CN113637047A - 一种以苯偶氮基吡啶为配体的多肽-锰-羰基复合物co释放分子及其合成方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种以苯偶氮基吡啶为配体的多肽‑锰‑羰基复合物CO释放分子及其合成方法与应用。本发明通过基于Fmoc保护基团的固相多肽合成法和带有正交保护基4‑氨基苯丙氨酸的使用，得到带有反应位点的多肽氨基树脂，再利用固相米尔斯反应在多肽目标位点构建苯偶氮基吡啶类配位基团，最后利用五羰基溴化锰进行锰‑羰基‑配体的配位反应，乙醚萃取后即获得目标产物。本发明将苯偶氮基吡啶配体与多肽‑CO释放分子结合起来，配体的使用能够使CO的释放光源能量明显降低，光源波长向近红外区域移动，有利于CO释放分子在生理生化研究中的实际应用，以多肽为载体有助与对特定部位的生理生化作用，为CO在相关疾病的治疗方面奠定良好基础。

Description

一种以苯偶氮基吡啶为配体的多肽-锰-羰基复合物CO释放分 子及其合成方法与应用
技术领域
本发明涉及多肽-金属复合物合成制备技术领域，具体涉及一种以苯偶氮基吡啶为配体的多肽-锰-羰基复合物CO释放分子及其合成方法与应用。
背景技术
一氧化碳(CO)因为具有与体内血红蛋白的强结合作用长期以来被认为是一种有毒气体。但于此同时，CO作为一种重要的气体分子，在哺乳动物体内发挥着信号传导，细胞保护等多种生理作用(R.Motterlini,Nat.Rev.Drug.Discov.,2010,9,728–743.)。为进一步探索CO在生命体系中的重要作用及临床医学的应用，首先需解决的关键问题之一即采用何种方式实现CO安全可控的定点运输。
一氧化碳释放分子(CORM)是常用于CO可控释放的技术手段之一。经过历年发展，根据激发CORMs释放CO方式，可将CORMs分为以下主要3类：1.配体交换引发CO释放型CORMs；2.酶诱导CO释放型CORMs(ET-CORMs)；3.光可控的光诱导CO释放型CORMs(PhotoCORMs)。PhotoCORMs由于其CO释放方式可控性更高的优点备受研究人员的关注，其中的代表是以锰-羰基(Mn(CO)3)为基础的PhotoCORMs，经过高能量的光源(紫外光或紫光)光照后诱发CO的释放(J.Niesel,Chem.Commun.,2008,1798–1800；PC.Kunz,Eur.J.Inorg.Chem.,2009,5358–5366；G.
Figure BDA0003176835750000011
,Inorg.Chem.,2011,50,4362–4367)。但能量较高的光源组织穿透性较差的同时还会对正常细胞造成一定损伤，这便限制了这类需要高能量光源为释放光源PhotoCORMs在生物方面的实际应用。
根据金属到配体的电子转移(metal-to-ligand charge transfer,MLCT)理论，在足够能量的光源刺激下，电子受到激发从金属d轨道跃迁至辅助配体的π*轨道，一方面提高了中心金属离子形式上的氧化态，另一方面破坏了金属与羰基化合物间的协同作用。上述这一过程削弱了金属-羰基键，促进了CO的释放。通过引入能够促进参与电子转移的轨道的能隙变窄的含有超共轭体系和π受体基团的辅助配体，有望实现PhotoCORM在长波长的低能量光源刺激下的CO释放。这类型的配体包括联二吡啶、二吡啶甲基胺、吡啶喹啉胺和苯偶氮基吡啶等。其中的苯偶氮基吡啶配体(2-phenylazopyridine,azpy)与联吡啶和其他α-二胺配体体系相比能够使中心金属稳定在较低的氧化态，能够有效促进可见光区域下金属到配体间的电子转移，削弱金属-羰基间的σ-π配键，进而实现使用可见光实现释放CO(MA.Gonzalez,Ino rg.Chem.,2012,51,601–608)。研究人员构建含有苯并偶氮吡啶配体的Mn(I)-CO复合物MnBr(azpy)(CO)3与[Mn(azpy)(CO)3(PPh3)](ClO4)能够实现在可见光(λ≤520nm)刺激下的CO释放(SJ.Carrington,Chem.Commun.,2013,49,11254)。
CORMs单体通常具有在水溶液中的溶解性较差，空气稳定性较差，生物相容性较差的缺点，因此常引入适合的载体如多肽、高分子聚合物和纳米材料等与CORMs构建成相应的复合物改善上述缺点。其中多肽与CORMs的复合物因具备更好的生物相容性而备受关注。制备多肽的CORMs复合物通常使用共价偶联的方法。通过化学逐步合成的方法，首先将带有金属-羰基的结构通过连接子与具有反应活性的官能团连接，接着反应活性官能团与多肽或蛋白原有或人为引入的反应位点反应，实现金属-羰基结构与多肽或蛋白的偶联。通用于金属-羰基结构与多肽或蛋白的偶联反应包括Sonogashira偶联，CuAAC催化的点击化学连接和肟的化学连接(M.Salmain,Eur.J.Inorg.Chem.,2020,2020,21–35)。这样的偶联反应通常需要在液相的环境中进行多步骤的合成，因此需要多步骤的纯化造成最终的产率较低。
将能够实现可见光释放CO的苯偶氮基吡啶配体与多肽的CORMs复合物结合起来，可有望构建一种可见光响应释放CO且生物相容性佳的新型多肽-PhotoCORMs。但目前尚无以苯偶氮基吡啶为配体的多肽-锰-羰基复合物的CO释放分子的相关合成方法方面的报导。因此，有必要开发一种全新的、合成与纯化便捷、可模块化合成的合成方法，来高效制备苯偶氮基吡啶为配体的多肽-CORMs复合物。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种以苯偶氮基吡啶为配体的多肽-锰-羰基复合物CO释放分子的固相合成方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述固相合成方法得到的以苯偶氮基吡啶为配体的多肽-锰-羰基复合物CO释放分子。
本发明的另一目的在于提供上述以苯偶氮基吡啶为配体的多肽-锰-羰基复合物CO释放分子的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种以苯偶氮基吡啶为配体的多肽-锰-羰基复合物CO释放分子的固相合成方法，包括如下步骤：
(1)设计含有作为配位基团引入位点的氨基酸的目标多肽序列，采用Fmoc固相多肽合成法，以Fmoc氨基树脂为载体，根据目标多肽序列，从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸，洗涤，干燥，获得线性多肽树脂；其中：
作为配位基团引入位点的氨基酸，使用苯胺氨基保护基为Alloc(烯丙氧羰基)的Fmoc-4-氨基苯丙氨酸(Fmoc-L-Aph(Alloc)-OH)进行合成；
其余氨基酸使用无侧链的Fmoc氨基酸，或侧链的保护基团能用三氟乙酸进行脱除的Fmoc氨基酸进行合成；
(2)取步骤(1)制备得到的线性多肽树脂，加入钯催化体系，反应，洗涤，干燥，得到Alloc保护基脱除的线性多肽树脂；
(3)取步骤(2)制备得到的线性多肽树脂，加入亚硝基吡啶类化合物，二氯甲烷(DCM)，冰醋酸(AcOH)，反应，洗涤，干燥，得到含苯偶氮基吡啶配位基团的线性多肽树脂；
(4)取步骤(3)制备得到的含苯偶氮基吡啶配位基团的线性多肽树脂，加入切割试剂，使多肽链从Fmoc氨基树脂上脱下，并脱除剩余侧链保护基；经过滤、旋干、萃取、离心、冻干，得到含苯偶氮基吡啶配位基团的线性多肽粗品；进一步分离纯化，得到含苯偶氮基吡啶配位基团的线性多肽；
(5)取步骤(4)制备得到的含苯偶氮基吡啶配位基团的线性多肽，加入五羰基溴化锰，以二氯甲烷/甲醇混合溶液为反应溶剂，进行配位反应；旋干溶剂，乙醚萃取，即获得含苯偶氮基吡啶配位基团的锰-羰基-线性多肽复合物。
步骤(1)中所述的作为配位基团引入位点的氨基酸优选为苯丙氨酸或酪氨酸。修饰位点的侧链由天然的脂肪链结构变为带有芳香环共轭体系的结构，结构变化较大，可能对多肽性质造成一定影响。苯丙氨酸侧链带有苯环，酪氨酸侧链基团带有苯酚，以其作为进行配体基团构建的位点可以最大程度保持多肽的原有结构不做过多改变。
步骤(1)中所述的作为配位基团引入位点的氨基酸占总氨基酸数量的百分比≤20％，优选为≤15％。考虑到修饰基团的位阻对固相修饰带来的潜在合成难度的影响，在被指定为侧链修饰位点的相邻两个氨基酸之间应有至少3个氨基酸间隔，优选为至少5个氨基酸间隔。
步骤(1)中所述的从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸的具体操作为：在偶联体系作用下先将第1位氨基酸和Fmoc氨基树脂反应生成氨基酸-氨基树脂，再逐一偶联其它Fmoc保护氨基酸，获得线性多肽树脂。
所述的偶联体系中的Fmoc脱保护试剂优选为20％哌啶/DMF。
所述的偶联体系中的脱保护反应时间优选为5～10min。
所述的偶联体系中的缩合剂优选为HOBT+DIC或TBTU+DIEA。
步骤(1)中所述的氨基树脂优选为Rink Amide MBHA树脂。
步骤(1)中所述的氨基树脂的负载量优选为0.2～0.8mmoL/g。
步骤(1)中所述的苯胺氨基保护基为Alloc(烯丙氧羰基)的Fmoc-4-氨基苯丙氨酸化学式为Fmoc-L-Aph(Alloc)-OH，其结构式如下所示：
Figure BDA0003176835750000031
所述的Fmoc-L-Aph(Alloc)-OH的用量优选按Fmoc氨基树脂：Fmoc-L-Aph(Alloc)-OH＝1：3的摩尔比计算。
所述的Fmoc-L-Aph(Alloc)-OH与Fmoc氨基树脂的偶联时间优选为4～12h；更优选为12h。
除Fmoc-L-Aph(Alloc)-OH以外的Fmoc保护氨基酸的用量优选按Fmoc氨基树脂：Fmoc保护氨基酸＝1：4的摩尔比计算。
除Fmoc-L-Aph(Alloc)-OH以外的Fmoc保护氨基酸与Fmoc氨基树脂的偶联时间优选为2～4h；更优选为2h。
步骤(2)中所述的钯催化体系优选为四(三苯基膦)钯催化体系，四(三苯基膦)钯的用量优选为树脂上承载多肽的3～5倍当量，反应溶剂为氯仿、乙酸、N-甲基吗啉按体积比37:2:1混合的氯仿-乙酸-N-甲基吗啉混合溶液。
步骤(2)中所述的反应的条件为温度20～30℃(室温)、时间2～3h。
步骤(3)中所述的亚硝基吡啶类化合物包括亚硝基吡啶和亚硝基吡啶衍生物。所述的亚硝基吡啶衍生物包括但不限于亚硝基喹啉。
所述的亚硝基吡啶化学式为C5H4N2O，其结构式如下：
Figure BDA0003176835750000041
步骤(3)中所述的亚硝基吡啶类化合物用量优选为树脂上承载多肽的5～15倍当量，更优选为10倍当量。
步骤(3)中所述的二氯甲烷的用量，优选按亚硝基吡啶类化合物在体系中的浓度大于0.4mol/L计；更优选按0.4～0.6mol/L计。
步骤(3)中所述的冰醋酸的用量优选为二氯甲烷用量的0.5％～1.5％(v/v)；更优选为1％(v/v)。
步骤(3)中所述的反应的条件为温度20～30℃(室温)，时间为反应直至树脂无色透明。
步骤(4)中所述的切割的试剂优选为三氟乙酸(TFA)和水按95：5的体积比混合得到的溶液。
步骤(4)中所述的切割的时间优选为1～2h。
步骤(4)中所述的萃取的萃取剂优选为冰乙醚。
步骤(4)中所述的萃取的次数优选为两次。
步骤(5)中所述的五羰基溴化锰加入量优选为多肽的1～5倍当量，更优选3倍当量。
步骤(5)中所述的二氯甲烷/甲醇混合溶液中二氯甲烷和甲醇的体积比优选为1:1，其用量优选按五羰基溴化锰在体系中的浓度大于0.4mol/L计，更优选按0.4～0.6mol/L计。
步骤(5)中所述的配位反应的条件优选为温度20～30℃(室温)、震荡反应4～6h。
一种以苯偶氮基吡啶为配体的多肽-锰-羰基复合物CO释放分子，通过上述固相合成方法得到。
上述以苯偶氮基吡啶为配体的多肽-锰-羰基复合物CO释放分子在制备药物和/或医用材料中的应用。
本发明的原理如下：合成侧链苯胺氨基使用Alloc保护基暂时保护的非天然氨基酸Fmoc-4-氨基苯丙氨酸(Fmoc-L-Aph(Alloc)-OH)。采用Fmoc固相多肽合成法，使用Fmoc氨基树脂为载体，根据目标多肽的序列，在需引入侧链修饰的位点使用Fmoc-L-Aph(Alloc)-OH，从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸，得到侧链带有Alloc保护的多肽氨基树脂；其中，Alloc保护基的脱除方式有别于其余氨基酸的侧链保护基团；其次采用Alloc保护基的脱除条件，进行树脂上的Alloc基团脱除，暴露可用于修饰反应的苯胺自由氨基；随后合成亚硝基吡啶类化合物，在树脂上采用米尔斯反应将树脂上多肽链上的苯胺自由氨基修饰为可进行化学配位的苯偶氮基吡啶类配体基团；将目标多肽从树脂裂解下来并纯化，接着加入五羰基溴化锰进行化学配位；乙醚萃取后即可得到带有锰-羰基配位的多肽。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明方法提出了全新的在多肽树脂上引入苯偶氮基吡啶类配位官能团并进行锰-羰基配位的合成手段，并提供相应实例。该合成路线中仅需要一步的反相液相色谱纯化，大大简化了目前已有合成多肽/蛋白金属复合物的合成步骤数量、缩短了合成所需时间。
本发明方法中在多肽固相合成中引入侧链苯胺氨基保护基团为Alloc的非天然氨基酸Fmoc-4-氨基苯丙氨酸(Fmoc-L-Aph(Alloc)-OH)，经过Pd(PPh3)4的脱除后，暴露自由氨基。该自由氨基具有进行多种不同类型反应的能力，因此可通过不同反应类型进行多种官能团的修饰。
本发明方法创新以五羰基溴化锰为反应底物的锰-羰基配位方式。将五羰基溴化锰溶解于有机溶剂中，解决了此前在缓冲液中进行液相配位时五羰基溴化锰溶解度不佳的问题。配位结束后通过旋干溶剂，加入足量乙醚萃取的方式即可轻松便捷地除去剩余未配位的五羰基溴化锰，节省了此前配位后的液相纯化步骤，极大缩短了合成时间和成本。
本发明的固相构建以苯偶氮基吡啶配体的多肽-锰-羰基复合物固相合成方法是对现有制备多肽-锰-羰基(Mn(CO)3)复合物的一次创新。本发明通过基于Fmoc保护基团的固相多肽合成法和带有正交保护基4-氨基苯丙氨酸的使用得到带有反应位点的多肽氨基树脂，利用树脂上的固相米尔斯反应在多肽目标位点构建苯偶氮基吡啶类配位基团。构建的带有苯偶氮基吡啶类配位基团的产物在树脂切割的反应过程中能够保持稳定，未发现脱落情况。随后利用五羰基溴化锰进行锰-羰基-配体的配位反应，乙醚萃取后成功制备以苯偶氮基吡啶为配位基团的多肽-锰-羰基(Mn(CO)3)复合物。
通过本发明方法所制备得到的以苯偶氮基吡啶为配位基团的多肽-锰-羰基(Mn(CO)3)，将多肽部分的靶向性和锰羰基的一氧化碳释放的光可控性结合起来，构建得到一种生物相容性高、生理环境稳定、实现一氧化碳具有靶向运输和可控释放以多肽为支架的一氧化碳释放分子。苯偶氮基吡啶类配体有助于将一氧化碳的释放波长延长至红光甚至近红外范围，有助于研究一氧化碳对特定部位的生理生化作用，同时为一氧化碳在相关疾病的治疗方面奠定良好基础。
附图说明
图1为实施例1制得的含苯偶氮基吡啶和锰-羰基配位的TAT(Y11Aph(azpy-Mn-CO)固相合成过程每阶段的HPLC示意图。
图2为实施例1制得的含苯偶氮基吡啶和锰-羰基配位的TAT(Y11Aph(azpy-Mn-CO)的结构与理论分子量。
图3为实施例1制得的含苯偶氮基吡啶和锰-羰基配位的TAT(Y11Aph(azpy-Mn-CO)的ESI-MS表征图。
图4为实施例1制得的含苯偶氮基吡啶和锰-羰基配位的TAT(Y11Aph(azpy-Mn-CO)的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)表征图。
图5为实施例1制备TAT(Y11Aph(azpy-Mn-CO)红光(～700nm,LED,5W)光控CO释放实验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中使用的Fmoc-L-Aph(Alloc)-OH，其结构式如下所示，参考文献“L.Leelasvatanakij,J.Peptide Res.,2000,56,80-87”记载的方法制备得到：
Figure BDA0003176835750000061
其余Fmoc保护氨基酸为Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Val-OH。
下述实施例中使用的亚硝基吡啶，其结构式如下所示：
Figure BDA0003176835750000071
下述实施例中HPLC，其仪器为安捷伦1260，色谱柱为Phenomenex C18柱，流动相为水和乙腈(含0.1％(v/v)TFA)。
下述实施例中合成的带有配体官能团的多肽序列为如下，而且合成的多肽C端均为酰胺化：
TAT(Y11Aph(azpy)):Aph(azpy)GRKKRRQRRR；
下述实施例中用到的试剂名称及缩写：
DMF：N，N-二甲基甲酰胺；
DCM：二氯甲烷；
HOBT：1-羟基苯并三唑；
DIC：N，N-二异丙基碳二亚胺；
TBTU：苯并三唑四甲基四氟硼酸；
DIEA：N，N-二异丙基乙胺；
NMM：N-甲基吗啉；
TFA：三氟乙酸；
MeCN：乙腈
MeOH：甲醇。
实施例1：侧链配位基团为苯偶氮基吡啶(azpy)的TAT-锰羰基复合物的制备方法：
(1)Fmoc-Arg(Pbf)-MBHA树脂的制备：取500mg Rink Amide MBHA树脂于多肽合成管中，负载量为0.2-0.8mmol/g，加入15mL DMF室温震荡溶胀两次，每次15min，抽干，往树脂加入10mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，再用DMF洗涤两次后，再次加入10mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，排干溶剂，得到氨基脱除Fmoc保护的树脂，称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH(1mmol)、TBTU(2mmol)以及DIEA(0.98mmol)，将Fmoc-Arg(Pbf)-OH与TBTU用少量DMF溶解，加入DIEA，室温震荡反应活化羧基2min，之后将活化后的氨基酸加入到树脂中，在室温下震荡反应2h，采用DMF、DCM各洗涤三次，氮气吹干得到干燥树脂，取树脂通过紫外检测其树脂负载量，最终得到约负载量为0.44mmol/g的Fmoc-Arg(Pbf)-MBHA树脂。
(2)TAT(Y11Aph(Alloc))-MBHA树脂的制备：取得到的Fmoc-Arg(Pbf)-MBHA树脂加入15mL DMF室温震荡溶胀两次，每次15min，排干，之后往树脂里加入10mL 20％乙酸酐/DMF，室温震荡反应20min从而封闭掉未耦合上氨基酸的树脂的氨基，阻止其下一步反应，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，往树脂加入10mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，再用DMF洗涤两次后，再次加入10mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，排干溶剂，得到脱除Fmoc保护的树脂，称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH(2mmol),TBTU(4mmol)以及DIEA(1.96mmol)，将Fmoc氨基酸与HOBT用少量DMF溶解，加入DIC，室温震荡反应活化羧基2min，之后将活化后的氨基酸加入到树脂中，在室温下震荡反应2h，可用Kaiser试剂监测反应，用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，重复以上实验操作(氨基酸含量以树脂的4倍摩尔当量计算，震荡反应为2h)，再依次耦合Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-L-Aph(Alloc)-OH。合成完毕后采用DMF、DCM各洗涤三次，氮气吹干得到干燥树脂1.2g。由于树脂质量增加，此时树脂的负载量约为0.18mmol/g。
(3)Alloc保护基的脱除：取1g步骤(2)得到的树脂，加入树脂上承载多肽的3倍当量Pd(PPh3)4，加入氯仿、乙酸、NMM按体积比37:2:1混合的混合溶液15mL，室温下反应2-3小时。
(4)亚硝基吡啶的制备：参考文献“EC.Taylor,J.Org.Chem.,1982,47,552-555”记载的方法，将0.94g(0.01mol)2-氨基吡啶和0.68g(0.8mL,0.011mL)二甲基硫醚溶于10mLDCM中，-20℃搅拌。保持-20℃搅拌的同时，将1.33g(0.01mol)N-chlorosuccinimide(N-氯代琥珀酰亚胺，CAS#:128-09-6)溶解于25mL DCM，逐滴加入反应瓶中滴加完毕后反应液保持-20℃搅拌1小时，随后恢复室温搅拌1小时。将0.405g甲醇钠溶解于7.5mL甲醇中，加入反应体系中搅拌反应10min，随后加入水15mL，室温搅拌4小时。分离有机层，水层使用5mL DCM萃取两次，将所有有机层汇合后水洗分液，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂。加入10mL DCM，0℃搅拌，加入0.201g(0.0119mol)溶解于超干DCM的m-chloroperbenzoic acid(间氯过氧苯甲酸，CAS#:937-14-4)(80％-90％)。保持0-5℃搅拌反应90min后(亮黄色溶液)，加入0.3mL二甲基硫醚，反应温度不变搅拌30min。反应瓶内加入50mL饱和碳酸氢钠溶液，分液保留有机相，充分水洗分液，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂。使用乙醇重结晶得到的亮黄色固体即为亚硝基吡啶。
(5)TAT(Y11Aph(azpy))-MBHA树脂的制备：取500mg步骤(3)得到的树脂，加入亚硝基吡啶(0.9mmol)，加入DCM 2.25mL，AcOH 22.5μL，室温震荡反应，用Kaiser试剂监测反应直至树脂呈亮橙色不再变色。反应完毕后采用DMF、DCM各洗涤三次，氮气吹干得到干燥树脂。
(6)TAT(Y11Aph(azpy))多肽的制备：取100mg步骤(5)得到的树脂，加入40mL切割试剂(TFA：H2O＝体积比95:5)，震荡反应1-2h，过滤得到黄棕色透明液体，液体旋蒸仪旋干后，加入约15mL冰乙醚萃取两次，离心后收集沉淀，将样品冻干，得到约30mg TAT(Y11Aph(azpy))多肽，之后如有需要可通过HPLC来对多肽粗品进行分离纯化。
(7)TAT(Y11Aph(azpy)-Mn(CO)3)的制备：取步骤(6)得到的TAT(Y11Aph(azpy))多肽，加入五羰基溴化锰(0.36mmol)，加入DCM/MeOH＝1/1(v/v)0.7mL，室温震荡反应4h。使用冻乙醚萃取，除去未反应的五羰基溴化锰。得到的深蓝色固体即为目标产物TAT(Y11Aph(azpy)-Mn(CO)3)多肽。
在TAT(Y11Aph(azpy)-Mn(CO)3)的固相合成过程中，通过对每个阶段得到的树脂进行小量的切割测试，并使用HPLC对不同阶段的产物进行检测，结果如图1所示。ESI-MS鉴定最终得到的TAT(Y11Aph(azpy)-Mn(CO)3)，结果如图3所示。傅里叶变换红外光谱(FT-IR)表征结果如图4所示。
实施例2：TAT(Y11Aph(azpy)-Mn(CO)3)的光控CO释放实验
实验原料：TAT(Y11Aph(azpy)-Mn(CO)3)，PBS缓冲液，可见光红光手电(～700nm，LED，5W)。
实验步骤：
①将PBS缓冲液使用氮气鼓泡30min进行除氧。
②加入TAT(Y11Aph(azpy)-Mn(CO)3)多肽-锰配合物(终浓度为0.16mg/mL)。
④使用可见光红光手电对比色皿进行光照，使用紫外可见光谱记录不同累计光照时间的谱图。结果如图5所示。
从紫外谱特征峰的变化得到以下结论①未经光照的TAT-Mn(CO)3不会释放CO；②经可见光红光光照之后，紫外可见光谱中546.5nm的TAT(Y11Aph(azpy)-Mn(CO)3)中的金属到配体电子转移(MLCT)下降，证明其中CO的快速释放。
对比例1：以酪氨酸为氨基酸底物构建苯偶氮基吡啶类配位基团
当选择使用酪氨酸为氨基酸底物进行苯偶氮基吡啶配位基团构建时，可以使用的反应为重氮偶联反应。在适当条件下，重氮盐能与某些芳环上连有强给电子基团的芳香族化合物如酚和胺等发生亲电取代反应，生成偶氮(-N＝N-)化合物。当偶合组分为酚类化合物时，重氮偶合常在弱碱性的水相环境中进行。为验证重氮偶合反应在酪氨酸上构建苯偶氮基吡啶类配位的可行性：
(1)选择简单底物，即苯胺与对甲酚进行重氮偶合的路线探索
首先，在0-5℃下将苯胺在浓盐酸的水溶液中与亚硝酸钠反应生成苯胺重氮盐；随后，在0℃条件下直接将苯胺重氮盐溶液滴入对甲酚的水溶液中，使用饱和碳酸钠溶液控制pH为8-9的弱碱性。
保持0℃反应3h，反应体系成深红色。使用乙醚进行萃取，旋干乙醚后得到深棕色的油状物。对该产物进行APCI-MS与1H-NMR表征，最后综合分析，得出结论确定目标产物即为4-甲基-2-苯偶氮基苯酚。
(2)使用多肽合成过程中使用的N端氨基为Fmoc保护的酪氨酸(Fmoc-L-Tyr-OH)作为底物，进行Fmoc保护的氨基酸上重氮偶合的探索
由于重氮偶联主要是在缓冲液等水系溶液中进行，而Fmoc-L-Tyr-OH在水溶液的溶解度较低，反应位点无法暴露在水溶液中。该条件下苯胺重氮盐与Fmoc-L-Tyr-OH的偶合效率极低，未生成目标产物。
由此可推测，常用的固相多肽合成中树脂反应的反应体系为有机溶剂体系，重氮偶合需要的水相反应体系限制了使用该反应进行固相一锅法合成以苯偶氮基吡啶为配位基团的多肽-金属羰基复合物上的应用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种以苯偶氮基吡啶为配体的多肽-锰-羰基复合物CO释放分子的固相合成方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)设计含有作为配位基团引入位点的氨基酸的目标多肽序列，采用Fmoc固相多肽合成法，以Fmoc氨基树脂为载体，根据目标多肽序列，从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸，洗涤，干燥，获得线性多肽树脂；其中：
作为配位基团引入位点的氨基酸，使用苯胺氨基保护基为烯丙氧羰基的Fmoc-4-氨基苯丙氨酸进行合成；
其余氨基酸使用无侧链的Fmoc氨基酸，或侧链的保护基团能用三氟乙酸进行脱除的Fmoc氨基酸进行合成；
(2)取步骤(1)制备得到的线性多肽树脂，加入钯催化体系，反应，洗涤，干燥，得到烯丙氧羰基保护基脱除的线性多肽树脂；
(3)取步骤(2)制备得到的线性多肽树脂，加入亚硝基吡啶类化合物，二氯甲烷，冰醋酸，反应，洗涤，干燥，得到含苯偶氮基吡啶配位基团的线性多肽树脂；
(4)取步骤(3)制备得到的含苯偶氮基吡啶配位基团的线性多肽树脂，加入切割试剂，使多肽链从Fmoc氨基树脂上脱下，并脱除剩余侧链保护基；经过滤、旋干、萃取、离心、冻干，得到含苯偶氮基吡啶配位基团的线性多肽粗品；进一步分离纯化，得到含苯偶氮基吡啶配位基团的线性多肽；
(5)取步骤(4)制备得到的含苯偶氮基吡啶配位基团的线性多肽，加入五羰基溴化锰，以二氯甲烷/甲醇混合溶液为反应溶剂，进行配位反应；旋干溶剂，乙醚萃取，即获得含苯偶氮基吡啶配位基团的锰-羰基-线性多肽复合物。
2.根据权利要求1所述的以苯偶氮基吡啶为配体的多肽-锰-羰基复合物CO释放分子的固相合成方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的作为配位基团引入位点的氨基酸为苯丙氨酸或酪氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的以苯偶氮基吡啶为配体的多肽-锰-羰基复合物CO释放分子的固相合成方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的钯催化体系为四(三苯基膦)钯催化体系，四(三苯基膦)钯的用量为树脂上承载多肽的3～5倍当量，反应溶剂为氯仿、乙酸、N-甲基吗啉按体积比37:2:1混合的氯仿-乙酸-N-甲基吗啉混合溶液；
步骤(2)中所述的反应的条件为温度20～30℃、时间2～3h。
4.根据权利要求1或2所述的以苯偶氮基吡啶为配体的多肽-锰-羰基复合物CO释放分子的固相合成方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的亚硝基吡啶类化合物包括亚硝基吡啶和亚硝基吡啶衍生物；
所述的亚硝基吡啶化学式为C5H4N2O，其结构式如下：
Figure FDA0003176835740000021
步骤(3)中所述的亚硝基吡啶类化合物用量为树脂上承载多肽的5～15倍当量；
步骤(3)中所述的二氯甲烷的用量，按亚硝基吡啶类化合物在体系中的浓度大于0.4mol/L计；
步骤(3)中所述的冰醋酸的用量为二氯甲烷用量的0.5％～1.5％v/v；
步骤(3)中所述的反应的条件为温度20～30℃，时间为反应直至树脂无色透明。
5.根据权利要求1或2所述的以苯偶氮基吡啶为配体的多肽-锰-羰基复合物CO释放分子的固相合成方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的切割的试剂为三氟乙酸和水按95：5的体积比混合得到的溶液；
步骤(4)中所述的切割的时间为1～2h；
步骤(4)中所述的萃取的萃取剂为冰乙醚；
步骤(4)中所述的萃取的次数为两次。
6.根据权利要求1所述的以苯偶氮基吡啶为配体的多肽-锰-羰基复合物CO释放分子的固相合成方法其特征在于：
步骤(5)中所述的五羰基溴化锰加入量为多肽的1～5倍当量；
步骤(5)中所述的二氯甲烷/甲醇混合溶液中二氯甲烷和甲醇的体积比为1:1，其用量按五羰基溴化锰在体系中的浓度大于0.4mol/L计；
步骤(5)中所述的配位反应的条件为温度20～30℃、震荡反应4～6h。
7.根据权利要求1所述的以苯偶氮基吡啶为配体的多肽-锰-羰基复合物CO释放分子的固相合成方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的亚硝基吡啶类化合物用量为树脂上承载多肽的10倍当量；
步骤(3)中所述的二氯甲烷的用量，按亚硝基吡啶类化合物在体系中的浓度为0.4～0.6mol/L计；
步骤(3)中所述的冰醋酸的用量为二氯甲烷用量的1％v/v；
步骤(5)中所述的五羰基溴化锰加入量为多肽的3倍当量；
步骤(5)中所述的二氯甲烷/甲醇混合溶液中二氯甲烷和甲醇的体积比为1:1，其用量按五羰基溴化锰在体系中的浓度为0.4～0.6mol/L计。
8.根据权利要求1所述的以苯偶氮基吡啶为配体的多肽-锰-羰基复合物CO释放分子的固相合成方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸的具体操作为：在偶联体系作用下先将第1位氨基酸和Fmoc氨基树脂反应生成氨基酸-氨基树脂，再逐一偶联其它Fmoc保护氨基酸，获得线性多肽树脂；
所述的偶联体系中的Fmoc脱保护试剂为20％哌啶/DMF；
所述的偶联体系中的脱保护反应时间为5～10min；
所述的偶联体系中的缩合剂为HOBT+DIC或TBTU+DIEA；
步骤(1)中所述的氨基树脂为Rink Amide MBHA树脂；
步骤(1)中所述的氨基树脂的负载量为0.2～0.8mmoL/g；
步骤(1)中所述的苯胺氨基保护基为烯丙氧羰基的Fmoc-4-氨基苯丙氨酸化学式为Fmoc-L-Aph(Alloc)-OH，其结构式如下所示：
Figure FDA0003176835740000031
所述的Fmoc-L-Aph(Alloc)-OH的用量按Fmoc氨基树脂：Fmoc-L-Aph(Alloc)-OH＝1：3的摩尔比计算；
所述的Fmoc-L-Aph(Alloc)-OH与Fmoc氨基树脂的偶联时间为4～12h；
除Fmoc-L-Aph(Alloc)-OH以外的Fmoc保护氨基酸的用量按Fmoc氨基树脂：Fmoc保护氨基酸＝1：4的摩尔比计算；
除Fmoc-L-Aph(Alloc)-OH以外的Fmoc保护氨基酸与Fmoc氨基树脂的偶联时间为2～4h。
9.一种以苯偶氮基吡啶为配体的多肽-锰-羰基复合物CO释放分子，其特征在于：通过权利要求1～8任一项所述的固相合成方法得到。
10.权利要求9所述的以苯偶氮基吡啶为配体的多肽-锰-羰基复合物CO释放分子在制备药物和/或医用材料中的应用。
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