CN110590911A - 一种含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法及其应用。本发明方法采用Fmoc固相多肽合成法，以Fmoc氨基树脂为载体，根据包含酪氨酸硫酸化修饰位点的多肽序列，从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸，获得线性肽氨基树脂；其中，酪氨酸侧链硫酸根采用新戊基作为保护基，半胱氨酸侧链采用三苯甲基和/或乙酰胺甲基作为保护基；然后通过合适的试剂除去侧链保护基和将目标多肽从树脂裂解下来并纯化，即得到含酪氨酸硫酸化修饰的多肽。本发明有助于我们研究酪氨酸硫酸化修饰对多肽生物活性的影响及相关机理，为相关疾病诊断及治疗奠定了良好的基础。

Description

一种含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法及其应用
技术领域
本发明涉及多肽合成制备技术领域，具体涉及一种含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法及其应用。
背景技术
蛋白质酪氨酸硫酸化(protein tyrosine sulfation,PTS)是一个普遍的翻译后修饰，无机硫酸盐与生物分子的结合在生物体系中具有重要作用。有研究者对Anophelin蛋白进行了双重硫酸化修饰，结果显示，这种修饰导致其凝血酶抑制活性增强了100倍(Watson,E.E.；Liu,X.；Thompson,R.E.ACS.Cent.Sci.2018,4,468-476)。因此，蛋白质酪氨酸硫酸化修饰对其生物活性的影响尤为重要。
芋螺毒素被誉为“海洋药物宝库”，它是一种来源于海洋芋螺中具有生物活性的环状多肽化合物。截至目前，已经从海洋芋螺中发现了上千种芋螺毒素，其药用活性已经成为当今生物医药领域研究的热点之一，其中ω-芋螺毒素MVIIA(齐考诺肽)已被美国FDA批准上市。α-芋螺毒素是人们最早发现的芋螺毒素种类，一般由12～19个氨基酸组成。α-芋螺毒素的半胱氨酸序列模式为CC-C-C，其二硫键成键方式为Cys1-Cys3和Cys2-Cys4。α4/7-芋螺毒素是α-芋螺毒素的亚家族，其二、三及三、四位半胱氨酸间氨基酸残基数量分别为4与7。α4/7-芋螺毒素能特异性阻断神经型乙酰胆碱受体，因此可通过研究它们之间的相互作用来揭示其在相关神经疾病，如阿尔兹海默症等诊疗中的应用潜能。
α-芋螺毒素EpI、AnIA、AnIB、AnIC、PnIA和PnIB分别来源于芋螺Conusepiscopatus，Conus anemones以及Conus pennaceu。其中，α-芋螺毒素EpI能特异性地与α3β2、α3β4乙酰胆碱受体相互作用，近期的研究表明它也很可能选择性抑制α7受体(Nicke.A.FEBS.Lett,2003,554,219-223.)，具有潜在的药用价值，在此之前，有其他研究者通过高分辨质谱等手段发现EpI的15号位酪氨酸残基会伴有酪氨酸硫酸化修饰(Loughnan,M.J.Biol.Chem.1998,273,15667-15674.)，但该修饰对EpI与乙酰胆碱受体间相互作用的影响尚不明确。与EpI类似，α-芋螺毒素PnIA和PnIB的15号位酪氨酸残基也存在硫酸化修饰，研究者试图通过化学合成的方法来得到含硫酸化修饰的PnIA和PnIB，但并未成功(Wolfender,J.L.J.Mass.Spectrom.1999,34,447-454.)。此外PnIA和PnIB均能特异性地与乙酰胆碱α3β2，α7受体结合，其中PnIA对α3β2受体抑制能力更强，而PnIB则能更好的抑制α7受体，同时PnIA的某些单个关键氨基酸残基对其乙酰胆碱受体靶向性有决定性影响(Luo,S.Biochemistry.1999,38,14542-14548.)，因此它是一种非常有潜力的药用毒素多肽。此外，α-芋螺毒素AnIA、AnIB、AnIC也存在酪氨酸硫酸化修饰，研究表明AnIB的16号位酪氨酸残基带有硫酸化修饰时能增强其与乙酰胆碱α7和α3β2受体的亲和力，其中对α7亲和力的影响更加显著(Wolfender,J.L.J.Med.Chem.2004,47,1234-1241)。因此，我们推测硫酸化修饰在α-芋螺毒素的乙酰胆碱亚型选择性及亲和力方面扮演着重要的作用。
截止目前为止，尚未有通过化学合成方法来得到含酪氨酸硫酸化修饰的芋螺毒素，其获取方法一般采用毒液分离法，这种方法过程复杂、成本高、并且产率较低，不适合大规模制备及应用。因此，开发出一种全新的、简便的、可实现规模化制备的化学方法来获得酪氨酸硫酸化修饰的α-芋螺毒素，对于研究该修饰对α-芋螺毒素的乙酰胆碱受体亚型选择性和亲和力的影响以揭示其一般性机制，为α-芋螺毒素的相关神经疾病诊断及治疗奠定基础。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法。
本发明的另一目的在于提供上述含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法，包括如下步骤：
(1)采用Fmoc固相多肽合成法，以Fmoc氨基树脂为载体，根据包含酪氨酸硫酸化修饰位点的多肽序列，从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸，获得线性肽氨基树脂；其中，Fmoc保护酪氨酸侧链的硫酸根采用新戊基作为保护基；Fmoc保护半胱氨酸侧链采用三苯甲基(Trt)和/或乙酰胺甲基(Acm)作为保护基；
(2)将所得线性肽氨基树脂进行切割，使肽链从Fmoc氨基树脂上脱下并脱除除新戊基和Acm保护基之外的侧链保护基；经过滤、旋干、萃取、离心、冻干，得到线性肽粗品；进一步分离纯化，得到线性肽；
(3)将步骤(2)所得线性肽进一步裂解；如果Fmoc保护半胱氨酸侧链没有采用Acm作为保护基，则脱除酪氨酸侧链的新戊基；如果Fmoc保护半胱氨酸侧链有采用Acm作为保护基，则分别脱除酪氨酸侧链的新戊基和半胱氨酸侧链的Acm保护基；分离纯化，得到含酪氨酸硫酸化修饰的多肽；其中，脱除酪氨酸侧链的新戊基的试剂为碳酸氢铵(NH4HCO3)溶液、碳酸氢铵和铁氰化钾(K3Fe(CN)6)混合液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或纯水溶液。
步骤(3)中所述的NH4HCO3溶液优选为0.1mol/L、pH＝8.4的NH4HCO3溶液。
步骤(3)中所述的NH4HCO3和K3Fe(CN)6混合液优选为10mmol/L K3Fe(CN)6、0.1mol/L NH4HCO3、pH＝8.4的混合液。
步骤(3)中所述的磷酸盐缓冲液优选为0.1mol/L、pH＝6.5的磷酸盐缓冲液。
步骤(3)中所述的Tris缓冲液优选为50mmol/L、pH＝8的Tris缓冲液。
当步骤(1)中所述的包含酪氨酸硫酸化修饰位点的多肽序列包含一或二个半胱氨酸时，在步骤(1)中，Fmoc保护半胱氨酸侧链采用Trt作为保护基；在步骤(3)中，将步骤(2)所得的线性肽进一步裂解，脱除酪氨酸侧链的新戊基。
当步骤(1)中所述的包含酪氨酸硫酸化修饰位点的多肽序列包含形成二硫键的两对半胱氨酸时，在步骤(1)中，两组Fmoc保护半胱氨酸侧链分别采用Trt和Acm作为保护基，同组的半胱氨酸连接相同保护基；在步骤(3)中，脱除酪氨酸侧链的新戊基的同时氧化折叠所得线性肽，形成第一对二硫键；脱除半胱氨酸侧链的Acm保护基的同时进一步氧化折叠，形成第二对二硫键。
在所述的脱除酪氨酸侧链的新戊基的同时氧化折叠所得线性肽步骤中，所用的试剂优选为NH4HCO3溶液或NH4HCO3和K3Fe(CN)6混合液；更优选为，当所述的多肽为α-芋螺毒素EpI、AnIC、PnIA或PnIB时，所用的试剂为NH4HCO3溶液；当所述的多肽为α-芋螺毒素AnIA或AnIB时，所用的试剂为K3Fe(CN)6和NH4HCO3混合液；最优选为，当所述的多肽为α-芋螺毒素EpI、AnIC、PnIA或PnIB时，所用的试剂为0.1mol/L、pH＝8.4的NH4HCO3溶液；当所述的多肽为α-芋螺毒素AnIA或AnIB时，所用的试剂为10mmol/L K3Fe(CN)6、0.1mol/L NH4HCO3、pH＝8.4的混合液。
在所述的脱除酪氨酸侧链的新戊基的同时氧化折叠所得线性肽步骤中，反应条件优选为室温下振荡反应12～96h。
所述的室温是指20～30℃。
在所述的脱除半胱氨酸侧链的Acm保护基的同时进一步氧化折叠步骤中，具体操作为：将脱除酪氨酸侧链的新戊基后的溶液进行酸化处理，加入I2/MeOH溶液或I2/50％AcOH溶液，反应，清除I2。
所述的酸化处理优选为加入盐酸至体系的pH为1～3。
所述的I2/MeOH溶液优选为0.1mol/L I2/MeOH溶液。
所述的I2/50％AcOH溶液优选为0.01mol/L I2/50％AcOH溶液。
所述的I2/MeOH溶液或I2/50％AcOH溶液的添加量优选为添加至体系呈黄色或棕色沉淀。
所述的清除I2所用的试剂优选为抗坏血酸；更优选为1mol/L抗坏血酸。
所述的抗坏血酸的添加量优选为添加至体系黄色褪去或沉淀消失。
所述的反应条件优选为振荡反应0.5～1min；更优选为振荡反应1min。
步骤(3)中所述的分离纯化优选通过反向液相色谱实现。
步骤(1)中所述的多肽优选为α-芋螺毒素；更优选为α-芋螺毒素EpI、AnIA、AnIB、AnIC、PnIA或PnIB。所述多肽序列中均包含形成二硫键的两对半胱氨酸。
步骤(1)中所述的包含酪氨酸硫酸化修饰位点的多肽序列优选为以下情形中的一种，其中sY表示酪氨酸硫酸化修饰位点：
EpI[Y15sY]：GCCSDPRCNMNNPDsYC；
AnIA[Y14sY]：CCSHPACAANNQDsYC；
AnIB[Y16sY]：GGCCSHPACAANNQDsYC；
AnIC[Y16sY]：GGCCSHPACFASNPDsYC；
PnIA[Y15sY]：GCCSLPPCAANNPDsYC；
PnIB[Y15sY]：GCCSLPPCALSNPDsYC。
步骤(1)中从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸的具体操作为：在偶联体系作用下先将第1位氨基酸和Fmoc氨基树脂反应生成氨基酸-氨基树脂，再逐一偶联其它Fmoc保护氨基酸，获得线性肽氨基树脂；
所述的偶联体系中的Fmoc脱保护试剂优选为20％哌啶/DMF。
所述的偶联体系中的Fmoc脱保护反应时间优选为5～10min。
所述的偶联体系中的缩合剂优选为HOBT+DIC或TBTU+DIEA。
步骤(1)中所述的氨基树脂优选为Rink Amide MBHA树脂。
步骤(1)中所述的氨基树脂的负载量优选为0.2～0.8mmoL/g。
步骤(1)中所述的Fmoc保护酪氨酸化学式为Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH，其结构式如下：
所述的Fmoc-L-Tyr(OSO3nP)-OH的用量优选按Fmoc氨基树脂：Fmoc-L-Tyr(OSO3nP)-OH＝1：2的摩尔比计算。
所述的Fmoc-L-Tyr(OSO3nP)-OH与Fmoc氨基树脂的偶联时间优选为2～12h；更优选为12h。
除酪氨酸以外的所述的Fmoc保护氨基酸的用量优选按Fmoc氨基树脂：Fmoc保护氨基酸＝1：4的摩尔比计算。
除酪氨酸以外的所述的Fmoc保护氨基酸与Fmoc氨基树脂的偶联时间优选为2～4h；更优选为2h。
步骤(2)中所述的切割的试剂优选为TFA、H2O和DODT按TFA：H2O：DODT＝95：2.5：2.5的体积比配比得到的溶液。在该裂解试剂中，实现除新戊基和Acm保护基之外的所有保护基的脱除。
步骤(2)中所述的切割的时间优选为2～4h。
步骤(2)中所述的萃取的萃取剂优选为冰乙醚。
步骤(2)中所述的萃取的次数优选为两次。
步骤(2)中所述的分离纯化优选通过反向液相色谱实现。
所述的反向液相色谱的流动相为含0.1％TFA的乙腈/水混合液。
上述的含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法在合成含酪氨酸硫酸化修饰的多肽中的应用。
所述的多肽优选为α-芋螺毒素EpI、AnIA、AnIB、AnIC、PnIA或PnIB。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明方法提供了新戊基在多种水溶液中脱除的实例，拓宽了新戊基脱除试剂的范围，促成新戊基脱除与二硫键形成这两步同时进行，为含硫酸化酪氨酸修饰和多对二硫键的多肽合成提供了广泛的缓冲液选择。在发明方法中，加入I2氧化时是在酸性条件下进行(pH<3)，但其暴露的硫酸根并未脱除(质谱表征)，打破了传统的酪氨酸硫酸根酸不稳定的观点。本发明方法还对HPLC的流动相进行了优化，同时发现酪氨酸硫酸根在含0.1％TFA的流动相中也能保持稳定，流动相的更换减少了HPLC纯化分离后处理的步骤(若采用醋酸铵溶液作为流动相，之后还需除去醋酸铵得到纯肽)。
本发明的化学全合成方法填补了现有技术对含有硫酸化酪氨酸的芋螺毒素多肽片段合成的空白。本发明通过基于Fmoc保护基团的固相多肽合成法得到芋螺毒素线性多肽，利用不同的氧化折叠体系，对Cys保护基依次脱除，从而定向形成二硫键，同时，酪氨酸硫酸根的保护基团-新戊基会在折叠体系中“一锅”脱除，此外，硫酸根在之后的反应过程中也能保持稳定，从而成功制备含有硫酸化酪氨酸的芋螺毒素。通过本发明方法所制备α-芋螺毒素硫酸化修饰类似物，有助于我们研究该酪氨酸硫酸化修饰对α-芋螺毒素生物活性的影响及相关机理，为相关疾病诊断及治疗奠定了良好的基础。
附图说明
图1为实施例2制得的含蛋白酪氨酸硫酸化修饰的EpI合成及折叠过程的HPLC跟踪示意图。
图2为实施例2制得的含蛋白酪氨酸硫酸化修饰的EpI纯化后的ESI-MS表征图。
图3为实施例3制得的含蛋白酪氨酸硫酸化修饰的AnIA合成及折叠过程的HPLC跟踪示意图。
图4为实施例3制得的含蛋白酪氨酸硫酸化修饰的AnIA纯化后的ESI-MS表征图。
图5为实施例4制得的含蛋白酪氨酸硫酸化修饰的AnIB合成及折叠过程的HPLC跟踪示意图。
图6为实施例4制得的含蛋白酪氨酸硫酸化修饰的AnIB纯化后的ESI-MS表征图。
图7为实施例5制得的含蛋白酪氨酸硫酸化修饰的AnIC合成及折叠过程的HPLC跟踪示意图。
图8为实施例5制得的含蛋白酪氨酸硫酸化修饰的AnIC纯化后的ESI-MS表征图。
图9为实施例6制得的含蛋白酪氨酸硫酸化修饰的PnIA合成及折叠过程的HPLC跟踪示意图。
图10为实施例6制得的含蛋白酪氨酸硫酸化修饰的PnIA纯化后的ESI-MS表征图。
图11为实施例7制得的含蛋白酪氨酸硫酸化修饰的PnIB合成及折叠过程的HPLC跟踪示意图。
图12为实施例7制得的含蛋白酪氨酸硫酸化修饰的PnIB纯化后的ESI-MS表征图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中使用的Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH的结构式如下：
其余Fmoc保护氨基酸为Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH。
下述实施例中HPLC，其仪器为安捷伦1260，色谱柱为Phenomenex C18柱，流动相为水和乙腈(含0.1％TFA)。
下述实施例中合成的芋螺毒素多肽序列为如下，而且合成的多肽C端均为酰胺化：
EpI[Y15sY]：GCCSDPRCNMNNPDsYC；
AnIA[Y14sY]：CCSHPACAANNQDsYC；
AnIB[Y16sY]：GGCCSHPACAANNQDsYC；
AnIC[Y16sY]：GGCCSHPACFASNPDsYC；
PnIA[Y15sY]：GCCSLPPCAANNPDsYC；
PnIB[Y15sY]：GCCSLPPCALSNPDsYC。
下述实施例中用到的试剂名称及缩写：
ACN：乙腈
MES：2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液
DMF：N，N-二甲基甲酰胺；
DCM：二氯甲烷；
HOBT：1-羟基苯并三唑；
DIC：N，N-二异丙基碳二亚胺；
TBTU：苯并三唑四甲基四氟硼酸；
DIEA：N，N-二异丙基乙胺；
TFA：三氟乙酸；
DODT：1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸。
实施例1：酪氨酸硫酸根上保护基-新戊基脱除条件的探究：
将Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH分别溶于100％H2O(溶解不全)、90％H2O/ACN、80％H2O/ACN、70％H2O/ACN、60％H2O/ACN、50％H2O/ACN、40％H2O/ACN、30％H2O/ACN、20％H2O/ACN、10％H2O/ACN、100％ACN溶液中至浓度为1mg/ml，室温震荡反应2天，通过液相色谱质谱联用(LC-MS)的峰面积来估算其新戊基脱除率，其脱除率分别为100％、83％、75％、59％、22％、18％、11％、2％、4％、1％、0％。由此可见随着溶液中水的组份增大，相同时间内新戊基脱除率更高。
将Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH溶于少量ACN(水溶性较差)中，并加入缓冲盐溶液至乙腈比例为20％，浓度为0.1mg/ml，室温震荡反应24h，当选择缓冲盐溶液分别为0.1mol/LNH4HCO3 pH＝8.4、10mmol/L K3Fe(CN)6 0.1mol/L NH4HCO3混合液pH＝8.4、0.05mol/L TrispH＝8、0.1mol/L磷酸盐pH＝7.5、6mol/L盐酸胍0.1mol/L磷酸盐pH＝7.5、1mol/L醋酸铵pH＝7、0.1mol/L磷酸盐pH＝6.5、0.05mol/L Mes pH＝6、2％甘油0.1mol/L NaCl以及NaAc pH＝5.5，通过LC-MS的峰面积来估算其新戊基脱除率，分别为55％、57％、60％、70％、59％、63％、72％、58％、60％。由此可见新戊基在上述各种缓冲盐溶液中均可脱除。
采用Fmoc固相多肽合成法合成序列为sYGCCSYPPCFATNSDYC的线性多肽的片段，浓度为1mg/mL，分别溶于水溶液中，如：1)100％水；2)0.1mol/L NH4HCO3 pH＝8.4；3)10mmol/LK3Fe(CN)6、0.1mol/L NH4HCO3混合液pH＝8.4；4)50mmol/L Tris pH＝8；5)1mol/L醋酸铵pH＝7；6)0.1mol/L磷酸盐pH＝6.5，37℃震荡反应12h，通过HPLC的保留时间以及MALDI-TOF质谱分析，发现其新戊基全部脱除，从而验证了多肽内的新戊基在所述几种溶液中均可完全脱除并为接下的实验奠定基础。
实施例2：α-芋螺毒素EpI[Y15sY]的制备方法：
(1)Fmoc-Cys(Acm)-MBHA树脂的制备：取0.5g Rink Amide MBHA树脂于多肽合成管中，负载量为0.2-0.8mmol/g，加入10mL DMF室温震荡溶胀两次，每次15min，抽干，往树脂加入5mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，再用DMF洗涤两次后，再次加入5mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，排干溶剂，得到氨基脱除Fmoc保护的树脂，称取Fmoc-Cys(Acm)-OH(0.3mmol)、HOBT(0.6mmol)以及DIC(0.3mmol)，将Fmoc-Cys(Acm)-OH与HOBT用少量DMF溶解，加入DIC，室温震荡反应活化羧基20min，之后将活化后的氨基酸加入到树脂中，在室温下震荡反应2h，采用DMF、DCM各洗涤三次，氮气吹干得到干燥树脂，取树脂通过紫外检测其树脂负载量，最终得到约0.6g负载量为0.5mmol/g的Fmoc-Cys(Acm)-MBHA树脂。
(2)EpI[Y15sY]-MBHA树脂的制备：将得到的0.6g Fmoc-Cys(Acm)-MBHA树脂加入10mL DMF室温震荡溶胀两次，每次15min，抽干，之后往树脂里加入5mL 20％乙酸酐/DMF，室温震荡反应20min从而封闭掉未耦合上氨基酸的树脂的氨基，阻止其下一步反应，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，往树脂加入5mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，再用DMF洗涤两次后，再次加入5mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，排干溶剂，得到脱除Fmoc保护的树脂，称取Fmoc-L-Tyr(OSO3nP)-OH(0.6mmol)HOBT(1.2mmol)以及DIC(0.6mmol)，将Fmoc氨基酸与HOBT用少量DMF溶解，加入DIC，室温震荡反应活化羧基20min，之后将活化后的氨基酸加入到树脂中，在室温下震荡反应12h，可用Kaiser试剂监测反应，用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，重复以上实验操作(氨基酸含量以树脂的4倍摩尔当量计算，震荡反应由12h变为2h)，再依次耦合Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Met-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Cys(Acm)-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH，最后再脱除Fmoc保护基。
(3)α-芋螺毒素EpI[Y15sY]线性肽的制备：取200mg树脂，加入5mL切割试剂(TFA：DODT：H2O＝95:2.5:2.5)，震荡反应2-4h，过滤得到红色透明液体，液体旋蒸仪旋干后，加入约15mL冰乙醚萃取两次，离心后收集沉淀，将样品冻干，得到约50mgα-芋螺毒素EpI[Y15D]线性肽粗品，之后通过HPLC来对线性肽粗品进行分离纯化，最终得到10mg线性肽。
(4)α-芋螺毒素EpI[Y15sY]线性肽的折叠：1mg/mL 9mg多肽溶于0.1mol/L NH4HCO3中，pH＝8.4，在室温下震荡反应折叠约24h，即可形成第一对二硫键(Cys1与Cys3)，与此同时，新戊基也会在水溶液中脱除，用盐酸将溶液酸化之后，加入0.1mol/L I2/MeOH至溶液呈黄色，震荡反应约1min(时间过长会导致Met氧化)，此时I2已经将Acm保护基脱除，之后加入1mol/L抗坏血酸清除I2，溶液变为无色，之后再通过HPLC来对样品进行纯化，最终得到1.8mgα-芋螺毒素EpI[Y15sY]。在EpI合成及折叠过程中通过HPLC对不同阶段的产物进行监测，结果如图1所示。ESI-MS鉴定最终得到的EpI，结果如图2所示。
实施例3：α-芋螺毒素AnIA[Y14sY]的制备方法：
(1)Fmoc-Cys(Acm)-MBHA树脂的制备：按照实施例2的方法得到负载量为0.6g0.5mmol/g的干燥树脂。
(2)AnIA[Y16sY]-MBHA树脂的制备：将得到的0.6g Fmoc-Cys(Acm)-MBHA树脂加入10mL DMF室温震荡溶胀两次，每次15min，抽干，之后往树脂里加入5mL 20％乙酸酐/DMF，室温震荡反应20min从而封闭掉未耦合上氨基酸的树脂的氨基，阻止其下一步反应，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，往树脂加入5mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，再用DMF洗涤两次后，再次加入5mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，排干溶剂，得到脱除Fmoc保护的树脂，称取Fmoc-L-Tyr(OSO3nP)-OH(0.6mmol)，HOBT(1.2mmol)以及DIC(0.6mmol)，将Fmoc氨基酸与HOBT用少量DMF溶解，加入DIC，室温震荡反应活化羧基20min，之后将活化后的氨基酸加入到树脂中，在室温下震荡反应12h，可用Kaiser试剂监测反应，用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，重复以上实验操作(氨基酸含量以树脂的4倍摩尔当量计算，震荡反应由12h变为2h)，再依次耦合Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Cys(Acm)-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，最后再脱除Fmoc保护基。
(3)α-芋螺毒素AnIA[Y14sY]线性肽的制备：取200mg树脂，加入5mL切割试剂(TFA：DODT：H2O＝95:2.5:2.5)，震荡反应2-4h，过滤得到红色透明液体，液体旋蒸仪旋干后，加入约15mL冰乙醚萃取两次，离心后收集沉淀，将样品冻干，得到约53mgα-芋螺毒素AnIA[Y14sY]线性肽粗品，之后通过HPLC来对线性肽粗品进行分离纯化，最终得到24mg线性肽。
(4)α-芋螺毒素AnIA[Y14sY]线性肽的折叠：1mg/mL 10mg多肽溶于10mmol/L K3Fe(CN)6，0.1mol/L NH4HCO3中，pH＝8.4，溶液变黄，在室温下震荡反应折叠约12h，即可形成第一对二硫键(Cys1与Cys3)，与此同时，新戊基也会在水溶液中脱除，用盐酸将溶液酸化之后，加入0.1mol/L I2/MeOH至溶液呈棕色浑浊，震荡反应约1min，此时I2已经将Acm保护基脱除，之后加入1mol/L抗坏血酸清除I2，溶液变为黄色透明，之后再通过HPLC来对样品进行纯化，最终得到约3mgα-芋螺毒素AnIA[Y14sY]。在AnIA合成及折叠过程中通过HPLC对不同阶段的产物进行监测，结果如图3所示。ESI-MS鉴定最终得到的AnIA，结果如图4所示。
实施例4：α-芋螺毒素AnIB[Y16sY]的制备方法：
(1)Fmoc-Cys(Acm)-MBHA树脂的制备：按照实施例2的方法得到0.6g负载量为0.5mmol/g的干燥树脂。
(2)AnIB[Y16sY]-MBHA树脂的制备：将得到的0.6g Fmoc-Cys(Acm)-MBHA树脂加入10mL DMF室温震荡溶胀两次，每次15min，抽干，之后往树脂里加入5mL 20％乙酸酐/DMF室温震荡反应20min从而封闭掉未耦合上氨基酸的树脂的氨基，阻止其下一步反应，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，往树脂加入5mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，再用DMF洗涤两次后，再次加入5mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，排干溶剂，得到脱除Fmoc保护的树脂，称取Fmoc-L-Tyr(OSO3nP)-OH(0.6mmol)，HOBT(1.2mmol)以及DIC(0.6mmol)，将Fmoc氨基酸与HOBT用少量DMF溶解，加入DIC，室温震荡反应活化羧基20min，之后将活化后的氨基酸加入到树脂中，在室温下震荡反应12h，用Kaiser试剂监测反应，用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，重复以上实验操作(氨基酸含量以树脂的4倍摩尔当量计算，震荡反应由12h变为2h)，再依次耦合Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Cys(Acm)-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Gly-OH，最后再脱除Fmoc保护基。
(3)α-芋螺毒素AnIB[Y16sY]线性肽的制备：取200mg树脂，加入5mL切割试剂(TFA：DODT：H2O＝95:2.5:2.5)，震荡反应2-4h，过滤得到红色透明液体，液体旋蒸仪旋干后，加入约15mL冰乙醚萃取两次，离心后收集沉淀，将样品冻干，得到约46mgα-芋螺毒素AnIB[Y16sY]线性肽粗品，之后通过HPLC来对线性肽粗品进行分离纯化，最终得到20mg线性肽。
(4)α-芋螺毒素AnIB[Y16sY]线性肽的折叠：1mg/mL 15mg多肽溶于10mmol/L K3Fe(CN)6，0.1mol/L NH4HCO3中，pH＝8.4，溶液变黄，在室温下震荡反应折叠约12h，即可形成第一对二硫键(Cys1与Cys3)，与此同时，新戊基也会在水溶液中脱除，用盐酸将溶液酸化之后，加入0.1mol/L I2/MeOH至溶液呈棕色浑浊，震荡反应约1min，此时I2已经将Acm保护基脱除之后加入1mol/L抗坏血酸清除I2，溶液变为黄色透明，之后再通过HPLC来对样品进行纯化，最终得到约2.8mgα-芋螺毒素AnIB[Y16sY]。在AnIB合成及折叠过程中通过HPLC对不同阶段的产物进行检测，结果如图5所示。ESI-MS鉴定最终得到的AnIB，结果如图6所示。
实施例5：α-芋螺毒素AnIC[Y16sY]的制备方法：
(1)Fmoc-Cys(Acm)-MBHA树脂的制备：按照实施例2的方法得到负载量为0.6g0.5mmol/g的干燥树脂。
(2)AnIC[Y16sY]-MBHA树脂的制备：将得到的0.6g Fmoc-Cys(Acm)-MBHA树脂加入10mL DMF室温震荡溶胀两次，每次15min，抽干，之后往树脂里加入5mL 20％乙酸酐/DMF室温震荡反应20min从而封闭掉未耦合上氨基酸的树脂的氨基，阻止其下一步反应，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，往树脂加入5mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，再用DMF洗涤两次后，再次加入5mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，排干溶剂，得到脱除Fmoc保护的树脂，称取Fmoc-L-Tyr(OSO3nP)-OH(0.6mmol)，HOBT(1.2mmol)以及DIC(0.6mmol)，将Fmoc氨基酸与HOBT用少量DMF溶解，加入DIC，室温震荡反应活化羧基20min，之后将活化后的氨基酸加入到树脂中，在室温下震荡反应12h，用Kaiser试剂监测反应，用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，重复以上实验操作(氨基酸含量以树脂的4倍摩尔当量计算，震荡反应由12h变为2h)，再依次耦合Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Cys(Acm)-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Gly-OH，最后再脱除Fmoc保护基。
(3)α-芋螺毒素AnIC[Y16sY]线性肽的制备：取200mg树脂，加入5mL切割试剂(TFA：DODT：H2O＝95:2.5:2.5)，震荡反应2-4h，过滤得到红色透明液体，液体旋蒸仪旋干后，加入约15mL冰乙醚萃取两次，离心后收集沉淀，将样品冻干，得到约42mgα-芋螺毒素AnIC[Y16sY]线性肽粗品，之后通过HPLC来对线性肽粗品进行分离纯化，最终得到20mg线性肽。
(4)α-芋螺毒素AnIC[Y16sY]线性肽的折叠：1mg/mL 20mg多肽溶于0.1mol/LNH4HCO3中，pH＝8.4，在室温下震荡反应折叠约24h，即可形成第一对二硫键(Cys1与Cys3)，与此同时，新戊基也会在水溶液中脱除，用盐酸将溶液酸化之后，加入0.1mol/L I2/MeOH至溶液呈黄色，震荡反应约1min，此时I2已经将Acm保护基脱除之后加入1mol/L抗坏血酸清除I2，溶液变为无色，之后再通过HPLC来对样品进行纯化，最终得到约11mgα-芋螺毒素AnIC[Y16sY]。在AnIC合成及折叠过程中通过HPLC对不同阶段的产物进行检测，结果如图7所示。ESI-MS鉴定最终得到的AnIC，结果如图8所示。
实施例6：α-芋螺毒素PnIA[Y15sY]的制备方法：
(1)Fmoc-Cys(Acm)-MBHA树脂的制备：按照实施例2的方法得到负载量为0.6g0.5mmol/g的干燥树脂。
(2)PnIA[Y15sY]-MBHA树脂的制备：将得到的0.6g Fmoc-Cys(Acm)-MBHA树脂加入10mL DMF室温震荡溶胀两次，每次15min，抽干，之后往树脂里加入5mL 20％乙酸酐/DMF室温震荡反应20min从而封闭掉未耦合上氨基酸的树脂的氨基，阻止其下一步反应，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，往树脂加入5mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，再用DMF洗涤两次后，再次加入5mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，排干溶剂，得到脱除Fmoc保护的树脂，称取Fmoc-L-Tyr(OSO3nP)-OH(0.6mmol)、HOBT(1.2mmol)以及DIC(0.6mmol)，将Fmoc氨基酸与HOBT用少量DMF溶解，加入DIC，室温震荡反应活化羧基20min，之后将活化后的氨基酸加入到树脂中，在室温下震荡反应12h，用Kaiser试剂监测反应，用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，重复以上实验操作(氨基酸含量以树脂的4倍摩尔当量计算，震荡反应由12h变为2h)，再依次耦合Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Cys(Acm)-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH，最后再脱除Fmoc保护基。
(3)α-芋螺毒素PnIA[Y15sY]线性肽的制备：取200mg树脂，加入5mL切割试剂(TFA：DODT：H2O＝95:2.5:2.5)，震荡反应2-4h，过滤得到红色透明液体，液体旋蒸仪旋干后，加入约15mL冰乙醚萃取两次，离心后收集沉淀，将样品冻干，得到约50mgα-芋螺毒素PnIA[Y15sY]线性肽粗品，之后通过HPLC来对线性肽粗品进行分离纯化，最终得到10mg线性肽。
(4)α-芋螺毒素PnIA[Y15sY]线性肽的折叠：1mg/mL 8.5mg多肽溶于0.1mol/LNH4HCO3中，pH＝8.4,在室温下震荡反应折叠约24h，即可形成第一对二硫键(Cys1与Cys3)，与此同时，新戊基也会在水溶液中脱除，用盐酸将溶液酸化之后，加入0.1mol/L I2/MeOH至溶液呈黄色，震荡反应约1min，此时I2已经将Acm保护基脱除之后加入1mol/L抗坏血酸清除I2，溶液变为无色，之后再通过HPLC来对样品进行纯化，最终得到约2mgα-芋螺毒素PnIA[Y15sY]。在PnIA合成及折叠过程中通过HPLC对不同阶段的产物进行检测，结果如图9所示。ESI-MS鉴定最终得到的PnIA，结果如图10所示。
实施例7：α-芋螺毒素PnIB[Y15sY]的制备方法：
(1)Fmoc-Cys(Acm)-MBHA树脂的制备：按照实施例2的方法得到0.6g负载量为0.5mmol/g的干燥树脂。
(2)PnIB[Y15sY]-MBHA树脂的制备：将得到的0.6g Fmoc-Cys(Acm)-MBHA树脂加入10mL DMF室温震荡溶胀两次，每次15min，抽干，之后往树脂里加入5mL 20％乙酸酐/DMF室温震荡反应20min从而封闭掉未耦合上氨基酸的树脂的氨基，阻止其下一步反应，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，往树脂加入5mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，再用DMF洗涤两次后，再次加入5mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，排干溶剂，得到脱除Fmoc保护的树脂，称取Fmoc-L-Tyr(OSO3nP)-OH(0.6mmol)、HOBT(1.2mmol)以及DIC(0.6mmol)，将Fmoc氨基酸与HOBT用少量DMF溶解，加入DIC，室温震荡反应活化羧基20min，之后将活化后的氨基酸加入到树脂中，在室温下震荡反应12h，用Kaiser试剂监测反应，用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，重复以上实验操作(氨基酸含量以树脂的4倍摩尔当量计算，震荡反应由12h变为2h)，再依次耦合、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Cys(Acm)-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH，最后再脱除Fmoc保护基。
(3)α-芋螺毒素PnIB[Y15sY]线性肽的制备：取200mg树脂，加入5mL切割试剂(TFA：DODT：H2O＝95:2.5:2.5)，震荡反应2-4h，过滤得到红色透明液体，液体旋蒸仪旋干后，加入约15mL冰乙醚萃取两次，离心后收集沉淀，将样品冻干，得到约50mgα-芋螺毒素PnIB[Y15sY]线性肽粗品，之后通过HPLC来对线性肽粗品进行分离纯化，最终得到17mg线性肽。
(4)α-芋螺毒素PnIB[Y15sY]线性肽的折叠：1mg/mL 10mg多肽溶于0.1mol/LNH4HCO3中，在室温下震荡反应折叠约4天，即可形成第一对二硫键(Cys1与Cys3)，与此同时，新戊基也会在水溶液中脱除，用盐酸将溶液酸化之后，加入0.1mol/L I2/MeOH至溶液呈黄色，震荡反应约1min，此时I2已经将Acm保护基脱除，之后加入1mol/L抗坏血酸清除I2，溶液变为无色，最后再通过HPLC来对样品进行纯化，最终得到约3.8mgα-芋螺毒素PnIB[Y15sY]。在PnIB合成及折叠过程中通过HPLC对不同阶段的产物进行检测，结果如图11所示。ESI-MS鉴定最终得到的PnIB，结果如图12所示。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> α-芋螺毒素EpI
<400> 1
Gly Cys Cys Ser Asp Pro Arg Cys Asn Met Asn Asn Pro Asp Tyr Cys
1 5 10 15
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> α-芋螺毒素AnIA
<400> 2
Cys Cys Ser His Pro Ala Cys Ala Ala Asn Asn Gln Asp Tyr Cys
1 5 10 15
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> α-芋螺毒素AnIB
<400> 3
Gly Gly Cys Cys Ser His Pro Ala Cys Ala Ala Asn Asn Gln Asp Tyr
1 5 10 15
Cys
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> α-芋螺毒素AnIC
<400> 4
Gly Gly Cys Cys Ser His Pro Ala Cys Phe Ala Ser Asn Pro Asp Tyr
1 5 10 15
Cys
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> α-芋螺毒素PnIA
<400> 5
Gly Cys Cys Ser Leu Pro Pro Cys Ala Ala Asn Asn Pro Asp Tyr Cys
1 5 10 15
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> α-芋螺毒素PnIB
<400> 6
Gly Cys Cys Ser Leu Pro Pro Cys Ala Leu Ser Asn Pro Asp Tyr Cys
1 5 10 15
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 线性多肽片段
<400> 7
Tyr Gly Cys Cys Ser Tyr Pro Pro Cys Phe Ala Thr Asn Ser Asp Tyr
1 5 10 15
Cys

Claims (10)

1.一种含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)采用Fmoc固相多肽合成法，以Fmoc氨基树脂为载体，根据包含酪氨酸硫酸化修饰位点的多肽序列，从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸，获得线性肽氨基树脂；其中，Fmoc保护酪氨酸侧链的硫酸根采用新戊基作为保护基；Fmoc保护半胱氨酸侧链采用三苯甲基和/或乙酰胺甲基作为保护基；
(2)将所得线性肽氨基树脂进行切割，使肽链从Fmoc氨基树脂上脱下并脱除除新戊基和乙酰胺甲基保护基之外的侧链保护基；经过滤、旋干、萃取、离心、冻干，得到线性肽粗品；进一步分离纯化，得到线性肽；
(3)将步骤(2)所得的线性肽进一步裂解；如果Fmoc保护半胱氨酸侧链没有采用乙酰胺甲基作为保护基，则脱除酪氨酸侧链的新戊基；如果Fmoc保护半胱氨酸侧链有采用乙酰胺甲基作为保护基，则分别脱除酪氨酸侧链的新戊基和半胱氨酸侧链的乙酰胺甲基保护基；分离纯化，得到含酪氨酸硫酸化修饰的多肽；其中，脱除酪氨酸侧链的新戊基的试剂为NH4HCO3溶液、NH4HCO3和K3Fe(CN)6混合液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或纯水溶液。
2.根据权利要求1所述的含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的NH4HCO3溶液为0.1mol/L、pH＝8.4的NH4HCO3溶液；
步骤(3)中所述的NH4HCO3和K3Fe(CN)6混合液为10mmol/L K3Fe(CN)6、0.1mol/LNH4HCO3、pH＝8.4的混合液；
步骤(3)中所述的磷酸盐缓冲液为0.1mol/L、pH＝6.5的磷酸盐缓冲液；
步骤(3)中所述的Tris缓冲液为50mmol/L、pH＝8的Tris缓冲液。
3.根据权利要求1所述的含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法，其特征在于：
当步骤(1)中所述的包含酪氨酸硫酸化修饰位点的多肽序列仅包含一个或二个半胱氨酸时，在步骤(1)中，Fmoc保护半胱氨酸侧链采用三苯甲基作为保护基；在步骤(3)中，将步骤(2)所得的线性肽进一步裂解，脱除酪氨酸侧链的新戊基；
当步骤(1)中所述的包含酪氨酸硫酸化修饰位点的多肽序列包含形成二硫键的两对半胱氨酸时，在步骤(1)中，两组Fmoc保护半胱氨酸侧链分别采用三苯甲基和乙酰胺甲基作为保护基，同组的半胱氨酸连接相同保护基；在步骤(3)中，脱除酪氨酸侧链的新戊基的同时氧化折叠所得线性肽，形成第一对二硫键；脱除半胱氨酸侧链的乙酰胺甲基保护基的同时进一步氧化折叠，形成第二对二硫键。
4.根据权利要求3所述的含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的多肽为α-芋螺毒素EpI、AnIA、AnIB、AnIC、PnIA或PnIB。
5.根据权利要求4所述的含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法，其特征在于：
在所述的脱除酪氨酸侧链的新戊基的同时氧化折叠所得线性肽步骤中，当所述的多肽为α-芋螺毒素EpI、AnIC、PnIA或PnIB时，所用的试剂为NH4HCO3溶液；当所述的多肽为α-芋螺毒素AnIA或AnIB时，所用的试剂为K3Fe(CN)6和NH4HCO3混合液；
在所述的脱除酪氨酸侧链的新戊基的同时氧化折叠所得线性肽步骤中，反应条件为室温下振荡反应12～96h。
6.根据权利要求3所述的含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法，其特征在于：
在所述的脱除半胱氨酸侧链的乙酰胺甲基保护基的同时进一步氧化折叠步骤中，具体操作为：将脱除酪氨酸侧链的新戊基后的溶液进行酸化处理，加入I2/MeOH溶液或I2/50％AcOH溶液，反应，清除过量的I2。
7.根据权利要求6所述的含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法，其特征在于：
所述的酸化处理为加入盐酸至体系的pH为1～3；
所述的I2/MeOH溶液为0.1mol/L I2/MeOH溶液；
所述的I2/50％AcOH溶液为0.01mol/L I2/50％AcOH溶液；
所述的I2/MeOH溶液或I2/50％AcOH溶液的添加量为添加至体系呈黄色或棕色沉淀；
所述的清除I2所用的试剂为1mol/L抗坏血酸；
所述的抗坏血酸的添加量为添加至体系黄色褪去或沉淀溶解；
所述的反应条件为振荡反应0.5～1min。
8.根据权利要求1所述的含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法，其特征在于：
步骤(1)中从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸的具体操作为：在偶联体系作用下先将C端第1位氨基酸和Fmoc氨基树脂反应生成氨基酸-氨基树脂，再逐一偶联其它Fmoc保护氨基酸，获得线性肽氨基树脂；
所述的偶联体系中的Fmoc脱保护试剂为20％哌啶/DMF；
所述的偶联体系中的Fmoc脱保护反应时间为5～10min；
所述的偶联体系中的缩合剂为HOBT+DIC或TBTU+DIEA；
步骤(1)中所述的氨基树脂为Rink Amide MBHA树脂；
步骤(1)中所述的氨基树脂的负载量为0.2～0.8mmoL/g；
步骤(1)中所述的Fmoc保护酪氨酸化学式为Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH；
所述的Fmoc-L-Tyr(OSO3nP)-OH的用量按Fmoc氨基树脂：Fmoc-L-Tyr(OSO3nP)-OH＝1：2的摩尔比计算；
所述的Fmoc-L-Tyr(OSO3nP)-OH与Fmoc氨基树脂的偶联时间为2～12h；
除酪酸以外的所述的Fmoc保护氨基酸的用量按Fmoc氨基树脂：Fmoc保护氨基酸＝1：4的摩尔比计算；
除酪酸以外的所述的Fmoc保护氨基酸与Fmoc氨基树脂的偶联时间为2～4h。
9.根据权利要求1所述的含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的切割的试剂为TFA、H2O和DODT按TFA：H2O：DODT＝95：2.5：2.5的体积比配比得到的溶液；
步骤(2)中所述的切割的时间为2～4h；
步骤(2)中所述的萃取的萃取剂为冰乙醚；
步骤(2)中所述的萃取的次数为两次；
步骤(2)和步骤(3)中所述的分离纯化均通过反向液相色谱实现；
所述的反向液相色谱的流动相为含0.1％TFA的乙腈/水混合液。
10.权利要求1～9任一项所述的含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法在合成含酪氨酸硫酸化修饰的多肽中的应用。
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