CN112972679B - 一种多肽偶联硼携带剂及其制备方法和药物制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种硼携带剂及其制备方法和药物制剂，所述硼携带剂包含化合物1 N‑4‑羧基苯硼酸酰胺‑苏‑苯‑苯‑酪‑甘‑甘‑丝‑精‑甘‑赖‑精‑天冬‑天冬‑苯‑赖‑苏‑谷‑谷‑酪‑半胱氨酸，分子式为C114H158BN30O35S1，分子量为2552.4，还包含化合物2 N‑4‑羧基苯硼酸酰胺精‑赖‑赖‑赖‑精‑精‑谷酰‑精‑精‑精氨酸，和/或化合物3N‑4‑羧基苯硼酸酰胺‑甲‑丙‑丝‑甲‑苏‑甘‑甘‑谷酰‑谷酰‑甲‑甘氨酸。本发明所述化合物可以作为一种靶向性的硼中子俘获治疗药物，用于治疗脑胶质瘤和头颈部肿瘤。
Description
技术领域：
本发涉及一种多肽偶联硼携带剂及其制备方法和药物制剂，尤其涉及一种N-4-羧基苯硼酸酰胺-苏-苯-苯-酪-甘-甘-丝-精-甘-赖-精-天冬-天冬-苯-赖-苏-谷-谷-酪-半胱氨酸及其制备方法和药物制剂。
背景技术：
肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，其死亡率仅次于心血管疾病，居各类疾病死亡率的第二位，而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。根据目前癌症的发病趋势，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人。
胶质瘤是发生于神经外胚层的肿瘤，故亦称神经外胚层肿瘤或神经上皮肿瘤。肿瘤起源于神经间质细胞，即神经胶质、室管膜、脉络丛上皮和神经实质细胞，即神经元。大多数肿瘤起源于不同类型的神经胶质，但根据组织发生学来源及生物学特征类似，对发生于神经外胚层的各种肿瘤，一般都称为神经胶质瘤。
胶质瘤的分类方法很多，临床工作者往往采用的是分类比较简单的Kernohan分类法。各型胶质瘤中，以星形细胞瘤最多，其次为胶质母细胞瘤，其后依次为髓母细胞瘤、室管膜瘤、少枝胶质瘤、松果体瘤、混合性胶质瘤、脉络丛乳头状瘤、未分类胶质瘤及神经元性肿瘤。各型胶质瘤的好发部位不同，如星形细胞瘤成人多见于大脑半球，儿童则多发在小脑；胶质母细胞瘤几乎均发生于大脑半球；髓母细胞瘤发生于小脑蚓部；室管膜瘤多见于第4脑室。
目前，胶质瘤的治疗按效果分依次为外科手术、放射治疗、化学治疗。由于胶质瘤呈侵袭性生长，与周围的组织界限不清，尽管在手术中应用了显微镜，也不可避免少量肿瘤细胞残留，导致肿瘤复发。虽然在化疗方面不断取得新的进展，但由于全身化疗很难通过血脑屏障，在肿瘤的局部很难达到有效的药物浓度，而且大剂量化疗使得全身毒副作用明显，如骨髓抑制、白细胞血小板的减少、肺纤维化等。虽然每一种治疗方式都取得了明显进步，并且3种方法的综合治疗能延长病人的生存期，但胶质瘤仍难治愈。近年来，硼中子俘获疗法等新疗法已从实验室走向临床。
硼中子俘获疗法(BNCT)是一种新型的治疗肿瘤的方法，最初是由美国Locher于1936年提出的设想，它是把与肿瘤有特异性亲和力的硼(10B)携带剂注入人体，聚集于肿瘤细胞之内，随后用超热低能中子(1eV~10keV)进行照射，10B原子核与中子发生核反应，产生的α粒子和7Li3+杀死肿瘤细胞：10B+1n→[11B]→ 4He2+(α)+7Li3++2.31MeV。研究表明肿瘤细胞中10B的中子反应截面为3800b(barn)，而肿瘤周围的正常细胞氢(1H)和氮(14N)也可发生中子俘获反应，但是1H和14N中子反应截面仅分别为0.332b和1.82b，所以相对于肿瘤周围的组织，肿瘤细胞内10B对中子的反应截面很大，毒副作用较小。但直到上世纪80年代后，硼化合物载体的制备有了重大突破，同时解决了热中子源的问题，才使得BNCT进入临床实用阶段。临床上BNCT主要用于脑部肿瘤、神经胶质瘤和黑色素瘤等癌症的治疗。
BNCT中使用的硼携带剂是一系列被动或主动靶向的含硼化合物，其分子能够选择性地被肿瘤细胞吸收。理想的硼携带剂应该具备以下特点：1)硼剂量要达到要求，至少保证每克肿瘤组织吸收约10~30μg10B，即每个肿瘤细胞含有109个10B原子，并且在照射期间，肿瘤细胞内硼的辐射剂量要保持在1Gy以上。2)肿瘤细胞对正常组织的硼浓度之比以及肿瘤细胞对血液的硼浓度之比均要保证达到3以上，保证硼携带剂的靶向性。3）除了被处于分裂期的肿瘤细胞摄取之外，还可以被肿瘤细胞吸收。4)无毒，水溶性好。
第二代BNCT试剂是一系列被动靶向的含硼有机小分子化合物，其分子能够选择性地被肿瘤细胞吸收。在临床治疗方面已有两种被美国FDA批准的含硼药物：
1) 硫基十二硼烷二钠盐(BSH：Na2B12H11SH)：BSH是一种水溶性化合物，分子中含有12个B原子。经验证明在脑肿瘤的治疗中BSH聚集效果最为良好，最初是由Miller等人在1964年合成的，1968年被首次用于脑肿瘤的治疗，在开颅术中使用BNCT照射，取得了良好的疗效。2018年Goeun Choi等将层状双氢氧化物(LDH)和BSH结合，在U87细胞吸收BSH-LDH纳米颗粒后，10B含量为42.4μg/106个细胞，比BNCT的最小硼需求大了约2000倍。小鼠体内BSH-LDH组10B的T/B值在2小时内也比使用BSH的组高4.4倍。在30μg10B mL-1条件下也最终产生优异的中子捕获效率。
2) 10B-对二羧硼酰苯丙氨酸(BPA：10BC9H12NO4)。BPA是一种脂溶性化合物，其结构类似于苯丙氨酸，因为肿瘤细胞代谢旺盛，需要的苯丙氨酸比正常细胞多，因此肿瘤细胞可主动地大量摄取BPA，但是因为其结构中含有硼，所以其并不参与蛋白质合成。基于BPA优先被黑色素合成细胞摄取的假设，它最初通过静脉注射治疗皮肤黑色素瘤患者。Coderre等人在1990年的实验表明，BPA也被其他类型的肿瘤细胞所吸收，包括大鼠脑9L胶质肉瘤等。Mallesh等人发现BPA的果糖复合物（BPA-F）能显著提高其水溶性，增加在血液内的溶解度，可以通过静脉注射，故BPA很快进入临床阶段，用于治疗恶性黑色素瘤和脑胶质瘤患者。
受制于分子特性层面的缺陷，BPA和BSH的肿瘤细胞特异性不足，无法满足前述硼携带剂的理想标准。硼携带剂的发展面临的主要挑战是需满足对肿瘤细胞的选择性靶向，以及在最小正常组织摄取和滞留情况下递送治疗浓度的硼。提高硼携带剂选择性的方向包括与肿瘤靶向基团的整合，如非天然氨基酸、多胺、多肽、蛋白质、抗体、核苷、糖类、卟啉类化合物、脂质体和纳米颗粒等。
硼中子俘获治疗针对的主要适应症之一是脑胶质瘤和头颈部肿瘤，药物到达脑胶质瘤需要穿透血脑屏障，所以后续对硼携带剂的研究需要满足将足够剂量的10B分子输送到肿瘤细胞中，并要保持较高的T/N值。其中，在不破坏正常脑组织的条件下有效杀死胶质瘤细胞，这比其他部位的恶性肿瘤的治疗更具挑战性。血脑屏障会排除分子量大于200Da的药物，同时还因为胶质瘤细胞的高度浸润特性及其基因组异质性导致治疗脑胶质瘤变得更加困难。
发明内容：
本发明的一个目的是提供一种多肽硼携带剂及其药学上可接受的盐。
本发明所述硼携带剂是一种N-4-羧基苯硼酰胺型多肽化合物，该化合物具有质量稳定的优点，并且性质优良，更适于作为原料药制备各种形式的药物制剂。
本发明实现上述目的的技术方案是：
本发明所述的一种硼携带剂及其药学上可接受的盐为N-4-羧基苯硼酸酰胺-苏-苯-苯-酪-甘-甘-丝-精-甘-赖-精-天冬-天冬-苯-赖-苏-谷-谷-酪-半胱氨酸及其药学上可接受的盐，具体分子式为：
本发明所述的N-4-羧基苯硼酸酰胺-苏-苯-苯-酪-甘-甘-丝-精-甘-赖-精-天冬-天冬-苯-赖-苏-谷-谷-酪-半胱氨酸类化合物（ANG），确定分子式为C114H158BN30O35S1，分子量为2552.4的化合物，此为化合物1
化合物2化学名称为N-4-羧基苯硼酸酰胺精-赖-赖-赖-精-精-谷酰-精-精-精氨酸（TAT）。
化合物3化学名称为N-4-羧基苯硼酸酰胺-甲-丙-丝-甲-苏-甘-甘-谷酰-谷酰-甲-甘氨酸（T7）。
本发明的另一个目的是提供一种药物制剂，其包含：(1)、本发明所述的硼携带剂和/或及其药学上可接受的盐；和(2)、一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明所述化合物或药物制剂可以制备一种靶向性的硼中子俘获治疗药物，用于治疗脑胶质瘤和头颈部肿瘤。
本发明的另一目的是提供上述化合物的制备方法，包括如下步骤：
1.向4-羧基苯硼酸上连接第一个氨基酸。将MBHA树脂预先在DCM中溶胀30 min,抽滤并用DMF冲洗干净。将含苏氨酸和DIPEA的二氯甲烷溶液加入到树脂中。树脂混合物在搅拌下反应2小时。
2.抽滤,用DCM/DIPEA/MeOH(17:l:2)的混合液处理树脂,然后用DMF (3×30秒),甲醇(3×30秒)和DCM (3×30秒)冲洗。
3.其余氨基酸的连接方法按照常规的Fmoc合成法。
4.用含20%哌淀的DMF溶液处理10分钟,依次用DMF、CH2Cl2和DMF冲洗、耦合、向Fmoc氨基酸溶液5ml中依次加入4mLHBTU、2mLHOBT和206.58μL DIPEA,然后加入700μL DMF溶解,将以上混合液加入树脂混合物中,反应1小时后,依次用DMF、CH2Cl2 (2x)和DMF清洗;
5. 使用HPLC高效液相色谱仪对合成的多肽进行纯化分离，条件：C18色谱柱ODS-34.6×250mm，流动相A：H2O（0.065%三氟乙酸），流动相B：乙腈（0.05%三氟乙酸），流速1mL/min，梯度条件：A:0-25min，5%-65%；25-27min,65%-95%；27-35min，95%-5%。
本发明的优点是：
本发明是作为一种靶向性的硼中子俘获治疗药物，其对的主要适应症之一是脑胶质瘤和头颈部肿瘤。由于胶质瘤呈侵袭性生长，与周围的组织界限不清，外科手术无法避免少量肿瘤细胞残留，导致肿瘤复发。虽然在化疗方面不断取得新的进展，但由于全身化疗很难通过血脑屏障，在肿瘤的局部很难达到有效的药物浓度，而且大剂量化疗使得全身毒副作用明显。本发明有望在不破坏正常脑组织的条件下有效杀死胶质瘤细胞，减少对大脑的损伤，有广泛的应用。
附图说明：
图1为本发明实施例1制得的N-4-羧基苯硼酰胺型多肽化合物质谱图，
图2为N-4-羧基苯硼酸酰胺精-赖-赖-赖-精-精-谷酰-精-精-精氨酸质谱图，
图3为N-4-羧基苯硼酸酰胺-甲-丙-丝-甲-苏-甘-甘-谷酰-谷酰-甲-甘氨酸质谱图，
图4为本产品和BPA12小时内在不同细胞中的吸收，
图5为多肽在不同组织中的吸收。
具体实施方式：
下文结合具体实施例对本发明的内容做进一步详细地说明，所述实施例的目 的仅用于说明和描述本发明当前的最佳模式。本发明的保护范围不以任何方式受 此处所述实施例的限制。
实施例1
N-4-羧基苯硼酸酰胺-苏-苯-苯-酪-甘-甘-丝-精-甘-赖-精-天冬-天冬-苯-赖-苏-谷-谷-酪-半胱氨酸的制备
向4-羧基苯硼酸上连接第一个氨基酸。将MBHA树脂预先在DCM中溶胀30 min,抽滤并用DMF冲洗干净。将含苏氨酸和DIPEA的二氯甲烷溶液加入到树脂中。树脂混合物在搅拌下反应2小时。抽滤,用DCM/DIPEA/MeOH(17:l:2，体积比)的混合液处理树脂,然后用DMF (3×30秒), 甲醇(3×30秒)和DCM (3×30秒)冲洗。
实施例2 N-4-羧基苯硼酸酰胺-苏-苯-苯-酪-甘-甘-丝-精-甘-赖-精-天冬-天冬-苯-赖-苏-谷-谷-酪-半胱氨酸的纯化
用含20%哌淀的DMF溶液处理10分钟,依次用DMF、CH2Cl2和DMF冲洗、耦合、向Fmoc氨基酸溶液5ml中(中依次加入4mLHBTU（189.62mg）、2mLHOBT（33.78mg）和206.58μLDIPEA,然后加入700μLDMF溶解,将以上混合液加入树脂混合物中,反应1小时后,依次用DMF、CH2Cl2(2x)和DMF清洗;
使用HPLC高效液相色谱仪对合成的多肽进行纯化分离，条件：C18色谱柱ODS-34.6×250mm，流动相A：H2O（0.065%三氟乙酸），流动相B：乙腈（0.05%三氟乙酸），流速1mL/min，梯度条件：A:0-25min，5%-65%；25-27min,65%-95%；27-35min，95%-5%。
实施例3 根据本发明的化合物的体外研究
将N-4-羧基苯硼酸酰胺-苏-苯-苯-酪-甘-甘-丝-精-甘-赖-精-天冬-天冬-苯-赖-苏-谷-谷-酪-半胱氨酸、N-4-羧基苯硼酸酰胺精-赖-赖-赖-精-精-谷酰-精-精-精氨酸、N-4-羧基苯硼酸酰胺-甲-丙-丝-甲-苏-甘-甘-谷酰-谷酰-甲-甘氨酸配置成0.1mg/g、0.2mg/g、0.4mg/g、0.6mg/g、0.8mg/g的水溶液，分别加入25T培养皿培养的U87MG、U251、A375、A549、HS683和Hep细胞系中，在恒温培养箱中培养12小时。取出后分离细胞和培养基，检测细胞数量，用浓硝酸消化细胞后，通过ICP-AES检测细胞中B的含量。
同时将BPA配置成0.1mg/g、0.2mg/g、0.4mg/g、0.6mg/g、0.8mg/g的水溶液，分别加入25T培养皿培养的的U87MG、U251、A375、A549、HS683和Hep细胞系中，在恒温培养箱中培养12小时。取出后分离细胞和培养基，检测细胞数量，用浓硝酸消化细胞后，通过ICP-AES检测细胞中B的含量。
检测线为249.772nm，检测后计算可得每106个细胞中所含的B含量，绘制图4，由此可见，在12小时中，细胞中硼浓度和加入的产品浓度呈正相关，且增长趋势逐渐减缓。12小时内，本产品在胶质瘤细胞系U251中吸收最佳。
对比可得在脑胶质瘤HS683、A375细胞吸收中，化合物1与化合物2均显著高于BPA。
实施例4根据本发明的化合物的体内研究
选取健康的BALB/c小鼠，平均体重约为21g，接种HS683脑胶质瘤，建立小鼠脑胶质瘤模型。待21天后，小鼠脑胶质瘤模型生成，通过小鼠尾静脉注射500mg/kg的BPA、N-4-羧基苯硼酸酰胺-苏-苯-苯-酪-甘-甘-丝-精-甘-赖-精-天冬-天冬-苯-赖-苏-谷-谷-酪-半胱氨酸、N-4-羧基苯硼酸酰胺精-赖-赖-赖-精-精-谷酰-精-精-精氨酸、N-4-羧基苯硼酸酰胺-甲-丙-丝-甲-苏-甘-甘-谷酰-谷酰-甲-甘氨酸溶液。给药后，于选定时间段(1小时、2小时、4小时)切除小鼠主要组织器官(心，肝，脾，肺、肾及肿瘤部位)，清洗称重后用浓硝酸消解组织器官。消解后的组织样品经稀释后，通过 ICP-MS 测定样品中的浓度。
如图5所示，给药后两小时，可以看出，小鼠脑胶质瘤部位，三种化合物吸收量均高于BPA，且化合物1最高，表示本产品能够提高硼携带剂的靶向效果，增加BNCT照射时的有效中子吸收量。
以上对本发明的具体实施例进行了描述，但需要理解的是，本发明并不局限于上述特定的实施方式，本领域技术人员可以在不脱离本发明构思的前提下，做出各种变形和修改，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种硼携带剂，其特征在于硼携带剂选自N-4-羧基苯硼酸酰胺-苏-苯-苯-酪-甘-甘-丝-精-甘-赖-精-天冬-天冬-苯-赖-苏-谷-谷-酪-半胱氨酸。
2.一种药物制剂，其特征在于所述药物制剂含有权利要求1所述的硼携带剂和/或者其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
3.如权利要求1所述的硼携带剂或权利要求2所述的药物制剂在制备一种靶向性硼中子俘获治疗药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述靶向性硼中子俘获治疗药物用于治疗脑胶质瘤和头颈部肿瘤。
5.一种制备权利要求1所述的硼携带剂的方法，包括如下步骤：
1）向4-羧基苯硼酸上连接第一个氨基酸，将MBHA树脂预先在DCM中溶胀30 min,抽滤并用DMF冲洗干净，将含苏氨酸和DIPEA的二氯甲烷溶液加入到树脂中，树脂混合物在搅拌下反应2小时；
2）抽滤,用DCM/DIPEA/MeOH，体积比为17:l:2的混合液处理树脂,然后用DMF 3×30秒,甲醇3×30秒和DCM 3×30秒冲洗；
3）其余氨基酸的连接方法按照常规的Fmoc合成法；
4）用含20%哌淀的DMF溶液处理10分钟,依次用DMF、CH2Cl2和DMF冲洗、耦合、向Fmoc氨基酸溶液5ml中依次加入4mLHBTU、2mLHOBT和206.58μL DIPEA,然后加入700μL DMF溶解,将以上混合液加入树脂混合物中,反应1小时后,依次用DMF、CH2Cl2 2x和DMF清洗;
5）使用HPLC高效液相色谱仪对合成的多肽进行纯化分离，条件：C18色谱柱ODS-34.6×250mm，流动相A：H2O 0.065%三氟乙酸，流动相B：乙腈 0.05%三氟乙酸，流速1mL/min，梯度条件：A:0-25min，5%-65%；25-27min,65%-95%；27-35min，95%-5%。
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