= 0,56, opløses omgående i 20 ml dimethylformamid, opløsningens pH-værdi indstilles på 8, og der tilsættes 2,12 g (5,5 mmol) Z-Sar-OPfp. Opløsningen 15 får lov at stå i 30 minutter, medens pH-værdien holdes på begyndelsesværdien, derefter fortyndes den med 60 ml chloroform og vaskes som beskrevet ovenfor. Opløsningen tørres, inddampes, remanensen tritureres med ethanol, og faststoffet omkrystalliseres fra ethanol. Der opnås 1,21 g (17,5% 20 beregnet på His? dette svarer til et udbytte på 75% på de individuelle trin) Z-Sar-Arg (NC^) -Val-Tyr (Bzl) -Ile-His (Dnp) --Pro-Lac-OEtj smp.: 208-212°C, 0,5.

Trin 3 25 Fjernelse af de beskyttende grupper 3 ml 2-mercaptoethanol sættes til en opløsning af 1,21 g (0,88 mmol) af det beskyttede octapeptid, fremstillet som beskrevet på trin 2, i 5 ml dimethylformamid. Blandingen omrøres i 1 time, derefter bundfældes produktet med tør ether, 30 filtreres og vaskes. Faststoffet opløses i methanol, og derefter bundfældes det igen med tør ether. Der opnås 0,94 g (89%) af det tilsvarende delvist beskyttede octapeptid, som (4) er frit for en beskyttende dinitrophenylgruppe, R£ = 0,59.

Dette stof opløses i 20 ml af en 5:1:1-blanding af methanol, 35 eddikesyre og vand, der tilsættes 0,5 g af en 10%'s palla- dium-på-carbon-katalysator, og hydrogen bobles igennem blandingen i 20 timer under kraftig omrøring. Reaktionens frem- 149777

O

17 adskriden overvåges ved tyndtlagschromatografi. Ved afslutningen af reaktionen filtreres katalysatoren fra, vaskes med den ovennævnte opløsningsmiddelblanding, filtratet og vaskevæsken kombineres og inddampes til tørhed. Remanensen 5 tritureres med en blanding af ethanol og ether og filtreres.

1 8

Der opnås 0,72 g (96%) (Sar ,Lac-OEt )-Ang-II.

Trin 4

Det rå fri peptid, der er opnået på ovennævnte trin, 10 renses i henhold til den almindelige fremgangsmåde beskrevet ovenfor. Det rene peptid har følgende fysiske konstanter:

Chroma tograf i ske konstanter: R^ = 0,24, R^= 0,53, R^= 0,36. Aminosyreanalyse: Pro 1,02 (1), Val 0,97 (1), Ile 1,08 (1),

Tyr 0,91 (1), His 1,00 (1), Arg 1,07 (1), Sar 1,0 (1).

15

Eksempel 3

Fremstilling af (sarcosin1,2-hydroxy-3-methylvaleriane- g ~ ' syre )-angiotensin-II Trin 1 20 Fremstilling af H-HMV-OBzl 20 ml af en 4 N saltsyreopløsning i ethylacetat sættes til en opløsning af 7,12 g (40 mmol) H-HMV-ONa i 10 ml ethylacetat. Blandingen omrøres i 2 timer, og derefter indstilles blandingens pH-værdi på 3 med triethylamin. Det udskilte 25 bundfald filtreres fra og vaskes to gange hver gang med 20 ml ethylacetat. Filtratets pH-værdi indstilles på 6 med triethylamin, og derefter tilsættes 8 ml (60 mmol) benzylbromid og 8,4 ml (60 mmol) triethylamin. Den resulterende blanding tilbagesvales i 8 timer, det udskilte uorganiske salt filtre-30 res fra, og filtratet vaskes succsessivt med vand, 1 N vandig saltsyre, en 5%'s vandig natriumhydrogencarbonatopløsning og derefter igen med vand. Opløsningen tørres, inddampes, og de resulterende 5,6 g (63%) H-HMV-OBzl renses ved destillation i vakuum. Produktet koger ved 134-136°C/5 mm Hg; [o]-13,9° 35 (c = 1%, i acetone

O

18 149777

Trin 2

Fremstilling af Boc-Pro-HMV-OBzl 3,2 g (20 mmol) carbonyldiimidazol sættes ved 0°C, i løbet af 10 minutter, til en opløsning af 2,7 g (12,5 mmol) ^ Boc-Pro-OH i 15 ml tørt tetrahydrofuran. En kold opløsning af 2,8 g (12,5 mmol) H-HMV-OBzl i 10 ml tetrahydrofuran tilsættes blandingen ved den samme temperatur, og den resulterende blanding omrøres ved 0°C i 30 minutter og derefter ved 20°C i 2 timer. Blandingen får lov at stå natten over 10 i et køleskab. Den næste dag afdampes tetrahydrofuran, remanensen opløses i 40 ml ethylacetat, og opløsningen vaskes successivt med 1 N vandig saltsyre (2x15 ml), vand, en 5%’s vandig natriumhydrogencarbonatopløsning og derefter igen med vand. Opløsningen tørres, inddampes, og den olieagtige remanens tørres indtil konstant vægt ved 25°C. Der opnås 3,19 g (65%) Boc-Pro-HMV-OBzl i R^ = 0,90, — 0,33.

Trin 3

Fremstilling af Z-Sar-Arg(N0o)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)- 20 * -Pro-HMV-OBzl 2,52 g (6 mmol) Boc-Pro-HMV-OBzl opløses i 8 ml af en 8 N saltsyreopløsning i dioxan, blandingen får lov at stå i 15 minutter, der tilsættes 30 ml tør ether, og blandingen inddampes til tørhed. Det fri dipeptid-hydrochlorid, 0,30, 25 * der opnås som remanens, opløses i 15 ml dimethylformamid, blandingens pH-værdi indstilles på 8 med triethylamin, og der tilsættes 2,9 g (5 mmol) Boc-His(dnp)-OPfp. Opløsningen får lov at stå i 1 time, medens pH-værdien holdes på begyndelsesværdien, derefter inddampes, og remanensen opløses i 30 ethylacetat. Denne opløsning vaskes successivt med 1 N vandig saltsyre, vand og en 5%,s vandig natriumhydrogencarbonatop- . løsning, tørres, inddampes, og det beskyttede tripeptid, (2)

Rji = 0,67, der opnås som remanens, opløses i 10 ml af en 8 N opløsning af saltsyre i dioxan. Efter at have stået i 35 20 minutter bundfældes det fri tripeptid-hydrochlorid, (4) R^ = 0,18, i 15 ml dimethylformamid, opløsningens pH-.værdi 149777

O

19 indstilles på 8 med triethylamin/ og der tilsættes 2,4 g (6 mmol) Boc-Ile-OPfp. Opløsningen får lov at stå i 1 time, medens pH-værdien holdes på begyndelsesværdien, derefter inddampes den, og remanensen opløses i chloroform. Denne op-^ løsning vaskes henholdsvis med vand, 1 N vandig saltsyre og en 5%'s vandig natriumhydrogencarbonatopløsning, tørres og inddampes. Det beskyttede tripeptid, der opnås som remanens, tritureres med n-hexan, n-hexan dekanteres, remanensen tri-tureres med tør ether og filtreres. Det resulterende beskyt-tede tripeptid, 0,65, opløses i 10 ml af en 8 N salt syreopløsning i dioxan, og efter at have stået i 15 minutter (4) bundfældes det fri tetrapeptid-hydrochlorid, = 0,27, med tør ether. Dette stof opløses i 15 ml dimethylformamid, opløsningens pH-værdi indstilles på 8, og der tilsættes 2,96 g 15 Boc-Tyr(Bzl)-OPfp. Opløsningen får lov at stå i 30 minutter, medens pH-værdien holdes på begyndelsesværdien, og derefter inddampes den. Remanensen opløses i ethylacetat, der sættes 0,22 ml Ν,Ν-dimethylamino-ethylamin til opløsningen, og efter at have stået i 10 minutter vaskes blandingen succes-20 sivt med en 10%'s vandig citronsyreopløsning, 1 N saltsyre og en 5%'s vandig natriumhydrogencarbonatopløsning. Opløsningen tørres, inddampes, remanensen tritureres med n-hexan og filtreres derefter. Det resulterende beskyttede pentapep- (3) tid, R^ = 0,75, opløses i 10 ml af en 8 N saltsyreopløsning 25 i dioxan, opløsningen får lov at stå i 15 minutter, og der- (4) efter bundfældes det fri pentapeptid-hydrochlorid, R^ - 0,66, med tør ether. Det resulterende stof opløses omgående i 20 ml dimethylformamid, opløsningens pH-værdi indstilles på 8, og der tilsættes 2,3 g (6 mmol) Boc-Val-OPfp. Den resulterende 30 opløsning får lov at stå i 1 time, medens pH-værdien holdes på begyndelsesværdien, derefter inddampes den, remanensen opløses'i chloroform, og chloroformopløsningen vaskes successivt med en 10%1 s vandig citronsyreopløsning, 1 N vandig saltsyre, en 5%'s vandig natriumhydrogencarbonatopløsning 35 og vand. Opløsningen tørres, inddampes, remanensen tritureres (3) med n-hexan, og det beskyttede hexapeptid, R^ \= 0,71, filtreres fra. Dette stof opløses i 10 ml af en 8 N saltsyreop- 149777 0 20 opløsning i dioxan, opløsningen får lov at stå i 15 minutter, og derefter bundfældes det fri hexapeptid-hydrochlorid, (4)

Rf = 0,34, med tør ether. Dette stof opløses omgående i 20 ml dimethylformamid, opløsningens pH-værdi indstilles 5 på 8, og der tilsættes 2,64 g (6 mmol) Boc-Arg(NC^)-OPFp. Opløsningen får lov at stå i 1 time, medens pH-værdien holdes på begyndelsesværdien, og inddampes derefter. Remanensen opløses i chloroform, opløsningen vaskes succsessivt med 10%'s vandig citronsyre indeholdende 10% dimethylforma-10 mid, 1 N vandig saltsyre, en 5%'s vandig natriumhydrogen-carbonatopløsning og vand, tørres og inddampes. Remanensen tritureres med en 8:2-blanding af ether og ethanol og fil- (3) treres. Det resulterende bekyttede heptapeptid, R£ = 0,63, opløses i 10 ml af en 8 N saltsyreopløsning i dioxan, og 15 efter at have stået i 15 minutter bundfældes det fri hepta-peptid-hydrochlorid, R^5^= 0,45, med tør ether. Produktet filtreres fra, vaskes, tørres, opløses i 20 ml dimethylformamid, opløsningens pH-værdi indstilles på 8, og der tilsættes 2,3 g (6 mmol) Z-Sar-OPfp. Opløsningen får lov at stå i 20 30 minutter, medens pH-værdien holdes på begyndelsesværdien, derefter fortyndes med 60 ml chloroform, vaskes med 1 N vandig saltsyre og vand, tørres og inddampes. Remanensen tritureres med en 8:2-blanding af ether og ethanol, faststoffet filtreres fra og vaskes. Der opnås 2,36 g (30% beregnet for 25 His, hvilket svarer til et udbytte på 82% på de individuelle trin) af Z-Sar-Arg(NO2)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(DNP)-Pro-HMV--OBzl; smp.: 193-202°C, R^3)= 0,30, R^4)= 0,86.

Trin 4 30 Fjernelse af de beskyttende grupper 2,8 ml 2-mercaptoethanol tilsættes en opløsning af 2,0 g (1,25 mmol) af det beskyttede octapeptid, fremstillet som beskrevet på trin 3, i 5 ml dimethylformamid. Blandingen omrøres i 1 time, derefter bundfældes produktet med tør ether, 35 vaskes med ether, opløses i methanol og bundfældes igen med ether. Der opnås 1,44 g (80%) af det delvist afbeskyttede 149777

O

21 octapeptid, frit for en dinitrophenylgruppe:, R^ = 0,41.

Dette stof opløses i 30 ml af en 5:2:1-blanding af methanol, eddikesyre og vand, der tilsættes 0,7 g af en 10%'s palladium--på-carbon-katalysator, og hydrogen bobles gennem blandingen 5 i 20 minutter under kraftig omrøring. Ved afslutningen af reaktionen filtreres katalysatoren fra, vaskes med 20 ml af ovennævnte opløsningsmiddelblanding, vaskevæsken og filtratet kombineres og inddampes til tørhed. Remanensen tritu-reres med en l:l-blanding af ethanol og ether og filtreres 10 derefter. Der opnås 0,65 g (67%) (sarcosin'*',L-2-hydroxy-3- 8 -methylvalerianesyre )-angiotensin-II.

Trin 5 Råproduktet, der er opnået som beskrevet på trin 4, 15 renses i henhold til den almindelige fremgangsmåde beskrevet ovenfor. Det rene produkt har følgende fysiske konstanter: Chromatografiske karakteristika: r!6^= 0,26, R^= 0,52, rW- 0,30.

Aminosyreanalyse: Pro 1,06 (1), Val 1,03 (1), Ile 1,03 (1), 20 Tyr 0,65 (1), His 0,99 (1), Arg 0,95 (1), Sar 1,0 (1).

Claims (1)

1. 22 140777 o Pate n t k r a v. Analogifremgangsmåde til fremstilling af et octa-peptid med angiotensin-II-antagoniserende virkninger og 5 med den almene formel (I) H- X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y-OA (I) hvori 10. står for resten af en aliphatisk N-methyl-a-Cp_^-amino- syre, fortrinsvis en sarcosylgruppe, Y er resten af en aliphatisk α-hydroxycarboxylsyre med 3-6 carbonatomer, fortrinsvis en mælkesyre- eller en L-2-15 -hydroxy-3-methylvalerianesyrerest, og A er hydrogen eller en C^_5~alkylgruppe, eller et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt eller kompleks deraf, kendetegnet ved, at man fjerner de beskyttende grupper i et beskyttet octapeptidderivat med den almene 20 formel (II) B-X-Arg(C)-Val-Tyr(D)-Ile-His(E)-Pro-Y-OF (II) hvori 25. er en gruppe, der kan omdannes til et hydrogenatom ved acidolyse eller katalytisk hydrogenering, fortrinsvis en benzyloxycarbonyl- eller tert.-butoxycarbonylgruppe, C er en gruppe til den midlertidige beskyttelse af guanidino-gruppen på Arg-delen, fortrinsvis en nitro- eller en tosyl-30 gruppe, D er en gruppe til den midlertidige beskyttelse af den aromatiske hydroxygruppe på Tyr-delen, fortrinsvis en benzyl- eller en substitueret benzylgruppe, E er en gruppe til den midlertidige beskyttelse af imidazol-35 gruppen på His-delen, fortrinsvis en dinitrophenylgruppe, og