CN112457372A

CN112457372A - 一种含半胱氨酸残基的多肽酰肼的合成方法及其应用

Info

Publication number: CN112457372A
Application number: CN202011373834.9A
Authority: CN
Inventors: 何春茂; 陈文韬; 莫泽源
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2021-03-09
Anticipated expiration: 2040-11-30
Also published as: CN112457372B

Abstract

本发明提供了一种含半胱氨酸残基的多肽酰肼的合成方法及其应用。本发明在目标多肽C端插入四半胱氨酸标签并用双砷荧光染料标记试剂特异性识别并结合该序列。用Pac基团保护目标多肽中的半胱氨酸巯基侧链，随后将双砷荧光染料标记试剂脱除，将四半胱氨酸标签序列氰基化肼解获得含半胱氨酸的多肽酰肼。本发明有助于完善自然化学连接反应，更有效地合成蛋白质。

Description

一种含半胱氨酸残基的多肽酰肼的合成方法及其应用

技术领域

本发明涉及多肽/蛋白质合成制备技术领域，具体涉及一种含半胱氨酸残基的多肽酰肼的合成方法及其应用。

技术背景

蛋白质作为一种生物体内的活性物质，在生命体中具有构成组织，催化，调节和免疫应答的作用，是生命活动的主要承担者。为了阐明蛋白质究竟是如何在生物体中发挥作用，并且将蛋白质进行修饰改进从而获得具有更多功能或者更高效率的重组蛋白，蛋白质合成的相关研究得到广泛的关注。

自然化学连接(Native Chemical Ligation,NCL)是一种能高效连接两段多肽的反应。该反应具体过程为N端多肽的半胱氨酸巯基侧链会进攻C端多肽硫酯的羰基碳，经硫酯转移作用形成由硫酯键连接的蛋白中间体。随后经S→N重排，获得完整多肽。如何高效率地获取C端多肽硫酯成为完善该反应的关键。目前获取多肽硫酯的获取方法主要有两种：1)内含肽C端氨基酸替换为丙氨酸，使内含肽切割环化过程终止，同时加入硫醇即可得到多肽硫酯。但内含肽的切割过程受内含肽折叠状态的影响；2)用固相多肽合成(SPPS)的方法获得多肽硫酯，但脱除Fmoc保护基会使得硫酯不稳定。针对以上缺陷，2011年刘磊课题组提出了用SPPS获得较易制得的多肽酰肼，用NaNO₂将其叠氮化，随后加入硫醇获得多肽硫酯的方法。由此，通过获取多肽酰肼制得多肽硫酯成为该类研究的新方向。

目前多肽酰肼的获取有多篇报道。文章(Angew.Chem.Int.Ed.2013,52:13062-13066)报道了Gly/His-Cys的序列在5％的N₂H₄·HOAc，60℃的条件下反应24h即可得到C端为Gly/His的多肽酰肼，但该方法受位点限制较大，且反应并不完全；文章(ChemistryOpen.2015,4,448-452)报道了多肽在含有10mM NiCl₂，pH 8.5的50％甲醇溶液中37℃反应3h，随后加入终浓度为5％的NH₂NH₂·H₂O即可获得以Ser为切割位点的多肽酰肼，然而该方法只能在非变性条件下反应，导致多肽的溶解度下降，并且无法获得含有Ser的多肽酰肼；文章(PeptideScience,2015,106,531-546)报道了将多肽中的Cys巯基侧链氰基化，加入NH₂NH₂·H₂O肼解即可获得以Cys为切割位点的多肽酰肼，然而该方法无法获取含有Cys的多肽酰肼，针对该不足，该报道利用Zn²⁺特异性识别并结合锌指结构实现了半胱氨酸的选择性保护。锌指序列具有较多氨基酸残基，且实现Zn²⁺保护需要在非变性条件下操作，然而，多数多肽/蛋白质在非变性条件下溶解性并不高，因此需要寻找另一种方法实现选择性保护半胱氨酸并制得相应的多肽酰肼。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有方法的缺点与不足，提供一种含半胱氨酸残基的多肽酰肼的合成方法。

本发明的另一目的在于提供上述含半胱氨酸残基的多肽酰肼的合成方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种含半胱氨酸残基的多肽酰肼的合成方法，是利用双砷染料标记试剂和四半胱氨酸标签的特异性结合，实现半胱氨酸残基侧链的选择性保护，双砷染料标记试剂脱除后将四半胱氨酸标签中的半胱氨酸残基氰基化并肼解，即可获得含有半胱氨酸残基的多肽酰肼；具体操作优选包括如下步骤：

(1)将C端插入四半胱氨酸标签的含半胱氨酸目标多肽溶于缓冲液A中，加入二硫键还原剂，反应；随后加入双砷染料标记试剂溶液，反应，透析除去多余的双砷染料标记试剂溶液，得到多肽反应液A；荧光染料标记试剂会特异性共价结合四半胱氨酸标签，从而选择性保护多肽的四半胱氨酸标签上的半胱氨酸；

(2)将步骤(1)得到的多肽反应液A加入到2-溴苯乙酮(PacBr)溶液中，反应；透析除去多余的溴苯乙酮，得到多肽反应液B；溴苯乙酮会与含半胱氨酸目标多肽段上的半胱氨酸巯基侧链反应，得到的是具有两种正交基团保护的多肽；

(3)在步骤(2)得到的多肽反应液B中加入乙二硫醇(EDT)，反应；反应液纯化，得到反应产物M；乙二硫醇会脱去结合于四半胱氨酸标签上的荧光染料标记试剂；

(4)将步骤(3)得到的反应产物M加入到N-氰-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐(CDAP)溶液中，反应；反应液纯化，得到反应产物N；N-氰-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐会使四半胱氨酸标签上各半胱氨酸巯基侧链氰基化；

(5)将水合肼(NH₂NH₂·H₂O)与缓冲液B混合，得到水合肼溶液；将步骤(4)得到的反应产物N加入到所述的水合肼溶液中，反应；反应液纯化，获得目标产物。所述目标产物是含有Pac基团保护半胱氨酸的多肽酰肼，可将多肽溶于7.5％v/v的2-巯基丙酸(MPA)溶液，加入Zn粉脱去Pac基团，反向HPLC制备纯化得到不含Pac保护半胱氨酸的多肽酰肼。若不加水合肼，多肽产物可能会与溶液中的氢氧根反应进而产生水解的副反应。

步骤(1)中所述的四半胱氨酸标签含如下氨基酸序列：CCXCC，其中，所述C表示半胱氨酸，所述X表示除半胱氨酸以外的任意数量及任意种类的氨基酸；优选地，所述X表示除半胱氨酸以外的两个任意种类的氨基酸；更优选地，所述的四半胱氨酸标签含如下氨基酸序列：CCPGCC。

步骤(1)中所述的含半胱氨酸目标多肽不能含有CCXCC序列。

步骤(1)中所述的缓冲液A的组成优选如下：5～7mol/L GdmCl，0.1～0.3mol/LNa₂HPO₄，0.5～2mmol/L EDTA，pH＝7.3～7.5；更优选如下：6mol/L GdmCl，0.2mol/LNa₂HPO₄，1mmol/L EDTA，pH＝7.4，其中，所述GdmCl为盐酸胍，CAS号：50-01-1。

步骤(1)中所述的缓冲液A的用量，优选按含半胱氨酸目标多肽在体系中的浓度为0.5～2mmol/L计；更优选按1mmol/L计。

步骤(1)中所述的二硫键还原剂优选为磷酸三(2-氯乙基)(TCEP)。

步骤(1)中所述的二硫键还原剂的用量优选按其在体系中的终浓度为8～12mmol/L计；更优选按10mmol/L计。

步骤(1)中所述的加入二硫键还原剂后的反应的条件，优选为35～40℃下震荡反应20～50min；更优选为37℃下震荡反应30min。

步骤(1)中所述的双砷荧光染料标记试剂包括但不限于FLAsH-EDT₂、F2FLAsH-EDT₂、F4FLAsH-EDT₂和ReAsH-EDT₂中的任意一种；优选为FLAsH-EDT₂。所述的FLAsH-EDT₂能特异性识别-CCXXCC-序列，该化合物上面的两个砷原子分别能与半胱氨酸的侧链巯基共价结合，其结构式如下所示：

步骤(1)中所述的双砷荧光染料标记试剂溶液的用量，优选按含半胱氨酸目标多肽在体系中的终浓度为0.5～2mmol/L计；更优选按1mmol/L计。

步骤(1)中所述的双砷荧光染料标记试剂溶液是由双砷荧光染料标记试剂溶解于有机溶剂中得到，双砷荧光染料标记试剂的用量按1倍当量四半胱氨酸标签的量计。所述的有机溶剂包括DMSO、DMF等。

步骤(1)中所述的加入双砷荧光染料标记试剂后的反应的条件，优选为室温避光搅拌反应20～50min；更优选为室温避光搅拌反应30min。本发明中所述室温是指20℃～30℃。

步骤(1)中所述的C端连接有四半胱氨酸标签的含半胱氨酸目标多肽可以通过固相多肽合成方法制备或生物表达获取。

步骤(2)中所述的2-溴苯乙酮溶液的用量，优选按含半胱氨酸目标多肽在体系中的终浓度为15～25mmol/L；更优选按20mmol/L计。

步骤(2)中所述的2-溴苯乙酮溶液是由2-溴苯乙酮溶解于乙腈中得到，溴苯乙酮的用量视含半胱氨目标多肽中含有半胱氨酸的量而定，优选按5～15倍当量半胱氨酸的量计；更优选按10倍当量半胱氨酸的量计。

步骤(2)中所述的反应的条件优选为室温避光搅拌反应20～50min；更优选为室温避光搅拌反应30min。

步骤(1)、步骤(2)中所述的透析所用透析液组成均优选如下：5～7mol/L GdmCl，0.1～0.3mol/L Na₂HPO₄，pH＝7.4～7.6；更优选组成如下：6mol/L GdmCl，0.2mol/LNa₂HPO₄，pH＝7.5。

步骤(3)中所述的乙二硫醇的用量优选按其在体系中的终浓度为25～35mmol/L计；更优选按30mmol/L计。

步骤(3)中所述的反应的条件优选为室温搅拌反应至荧光现象消失为止。

步骤(4)中所述的N-氰-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐溶液的用量，优选按40倍当量含半胱氨酸目标多肽的量计。

步骤(4)中所述的N-氰-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐溶液是由N-氰-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐溶解于含有0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈溶液中得到，浓度优选为35～45mmol/L；更优选浓度为40mmol/L。

步骤(4)中所述的反应的条件优选为35～40℃下震荡反应20～50min；更优选为37℃的下震荡反应30min。

步骤(5)中所述的水合肼、缓冲液B的配比优选按水合肼浓度为400～600mmol/L计，更优选按浓度为500mmol/L计。

步骤(5)中所述的缓冲液B组成优选如下：5～7mol/L GdmCl，0.1～0.3mol/LNa₂HPO₄，pH＝8.5～9.5；更优选如下：6mol/L GdmCl，0.2mol/L Na₂HPO₄，pH＝9。

步骤(5)中所述的水合肼溶液的用量，优选按含半胱氨酸目标多肽在体系中的终浓度为500mmol/L计。此浓度远远过量，保证不会发生水解副反应。

步骤(5)中所述的反应的条件优选为35～40℃下震荡反应3～5h；更优选为在37℃的条件下震荡反应4h。

步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)中所述的纯化均优选通过反向液相色谱(HPLC)实现；所述反向液相色谱流动相为含0.1％三氟乙酸的乙腈/水混合液。

上述含半胱氨酸多肽酰肼的合成方法在多肽/蛋白质合成中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明利用了-CCPGCC-序列与FLAsH-EDT₂特异性共价结合的特性，将以往用于荧光显色的标签用作选择性保护目标多肽半胱氨酸巯基侧链的方法，大大缩短了表达或合成肽链的长度，为多肽酰肼的合成提供了新的路径以及拓宽了双砷荧光染料标记试剂的应用范围。并且该方法能通过是否具有荧光现象直观地监测四半胱氨酸标签是否被保护。

本发明还实现了在变性条件中选择性保护半胱氨酸。本发明对于-CCPGCC-序列的保护以及对于目标多肽用Pac基团保护均处于6mol/L GdmCl的溶液中，提高了多肽的溶解性，提高了获取多肽酰肼的产率以及效率。为接下来的自然化学连接及相关反应的研究奠定了基础。

附图说明

图1为对ASHC4实施选择性氰基化半胱氨酸并肼解策略完整流程的HPLC示意图。

图2为ASHC4原料的MALDI示意图。

图3为ASHC4加入FLAsH-EDT2反应30分钟后产物的MALDI-TOF示意图。

图4为ASHC4-FLAsH耦合物加入ParBr反应30分钟后产物的MALDI-TOF示意图。

图5为ASHC4-FLAsH-Pac耦合物加入EDT反应至荧光消失后产物的MALDI-TOF示意图。

图6为ASHC4-Pac耦合物加入CDAP反应30min后产物的MALDI-TOF示意图。

图7为氰基化的ASHC4-Pac耦合物肼解反应30min后产物的MALDI-TOF示意图。

图8为使用本发明方法制得的Rubredoxin F1多肽酰肼的MALDI-TOF示意图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的FLAsH-EDT₂(CAS编号212118-77-9)的结构式如下：

下述实施例中HPLC使用的仪器为安捷伦1260，色谱柱为Phenomenex C18柱，流动相为水和乙腈(含0.1％TFA)。

下述实施例中用到的试剂名称及缩写：

EDTA：乙二胺四乙酸

TCEP：磷酸三(2-氯乙基)酯

PacBr：溴苯乙酮

EDT：乙二硫醇

CDAP：N-氰-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐

ACN：乙腈

TFA：三氟乙酸

NH₂NH₂·H₂O：水合肼

MPA：2-巯基丙酸

下述实施例中以ASHC4模拟肽作为目标多肽时，在其氨基酸序列的C端依次连接四半胱氨酸标签CCPGCC和模拟其他标签的额外序列AKA，并通过固相多肽合成方法获取，最终得到的多肽片段(命名为ASHC4-CCPGCC-AKA)的氨基酸序列为：YLCASLSKLA-CCPGCC-AKA；

下述实施例中以红素氧还蛋白(Rubredoxin)F1作为目标多肽时，在其氨基酸序列的C端依次连接四半胱氨酸标签CCPGCC和组氨酸标签HHHHHH(His₆)，并通过生物表达获取，最终得到的多肽片段(命名为Rubredoxin F1--CCPGCC-H6)的氨基酸序列为：MAKWVCKIAGYIYDEDAGDPDNGISPGTKFEELPDDWG-CCPGCC-HHHHHH。

实施例1：ASHC4模拟肽多肽酰肼的合成

(1)溶解多肽并还原处理

将合成的ASHC4-CCPGCC-AKA溶于6mol/L GdmCl，0.2mol/L Na₂HPO₄，1mmol/LEDTA，pH 7.4的缓冲液中配成1mmol/L的多肽溶液，加入终浓度为10mmol/L的TCEP，在37℃条件下震荡反应30min，确保多肽内与多肽间不会形成二硫键。可用反向HPLC监测，在方法25％-45％in20min(ACN浓度从25％在20分钟内升至45％)中根据是否只出现目标分子峰判断反应是否完成。

(2)多肽与FLAsH-EDT₂耦合反应

取上述溶液，加入溶于DMSO的FLAsH-EDT₂至多肽终浓度为1mmol/L，在室温，避光条件下搅拌反应30min，使用反向HPLC与MALDI-TOF监测反应。反应完毕后FLAsH结合于-CCPGCC-序列，溶液应变为荧光黄色，并在365nm紫外灯照射下呈现荧光现象，此外能闻到脱落下来的EDT具有的刺激性气味。将反应混合液过夜透析至6mol/L GdmCl，0.2mol/LNa₂HPO₄，pH 7.5的缓冲液中，透析除去TCEP和EDT。

HPLC监测结果显示目标产物可能为多个具有相同分子量的产物峰，这些产物峰为目标产物的异构体，属于正常现象。

上述FLAsH-EDT₂加入的量应为1倍当量四半胱氨酸标签。

(3)多肽-FLAsH耦合物与PacBr反应

取出透析液，加入溶于ACN的PacBr至多肽终浓度为20mmol/L，在室温，避光条件下搅拌反应30min，使用反向HPLC与MALDI-TOF监测反应。反应完毕后Pac基团会结合于剩余的半胱氨酸巯基侧链。将反应混合液过夜透析至6mol/L GdmCl，0.2mol/L Na₂HPO₄，pH7.0的缓冲液中，除去过量的PacBr。

上述PacBr加入的量视多肽中含有半胱氨酸的量而定，应为10倍当量半胱氨酸的量。

(4)FLAsH脱除反应

取出上述透析液，加入终浓度为30mmol/L的EDT，在室温条件下搅拌反应至荧光现象消失，使用反向HPLC与MALDI-TOF监测反应。反应后溶液呈橙色，并出现浑浊现象。离心除去沉淀后使用反向HPLC进行制备纯化，冷冻干燥，称重，在-20℃的环境下保存。

上述脱除FLAsH步骤后，在实施例2中可能观测到的异构现象会消失，目标产物重新归为单峰。

上述纯化制备出来的多肽耦合物可能会呈现橙色，属于正常现象。

(5)多肽耦合物氰基化反应

称量CDAP，将CDAP溶解于含有0.1％TFA的乙腈溶液中，配成40mmol/L的CDAP溶液，再将该CDAP溶液溶解上述制备出来的多肽耦合物，CDAP溶液的用量按40倍当量多肽的量计；在37℃的条件下震荡反应30min，用反向HPLC及MALDI-TOF监测反应。此时-CCPGCC-序列中各半胱氨酸巯基会被氰基化。用反向HPLC制备纯化，冷冻干燥，并保存于-20℃的环境中。

上述氰基化反应完毕后应尽快处理反应混合液，CDAP在溶液中反应过长时间会造成副反应的发生。

(6)多肽耦合物肼解反应

在6mol/L GdmCl，0.2M Na₂HPO₄，pH 9.0的缓冲溶液中加入NH₂NH₂·H₂O，配成500mmol/L的水合肼溶液，将该溶液溶解上述氰基化的多肽耦合物；在37℃的条件下震荡反应4h，用反向HPLC以及MALDI-TOF监测反应。反应完毕后制得以四半胱氨酸标签作为切割位点的多肽酰肼。用反向HPLC制备纯化，冷冻干燥，称重计算产率为54％，并保存于-20℃的环境中。

制得的多肽酰肼中半胱氨酸的巯基侧链仍被Pac基团所保护，可将多肽溶于7.5％的MPA溶液，加入Zn粉脱去Pac基团，反向HPLC制备纯化得到不含Pac保护半胱氨酸的多肽酰肼。

实施例2:Rubredoxin F1多肽酰肼的合成

参照实施例1的方法，制备得到Rubredoxin F1多肽酰肼，图8为产物的MALDI-TOF示意图，产率为48％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120>一种含半胱氨酸残基的多肽酰肼的合成方法及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASHC4模拟肽氨基酸序列

<400> 1

Tyr Leu Cys Ala Ser Leu Ser Lys Leu Ala Cys Cys Pro Gly Cys Cys

1 5 10 15

Ala Lys Ala

<210> 2

<211> 50

<212> PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>红素氧还蛋白（Rubredoxin）F1氨基酸序列

<400> 2

Met Ala Lys Trp Val Cys Lys Ile Ala Gly Tyr Ile Tyr Asp Glu Asp

1 5 10 15

Ala Gly Asp Pro Asp Asn Gly Ile Ser Pro Gly Thr Lys Phe Glu Glu

20 25 30

Leu Pro Asp Asp Trp Gly Cys Cys Pro Gly Cys Cys His His His His

35 40 45

His His

50

Claims

1.一种含半胱氨酸残基的多肽酰肼的合成方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将C端插入四半胱氨酸标签的含半胱氨酸目标多肽溶于缓冲液A中，加入二硫键还原剂，反应；随后加入双砷染料标记试剂溶液，反应，透析除去多余的双砷染料标记试剂溶液，得到多肽反应液A；

(2)将步骤(1)得到的多肽反应液A加入到2-溴苯乙酮溶液中，反应；透析除去多余的溴苯乙酮，得到多肽反应液B；

(3)在步骤(2)得到的多肽反应液B中加入乙二硫醇，反应；反应液纯化，得到反应产物M；

(4)将步骤(3)得到的反应产物M加入到N-氰-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐溶液中，反应；反应液纯化，得到反应产物N；

(5)将水合肼与缓冲液B混合，得到水合肼溶液；将步骤(4)得到的反应产物N加入到所述的水合肼溶液中，反应；反应液纯化，获得目标产物；

其中，步骤(1)中所述的四半胱氨酸标签含如下氨基酸序列：CCXCC，其中，所述C表示半胱氨酸，所述X表示除半胱氨酸以外的任意数量及任意种类的氨基酸。

2.根据权利要求1所述的含半胱氨酸残基的多肽酰肼的合成方法，其特征在于：

所述X表示除半胱氨酸以外的两个任意种类的氨基酸；

步骤(1)中所述的双砷荧光染料标记试剂包括但不限于FLAsH-EDT₂、F2FLAsH-EDT₂、F4FLAsH-EDT₂和ReAsH-EDT₂中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的含半胱氨酸残基的多肽酰肼的合成方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的缓冲液A的组成如下：5～7mol/L GdmCl，0.1～0.3mol/L Na₂HPO₄，0.5～2mmol/L EDTA，pH＝7.3～7.5；

步骤(5)中所述的缓冲液B组成如下：5～7mol/L GdmCl，0.1～0.3mol/L Na₂HPO₄，pH＝8.5～9.5；

步骤(1)、步骤(2)中所述的透析所用透析液组成均如下：5～7mol/L GdmCl，0.1～0.3mol/L Na₂HPO₄，pH＝7.4～7.6；

其中，所述GdmCl为盐酸胍，CAS号：50-01-1。

4.根据权利要求3所述的含半胱氨酸残基的多肽酰肼的合成方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的缓冲液A的组成如下：6mol/L GdmCl，0.2mol/L Na₂HPO₄，1mmol/LEDTA，pH＝7.4；

步骤(5)中所述的缓冲液B组成如下：6mol/L GdmCl，0.2mol/L Na₂HPO₄，pH＝9；

步骤(1)、步骤(2)中所述的透析所用透析液组成均如下：6mol/L GdmCl，0.2mol/LNa₂HPO₄，pH＝7.5。

5.根据权利要求1所述的含半胱氨酸残基的多肽酰肼的合成方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的二硫键还原剂为磷酸三(2-氯乙基)；

步骤(1)中所述的双砷荧光染料标记试剂溶液是由双砷荧光染料标记试剂溶解于有机溶剂中得到，双砷荧光染料标记试剂的用量按1倍当量四半胱氨酸标签的量计；

步骤(2)中所述的2-溴苯乙酮溶液是由2-溴苯乙酮溶解于乙腈中得到，溴苯乙酮的用量按含半胱氨目标多肽中含有半胱氨酸的量的5～15倍当量计；

步骤(4)中所述的N-氰-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐溶液是由N-氰-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐溶解于含有0.1％三氟乙酸的乙腈溶液中得到，浓度为35～45mmol/L；

步骤(5)中所述的水合肼、缓冲液B的配比按水合肼浓度为400～600mmol/L计。

6.根据权利要求1所述的含半胱氨酸残基的多肽酰肼的合成方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的二硫键还原剂的用量按其在体系中的终浓度为8～12mmol/L计；

步骤(1)中所述的双砷荧光染料标记试剂溶液的用量，按含半胱氨酸目标多肽在体系中的终浓度为0.5～2mmol/L计；

步骤(2)中所述的2-溴苯乙酮溶液的用量，按含半胱氨酸目标多肽在体系中的终浓度为15～25mmol/L计；

步骤(3)中所述的乙二硫醇的用量按其在体系中的终浓度为25～35mmol/L计；

步骤(4)中所述的N-氰-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐溶液的用量按40倍当量含半胱氨酸目标多肽的量计；

步骤(5)中所述的水合肼溶液的用量，按含半胱氨酸目标多肽在体系中的终浓度为500mmol/L计。

7.根据权利要求1所述的含半胱氨酸残基的多肽酰肼的合成方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的加入二硫键还原剂后的反应的条件为35～40℃下震荡反应20～50min；

步骤(1)中所述的加入双砷荧光染料标记试剂后的反应的条件为室温避光搅拌反应20～50min；

步骤(2)中所述的反应的条件为室温避光搅拌反应20～50min；

步骤(3)中所述的反应的条件为室温搅拌反应至荧光现象消失为止；

步骤(4)中所述的反应的条件为35～40℃下震荡反应20～50min；

步骤(5)中所述的反应的条件为35～40℃下震荡反应3～5h。

8.根据权利要求1所述的含半胱氨酸残基的多肽酰肼的合成方法，其特征在于：

步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)中所述的纯化通过反向液相色谱实现；所述反向液相色谱流动相为含0.1％三氟乙酸的乙腈/水混合液。

9.根据权利要求1所述的含半胱氨酸残基的多肽酰肼的合成方法，其特征在于：

所述的合成方法还包括如下步骤：

(6)：将步骤(5)得到的目标产物加入到7.5％v/v 2-巯基丙酸水溶液中，再加入锌粉，反应；反应液纯化，得到不含任何保护基团的多肽酰肼。

10.权利要求1～9任一项所述的含半胱氨酸残基的多肽酰肼的合成方法在多肽/蛋白质合成中的应用。