CN112724193B - 一种基于多肽-锰-羰基复合物的co释放分子的固相合成方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于多肽‑锰‑羰基复合物的CO释放分子的固相合成方法及其应用。本方法采用Fmoc固相多肽合成法，在需引入侧链修饰的位点使用侧链Alloc保护的赖氨酸，从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸，得到侧链带有Alloc保护的多肽氨基树脂；进行树脂上的Alloc基团脱除，暴露可用于修饰反应的自由氨基；在树脂上采用还原胺化反应，将树脂上多肽链上的自由氨基修饰为可进行化学配位的配体基团；加入五羰基溴化锰进行树脂上的化学配位；最后将目标多肽从树脂裂解下来并纯化，即可得到带有锰‑羰基配位的多肽。本发明有助于研究一氧化碳对特定部位的生理生化作用，同时为一氧化碳在相关疾病的治疗方面奠定良好基础。
Description
技术领域
本发明涉及多肽-金属复合物合成制备技术领域，具体涉及一种基于多肽-锰-羰基复合物的CO释放分子的固相合成方法及其应用。
背景技术
一氧化碳(CO)因为具有与体内血红蛋白的强结合作用长期以来被认为是一种有毒气体。但于此同时，CO作为一种重要的气体分子，在哺乳动物体内发挥着信号传导，细胞保护等多种生理作用(R.Motterlini,Nat.Rev.Drug.Discov.,2010,9,728–743.)。为进一步探索CO在生命体系中的重要作用及临床医学的应用，首先需解决的关键问题之一即采用何种方式实现CO安全可控的定点运输。
使用一氧化碳释放分子(CORMs)是CO可控传递的可行方案之一。大部分的CORMs为金属-羰基复合物，CO与低氧化态的过度金属配位，经过一定刺激后可以释放出分子结构中的CO(R.Alberto,Dalton.Trans.,2007,1651–1660)。经过数年发展，根据激发CORMs释放CO方式，可将CORMs分为以下主要3类：1.配体交换引发CO释放型CORMs；2.酶诱导CO释放型CORMs(ET-CORMs)；3.光可控的光诱导CO释放型CORMs(PhotoCORMs)。PhotoCORMs由于其CO释放方式可控性更高的优点备受研究人员的关注，其中的代表是以锰-羰基(Mn(CO)3)为基础的PhotoCORMs。但CORMs单体通常在水溶液中的溶解性较差，空气稳定性较差，生物相容性较差的缺点，这些缺点限制了单体CORMs的实际应用(R.D.Rimmer,Coord.Chem.Rev.,2012,256,1509–1519)。
采用CORMs与适合的载体构建得到的复合物可以解决CORMs上述的问题。用于构建CORMs复合物的载体通常包括多肽、高分子聚合物和纳米材料等。其中多肽与CORMs的复合物因具备更好的生物相容性而备受关注。除此之外，得益于一些特定种类多肽的特异靶向性，有望实现可控并定点的CO局部释放。
制备上述的多肽的CORMs复合物通常使用共价偶联的方法。通过化学逐步合成的方法，首先将带有金属-羰基的结构通过连接子与具有反应活性的官能团连接，接着反应活性官能团与多肽或蛋白原有或人为引入的反应位点反应，实现金属-羰基结构与多肽或蛋白的偶联。通用于金属-羰基结构与多肽或蛋白的偶联反应包括Sonogashira偶联，CuAAC催化的点击化学连接和肟的化学连接(M.Salmain,Eur.J.Inorg.Chem.,2020,2020,21–35)。这样的偶联反应通常需要在液相的环境中进行多步骤的合成，因此需要多步骤的纯化造成最终的产率较低。
双亚甲基氮原子杂环化物，如双亚甲基吡啶(dpa)及双亚甲基喹啉(dqa)，在最近的研究工作中常作为配位基团用于构建PhotoCORMs(M.A.Gonzalez,Inorg.Chem.,2012,51,601–608)。通过改变氮原子杂环化物的类型或在杂环上增加取代基团，可调节进行光诱导释放的光源波长。氮原子杂环化物可进行种类多样的化学配位，所以也有研究人员将其通过点击偶联后进行配体-金属配位或配体-金属首先配位再进行点击偶联的方式构建多肽-金属复合物(M.Salmain,N.Fischer-Durand and B.Rudolf,Eur.J.Inorg.Chem.,2020,2020,21–35)。除此之外，以Fmoc保护的赖氨酸(Fmoc-L-Lysine)为基础，人工合成带有配位基团的单氨基酸螯合物(single amino acid chelates，SAAC)也被用于构建多肽-金属复合物。例如将双亚甲基吡啶配体(dpa)基团或双亚甲基喹啉配体(dqa)通过化学合成引入Fmoc-L-Lysine的侧链，可分别合成带有配位基团SAAC-dpa或SAACQ-dqa，通过标准的多肽固相固相合成和配位步骤可获得带有dpa或dqa基团的多肽-金属复合物(M.
Chem.Commun.,2009,493–512)。上述的多肽-金属复合物的构建方法通常为：首先通过有机合成和柱层析纯化得到目标SCCA；其次，经过固相多肽合成，将SAAC引入至多肽序列的目标位置；最后，经过树脂上裂解得到粗品产物，进一步纯化得到目标多肽-金属复合物。
将氮原子杂环化物的丰富化学配位能力和已有多肽-金属复合物的合成方案结合起来，可用于构建以多肽-金属羰基复合物为基础的PhotoCORMs复合物。但已有的多肽-金属复合物合成方案中的SAAC制备环节较为复杂耗时(需要经过液相的有机反应和柱层析的纯化)。并且，若希望通过改变氮原子杂环化物的类型或在杂环上增加取代基团来进行光源波长的调节，需要重新合成新的SAAC再进行逐步的多肽合成，使得完整的合成流程更为冗长耗时。因此，有必要开发一种全新的、合成与纯化便捷、可模块化合成的合成方法，来高效制备多肽-金属羰基复合物为基础的PhotoCORMs。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于多肽-锰-羰基复合物的CO释放分子的固相合成方法。
本发明的另一目的在于提供上述基于多肽-锰-羰基复合物的CO释放分子的固相合成方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基于多肽-锰-羰基复合物的CO释放分子的固相合成方法，包括如下步骤：
(1)采用Fmoc固相多肽合成法，以Fmoc氨基树脂为载体，根据目标多肽序列，从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸，洗涤，干燥，获得线性多肽树脂；其中：
所述的目标多肽序列含有任意数量、任意位置作为侧链修饰位点的赖氨酸，作为侧链修饰位点的赖氨酸，使用侧链氨基保护基为Alloc(烯丙氧羰基)的Fmoc赖氨酸(Fmoc-L-Lys(Alloc)-OH)进行合成；
当所述的目标多肽序列还含有不作为侧链修饰位点的赖氨酸时，不作为侧链修饰位点的赖氨酸使用侧链氨基保护基为Boc(叔丁氧羰基)的Fmoc赖氨酸(Fmoc-L-Lys(Boc)-OH)进行合成；
其余氨基酸使用无侧链的Fmoc氨基酸，或侧链的保护基团能用三氟乙酸进行脱除的Fmoc氨基酸进行合成；
(2)取步骤(1)制备得到的线性多肽树脂，加入钯催化体系，反应，洗涤，干燥，得到Alloc保护基脱除的线性多肽树脂；
(3)取步骤(2)制备得到的线性多肽树脂，加入带有醛基的氮杂环化合物，三乙酰氧基硼氢化钠(Na(CH3CO2)3BH)，二氯乙烷(DCE)，反应，洗涤，干燥，得到赖氨酸侧链含配位基团的线性多肽树脂；
(4)取步骤(3)制备得到的线性多肽树脂，加入五羰基溴化锰，二氯甲烷，进行配位反应，洗涤，干燥，得到锰-羰基-线性多肽树脂复合物；
(5)取步骤(4)制备得到的锰-羰基-线性多肽树脂复合物，加入切割试剂，使多肽链从Fmoc氨基树脂上脱下，并脱除剩余侧链保护基；经过滤、旋干、萃取、离心、冻干，得到多肽-锰-羰基复合物粗品；进一步分离纯化，得到多肽-锰-羰基复合物。步骤(1)中所述的从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸的具体操作为：在偶联体系作用下先将第1位氨基酸和Fmoc氨基树脂反应生成氨基酸-氨基树脂，再逐一偶联其它Fmoc保护氨基酸，获得线性多肽树脂；
所述的偶联体系中的Fmoc脱保护试剂优选为20％哌啶/DMF。
所述的偶联体系中的脱保护反应时间优选为5～10min。
所述的偶联体系中的缩合剂优选为HOBT+DIC或TBTU+DIEA。
步骤(1)中所述的氨基树脂优选为Rink Amide MBHA树脂。
步骤(1)中所述的氨基树脂的负载量优选为0.2～0.8mmoL/g。
步骤(1)中所述的侧链氨基保护基为Alloc的Fmoc赖氨酸的化学式为Fmoc-L-Lys(Alloc)-OH，其结构式如下所示：
所述的Fmoc-L-Lys(Alloc)-OH的用量优选按Fmoc氨基树脂：Fmoc-L-Lys(Alloc)-OH＝1：3的摩尔比计算。
所述的Fmoc-L-Lys(Alloc)-OH与Fmoc氨基树脂的偶联时间优选为4～12h；更优选为12h。
除Fmoc-L-Lys(Alloc)-OH以外的Fmoc保护氨基酸的用量优选按Fmoc氨基树脂：Fmoc保护氨基酸＝1：4的摩尔比计算。
除Fmoc-L-Lys(Alloc)-OH以外的Fmoc保护氨基酸与Fmoc氨基树脂的偶联时间优选为2～4h；更优选为2h。
步骤(2)中所述的钯催化体系优选为四(三苯基膦)钯催化体系，四(三苯基膦)钯的用量优选为树脂上承载多肽的3～5倍当量，反应溶剂为氯仿、乙酸、N-甲基吗啉按体积比37:2:1混合的氯仿-乙酸-N-甲基吗啉混合溶液。
步骤(2)中所述的反应的条件为温度20～30℃(室温)、时间2～3h。
步骤(3)中所述的带有醛基的氮杂环化合物优选为2-甲醛吡啶、2-甲醛喹啉中的至少一种。
步骤(3)中所述的带有醛基的氮杂环化合物和三乙酰氧基硼氢化钠的用量，均优选为树脂上承载多肽的5～15倍当量，更优选为10倍当量。
步骤(3)中所述的二氯乙烷的用量，优选按带有醛基的氮杂环化合物和三乙酰氧基硼氢化钠在体系中的浓度大于0.4mol/L计；更优选按0.4～0.6mol/L计。
步骤(3)中所述的反应的条件为温度20～30℃(室温)，时间为反应直至树脂无色透明。
步骤(4)中所述的五羰基溴化锰加入量优选为树脂上承载多肽的1～5倍当量，更优选3倍当量。
步骤(4)中所述的二氯甲烷的用量，优选按二氯甲烷：Fmoc氨基树脂＝5～10mL：1g计算。
步骤(4)中所述的配位反应的条件优选为温度20～30℃(室温)、震荡反应4～6h。
步骤(5)中所述的切割的试剂优选为三氟乙酸(TFA)、水和1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DODT)按95：2.5：2.5的体积比混合得到的溶液。
步骤(5)中所述的切割的时间优选为2～4h。
步骤(5)中所述的萃取的萃取剂优选为冰乙醚。
步骤(5)中所述的萃取的次数优选为两次。
步骤(5)中所述的分离纯化优选通过反向液相色谱实现。
所述的反向液相色谱的流动相为含0.1％三氟乙酸的乙腈/水混合液。
上述基于多肽-锰-羰基复合物的CO释放分子的固相合成方法在制备药物和/或医用材料中的应用。
本发明方法的原理如下：采用Fmoc固相多肽合成法，使用Fmoc氨基树脂为载体，根据目标多肽的序列，在需引入侧链修饰的位点使用侧链Alloc保护的赖氨酸，从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸，得到侧链带有Alloc保护的多肽氨基树脂；其中，Alloc保护基的脱除方式有别于其余氨基酸的侧链保护基团；其次采用Alloc保护基的脱除条件，进行树脂上的Alloc基团脱除，暴露可用于修饰反应的自由氨基；随后进行在树脂上采用还原胺化反应，将树脂上多肽链上的自由氨基修饰为可进行化学配位的配体基团；接着加入五羰基溴化锰进行树脂上的化学配位；最后将目标多肽从树脂裂解下来并纯化，即可得到带有锰-羰基配位的多肽。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明方法提供了在多肽上引入配位官能团并进行锰-羰基配位的全程固相合成实例，仅需要最后一步的反应液相色谱纯化即可得到目标产物，大大简化了目前已有合成多肽/蛋白金属复合物的合成步骤数量和缩短了合成所需时间。
本发明方法中在多肽固相合成中引入侧链保护基团为Alloc的赖氨酸经过Pd(PPh3)4的脱除后，暴露自由氨基。该自由氨基具有进行多种不同类型反应的能力，因此可通过不同反应类型进行多种官能团的修饰。
本发明方法创新以五羰基溴化锰为反应底物的锰-羰基配位方式。将五羰基溴化锰溶解于多肽固相合成中所使用的有机溶剂中，解决了此前在缓冲液中进行液相配位时五羰基溴化锰溶解度不佳的问题。使用树脂上的固相配位的方法，配位结束后通过洗涤树脂的方式即可轻松便捷地除去剩余未配位的五羰基溴化锰，节省了此前配位后的液相纯化步骤，极大缩短了合成时间和成本。
本发明的全程固相合成方法是对现有制备多肽-锰-羰基(Mn(CO)3)复合物的一次创新。本发明通过基于Fmoc保护基团的固相多肽合成法和正交保护基赖氨酸的使用得到带有反应位点的多肽氨基树脂，利用树脂上的还原胺化反应在多肽目标位点进行可用于配位的官能团化修饰，随后利用五羰基溴化锰进行树脂上的锰-羰基-配体的配位反应。配位后的产物在树脂切割的反应过程中能够保持稳定，未发现脱落情况，从而仅需一步纯化，成功制备多肽-锰-羰基(Mn(CO)3)复合物。
通过本发明方法所制备得到的多肽-锰-羰基(Mn(CO)3)复合物，将多肽部分的靶向性和锰羰基的一氧化碳释放的光可控性，构建得到一种生物相容性高、生理环境稳定、实现一氧化碳具有靶向运输和可控释放以多肽为支架的一氧化碳释放分子，有助于研究一氧化碳对特定部位的生理生化作用，同时为一氧化碳在相关疾病的治疗方面奠定良好基础。
附图说明
图1为实施例1制得的含双亚甲基吡啶和锰-羰基配位的TATK7K(dpa-Mn-CO)固相合成过程每阶段的HPLC示意图。
图2为实例1制备得到含双亚甲基吡啶和锰-羰基配位的TATK7K(dpa-Mn-CO)的ESI-MS表征图。
图3为实施例2制得的含双亚甲基喹啉和锰-羰基配位的TATK7K(dqa-Mn-CO)固相合成过程每阶段的HPLC示意图。
图4为实施例2制备得到含双亚甲基喹啉和锰-羰基配位的TATK7K(dqa-Mn-CO)的ESI-MS表征图。
图5为实施例1制备TATK7K(dpa-Mn(CO)3)光控CO释放实验结果图。
图6为实施例2制备TATK7K(dqa-Mn(CO)3)光控CO释放实验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中使用的Fmoc-L-Lys(Alloc)-OH的结构式如下：
其余Fmoc保护氨基酸为Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH。
下述实施例中HPLC，其仪器为安捷伦1260，色谱柱为Phenomenex C18柱，流动相为水和乙腈(含0.1％(v/v)TFA)。
下述实施例中合成的带有两种不同配体官能团的多肽序列为如下，而且合成的多肽C端均为酰胺化：
TAT(K7K(dpa)):YGRKK(dpa)RRQRRR；
TAT(K7K(dqa)):YGRKK(dqa)RRQRRR。
下述实施例中用到的试剂名称及缩写：
DMF：N，N-二甲基甲酰胺；
DCM：二氯甲烷；
HOBT：1-羟基苯并三唑；
DIC：N，N-二异丙基碳二亚胺；
TBTU：苯并三唑四甲基四氟硼酸；
DIEA：N，N-二异丙基乙胺；
NMM：N-甲基吗啉；
DEC：二氯乙烷；
TFA：三氟乙酸；
DODT：1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸；
ACN：乙腈。
实施例1：侧链配位基团为双亚甲基吡啶(dpa)TAT-锰羰基复合物的制备方法：
(1)Fmoc-Arg(Pbf)-MBHA树脂的制备：取500mg Rink Amide MBHA树脂于多肽合成管中，负载量为0.2-0.8mmol/g，加入15mL DMF室温震荡溶胀两次，每次15min，抽干，往树脂加入10mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，再用DMF洗涤两次后，再次加入10mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，排干溶剂，得到氨基脱除Fmoc保护的树脂，称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH(1mmol)、TBTU(2mmol)以及DIEA(0.98mmol)，将Fmoc-Arg(Pbf)-OH与TBTU用少量DMF溶解，加入DIEA，室温震荡反应活化羧基2min，之后将活化后的氨基酸加入到树脂中，在室温下震荡反应2h，采用DMF、DCM各洗涤三次，氮气吹干得到干燥树脂，取树脂通过紫外检测其树脂负载量，最终得到约负载量为0.44mmol/g的Fmoc-Arg(Pbf)-MBHA树脂。
(2)TATK7K(Alloc)-MBHA树脂的制备：取得到的Fmoc-Arg(Pbf)-MBHA树脂加入15mL DMF室温震荡溶胀两次，每次15min，排干，之后往树脂里加入10mL 20％乙酸酐/DMF，室温震荡反应20min从而封闭掉未耦合上氨基酸的树脂的氨基，阻止其下一步反应，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，往树脂加入10mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，再用DMF洗涤两次后，再次加入10mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，排干溶剂，得到脱除Fmoc保护的树脂，称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH(2mmol)TBTU(4mmol)以及DIEA(1.96mmol)，将Fmoc氨基酸与HOBT用少量DMF溶解，加入DIC，室温震荡反应活化羧基2min，之后将活化后的氨基酸加入到树脂中，在室温下震荡反应2h，可用Kaiser试剂监测反应，用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，重复以上实验操作(氨基酸含量以树脂的4倍摩尔当量计算，震荡反应为2h)，再依次耦合Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH。合成完毕后采用DMF、DCM各洗涤三次，氮气吹干得到干燥树脂1.2g。由于树脂质量增加，此时树脂的负载量约为0.18mmol/g。
(3)Alloc保护基的脱除：取1g步骤(2)得到的树脂，加入树脂上承载多肽的3倍当量Pd(PPh3)4，加入氯仿、乙酸、NMM按体积比37:2:1混合的混合溶液15mL，室温下反应2-3小时。
(4)TATK7K(dpa)-MBHA树脂的制备：取500mg步骤(3)得到的树脂，加入2-甲醛吡啶(0.9mmol)，三乙酰氧基硼氢化钠(0.9mmol)，加入DCE 2.25mL，室温震荡反应，用Kaiser试剂监测反应直至树脂无色透明。反应完毕后采用DMF、DCM各洗涤三次，氮气吹干得到干燥树脂。
(5)TATK7K(dpa-Mn(CO)3)-MBHA树脂的制备：取500mg步骤(4)得到的树脂，加入五羰基溴化锰(0.36mmol)，加入DCM 2.5mL，室温震荡反应4h。反应完毕后采用DMF、DCM各洗涤三次，氮气吹干得到干燥树脂。
(6)TATK7K(dpa-Mn(CO)3)多肽的制备：取250mg步骤(5)得到的树脂，加入5mL切割试剂(TFA：DODT：H2O＝体积比95:2.5:2.5)，震荡反应2-4h，过滤得到黄棕色透明液体，液体旋蒸仪旋干后，加入约15mL冰乙醚萃取两次，离心后收集沉淀，将样品冻干，得到约80mgTATK7K(dpa-Mn(CO)3)多肽，之后通过HPLC来对多肽粗品进行分离纯化，最终得到约68mgTATK7K(dpa-Mn(CO)3)多肽。
在TATK7K(dpa-Mn(CO)3)的全程固相合成过程中，通过对每个阶段得到的树脂进行小量的切割测试，并使用HPLC对不同阶段的产物进行检测，结果如图1所示。ESI-MS鉴定最终得到的TATK7K(dpa-Mn(CO)3)，结果如图2所示。
实施例2：侧链配位基团为双亚甲基喹啉(dqa)TAT-锰羰基复合物的制备方法：
(1)按照实施例1的方法得到500mg负载量约为0.44mmol/g的Fmoc-Arg(Pbf)-MBHA树脂。
(2)TATK7K(Alloc)-MBHA树脂的制备：取得到的Fmoc-Arg(Pbf)-MBHA树脂加入15mL DMF室温震荡溶胀两次，每次15min，排干，之后往树脂里加入10mL 20％乙酸酐/DMF，室温震荡反应20min从而封闭掉未耦合上氨基酸的树脂的氨基，阻止其下一步反应，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，往树脂加入10mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，再用DMF洗涤两次后，再次加入10mL 20％哌啶/DMF，室温下震荡反应5min，依次用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，排干溶剂，得到脱除Fmoc保护的树脂，称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH(2mmol)TBTU(4mmol)以及DIEA(1.96mmol)，将Fmoc氨基酸与HOBT用少量DMF溶解，加入DIC，室温震荡反应活化羧基2min，之后将活化后的氨基酸加入到树脂中，在室温下震荡反应2h，可用Kaiser试剂监测反应，用DMF、DCM、DMF各洗涤两次，重复以上实验操作(氨基酸含量以树脂的4倍摩尔当量计算，震荡反应为2h)，再依次耦合Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH。合成完毕后采用DMF、DCM各洗涤三次，氮气吹干得到干燥树脂1.2g。由于树脂质量增加，此时树脂的负载量约为0.18mmol/g。
(3)Alloc保护基的脱除：Alloc保护基的脱除：取1g步骤(2)得到的树脂，加入树脂上承载多肽的3倍当量Pd(PPh3)4，加入氯仿、乙酸、NMM按体积比37:2:1混合的混合溶液15mL，室温下反应2-3小时。
(4)TATK7K(dqa)-MBHA树脂的制备：取500mg树脂，加入2-甲醛喹啉(0.9mmol)，加入DCE 2.25mL，室温震荡反应2h。随后加入三乙酰氧基硼氢化钠(0.9mmol)，继续室温震荡反应，用Kaiser试剂监测反应直至树脂无色透明。反应完毕后采用DMF、DCM各洗涤三次，氮气吹干得到干燥树脂。
(5)TATK7K(dqa-Mn(CO)3)-MBHA树脂的制备：取500mg(3)得到树脂，加入五羰基溴化锰(0.36mmol)，加入DCM 2.5mL，室温震荡反应4h。反应完毕后采用DMF、DCM各洗涤三次，氮气吹干得到干燥树脂。
(5)TATK7K(dqa-Mn(CO)3)多肽的制备：取250mg树脂，加入5mL切割试剂(TFA：DODT：H2O＝95:2.5:2.5)，震荡反应2-4h，过滤得到黄棕色透明液体，液体旋蒸仪旋干后，加入约15mL冰乙醚萃取两次，离心后收集沉淀，将样品冻干，得到约75mg TATK7K(dqa-Mn(CO)3)多肽，之后通过HPLC来对多肽粗品进行分离纯化，最终得到约62mg TATK7K(dqa-Mn(CO)3)多肽。
在TATK7K(dqa-Mn(CO)3)的全程固相合成过程中，通过对每个阶段得到的树脂进行小量的切割测试，并使用HPLC对不同阶段的产物进行检测，结果如图3所示。ESI-MS鉴定最终得到的TATK7K(dqa-Mn(CO)3)，结果如图4所示。
实施例3：光控CO释放实验
实验原料：肌红蛋白(Mb)(sigma aldrich)，连二亚硫酸钠，TATK7K(dpa-Mn(CO)3)，TATK7K(dqa-Mn(CO)3)，PBS缓冲液，可见光紫光手电(380～415nm，LED，5W)。
实验步骤：
①将PBS缓冲液使用氮气鼓泡30min进行除氧。
②使用除氧后的PBS将Mb配制为终浓度40μmol/L，加入石英比色皿。加入连二亚硫酸钠(终浓度为3.2mmol/L)对Mb进行还原。
③加入TAT-Mn(CO)3多肽-锰配合物(终浓度为10μmol/L)。
④使用可见光紫光手电对比色皿进行光照，使用紫外可见光谱记录不同累计光照时间的谱图。结果如图5、图6所示。
从紫外谱特征峰的变化得到以下结论①未经光照的TAT-Mn(CO)3不会释放CO；②光照之后，TAT-Mn(CO)3中的CO快速释放，紫外中出现Mb-CO的540nm，570nm特征吸收双峰。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种基于多肽-锰-羰基复合物的CO释放分子的固相合成方法及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 第5位赖氨酸（K）侧链含有配位基团双亚甲基吡啶（dpa)
<400> 1
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 第5位赖氨酸（K）侧链含有配位基团双亚甲基喹啉（dqa)
<400> 2
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
Claims (9)
1.一种基于多肽-锰-羰基复合物的CO释放分子的固相合成方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)采用Fmoc固相多肽合成法，以Fmoc氨基树脂为载体，根据目标多肽序列，从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸，洗涤，干燥，获得线性多肽树脂；其中：
所述的目标多肽序列含有任意数量、任意位置作为侧链修饰位点的赖氨酸，作为侧链修饰位点的赖氨酸，使用侧链氨基保护基为Alloc的Fmoc赖氨酸进行合成；
当所述的目标多肽序列还含有不作为侧链修饰位点的赖氨酸时，不作为侧链修饰位点的赖氨酸使用侧链氨基保护基为Boc的Fmoc赖氨酸进行合成；
其余氨基酸使用无侧链的Fmoc氨基酸，或侧链的保护基团能用三氟乙酸进行脱除的Fmoc氨基酸进行合成；
(2)取步骤(1)制备得到的线性多肽树脂，加入钯催化体系，反应，洗涤，干燥，得到Alloc保护基脱除的线性多肽树脂；
(3)取步骤(2)制备得到的线性多肽树脂，加入2-甲醛吡啶或2-甲醛喹啉，三乙酰氧基硼氢化钠，二氯乙烷，反应，洗涤，干燥，得到赖氨酸侧链含配位基团的线性多肽树脂；
(4)取步骤(3)制备得到的线性多肽树脂，加入五羰基溴化锰，二氯甲烷，进行配位反应，洗涤，干燥，得到锰-羰基-线性多肽树脂复合物；
(5)取步骤(4)制备得到的锰-羰基-线性多肽树脂复合物，加入切割试剂，使多肽链从Fmoc氨基树脂上脱下，并脱除剩余侧链保护基；经过滤、旋干、萃取、离心、冻干，得到多肽-锰-羰基复合物粗品；进一步分离纯化，得到多肽-锰-羰基复合物。
2.根据权利要求1所述的基于多肽-锰-羰基复合物的CO释放分子的固相合成方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的钯催化体系为四(三苯基膦)钯催化体系，四(三苯基膦)钯的用量为树脂上承载多肽的3～5倍当量，反应溶剂为氯仿、乙酸、N-甲基吗啉按体积比37:2:1混合的氯仿-乙酸-N-甲基吗啉混合溶液。
3.根据权利要求1所述的基于多肽-锰-羰基复合物的CO释放分子的固相合成方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的2-甲醛吡啶或2-甲醛喹啉和三乙酰氧基硼氢化钠的用量，均为树脂上承载多肽的5～15倍当量；
步骤(3)中所述的二氯乙烷的用量，按2-甲醛吡啶或2-甲醛喹啉和三乙酰氧基硼氢化钠在体系中的浓度大于0.4mol/L计。
4.根据权利要求1所述的基于多肽-锰-羰基复合物的CO释放分子的固相合成方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的五羰基溴化锰加入量为树脂上承载多肽的1～5倍当量；
步骤(4)中所述的二氯甲烷的用量，按二氯甲烷：Fmoc氨基树脂＝5～10mL：1g计算。
5.根据权利要求1所述的基于多肽-锰-羰基复合物的CO释放分子的固相合成方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的反应的条件为温度20～30℃、时间2～4h；
步骤(3)中所述的反应的条件为温度20～30℃，时间为反应直至树脂无色透明；
步骤(4)中所述的配位反应的条件为温度20～30℃、震荡反应4～6h。
6.根据权利要求1所述的基于多肽-锰-羰基复合物的CO释放分子的固相合成方法，其特征在于：
步骤(5)中所述的切割的试剂为三氟乙酸、水和1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸按95：2.5：2.5的体积比混合得到的溶液；
步骤(5)中所述的切割的时间为2～4h。
7.根据权利要求1所述的基于多肽-锰-羰基复合物的CO释放分子的固相合成方法，其特征在于：
步骤(5)中所述的萃取的萃取剂为冰乙醚；
步骤(5)中所述的萃取的次数为两次；
步骤(5)中所述的分离纯化通过反向液相色谱实现；
所述的反向液相色谱的流动相为含0.1％三氟乙酸的乙腈/水混合液。
8.根据权利要求1所述的基于多肽-锰-羰基复合物的CO释放分子的固相合成方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸的具体操作为：在偶联体系作用下先将第1位氨基酸和Fmoc氨基树脂反应生成氨基酸-氨基树脂，再逐一偶联其它Fmoc保护氨基酸，获得线性多肽树脂；
所述的偶联体系中的Fmoc脱保护试剂为20％哌啶/DMF；
所述的偶联体系中的脱保护反应时间为5～10min；
所述的偶联体系中的缩合剂为HOBT+DIC或TBTU+DIEA。
9.根据权利要求1所述的基于多肽-锰-羰基复合物的CO释放分子的固相合成方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的氨基树脂为Rink Amide MBHA树脂；
步骤(1)中所述的氨基树脂的负载量为0.2～0.8mmoL/g；
步骤(1)中所述的侧链氨基保护基为Alloc的Fmoc赖氨酸的化学式为Fmoc-L-Lys(Alloc)-OH，其结构式如下所示：
所述的Fmoc-L-Lys(Alloc)-OH的用量按Fmoc氨基树脂：Fmoc-L-Lys(Alloc)-OH＝1：3的摩尔比计算；
所述的Fmoc-L-Lys(Alloc)-OH与Fmoc氨基树脂的偶联时间为4～12h；
除Fmoc-L-Lys(Alloc)-OH以外的Fmoc保护氨基酸的用量按Fmoc氨基树脂：Fmoc保护氨基酸＝1：4的摩尔比计算；
除Fmoc-L-Lys(Alloc)-OH以外的Fmoc保护氨基酸与Fmoc氨基树脂的偶联时间为2～4h。
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